KR100771584B1 - 메치실린-내성 황색포도상구균 특이적 항체, 상기 항체를이용하는 메치실린-내성 황색포도상구균 탐지방법, 및탐지키트 - Google Patents

메치실린-내성 황색포도상구균 특이적 항체, 상기 항체를이용하는 메치실린-내성 황색포도상구균 탐지방법, 및탐지키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메치실린 내성 황색포도상구균에서 특이적으로 발현되는 단백질에 대한 항체, 상기 항체를 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법 및 팀지키트에 관한 것으로, 메치실린 내성 황색포도상구균을 신속하게 검출함으로써 별도의 세균배양 시간이 소요되지 않아 신속하게 상기 세균의 감염여부를 판단할 수 있고, 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 단백질에 특이적 항체를 이용함으로써 메치실린 내성 응고효소 음성 포도상구균의 감염과 구별하여 메치실린 내성 황색포도상구균의 감염여부를 정확하게 판단하기 위하여 이용될 수 있다.
메치실린 내성 황색포도상구균, PBP2a, 코아굴라제, 항체.

Description

메치실린-내성 황색포도상구균 특이적 항체, 상기 항체를 이용하는 메치실린-내성 황색포도상구균 탐지방법, 및 탐지키트{ANTIBODY SPECIFIC TO METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS, DETECTION METHOD AND KIT FOR METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS USING THE SAME}
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)종간의 페니실린 결합단백질 2a(이하, PBP2a) 단백질의 염기서열의 상동성을 측정한 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 PBP2a 단백질을 가진 박테리아 중 황색포도상구균에 특이적인 단편을 선정하기 위하여 다양한 PBP2a 단백질 상동성을 측정한 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 코아굴라제 단백질 중 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)에 특이적인 단편을 선정하기 위하여 다양한 코아글라제의 상동성 및 존재위치를 측정한 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 PBP2a 및 코아굴라제 단백질 특이적 프라이머를 이용하여 얻은 폴리펩타이드를 전기영동한 사진이며, M은 82kDa 및 48kDa을 나타내는 마커이고, A는 PBP2a-GBT 융합단백질을 나타내는 것이며, B는 코아굴라제-GBT 융합단백질을 나타낸다.
도 5A 내지 5C는 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA), 메치실린내성 코아굴라제 음성균(MR-CNS), 메치실린 감수성 황색포도구균(MSSA), 및 메치실린 감수성 코아굴라제 음성균(MS-CNS)에서의 페니실린 결합단백질 2A 및 코아굴라제의 존재여부를 ELISA법으로 측정한 결과를 보여주는 그래프이며, 도 5A는 페니실린 결합단백질 2A에 대한 것이고, 도 5B는 코아굴라제에 대한 것이며, 및 도 5C는 두가지 단백질을 모두 포함하는 경우에 대한 결과이다.
[산업상 이용분야]
본 발명은 메치실린 내성 황색포도상구균에서 특이적으로 발현되는 단백질에 대한 항체, 상기 항체를 이용한 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법 및 탐지방법에 관한 것으로, 메치실린 내성 응고효소 음성 포도상구균의 감염과 구별하여 메치실린 내성 황색포도상구균을 신속하고 정확하게 탐지할 수 있다.
[종래기술]
황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus)은 병원내 및 병원외에서 가장 빈번히 감염을 일으키는 균으로 알려져 있다. 또한, 상기 황색포도상구균 중 대표적인 세균은 메치실린 내성 황색포도상구균(Methicillin resistant Staphylococcus aureus, 이하 'MRSA'), 메치실린내성 코아굴라제 음성균(Methicillin resistant coagulase negative Staphylococcus, MR-CNS), 메치실린 감수성 황색포도구균(Methilcillin sensitive Staphylococcus aureus, MSSA), 및 메치실린 감수성 코아굴라제 음성균(Methilcillin sensitive coagulase negative Staphylococcus, MS-CNS) 등이 있다. 이중 MRSA는 병원에서 다량으로 발견되며 면역력이 적은 환자들이 많이 보유하고 있는 균으로, 상기 균에 대한 항균제도 많이 발달되지 아니하여 환자 중 상기 세균의 감염율이 높은 실정이다.
