KR100943302B1

KR100943302B1 - 메치실린-내성 황색포도상구균 특이적 항체, 상기 항체를 이용하는 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지방법, 및 탐지키트

Info

Publication number: KR100943302B1
Application number: KR1020090020935A
Authority: KR
Inventors: 송형근; 윤상순; 김해정; 지길용; 신미향; 문유리
Original assignee: 다이노나(주)
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2010-02-23
Also published as: WO2010104245A1; CN102482346B; US20120070851A1; US8546093B2; CN102482346A

Abstract

본 발명은 메치실린 내성 황색포도상구균에서 특이적으로 발현되는 단백질에 대한 항체, 상기 항체를 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법 및 검출용 키트에 관한 것으로, PBP2a에 특이적인 항체를 이용하여 PBP2a의 존재 여부를 탐지하고 단백질 A에 특이적인 항체를 이용하여 단백질 A의 존재 여부를 탐지함으로써 PBP2a 및 단백질 A가 모두 존재하는 메치실린 내성 황색포도상구균을 신속하고 정확하게 탐지할 수 있다.

메치실린, 내성, 황색포도상구균, 단클론, 항체, 단백질 A

Description

메치실린-내성 황색포도상구균 특이적 항체, 상기 항체를 이용하는 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지방법, 및 탐지키트{ANTIBODY SPECIFIC TO METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS, DETECTION METHOD AND KIT FOR METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS USING THE SAME}

본 발명은 메치실린 내성 황색포도상구균에서 특이적으로 발현되는 단백질에 대한 항체, 상기 항체를 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법 및 검출용 키트에 관한 것으로, 다른 황색포도상구균과 구별하여 메치실린 내성 황색포도상구균을 신속하고 정확하게 탐지할 수 있다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus)은 병원내 및 병원외에서 가장 빈번히 감염을 일으키는 균으로 알려져 있다. 또한, 상기 황색포도상구균 중 대표적인 세균은 메치실린 내성 황색포도상구균(Methicillin resistant Staphylococcus aureus, 이하 'MRSA'), 메치실린내성 코아굴라제 음성균(Methicillin resistant coagulase negative Staphylococcus, MR-CNS), 메치실린 감수성 황색포도구균(Methilcillin sensitive Staphylococcus aureus, MSSA), 및 메치실린 감수성 코아굴라제 음성균(Methilcillin sensitive coagulase negative Staphylococcus, MS-CNS) 등이 있다. 이중 MRSA는 병원에서 다량으로 발견되며 면역력이 적은 환자들이 많이 보유하고 있는 균으로, 상기 균에 대한 항균제도 많이 발달되지 아니하여 환자 중 상기 세균의 감염율이 높은 실정이다.

현재 상기 MRSA를 진단하는 방법으로 1) 균을 배양하여 항균제 감수성 검사를 시행하거나 2) 균을 배양하여 균 집락에서 직접 MRSA에 특별한 유전자를 검출하거나 3) MRSA에 특별한 단백질을 검출하는 방법이다. 그 중에서 대부분의 병원에서는 1)의 방법으로 탐지하며 이때 검사시간이 최소 2일에서 3일 정도 소요되는 단점이 있다. 또한, 배양된 균을 이용하여 황색포도상구균이 특이적으로 생산하는 단백질의 존재여부에 의하여 감염여부를 판단하는 방법은, 소규모 병원에서 실시하기 어려운 실정이다. 이와 같은 경우에는 1 내지 2일이 더욱 소요될 수 있어 검사를 하지 아니하고 항균제를 사용하는 경우도 있다. 2) 및 3) 의 경우는 그 과정이 복잡하여 일반 검사실에서는 시행되지 아니하고 연구목적으로만 시행하고 있는 실정이다.

따라서, MRSA에 감염되었는지 여부의 판단이 늦어지는 경우가 많아 치료시기가 늦어지거나 잘못된 항균제를 사용하는 경우가 발생하여, 신속하고 정확한 MRSA 감염여부를 판단할 수 있는 탐지키트 및 탐지방법이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 MRSA 감염여부를 판단할 수 있는 탐지방법을 연구하던 중, MRSA에 특이적인 페니실린 결합 단백질(PBP2a)을 항원으로 하는 단클론 항체 및 단백질 A(protein A)를 항원으로 하는 항체를 이용하여, 상기 세균을 신속하고 정확하게 탐지함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 페니실린 결합 단백질(PBP2a)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 단클론 항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00202, KCLRF-BP-00203 및 KCLRF-BP-00204으로 이루어진 군에서 선택된 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 PBP2a에 특이적인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 각각 검체시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 PBP2a에 특이적인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 PBP2a에 특이적인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 조성물을 제공하 는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 페니실린 결합 단백질(PBP2a)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 단클론 항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00202, KCLRF-BP-00203 및 KCLRF-BP-00204으로 이루어진 군에서 선택된 하이브리도마 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 PBP2a에 특이적인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 각각 검체시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법을 제공한다.

또한 본 발명은 PBP2a에 특이적인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 PBP2a에 특이적인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 "단클론 항체" 는 당해 분야에 공지된 용어이며, 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도로 특이적인 항체이다. 전형적으로 상이한 결정기(에 피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 본 발명의 단클론 항체는 통상적인 클로닝 및 세포 융합 기술들을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 관심 대상의 면역원(항원)을 야생형이나 육종된 마우스(예를 들면, BALB/c)에 투여하여 천연 또는 사람 단클론 항체를 생산할 수 있다. 이러한 항원은 단독으로 투여되거나, 애주번트와 혼합하여 투여되거나, 벡터로부터 발현될 수 있으며 DNA 또는 융합 단백질로서 면역 반응을 유도할 수 있다. 융합 단백질은 면역 반응에 의도된 펩타이드와 커플링된 담체 단백질, 예를 들면, β-갈락토시다제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 및 소 혈청 알부민을 포함하며, 담체 단백질은 이에 제한되지는 않는다. 상기의 경우에 펩타이드는 담체 단백질에 대해서 합텐(hapten)으로 작용한다. 단클론 항체 제조 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 동물을 부스팅시킨 후, 비장을 제거하고 비장 세포를 추출하여 당해 분야에 공지된 방법[Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]]으로 골수종 세포와 융합시킨다. 수득되는 하이브리드 세포를 통상적인 방법, 예를 들면, 제한 희석으로 클로닝하고, 목적하는 단클론 항체를 생산하는 수득된 클론을 배양하는 것이다. 단클론 항체는 항원-항체 결합을 사용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한, 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 또 다른 장점을 갖는다.

본 발명에서 "하이브리도마" 는 당해 분야에 공지되어 있으며, 항체 생산 세포와 불멸 세포, 예를 들면 골수종 세포와의 융합에 의해서 형성된 세포를 의미한다. 상기 하이브리드 세포는 항체를 지속적으로 공급할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "검출 표지제" 는 면역복합체의 검출을 위한 표지를 의미하며, 구체적인 예로는 방사성 동위원소 표지, 효소, 화학발광화합물(chemoluminescent compound), 플루오레세인, 피코빌리프로테인, 희토류 킬레이트, 로다민 등과 같은 형광 물질, 효소 보조인자(enzyme cofactor), 바이오틴 등을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 "검체시료" 는 세포, 조직 또는 생물학적 유체를 포함하는 생물학적 물질을 포함한다.

본 발명에서 사용된 "항원-항체 복합체"는 시료중의 PBP2a 및 단백질 A의 존재 또는 부재를 확인하기 위하여 PBP2a 또는 단백질 A와 각각 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.

본 발명에 따른 페니실린 결합 단백질(이하 'PBP2a'라고 함)에 특이적인 항체는 PBP2a 서열 중 종간 상동성이 낮은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단편에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 페니실린 결합 단백질(이하 'PBP2a'라고 함)에 특이적인 항체는 단클론 항체일 수 있다.

또한, 상기 본 발명에서 항원으로 사용한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 페니실린 결합 단백질(PBP2a)의 단편은 상기 MRSA 균으로부터 정제할 수 있으 며, 또는 벡터 등을 이용하여 재조합 단백질로 제조할 수 있다. 바람직하게는 EcoRⅠ 및 XhoⅠ 제한효소를 이용하여 벡터에 클로닝하여 얻을 수 있다.

상기 폴리펩티드는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)종간의 PBP2a 단백질의 염기서열의 상동성을 분석하여 메치실린 내성 황색포도상구균의 PBP2a 단백질에 특이적인 부분인 N-말단 부분을 포함한다(<실시예 1-1> 참조).

따라서 본 발명에 따른 항체는 상기 폴리펩티드를 항원으로 인식하여 페니실린 결합 단백질(PBP2a)의 존재 여부를 효과적으로 검출할 수 있으며 바람직하게는 상기 항체는 단클론 항체일 수 있다. 상기 단클론 항체는 종래 항체 제조방법을 이용하여 생산될 수 있으나 바람직하게는 기탁번호 KCLRF-BP-00202, KCLRF-BP-00203 및 KCLRF-BP-00204으로 이루어진 군에서 선택된 하이브리도마 세포에 의해 생산될 수 있다. 구체적으로 상기 하이브리도마 세포는 모두 한국세포주은행에 2009년 2월 18일자로 기탁되었다.

본 발명의 일실시예에서는 PBP2a 특이적 프라이머를 이용하여 항원을 다량 확보하고(<실시예 1-2> 참조), 여러 마우스의 복강에 상기 항원을 주입하여, PBP2a에 대한 역가가 가장 높고 음성 대조항원인 His-Coagulase에 대해서는 거의 결합하지 않는 다클론 항체를 생산하는 마우스를 선택하고(<실시예 1-3> 참조), 상기 마우스의 비장세포와 골수종세포가 융합된 하이브리도마 세포를 제조하고 이로부터 PBP2a에 특이적인 본 발명의 단클론 항체를 생산하였다(<실시예 2> 참조).

상기 본 발명의 단클론 항체는 PBP2a를 특이적으로 인식함으로써 PBP2a를 가 지고 있는 것으로 알려진 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 및 메치실린내성 코아굴라제 음성균(MR-CNS)을 구별해 낼 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 ELISA를 통해 본 발명의 단클론 항체의 PBP2a항원 특이성을 확인하고(<실시예 3> 참조), 면역블랏 또는 ELISA를 통해 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)을 검출할 수 있음을 확인하였다(<실시예 4> 참조). 나아가 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 단클론 항체 쌍을 선발하고 이를 이용하여 샌드위치 ELISA 또는 면역크로마토그래피 분석법을 통해 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)을 검출할 수 있음을 알 수 있었다(<실시예 5> 참조).

상기 본 발명의 단클론 항체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표시제가 결합될 수 있다. 상기 검출 표시제는 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사성 물질로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 보다 구체적으로 검출 표지제의 예는 다양한 효소, 보결분자족, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 방사성 물질 등을 포함한다. 검출 표지제는 당해 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 본 발명의 단클론 항체에 직접적으로 커플링 또는 결합되거나 중간체(예를 들면, 당해 분야에 공지된 링커)를 통해 간접적으로 커플링되거나 결합될 수 있다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 아세틸콜린 에스터라제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산 디하이드로게나아제, 인버타제 등을 포함하고; 적합한 보결분자족 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드, 피코에리트린 또는 피코빌리프로테인 등을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀, 이소루시놀, 루시제닌을 포함하고; 생물 발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하며; 적합한 방사선 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In, ⁹⁹Tc ¹⁴C, ³H 등을 포함한다.

한편 본 발명의 하이브리도마 세포는 기탁번호 KCLRF-BP-00202, KCLRF-BP-00203 및 KCLRF-BP-00204으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며 상기 본 발명의 단클론 항체를 생산할 수 있다. 구체적으로 상기 하이브리도마 세포는 모두 한국세포주은행에 2009년 2월 18일자로 기탁되었다.

상기 하이브리도마 세포의 제조방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 바람직하게는 항체 생산 세포와 불멸 세포, 예를 들면 골수종 세포와의 융합에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 마우스의 비장세포와 골수종세포가 융합된 하이브리도마 세포를 제조하고 이로부터 PBP2a에 특이적인 본 발명의 단클론 항체를 생산할 수 있음을 알 수 있었다(<실시예 2> 참조).

한편 본 발명의 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법은 PBP2a에 특이적 인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 각각 검체시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인함으로써 메치실린 내성 황색포도상구균을 특이적으로 탐지할 수 있다.

상기 PBP2a에 특이적인 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 페니실린 결합 단백질(PBP2a)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으며, 바람직하게는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 페니실린 결합 단백질(PBP2a)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 앞서 기술한 본 발명의 단클론 항체일 수 있다.

상기 단백질 A는 황색포도상구균에서 특이적으로 발현되는 단백질로, 특히 황색포도상구균 중에서 MRSA 및 MSSA 균에서 발현되나 MR-CNS 및 MS-CNS에서는 생성되지 않는 단백질이다.

상기 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 단백질 A를 닭에 면역화하여 수득한 다클론 항체일 수 있다.

상기 본 발명의 탐지방법은 PBP2a에 특이적인 항체만을 사용하는 경우 MRSA 및 MR-CNS의 구별이 곤란하지만, 단백질 A는 MRSA에는 존재하고 MR-CNS에는 존재하지 않으므로, PBP2a에 특이적인 항체 및 단백질 A에 특이적인 항체를 함께 사용함으로써 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)를 검출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 본 발명자들은 단백질 A가 항체의 Fc부분에 결합하는 특성이 있어 항체를 이용한 단백질 A의 탐지에 장애 요인이 될 수 있다고 판단하였다. 이에 본 발명자들은 닭을 숙주로 하여 얻어진 단백질 A에 대한 항체의 경 우 상기와 같은 장애 요인이 없음을 알고(Larsson A, Sjㆆquist J. 1989;27(12):2856-7. J Clin Microbiol.), 단백질 A를 닭에 면역화하여 단백질 A에 특이적인 항체를 제조하였다(<실시예 6-1> 참조).

본 발명의 일실시예에서는 상기와 같이 제조된 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA법, 면역크로마토그래피 분석법을 통해 단백질 A를 생성하는 MRSA 및 MSSA 균을 탐지할 수 있음을 알 수 있었다(<실시예 6-2> 및 <실시예 6-3> 참조).

따라서 본 발명의 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법은 1) 상기 PBP2a에 특이적인 항체를 이용하여 PBP2a의 존재 여부를 탐지하고 2) 상기 단백질 A에 특이적인 항체를 이용하여 단백질 A의 존재 여부를 탐지함으로써 PBP2a 및 단백질 A가 모두 존재하는 메치실린 내성 황색포도상구균을 특이적으로 탐지할 수 있다. 결국 1) 및 2)의 항원 항체 반응에서 모두 양성으로 판단되는 경우 메치실린 내성 황색포도상구균이 존재하는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기와 같이 1) 및 2)의 항원 항체 반응을 통하여 메치실린 내성 황색포도상구균을 탐지하였다(<실시예 7> 참조).