현재 상기 MRSA를 진단하는 방법으로 1) 균을 배양하여 항균제 감수성 검사를 시행하거나 2) 균을 배양하여 균 집락에서 직접 MRSA에 특별한 유전자를 검출하거나 3) MRSA에 특별한 단백질을 검출하는 방법이다. 그 중에서 대부분의 병원에서는 1)의 방법으로 탐지하며 이때 검사시간이 최소 2일에서 3일 정도 소요되는 단점이 있다. 또한, 배양된 균을 이용하여 황색포도상구균이 특이적으로 생산하는 단백질의 존재여부에 의하여 감염여부를 판단하는 방법은, 소규모 병원에서 실시하기 어려운 실정이다. 이와 같은 경우에는 1 내지 2일이 더욱 소요될 수 있어 검사를 하지 아니하고 항균제를 사용하는 경우도 있다. 2) 및 3) 의 경우는 그 과정이 복잡하여 일반 검사실에서는 시행되지 아니하고 연구목적으로만 시행하고 있는 실정이다.
따라서, MRSA에 감염되었는지 여부의 판단이 늦어지는 경우가 많아 치료시기가 늦어지거나 잘못된 항균제를 사용하는 경우가 발생하여, 신속하고 정확한 MRSA 감염여부를 판단할 수 있는 탐지키트 및 탐지방법이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 메치실린 내성 황색포도상구균의 특이적인 단백질을 항원으로 하여 얻어진 항체를 이용하여 상기 세균에의 감염여부를 신속하고 정확하게 탐지할 수 있는 탐지키트 및 탐지방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 페니실린 결합단백질 2A(PBP2a)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 항체에 관한 것이다.
바람직하게는 상기 폴리펩타이드를 마우스에 면역화하여 얻어진 폴리클로날 항체인 것인 항체일 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성균에 특이적인 페니실린 결합단백질 2A의 단편과 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Glutathione-S-Transferase, GST)의 융합펩타이드인 항체이다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 코아굴라제(coagulase) 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 항체에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 폴리펩타이드를 마우스에 면역화하여 얻어진 폴리클로날 항체인 것인 항체이며, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 황색포도상구균에 특이적인 코아굴라제(coagulase) 단백질의 단편과 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Glutathione-S-Transferase, GST)의 융합펩타이드인 항체이다.
또한, 본 발명은 상기 PBP2a 특이적 항체와, 상기 코아굴라제 특이적 항체를 각각 검체시료와 항원-항체 반응을 수행하는 단계; 및
상기 항원-항체 반응의 결과를 면역분석법으로 분석하여 PBP2a 특이적 항체에 대한 양성반응 및 코아굴라제 특이적 항체에 대한 양성반응을 나타내는 시료를 메치실린 내성 황색포도상구균 양성으로 판단하는 단계를 포함하는, 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법에 관한 것이다. 상기 검체시료는 혈액, 객담, 또는 소변일 수 있으며, 상기 면역분석법은 항체를 이용한 방사성 면역분석법, 효소-연관 면역분석법(ELISA), 또는 샌드위치 면역분석법일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 PBP2a 특이적 항체와, 상기 코아굴라제 특이적 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지용 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 키트는 고체상 지지체; 상기 PBP2a 특이적 항체와 상기 코아굴라제 특이적 항체; 및 기질과의 반응을 위한 효소표지항체액 및 효소반응을 나타내는 발색액을 함유하는 효소-연관 면역분석용 (ELSIA) 반응액을 포함하는, 메치실린 내성 황색포도상구균 항원 검출용 탐지키트일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 PBP2a 특이적 항체와, 상기 코아굴라제 특이적 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지용 시약 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
포도상구균(Staphylococcus aureus)은 그람양성의 균으로 비운동성 및 아포비형성성의 특징을 가지며, 특히 황색포도상구균은 병원성이 높은 균으로 식중독의 주된 원인이 되며 화농성의 대표적인 병원균이다. 상기 황색포도상구균은 열에 안 정적인 특징을 가져 고온처리하는 경우에도 상기 세균의 감염을 방지하기 어렵다.
본 발명은 별도의 균 배양없이 MRSA가 특이적으로 생산하는 단백질에 대한 항체를 이용하여 항원-항체 반응으로 황색포도상구균의 감염여부를 신속하고 정확하게 판단하는 탐지키트 및 상기 세균 감염여부의 탐지방법을 제공하며, 바람직하게는, MRSA에 특이적으로 생산하는 두 가지의 단백질에 대한 항체를 이용하여 MRSA 감염여부를 신속하고 정확하게 판단하는 탐지키트 및 상기 세균 감염여부의 탐지방법을 제공할 수 있다. 패혈증은 병원내 사망의 중요한 원인이며, 이 중 MRSA가 차지하는 비율이 높아 혈액 배양병에서 균이 증식하고 있다는 신호가 검출되는 경우, MRSA 균의 존재여부를 검토함으로써 패혈증의 신속한 탐지가 가능하게 된다. 또한, 중이염, 창상감염, 폐렴 등의 질병에 있어서 MRSA는 주요한 원인균으로, 상기 MRSA의 감염에 의하여 질병의 존재여부를 신속하게 판단할 수 있다.