상기 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하기 위해서 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 방사성 면역분석법, 효소연관 면역분석법(ELISA), 샌드위치 면역분석법 및 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 이용할 수 있다. 또한 상기 항원-항체 복합체의 검출은 직접적으로나 간접적으로 표지된 항체의 사용을 수반하며, 사용 가능한 검 출 표시제는 앞서 기술한 바와 같으며 상기 분석법의 구체적인 내용 및 방법은 당업계에 공지된 바에 의한다. 일례로 ELISA 검출 방법에 의하는 경우 시료 샘플은 고체 지지체, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 테스트 스트립 등에 코팅된 본 발명의 단클론 항체 또는 상기 단백질 A에 특이적인 항체와 접촉된다. 구체적 일례로서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 본 발명의 단클론 항체 또는 상기 단백질 A에 특이적인 항체로 코팅하고 점유되지 않은(nonoccupied) 결합 부위를 예를 들어 BSA로 차단한 후, 코팅된 플레이트의 웰을 시료 샘플과 인큐베이션하고, 이어서 항원-항체 복합체의 존재를 결정할 수 있다. 상기 항체는 앞서 기술한 바와 같이 검출 표지제를 가질 수 있다.

특히 샌드위치 면역분석법 및 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)을 사용하는 경우 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 항체 쌍을 제조하고 이를 이용하여 메치실린 내성 황색포도상구균을 탐지할 수 있다(도 8 참조). 상기 항체 쌍은 본 발명의 단클론 항체를 이용한 것이라면 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 기탁번호 KCLRF-BP-00202인 하이브리도마 세포에서 생산된 단클론 항체를 검출용으로 이용하고 기탁번호 KCLRF-BP-00203인 하이브리도마 세포에서 생산된 단클론 항체 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00204인 하이브리도마 세포에서 생산된 단클론 항체를 코팅용으로 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 단클론 항체 쌍을 선정하고 이를 이용하여 샌드위치 면역분석법 및 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)을 통해 메치실린 내성 황색포도상구균을 탐지할 수 있었다. 특히 기탁번호 KCLRF-BP-00202인 하이브리도마 세포에서 생산된 단클론 항체를 검출용으로 이용하고 기탁번호 KCLRF-BP-00203인 하이브리도마 세포에서 생산된 단클론 항체 또는 기탁번호 KCLRF-BP-00204인 하이브리도마 세포에서 생산된 단클론 항체를 코팅용으로 사용하는 경우 보다 효과적으로 메치실린 내성 황색포도상구균을 탐지할 수 있었다(<실시예 5> 참조).

한편 본 발명의 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 키트는 PBP2a에 특이적인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 포함한다.

본 발명에 사용하기 위한 키트 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는, 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다. 면역크로마토그래피법을 이용한 진단은, 검체의 혈청 중에 들어 있는 항원이 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)에 결합된 표식자 항체(tracer antibody)와 반응한 다음, 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인의 미세구멍(micropore)을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 포획 항체(capture antibody)와 결합하여 발색띠를 형성함으로써, 양성 및 음성을 육안으로 판별 가능하도록 할 수 있다.

상기 키트는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 효소연관 면역분석법(ELISA) 또는 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)을 이용할 수 있다. 앞서 기술한 바와 같이 샌드위치 면역분석법 및 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)을 사용하는 경우 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 항체 쌍을 제조하고 이를 이용하여 메치실린 내성 황색포도상구균을 탐지할 수 있다.

상기 본 발명의 키트에는 통상적으로 키트에 사용되는 것이라면 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 ELSIA를 이용한 것이라면 고체상 지지체; 본 발명의 단클론 항체 및 단백질 A에 특이적인 항체; 및 항원과의 반응을 위한 효소표지항체액 및 효소반응을 나타내는 발색액을 함유하는 효소-연관 면역분석용(ELSIA) 반응액을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 효소표지항체액은 goat anti-mouse Ig-HRP로 적정농도에서 플레이트 웰당 50 내지 150㎕가 포함될 수 있으며, 발색액은 테트라 메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine, TMB)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 반응차단용액은 1N HCl 또는 1N H₂SO₄으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

한편 본 발명의 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 조성물은 PBP2a에 특이적인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 포함한다.

상기 조성물에는 상기 PBP2a에 특이적인 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체 외에 면역학적 분석에 사용되는 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제가 포함될 수 있다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 상기 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 락텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, PBP2a에 특이적인 항체를 이용하여 PBP2a의 존재 여부를 탐지하고 단백질 A에 특이적인 항체를 이용하여 단백질 A의 존재 여부를 탐지함으로써 PBP2a 및 단백질 A가 모두 존재하는 메치실린 내성 황색포도상구균을 신속하고 정확하게 탐지할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 PBP2a에 특이적인 다클론 항체 제작

<1-1> PBP2a(Penicillin-binding protein 2a) 단백질의 특이적 부분 선정

먼저 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)종간의 PBP2a 단백질의 염기서열의 상동성을 ExPASy Proteomics Server의 SIB BLAST Network Service(http://au.expasy.org/tools/blast/)을 이용하여 측정하였으며, 이의 결과를 하기 도 1에 나타냈다.

도 1의 연두색이 상동성이 높음을 나타나며, 연두색으로 표시된 것은 모두 PBP2a 단백질을 가진 박테리아로 나타났다. 이들 PBP2a 단백질을 가진 박테리아중에서 황색포도상구균과 상동성이 낮은 부분을 선정하기 위하여 ExPASy Proteomics Server의 SIB BLAST Network Service(http://au.expasy.org/tools/blast/)을 이용하여 측정하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, N-말단의 경우 상동성이 낮게 나타났으며, C-말단의 경우는 상대적으로 상동성이 높게 나타났다. 또한, 단백질 기능을 나타내는 C- 말단의 트랜스펩티다아제인 경우, 유사 PBP2a 단백질간의 상동성이 높은 것으로 나타났다. 따라서, 메치실린 내성 황색포도상구균의 PBP2a 단백질에 특이적인 부분으로 N-말단 부분(서열번호 1)을 선정하였다. 또한, PBP2a 단백질 전체의 아미노산 서열은 서열번호 2와 같다.

<1-2> PBP2a 항원의 확보

하기 표 2의 PBP2a 특이적 프라이머를 이용하여 포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus, 이하 'MRSA') 콜로니로부터 유전자 DNA를 분리하여 PCR을 하기 표 1의 조건으로 수행하였다.

PCR 조건

	온도 및 시간	Cycles 횟수
Denature	95℃ 7분
Cycles	95℃ 30초 58℃ 30초 72℃ 1분 30초	30 cycles
Elongate	72℃ 7분

PBP2a 단백질 특이적 프라이머

정방향	서열번호 3	5'-GGAATTCGGTATATATTTTTATGCTTC-3'
역방향	서열번호 4	5'-TCTCGAGAGTACCTGAGCCATAATC-3'

PCR 산물인 988bp의 염기를 EcoRⅠ 및 XhoⅠ 제한효소를 이용하여 pET 벡터에 클로닝한 다음 단백질을 발현시켰다. 상기 PBP2a 단백질을 전기영동법으로 관찰하여 도 3에 나타냈다.

상기 도 3에 나타나듯이, PBP2a 특이적 프라이머를 이용한 경우는 약 37kDa의 단백질이 발현됨을 알 수 있었다.

<1-3> PBP2a에 대한 다클론 항체 제작

6주령의 암컷 Balb/c 에 마우스 한 마리당 50㎍의 상기 <실시예 1-1>의 PBP2a 재조합 단백질을 복강(intraperitoeal cavity, IP)으로 주입하였다. 이때, 항원보강제는 Freund's 항원보강제를 사용하였으며, 한달 간격으로 세 차례 면역화한 후 마우스 꼬리의 혈관으로부터 채혈하여 채혈된 혈액을 2~3분간 14000rpm으로 원심 분리하여 상층액을 취함으로써 혈청을 분리하여 PBP2a 항원에 대한 항체를 모두 포함하는 다클론 항체를 얻었다.

상기 다클론 항체의 항원에 대한 역가는 재조합 항원을 코팅하여 간접 ELISA를 통하여 확인하고 그 결과를 하기 표 3, 표 4 및 도 4에 나타냈다. 상기 표 3에 기재된 His-코아굴라제(Coagulase)는 His이 아닌 PBP2a에 대해 특이적인 항체 역가를 보다 확실히 알아보기 위한 대조군으로 사용하였다.

다클론 항체의 항원(His-PBP2a)에 대한 역가

혈청희석	His-PBP2a 10ng/well
혈청희석	#1 mouse	#2 mouse	#3 mouse	#4 mouse	#5 mouse
1/1,000	0.883	1.339	1.376	1.711	1.150
1/10,000	1.695	1.705	1.965	1.892	1.878
1/100,000	0.964	0.640	0.879	0.511	0.997
1/1,000,000	0.123	0.061	0.162	0.222	0.143

다클론 항체의 항원(His-Coagulse)에 대한 역가

혈청희석	His-Coagulse 10ng/well
혈청희석	#1 mouse	#2 mouse	#3 mouse	#4 mouse	#5 mouse
1/1,000	0.285	0.481	0.741	0.553	1.235
1/10,000	0.007	0.067	0.047	0.012	0.061
1/100,000	0.000	0.008	0.006	0.002	0.004
1/1,000,000	-0.001	0.000	-0.003	-0.002	-0.002

상기 표 3, 표 4 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 5마리의 마우스 중에서 3번 마우스가 PBP2a에 대한 역가가 가장 높은 것을 알 수 있었으며, 상기 His-PBP2a에 결합하는 항체는 His-PBP2a에 대해서는 높은 결합을 보이는 반면 음성 대조항원인 His-코아굴라제(Coagulase)에 대해서는 거의 결합하지 않는 것을 알 수 있었다.

<실시예 2>

메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 PBP2a에 특이적인 단클론 항체 제작

<2-1> 하이브리도마 세포 제조

상기 <실시예 1-3>에서 다클론 항체에 대한 항원의 역가가 가장 높은 3번 마우스를 이용하여 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 수득하였다. 구체적으로 상기 마우스의 비장을 절제하여 단일 세포 부유액을 수득하여 RPMI 1640(Hyclone)으로 2회 정도 세척한 후 트리판 블루(tryphan blue) 염색으로 세포수를 계수하였다. 상기 비장세포와 융합할 세포로 SP2/0 또는 X63 마우스 골수종(myeloma)세포주(ATCC CRL-1581, ATCC CRL-1580)를 사용하였으며 상기 비장세포와 동일하게 세척 후 세포수를 계수하였다. 상기 골수종세포와 비장세포를 1:5의 비율로 혼합하고 원심분리 후, 상등액을 제거하고 37℃로 예열된 50% PEG(Polyethylenglycol) 1500ml을 1분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 상기 첨가 후 약 1분 정도 정체시키고 RPMI-1640(Hyclone) 배지를 서서히 추가하여 단계적으로 희석하였다. 이를 원심분리한 후 1xHAT 이 포함된 RPMI(20%FBS, hypoxanthine-aminopterin-thymidine)에 부유시키고, 96웰-플레이트에 100ul/웰로 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포를 제조하였다.

<2-2> 하이브리도마 세포의 분리 및 선별

상기 <실시예 2-1>에서 골수종세포와 비장세포가 융합된 하이브리도마 세포에 HAT feeding을 진행한 다음, 군락을 형성한 웰이 관찰되면 배양 상층액을 200ul로 분리한 다음 ELISA 방법으로 단클론 항체를 선별하였다. 구체적으로 단클론 항체 선별을 위하여 PBP2a 재조합 단백질을 웰당 100ng씩 넣어 코팅한 후 상기 배양 상층액 100ul를 추가하고 Goat 항-마우스 Ig-HRP를 넣어 ELISA를 실시하였다. 상기 ELISA를 실시한 후, 양성으로 판별된 하이브리도마를 HFCS(Hybridoma fusion and cloning supplement, Roche)가 들어있는 24웰-플레이드에 옮겨 세포군락이 50~70%를 차지하면 다시 양성반응을 보이는 하이브리도마를 선별하여 한계 희석법(limiting dilution)을 이용하여 싱글 셀 클로닝(single cell cloning)을 실시하였다. 마지막까지 항체생성이 확인된 클론을 확장 배양하여 하기 표 5와 같이 PBP2a 항원에 대한 단클론 항체를 생산하는 3개의 하이브리도마 세포를 제조하였다.

PBP2a 항원에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포

	클론 #
1	6G10-46-63
2	9C6-52-40
3	17A10-2-2

특히 상기 하이브리도마 세포 중 클론 번호가 6G10-46-63인 세포를 한국세포주은행에 2009년 2월 18일자로 기탁(기탁번호: KCLRF-BP-00202)하였으며, 또한 클론 번호가 9C6-52-40인 세포를 한국세포주은행에 2009년 2월 18일자로 기탁(기탁번호: KCLRF-BP-00203)하였으며, 또한 클론 번호가 17A10-2-2인 세포를 한국세포주은행에 2009년 2월 18일자로 기탁(기탁번호: KCLRF-BP-00204)하였다.

<2-3> 단클론 항체의 분리 및 정제

상기 <실시예 2-2>에서 선별된 하이브리도마 세포 클론들을 대량 정제하기 위하여, BALB/c 마우스(8-10주, 암컷)의 복강에 불완전 면역반응 항진제(Incomplete Freund's Adjuvant)를 0.5ml 주입하고 10일이 지난 다음, 상기 <실시예 2-2>에서 선별된 각 하이브리도마 세포 5x10⁶를 PBS 0.5ml에 부유하여 복강에 주입하였다. 상기 주입 후 10일~2주가 지난 후 복수를 취하여 원심분리하고 보존제(0.02% sodium azide)를 첨가하고 항체의 아이소타입(isotype)에 따라 단백질 A 또는 단백질 G 세파로스 비드(sepharose bead)를 이용하여 단클론 항체를 정제하였다. 상시 수득한 단클론 항체를 클론 번호를 기준으로 각각 '6G10', '9C6'및 '17A10' 으로 명명하기로 하였다.

<실시예 3>

ELISA를 통한 본 발명의 단클론 항체의 항원 특이성 확인

<3-1> ELISA를 통한 본 발명의 단클론 항체의 PBP2a 항원 특이성

His-PBP2a를 웰당 10ng에서 시작해 단계적으로 PBS에 희석하여 Maxisorp 플레이트(Nunc.)에 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅시켰다. 그 후, 3% BSA/PBS로 37℃에서 추가로 1시간 더 배양하여 반응을 차단하였다. 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 단클론 항체를 PBS로 희석하고 웰당 1ug씩 넣어 1시간 동안 배양하여 항원-항체 반응을 유도하였다. 이후, 세 차례 세척한 다음 결합된 항체를 산양 항-마우스 Ig-HRP(Horse radish peroxidase, Dinona)로 처리하여 37℃ 에서 30분간 배양하였다. 상기 배양 후, 다시 세 차례 세척한 다음 반응 효소에 대하여 기질로 TMB 용액(tetramethylbenzidine)을 웰당 50ul 처리하여 10분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 웰당 50ul 처리하여 반응을 정지하고 발색반응을 450nm에서 측정하여 본 발명의 단클론 항체별 측정결과를 도 5a에 나타내었다. 또한 His-PBP2a를 웰당 10ng으로 코팅하고 항체를 500ng/ml에서 시작해 단계적으로 희석하여 첨가하고 측정한 결과를 도 5b에 나타냈다.

상기 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체마다 항원에 대한 결합이 서로 다른 것을 확인하였다.