상기 MRSA는 페니실린 결합단백질 2A(penicillin-binding protein 2A, 이하 'PBP2a')을 발현하는 mec-A 유전자를 가지고 있으며, 상기 단백질은 b-lactam 계열 항균제(penicillin, oxacillin, methicillin, cephalosporin 등)에 내성을 보인다. 상기 PBP2a는 MRSA 뿐만 아니라, MR-CNS 균에서도 포함되는 단백질이다.
또한, 코아굴라제(coagulase)는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 특이적으로 발현되는 단백질로, 상기 황색포도상구균의 종류에서 MRSA 및 MSSA 균에서 발현되나 MR-CNS 및 MS-CNS에서는 생성되지 아니하는 단백질이다.
따라서, PBP2a 및 코아굴라제 두종류의 단백질 모두에 양성반응을 보이는 경우 메치실린-내성 황색포도상구균에 감염되었음을 탐지할 수 있다.
MRSA의 감염여부를 신속하고 정확하게 판단하기 위하여 본 발명에서는 MRSA, 다른 박테리아종 및 다른 종류의 생물체들이 가지고 있는 유사 단백질 간의 아미노산 서열 상동성을 분석하여 다른 박테리아 종 또는 생물체의 유사 단백질과의 상동성은 낮으며 MRSA 종간에는 상동성이 높은, 즉, MRSA PBP2a 또는 MRSA 코아굴라제 특이적인 서열 부위를 선정하여 항원으로 사용할 수 있다.
본 발명의 항-메치실린 내성 포도상구균 항체는 상기 MRSA PBP2a 및 MRSA 코아굴라제를 항원으로 하여 얻어진 것일 수 있으며, 바람직하게 상기 MRSA PBP2a 단백질은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 것이고, MRSA 코아굴라제 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 항원일 수 있다.
또한, 상기 본 발명에서 항원으로 사용한 PBP2a 및 코아굴라제 단백질 조각은 상기 MRSA 균으로부터 정제할 수 있으며, 또는 벡터 등을 이용하여 재조합 단백질로 제조할 수 있다. 바람직하게는 EcoRⅠ 및 XhoⅠ 제한효소를 이용하여 벡터에 클로닝하여 얻을 수 있다.
본 발명의 메치실린 내성 황색포도상구균 감염여부의 탐지방법은 상기 MRSA PBP2a 또는 MRSA 코아굴라제 특이적으로 선정된 서열을 PCR 법으로 증폭하여 재조합 단백질을 제조하고, 상기 재조합 단백질에 대한 항체를 제작할 수 있다. 바람직하게는 상기 MRSA PBP2a 또는 MRSA 코아굴라제 단백질 항원은 각각 SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 메치실린 내성 황색포도상구균 감염여부 탐지방법은 상기 PBP2a 특이적 항체와, 상기 코아굴라제 특이적 항체를 각각 검체시료와 항원-항체 반응을 수행하 는 단계; 및 상기 항원-항체 반응의 결과를 면역분석법으로 분석하여 PBP2a 특이적 항체에 대한 양성반응 및 코아굴라제 특이적 항체에 대한 양성반응을 나타내는 시료를 메치실린 내성 황색포도상구균 양성으로 판단하는 단계를 포함한다.
구체적인 일예에서, 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법은 상세하게는 ⅰ) 메치실린 내성 황색포도상구균으로부터 PBP2a 및 코아굴라제(coagulase) 단백질 발현시키는 단계; ⅱ) 상기 단백질을 이용하여 마우스의 혈청으로부터 두 종류의 항원에 대한 항-메치실린 내성 황색포도상구균 폴리클로날 항체를 확보하는 단계; ⅲ) 상기 두 종류의 항원에 대한 폴리클로날 항체를 사람의 혈액이나 객담, 소변에 주입하여 항원-항체 반응을 수행하는 단계; ⅳ) 상기 항원-항체 반응을 수행한 혈액, 객담, 또는 소변이 희석된 용액에 TMB 용액을 처리하여 메치실린 내성 황색포도상구균에 감염된 혈액, 객담, 또는 소변을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 메치실린 내성 황색포도상구균 감염여부 탐지키트는 상기의 방법으로 얻어진 항원 및 항체를 이용할 수 있다. 상기 탐지키트는 상기 PBP2a 특이적 항체와, 상기 코아굴라제 특이적 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지용 키트에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 키트는 고체상 지지체; 상기 PBP2a 특이적 항체와 상기 코아굴라제 특이적 항체; 및 기질과의 반응을 위한 효소표지항체액 및 효소반응을 나타내는 발색액을 함유하는 효소-연관 면역분석용 (ELSIA) 반응액을 포함하는, 메치실린 내성 황색포도상구균 항원 검출용 탐지키트일 수 있다.