<3-2> ELISA를 통한 본 발명의 단클론 항체의 단백질 A 항원 특이성

단백질 A는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 특이적인 단백질로 항체의 Fc부분과 결합을 하는 것으로 알려져 있다(Larsson A, Sjㆆquist J. 1989; 27(12):2856-7. J Clin Microbiol./Lindmark R, Sjㆆquist J. 1983;62:1-13. J. Immunol. Methods). 따라서 단백질 A에 대한 결합이 적은 항체를 선별하여 이용하는 것이 PBP2a에 대한 특이성을 높일 수 있다. 이에 본 발명자들은 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 단클론 항체의 단백질 A에 대한 결합도를 ELISA를 통해 확인하였다.

상기 황색포도상구균에서 정제한 단백질 A를 구매(Fluka사)하여 웰당 100ng에서 시작해 단계적으로 PBS에 희석하고 Maxisorp 플레이트(Nunc.)에 넣어 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅하였다. 그 후, 3% BSA/PBS로 37℃에서 추가로 1시간 더 배양하여 반응을 차단하였다. 이에 대하여 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 단클론 항체를 희석하고 웰당 1ug씩 넣어 1시간 동안 배양하여 항원-항체 반응을 유도하였다. 이후 세 차례 세척한 다음, 결합된 항체는 산양 항-마우스 Ig-HRP(Horse radish peroxidase)를 처리하여 37℃ 에서 30분간 배양하고, 다시 세 차례 세척하고 반응 효소에 대하여 기질로 TMB 용액을 웰당 50ul 처리하여 10분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 웰당 50ul 처리하여 반응을 정지하고 발색반응을 450nm로 측정하여 본 발명의 단클론 항체별 측정결과를 도 6에 나타냈다.

상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체마다 단백질 A에 대한 특이성이 서로 차이가 나는 것을 확인하였으며 이를 통해 단백질 A에 영향을 받지 않으면서 본 발명의 단클론 항체를 이용한 면역분석(immunoassay)이 가능함을 알 수 있었다.

<실시예 4>

본 발명의 단클론 항체를 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 검출

<4-1> 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 관련 그룹의 용해질 분리

균주는 충북대학교 의대병원에서 동정 분리된 균주를 제공 받아 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 2회 세척한 후, 세균 용해 버퍼(bacterial lysis buffer, B-PER buffer, Pierce)에 부유하여 30분간 배양하였다. 그 후, 동결-해동을 영하 70℃ 온도로 2번 시행하고 원심분리(14,000rpm, 25분)하였다. 상기 원심분리 후 상층액을 취하여 각각의 세균에 대한 용해질을 확보하였으며, 브래드포드 실험으로 단백질 정량을 수행하여 하기 표 6에 나타냈다.

본 발명에 사용된 세균의 용해질의 흡광도 및 농도

	562nm 흡광도		농도 (ug/ml)
	원액	1/2 희석	원액	1/2 희석	평균
MSSA 1765	1.083	0.857	445	325	385
MSSA 1886	1.528	1.077	1001	875	938
MRSA 80	2.009	1.382	1602	1637	1620
MRSA 85	1.951	1.351	1530	1560	1545
MRSA 97	1.317	1.051	737	810	774
MRSA 361	2.152	1.689	1781	2405	2093
MRSA 1395	1.353	1.079	782	880	831
MRSA 1672	1.962	1.430	1544	1757	1650
MRCNS 204	1.577	1.223	1062	1240	1151
MSCNS 6535	1.674	1.224	1184	1242	1213

<4-2> 본 발명의 단클론 항체를 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)검출(면역블랏 이용)

상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA), 메치실린 감수성 황색포도상구균(MSSA), 및 메치실린 감수성 코아굴라제 음성균(MS-CNS)에서의 PBP2a의 존재여부를 알 수 있는지 확인하기 위하여 면역블랏(immunoblot)을 이용하였다.

구체적으로 10% SDS-PAGE에 레인(lane)에 1ug씩 황색포도상구균의 용해질 속 단백질을 전개시킨 후 니트로 셀룰로스막에 전기적 방법으로 옮겼다. 이후, 5% BSA/PBS로 실온에서 1시간 배양하여 단백질이 없는 곳의 반응을 차단하고 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 단클론 항체를 PBS로 희석하여 1ug/ml의 농도로 넣어 1시간 동안 추가 배양하여 항원-항체 반응을 유도하였다. 이후 세 차례 세척한 다음, 결합된 항체는 산양 항-마우스 Ig-HRP(Horse radish peroxidase)를 처리하여 37℃에서 30분간 배양하고, 다시 세 차례 세척하고 반응 효소에 대하여 ECL(enhanced chemiluminescence, PIERCE)용액을 처리한 다음 X-ray 필름에 감광시켜 그 결과를 도 7a에 나타내었다.

상기 도 7a에 기재된 바와 같이, 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)에서만 약 70kDa의 PBP2a가 나타나 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)을 효과적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

<4-3> 본 발명의 단클론 항체를 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)검출(ELISA 이용)

상기 <실시예 4-1>에서 수득한 다양한 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 용해질을 웰당 10ng에서 시작해 단계적으로 PBS에 희석하여 Maxisorp 플레이트(Nunc.)에 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅하였다. 이후, 3% BSA/PBS로 37℃에서 추가로 1시간 더 배양하여 반응을 차단하였다. 이에 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 단클론 항체를 PBS로 희석하여 웰당 1ug씩 넣어 1시간 동안 배양하여 항원-항체 반응을 유도하였다. 이후, 세 차례 세척한 다음 결합된 항체는 산양 항-마우스 Ig-HRP(Horse radish peroxidase)를 처리하여 37℃에서 30분간 배양하고, 다시 세 차례 세척하고 반응 효소에 대하여 기질로 TMB 용액을 웰당 50ul로 처리하여 10분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 웰당 50ul로 처리하여 반응을 정지하고 발색반응을 450nm로 측정하였다. 상기 측정결과를 도 7b에 나타내었다.

상기 도 7b에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 단클론 항체는 약간의 차이는 있지만, 메치실린 감수성 황색포도상구균(MSSA) 보다 항원인 PBP2a가 존재하는 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)에서 높은 결합을 하는 것을 알 수 있었다.

<실시예 5>

본 발명의 단클론 항체 쌍을 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 검출

<5-1> 본 발명의 단클론 항체 쌍 선정

항체를 이용해 샌드위치(sandwich) ELISA, rapid kit같은 면역분석 방법에 적용하기 위해서는 하나의 항체가 아닌 두 개의 항체가 쌍을 이뤄 항원을 인지하여야 한다(After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman and Company, 2000), p. 162)(도 8a 및 8b 참조).

이에 본 발명자들은 상기 PBP2a 항원을 인지할 수 있는 가장 적합한 항체 쌍을 찾기 위해 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 단클론 항체를 capture로 웰당 100ng씩 PBS에 희석하여 Maxisorp 플레이트(Nunc.)에 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅하였다. 이후, 3% BSA/PBS 로 37℃에서 추가로 1시간 더 배양하여 반응을 차단하였다. 이에 His-PBP2a를 웰당 10ng씩 PBS로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 상기 코팅된 항체와 결합시켰다. 이후 이를 세 차례 세척한 후, 상기 단클론 항체에 비오틴(biotin)을 결합시킨 항체를 1:1000으로 PBS로 희석하여 웰당 100ul씩 넣어 1시간 동안 배양하여 항원에 결합시켰다. 이후 세 차례 세척한 후, 결합된 항원-항체 복합체는 스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP(Horse radish peroxidase)를 처리하여 37℃에서 30분간 배양하고, 다시 세 차례 세척하고 반응 효소에 대하여 기질로 TMB 용액을 웰당 50ul 처리하여 10분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 웰당 50ul 처리하여 반응을 정지하고 발색반응을 450nm에서 측정하였다. 상기 결과를 도 9a에 나타내었다.

상기 도 9a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체로 항체 쌍을 선정하고 이를 이용하는 경우에도 PBP2a 항원을 효과적으로 인지할 수 있음을 알 수 있었다. 특히 같은 농도의 His-PBP2a에 대하여 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 '6G10' 단클론 항체를 검출용으로 이용하고 '9C6' 단클론 항체를 코팅용으로 사용한 경우에 가장 잘 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

또한 '6G10' 단클론 항체를 검출용으로 선정하고 HRP(Horse radish peroxidase)를 결합시켜 비오틴 결합 항체 대신 바로 검출용으로 사용한 뒤 코팅용 항체에 따른 His-PBP2a에 대한 결합의 차이를 도 9b에 나타내었다.

상기 도 9b에 나타낸 바와 같이, 그 결과 항체 쌍마다 같은 농도의 His-PBP2a에 대한 결합에 차이를 나타냈으나, 본 발명의 단클론 항체는 PBP2a 항원을 효과적으로 인지할 수 있음을 알 수 있었다.

또한 His-PBP2a의 양을 단계적으로 희석한 뒤 항체 쌍 별로 결합 차이를 살피고 그 결과를 도 9c에 나타내었다.

상기 도 9c에 나타낸 바와 같이, His-PBP2a의 양을 단계적으로 희석한 뒤 항체 쌍 별로 반응의 크기에 차이가 있으나, 본 발명의 단클론 항체는 PBP2a 항원을 효과적으로 인지할 수 있음을 알 수 있었다.

<5-2> 본 발명의 단클론 항체 쌍을 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 검출(샌드위치 ELISA 이용)

상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 단클론 항체를 capture로 웰당 100ng씩 PBS에 희석하여 Maxisorp plate(Nunc.)에 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅시켰다. 이후, 3% BSA/PBS로 37℃에서 추가로 1시간 더 배양하여 반응을 차단하였다. 이에 대하여 상기 <실시예 4-1>에서 수득한 MRSA와 MSSA 용해질을 웰당 100ng씩 PBS로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅된 항체와 결합시켰다. 이후 세 차례 세척한 후, 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 '6G10'항체에 HRP(Horse radish peroxidase)를 결합시키고 PBS로 1:10000로 희석한 다음 웰당 100ul씩 넣어 1시간 동안 배양함으로써 항원에 결합시켰다. 이후 세 차례 세척한 후, 반응효소에 대하여 기질로 TMB 용액을 웰당 50ul로 처리하여 10분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 웰당 50ul 처리하여 반응을 정지한 다음 발색반응을 450nm로 측정하여 그 결과를 도 10a에 기재하였다.

상기 도 10a에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 본 발명의 항체로 MSSA와 MRSA를 효과적으로 구별함으로써 메치실린 내성 항색포도상구균을 효과적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다. 특히 코팅용으로 '17A10'단클론 항체와 검출용으로 '6G10' 단클론 항체를 이용하는 경우 메치실린 내성 항색포도상구균을 가장 잘 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

또한 상기 코팅용으로 '17A10'단클론 항체와 검출용으로 '6G10' 단클론 항체를 이용하여 4개의 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA), 1개의 메치실린 내성 코아굴라제 음성균(MR-CNS), 2개의 메치실린 감수성 황색포도상구균(MSSA), 및 2개의 메치실린 감수성 코아굴라제 음성균(MS-CNS)에서의 PBP2a의 존재여부를 상기와 같은 방법으로 측정하고 그 결과를 도 10b에 나타내었다.

상기 도 10b에 나타낸 바와 같이, PBP2a가 존재하는 MRSA와 MR-CNS에서 높은 값을 보이는 것을 확인하였다.

<5-3> 본 발명의 단클론 항체 쌍을 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 검출(면역크로마토그래피 분석법 이용)

본 발명자들은 본 발명의 단클론 항체 쌍이 검출용 항체를 gold conjugation하여 이용하는 측방 유동 면역 크로마토그래피(lateral flow immunographic assay)인 Rapid kit 형태로도 활용 가능한지 여부를 확인하였다.

구체적으로 본 발명의 단클론 항체 중 capture용 항체는 membrane에 코팅하고 검출용 항체는 gold conjugation 하여 건조 후 디바이스에 조립하였다. 조립된 디바이스에 상기 <실시예 4-1>에서 수득한 용해질을 100ul씩 넣어 전개 후 20분 뒤 확인하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.

상기 도 11에 나타낸 바와 같이 본 발명의 단클론 항체 쌍을 이용하여 PBP2a를 갖고 있는 MRSA와 MR-CNS에서 test line(T)의 양성 반응을 확인 할 수 있었다.

<실시예 6>

단백질 A에 특이적인 다클론 항체를 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 검출

<6-1> 단백질 A에 대한 다클론 항체의 선정

단백질 A의 경우 단백질 A가 항체의 Fc 부분에 결합하는 특성이 있기 때문에 항체를 이용한 단백질 A 구별에 장애가 있을 수 있으나 닭을 숙주로 하여 수득한 단백질 A에 대한 항체는 단백질 A에 대한 결합이 없는 것으로 알려져 있어 본 발명자들은 닭에서 수득한 항체(ABCPA-0500, Arista)를 이용하여 하기 실험을 진행하였다(Larsson A, Sjㆆquist J. 1989; 27(12):2856-7. J Clin Microbiol./Lindmark R, Sjㆆquist J. 1983; 62:1-13. J. Immunol.).

<6-2> 샌드위치 ELISA법 이용

상기 <실시예 6-1>에서와 같이 닭에서 수득한 단백질 A에 대한 다클론 항체(ABCPA-0500, Arista)를 capture로 웰당 100ng씩 PBS에 희석하여 Maxisorp 플레이트(Nunc.)에 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅하였다. 그 후, 3% BSA/PBS 로 37℃에서 추가로 1시간 더 배양하여 반응을 차단하였다. 이에 대하여 상기 <실시예 4-1>에서 수득한 용해질을 웰당 100ng씩 PBS로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅된 항체와 결합시켰다. 세 차례 세척한 후, 토끼 항-단백질 A-HRP 항체(Sigma)를 1:10000으로 PBS로 희석하여 웰당 100ul씩 넣어 1시간 동안 배양하여 항원에 결합시켰다. 세 차례 세척한 후, 반응 효소에 대하여 기질로 TMB 용액을 웰당 50ul 처리하여 10분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 웰당 50ul 처리하여 반응을 정지하고 발색반응을 450nm로 측정하여 그 측정결과를 도 12에 나타냈다.

상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 단백질 A가 존재하는 황색포도상구균 (MRSA, MSSA)에서 높은 값을 보이는 것을 확인 할 수 있었다.

<6-3> 면역크로마토그래피 분석법 이용

본 발명자들은 상기 <실시예 6-1>에서와 같이 닭에서 수득한 단백질 A에 대한 다클론 항체 쌍이 검출용 항체를 gold conjugation하여 이용하는 측방 유동 면역 크로마토그래피(lateral flow immunographic assay) 방법인 Rapid kit 형태로도 활용 가능한지 여부를 확인하였다.

구체적으로 상기 다클론 항체 중 capture용 항체는 membrane에 코팅하고 검출용 항체는 gold conjugation을 하여 건조 후 디바이스에 조립하였다. 상기 조립된 디바이스에 상기 <실시예 4-1>에서 수득한 용해질을 100ul씩 넣어 전개 후 20분 뒤 확인한 결과를 도 13에 나타냈다.

상기 도 13에 나타낸 바와 같이, 단백질 A가 존재하는 MRSA와 MSSA에서만 test line(T)의 양성 반응을 확인 할 수 있었다.