본 발명의 일예에서, 상기 탐지키트는 ⅰ) 동물의 혈액의 항혈청으로부터 정 제한 항체가 피복된 항체고상화플레이트 ⅱ) 검체를 희석하기위한 완충용액 ⅲ) 기질과의 반응을 위한 효소표지항체액 ⅳ) 전혈중 혈청성분만을 분리시키는 완충성분액 ⅴ) 반응을 나타내는 발색액 ⅵ) 반응을 차단하는 반응차단용액을 포함할 수 있다.
상기 항- 메치실린 내성 황색포도상구균 항체는 메치실린 내성 황색포도상구균이 특이적으로 포함하는 PBP2a 단백질 및 코아굴라제(coagulase) 단백질을 항원으로 하여 이를 동물에 면역시켜 동물의 혈청에서 정제할 수 있으며, 상기 동물은 마우스 일 수 있다.
상기 PBP2a 단백질은 황색포도상구균이 특이적으로 생성하는 단백질로, 이는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 코딩될 수 있다. 또한, 60 내지 70kDa의 분자량을 가지며, pH 5 내지 9　및 4 내지 37℃의 온도에서 안정하다.
상기 코아굴라제(coagulase) 단백질은 황색포도상구균이 특이적으로 생성하는 단백질로, 상기 PBP2a 단백질과 달리 황색포도상구균 중 특히 메치실린 내성 황색포도상구균이 특이적으로 생성하는 단백질이며, 이는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 코딩될 수 있다. 또한, 40 내지 50 kDa의 분자량을 가지며, pH 5 내지 9　및 4 내지 37℃의 온도에서 안정하다.
상기 항-황색포도상구균 항원은 플레이트 웰당 100 내지 600 ng/㎖으로 피복시킬 수 있으며, 상기 항원고상화플레이트는 통상적인 방법에 의하여 제조되며 Nunc사의 Maxisorp 플레이트나 Polysorp 플레이트, Greiner사의 Immunoplate, Pierce사의 Immunoplate 등을 포함할 수 있다.
상기 검체를 희석하기 위한 완충용액은 BSA, Normal goat serum, casein, skim milk 및 Tween-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 탐지키트에 있어서, 효소표지항체액은 goat anti-mouse Ig -HRP로 적정농도에서 플레이트 웰당 50 내지 150㎕가 포함될 수 있으며, 발색액은 테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine, TMB)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 반응차단용액은 1N HCl 또는 1N H2SO4으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 황색포도상구균 특이적 항체 제작
1-1: PBP2a 단백질의 특이적 부분 선정
먼저 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)종간의 PBP2a 단백질의 염기서열의 상동성을 ExPASy Proteomics Server의 SIB BLAST Network Service(http://au.expasy.org/tools/blast/)을 이용하여 측정하였으며, 이의 결과를 하기 도 1에 나타냈다.
도 1의 연두색이 상동성이 높음을 나타나며, 연두색으로 표시된 것은 모두 PBP2a 단백질을 가진 박테리아로 나타났다. 이들 PBP2a 단백질을 가진 박테리아 중에서 황색포도상구균과 상동성이 낮은 부분을 선정하기 위하여 ExPASy Proteomics Server의 SIB BLAST Network Service(http://au.expasy.org/tools/blast/)을 이용하여 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, N-말단의 경우 상동성이 낮게 나타났으며, C-말단의 경우는 상대적으로 상동성이 높게 나타났다. 또한, 단백질 기능을 나타내는 C-말단의 트랜스펩티다아제인 경우, 유사 PBP2a 단백질간의 상동성이 높은 것으로 나타났다. 따라서, 메치실린 내성 황색포도상구균의 PBP2a 단백질에 특이적인 부분으로 SEQ ID NO:1의 N-말단 부분을 선정하였다. 또한, PBP2a 단백질 전체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3과 같다.