<실시예 7>

본 발명의 단클론 항체 및 단백질 A에 특이적인 다클론 항체를 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)의 검출

두 개의 웰을 하나의 쌍으로 하여 한 웰은 본 발명의 항-PBP2a 단클론 항체를 100ng씩 PBS에 희석하여 Maxisorp 플레이트(Nunc.)에 넣고, 다른 한 웰은 닭에서 수득한 항-단백질 A 다클론 항체를 100ng씩 PBS에 희석하여 Maxisorp 플레이트(Nunc.)에 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅시켰다. 그 후, 3% BSA/PBS로 37℃에서 추가로 1시간 더 배양하여 반응을 차단하였다. 이에 대하여 상기 <실시예 4-1>에서 수득한 용해질을 웰당 100ng씩 PBS로 희석하여 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅된 항체와 결합시켰다. 세 차례 세척한 후, '6G10' 항-PBP2a 단클론-HRP 항체를 1:10000으로 PBS로 희석하여 PBP2a 웰에 웰당 100ul씩 넣고, 토끼 항-Protein A-HRP 항체를 1:10000으로 PBS로 희석하여 단백질 A 웰에 웰당 100ul씩 넣어 1시간 동안 배양하여 항원에 결합시켰다. 세 차례 세척한 후, 반응 효소에 대하여 기질로 TMB 용액을 웰당 50ul 처리하여 10분간 반응시킨 후, 반응 정지액을 웰당 50ul 처리하여 반응을 정지하고 발색반응을 450nm로 측정하여 그 결과를 도 14a에 나타내었다.

상기 도 14a에 나타낸 바와 같이, PBP2a 및 단백질 A 항원에 대해 높은 반응을 보이는 균은 메치실린 내성 황색포도상 구균(MRSA)인 것을 알 수 있었다.

또한 측방 유동 면역 크로마토그래피(lateral flow immunographic assay)를 하기 위하여 각각의 코팅과 gold conjugate를 PBP2a용과 단백질 A용으로 조립한 후, 조립한 디바이스에 상기 <실시예 4-1>에서 수득한 용해질을 100ul씩 넣어 전개 후 20분 뒤 확인한 결과를 도 14b에 나타내었다.

상기 도 14b에 나타낸 바와 같이, PBP2a 및 단백질 A 항원에 대해 높은 반응을 보이는 균은 메치실린 내성 황색포도상 구균(MRSA)인 것을 알 수 있었다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 종간 페니실린 결합 단백질 2a(이하, PBP2a) 단백질의 염기서열의 상동성을 측정한 것이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 PBP2a 단백질을 가진 박테리아 중 황색포도상구균에 특이적인 단편을 선정하기 위하여 다양한 PBP2a 단백질 간의 상동성을 측정한 것이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 PBP2a 단백질 특이적 프라이머를 이용하여 얻은 폴리펩타이드를 박테리아에 발현시켜 전기영동한 사진이며, M은 175kDa, 83kDa, 62kDa, 47.5kDa, 32.5kDa, 26kDa 나타내는 마커이고, 1은 단백질이 발현되기 전을 나타내며, 2는 37kDa의 His-PBP2a가 발현된 것을 나타낸 것이고 3은 발현된 단백질을 정제하여 얻은 것을 나타낸다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따라, ELISA 법을 이용하여 His-PBP2a에 결합하는 항체가 생성되었는지를 음성 대조항원인 His-Coagulase와 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따라, His-PBP2a에 결합하는 본 발명의 단클론 항체들의 결합 정도를 나타내면, 도 5a는 His-PBP2a를 희석하여 ELISA 법으로 확인한 것을 나타낸 그래프이고 도 5b는 본 발명의 단클론 항체를 희석하여 ELISA 법으로 확인한 것을 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따라, 본 발명의 단클론 항체들의 단백질 A에 대한 결합 정도를 ELISA법으로 확인 한 것을 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA), 메치실린 감수성 황색포도상구균(MSSA), 및 메치실린 감수성 코아굴라제 음성균(MS-CNS)의 PBP2a 존재여부를 확인한 결과를 나타내며, 도 7a는 면역블랏을 이용한 결과를 나타내며, 도 7b는 ELISA법을 이용한 결과이다.

도 8은 샌드위치 ELISA(도 8a) 및 lateral flow immunographic assay (Rapid, 도 8b)의 원리를 나타낸 개략도이다.

도 9는 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 코팅용과 검출용 단클론 항체 쌍을 제작하고 이를 통해 PBP2a 항원을 검출할 수 있는지 여부를 보여주는 그래프이며, 도 9a는 검출용으로 비오틴을 결합한 본 발명의 단클론 항체를 사용한 샌드위치 ELISA법을 이용한 경우이고, 도 9b는 '6G10' 단클론 항체를 검출용으로 '9C6' 단클론 항체를 코팅용으로 사용한 경우이며, 도 9c는 His-PBP2a을 단계적으로 희석하면서 실험한 경우이다.

도 10은 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA법을 통해 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)을 구별할 수 있음을 나타낸 그래프이며, 도 10a는 본 발명의 단클론 항체 쌍으로 5개의 MRSA와 1개의 MSSA 용해질에 대한 샌드위치 ELISA법을 실시한 결과이고, 도 10b는 본 발명의 단클론 항체 쌍을 이용해 다양한 균주의 PBP2a의 존재여부를 샌드위치 ELISA법으로 측정한 결과이다.

도 11은 본 발명의 단클론 항체 쌍을 이용하여 lateral flow immunoassay를 실시한 결과를 나타낸 그림이다.

도 12는 항-단백질 A 다클론 항체를 이용하여 샌드위치 ELISA법을 이용해 단백질 A의 존재여부를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 13은 항-단백질 A 다클론 항체를 이용하여 lateral flow immunoassay를 실시한 그림이다.

도 14는 본 발명의 단클론 항체와 항-단백질 A 다클론 항체를 이용하여 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)를 검출한 결과를 나타낸 것이며 도 14a는 샌드위치 ELISA를 이용한 것이며, 도 14b는 lateral flow immunoassay를 이용한 것이다.

<110> DiNonA Inc. <120> ANTIBODY SPECIFIC TO METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS, DETECTION METHOD AND KIT FOR METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS USING THE SAME <130> DPP20085657KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MRSA Specific-PBP2a region <400> 1 Gly Ile Tyr Phe Tyr Ala Ser Lys Asp Lys Glu Ile Asn Asn Thr Ile 1 5 10 15 Asp Ala Ile Glu Asp Lys Asn Phe Lys Gln Val Tyr Lys Asp Ser Ser 20 25 30 Tyr Ile Ser Lys Ser Asp Asn Gly Glu Val Glu Met Thr Glu Arg Pro 35 40 45 Ile Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Val Lys Asp Ile Asn Ile Gln Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Lys Lys Val Ser Lys Asn Lys Lys Arg Val Asp Ala Gln 65 70 75 80 Tyr Lys Ile Lys Thr Asn Tyr Gly Asn Ile Asp Arg Asn Val Gln Phe 85 90 95 Asn Phe Val Lys Glu Asp Gly Met Trp Lys Leu Asp Trp Asp His Ser 100 105 110 Val Ile Ile Pro Gly Met Gln Lys Asp Gln Ser Ile His Ile Glu Asn 115 120 125 Leu Lys Ser Glu Arg Gly Lys Ile Leu Asp Arg Asn Asn Val Glu Leu 130 135 140 Ala Asn Thr Gly Thr His Met Arg Leu Gly Ile Val Pro Lys Asn Val 145 150 155 160 Ser Lys Lys Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Lys Glu Leu Ser Ile Ser Glu 165 170 175 Asp Tyr Ile Asn Asn Lys Trp Ile Lys Ile Gly Tyr Lys Met Ile Pro 180 185 190 Ser Phe His Phe Lys Thr Val Lys Lys Met Asp Glu Tyr Leu Ser Asp 195 200 205 Phe Ala Lys Lys Phe His Leu Thr Thr Asn Glu Thr Glu Ser Arg Asn 210 215 220 Tyr Pro Leu Glu Lys Ala Thr Ser His Leu Leu Gly Tyr Val Gly Pro 225 230 235 240 Ile Asn Ser Glu Glu Leu Lys Gln Lys Glu Tyr Lys Gly Tyr Lys Asp 245 250 255 Asp Ala Val Ile Gly Lys Lys Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Asp Lys Lys 260 265 270 Leu Gln His Glu Asp Gly Tyr Arg Val Thr Ile Val Asp Asp Asn Ser 275 280 285 Asn Thr Ile Ala His Thr Leu Ile Glu Lys Lys Lys Lys Asp Gly Lys 290 295 300 Asp Ile Gln Leu Thr Ile Asp Ala Lys Val Gln Lys Ser Ile Tyr Asn 305 310 315 320 Asn Met Lys Asn Asp Tyr Gly Ser Gly Thr 325 330 <210> 2 <211> 668 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PBP2a protein <400> 2 Met Lys Lys Ile Lys Ile Val Pro Leu Ile Leu Ile Val Val Val Val 1 5 10 15 Gly Phe Gly Ile Tyr Phe Tyr Ala Ser Lys Asp Lys Glu Ile Asn Asn 20 25 30 Thr Ile Asp Ala Ile Glu Asp Lys Asn Phe Lys Gln Val Tyr Lys Asp 35 40 45 Ser Ser Tyr Ile Ser Lys Ser Asp Asn Gly Glu Val Glu Met Thr Glu 50 55 60 Arg Pro Ile Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Val Lys Asp Ile Asn Ile 65 70 75 80 Gln Asp Arg Lys Ile Lys Lys Val Ser Lys Asn Lys Lys Arg Val Asp 85 90 95 Ala Gln Tyr Lys Ile Lys Thr Asn Tyr Gly Asn Ile Asp Arg Asn Val 100 105 110 Gln Phe Asn Phe Val Lys Glu Asp Gly Met Trp Lys Leu Asp Trp Asp 115 120 125 His Ser Val Ile Ile Pro Gly Met Gln Lys Asp Gln Ser Ile His Ile 130 135 140 Glu Asn Leu Lys Ser Glu Arg Gly Lys Ile Leu Asp Arg Asn Asn Val 145 150 155 160 Glu Leu Ala Asn Thr Gly Thr His Met Arg Leu Gly Ile Val Pro Lys 165 170 175 Asn Val Ser Lys Lys Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Lys Glu Leu Ser Ile 180 185 190 Ser Glu Asp Tyr Ile Asn Asn Lys Trp Ile Lys Ile Gly Tyr Lys Met 195 200 205 Ile Pro Ser Phe His Phe Lys Thr Val Lys Lys Met Asp Glu Tyr Leu 210 215 220 Ser Asp Phe Ala Lys Lys Phe His Leu Thr Thr Asn Glu Thr Glu Ser 225 230 235 240 Arg Asn Tyr Pro Leu Glu Lys Ala Thr Ser His Leu Leu Gly Tyr Val 245 250 255 Gly Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Lys Gln Lys Glu Tyr Lys Gly Tyr 260 265 270 Lys Asp Asp Ala Val Ile Gly Lys Lys Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Asp 275 280 285 Lys Lys Leu Gln His Glu Asp Gly Tyr Arg Val Thr Ile Val Asp Asp 290 295 300 Asn Ser Asn Thr Ile Ala His Thr Leu Ile Glu Lys Lys Lys Lys Asp 305 310 315 320 Gly Lys Asp Ile Gln Leu Thr Ile Asp Ala Lys Val Gln Lys Ser Ile 325 330 335 Tyr Asn Asn Met Lys Asn Asp Tyr Gly Ser Gly Thr Ala Ile His Pro 340 345 350 Gln Thr Gly Glu Leu Leu Ala Leu Val Ser Thr Pro Ser Tyr Asp Val 355 360 365 Tyr Pro Phe Met Tyr Gly Met Ser Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Leu Thr 370 375 380 Glu Asp Lys Lys Glu Pro Leu Leu Asn Lys Phe Gln Ile Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro Gly Ser Thr Gln Lys Ile Leu Thr Ala Met Ile Gly Leu Asn Asn 405 410 415 Lys Thr Leu Asp Asp Lys Thr Ser Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Gly Trp 420 425 430 Gln Lys Asp Lys Ser Trp Gly Gly Tyr Asn Val Thr Arg Tyr Glu Val 435 440 445 Val Asn Gly Asn Ile Asp Leu Lys Gln Ala Ile Glu Ser Ser Asp Asn 450 455 460 Ile Phe Phe Ala Arg Val Ala Leu Glu Leu Gly Ser Lys Lys Phe Glu 465 470 475 480 Lys Gly Met Lys Lys Leu Gly Val Gly Glu Asp Ile Pro Ser Asp Tyr 485 490 495 Pro Phe Tyr Asn Ala Gln Ile Ser Asn Lys Asn Leu Asp Asn Glu Ile 500 505 510 Leu Leu Ala Asp Ser Gly Tyr Gly Gln Gly Glu Ile Leu Ile Asn Pro 515 520 525 Val Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Ala Leu Glu Asn Asn Gly Asn Ile 530 535 540 Asn Ala Pro His Leu Leu Lys Asp Thr Lys Asn Lys Val Trp Lys Lys 545 550 555 560 Asn Ile Ile Ser Lys Glu Asn Ile Asn Leu Leu Asn Asp Gly Met Gln 565 570 575 Gln Val Val Asn Lys Thr His Lys Glu Asp Ile Tyr Arg Ser Tyr Ala 580 585 590 Asn Leu Ile Gly Lys Ser Gly Thr Ala Glu Leu Lys Met Lys Gln Gly 595 600 605 Glu Ser Gly Arg Gln Ile Gly Trp Phe Ile Ser Tyr Asp Lys Asp Asn 610 615 620 Pro Asn Met Met Met Ala Ile Asn Val Lys Asp Val Gln Asp Lys Gly 625 630 635 640 Met Ala Ser Tyr Asn Ala Lys Ile Ser Gly Lys Val Tyr Asp Glu Leu 645 650 655 Tyr Glu Asn Gly Asn Lys Lys Tyr Asp Ile Asp Glu 660 665 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MRSA Specific-PBP2a forwarding primer <400> 3 ggaattcggt atatattttt atgcttc 27 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MRSA Specific-PBP2a reverse primer <400> 4 tctcgagagt acctgagcca taatc 25

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 페니실린 결합 단백질(PBP2a)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 활성이 있으며 기탁번호 KCLRF-BP-00202, KCLRF-BP-00203 및 KCLRF-BP-00204으로 이루어진 군에서 선택된 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체.
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제1항의 단클론 항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00202, KCLRF-BP-00203 및 KCLRF-BP-00204으로 이루어진 군에서 선택된 하이브리도마 세포.
제1항의 단클론 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 각각 검체시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법.
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제4항에 있어서, 상기 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체는 단백질 A를 닭에 면역화하여 수득한 다클론 항체인 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법.
제4항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체 존재 여부를 확인하는 것은 방사성 면역분석법, 효소연관 면역분석법(ELISA), 샌드위치 면역분석법 및 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 이용하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법.
제1항의 단클론 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 키트.
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제9항에 있어서, 상기 키트는 효소연관 면역분석법(ELISA) 또는 측방 유동 면역 크로마토그래피 분석법(lateral flow immunographic assay)을 이용한 키트인 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 키트.
제1항의 단클론 항체와 단백질 A(protein A)에 특이적인 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 조성물.
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