1-2: 코아글라아제 단백질 특이적 부분의 선정
메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA)에 특이적인 코아글라아제 단백질 부분을 선정하기 위하여 ExPASy Proteomics Server의 SIB BLAST Network Service(http://au.expasy.org/tools/blast/)를 이용하여 황색포도상구균에 존재하는 코아굴라제 단백질 서열의 존재여부 및 존재시 위치를 검색하여 도 3에 나타냈다.
도 3에 나타나듯이, MRSA에 특이적인 코아글라아제의 아미노산 서열은 C-말단 부분으로 SEQ ID NO:2에 기재하였다. 또한, 코아글라아제 단백질 전체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4와 같다.
1-３: PBP2a 및 코아굴라제 항원의 확보
하기 표 1의 PBP2a 특이적 프라이머를 이용하여 포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus, 이하 'MRSA') 콜로니로부터 유전자 DNA를 분리 하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물인 988bp의 염기를 EcoRⅠ 및 XhoⅠ 제한효소를 이용하여 pGEX 4T-1 벡터에 클로닝하여 단백질을 발현시켰다.
또한, 하기 표 1의 코아굴라제(coagulase) 특이적 프라이머를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 단백질을 발현시켰으며, 상기 PBP2a 및 코아굴라제 단백질을 전기영동법으로 관찰하여 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타나듯이, PBP2a 특이적 프라이머를 이용한 경우는 약 63kDa(37kDa + 26kDa;GST protein size)의 단백질을 발현시켰으며, 코아굴라제 특이적 프라이머를 이용한 경우는 약 44Da (18kDa + 26kDa;GST)의 단백질을 발현됨을 알 수 있었다.
PBP2a 단백질 특이적 프라이머 정방향 서열번호５ 5'-GGAATTCGGTATATATTTTTATGCTTC-3'
역방향 서열번호６ 5'-TCTCGAGAGTACCTGAGCCATAATC-3'
코아굴라제　단백질 특이적 프라이머 정방향 서열번호７ 5'-ATGAATTCGCGAGACCAAGATTC-3'
역방향 서열번호８ 5'-TACTCGAGTTATTTTGTTACTCTAG-3'
1-４: PBP2a 및 코아굴라제에 대한 폴리클로날 항체 제작
6주령의 암컷 Balb/c 에 마우스 한 마리당 50㎍의 상기 실시예 1-1의 PBP2a 및 코아굴라제 재조합 단백질을 복강(intraperitoeal cavity, IP)으로 주입하였다. 이때, 항원보강제는 Freund's 항원보강제를 사용하였으며, 한달 간격으로 세 차례 면역화한 후 마우스 꼬리의 혈관으로부터 채혈하여 채혈된 혈액을 2~3분간 14000rpm으로 원심분리하여 상층액을 취함으로써 혈청을 분리하여 PBP2a 및 코아굴라제 두 종류의 항원에 대한 항체를 모두 포함하는 폴리클로날 항체를 얻었다. 상기 폴리클로날 항체의 항원에 대한 역가는 재조합 항원을 코팅하여 간접 ELISA를 통하여 확인하여 하기 표 2에 나타냈다.
혈청 희석 항원역가
PBP2a Coagulase
2000 0.985 1.311
4000 0.767 1.03
8000 0.505 0.669
16000 0.292 0.396
32000 0.166 0.219
64000 0.097 0.12
128000 0.065 0.064
256000 0.072 0.04
실시예 2: MRSA 특이적인 반응의 확인
2-1: MRSA 관련 그룹의 용해질 분리
MRSA, 메치실린내성 코아글라아제 음성균(Methicillin resistant coagulase negative Staphylococcus, MR-CNS), 메치실린 감수성 황색포도구균(Methilcillin sensitive Staphylococcus aureus, MSSA), 메티실린 감수성 코아글라아제 음성균(Methilcillin sensitive coagulase negative Staphylococcus, MS-CNS)를 사람의 객담, 혈액 또는 소변으로부터 준비하여 각각 10㎕씩 배양접시(blood agar plate)에 분주하고 37℃ 온도로 24시간 동안 5% CO2 배양기에서 배양하여 콜로니 상태로 배양된 세균을 각각 얻었다.
플레이트 배지 상에 있는 각각의 콜로니를 펼치개(spreader)로 긁어 모아 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 2회 세척한 후, 세균 용해 버퍼(bacterial lysis buffer, B-PER buffer, Pierce)에 부유하여 30분간 배양하였다. 그 후, 동결-해동을 영하 70℃ 온도로 2번 시행하고 원심분리(14,000rpm, 25분)하였다. 원심분리 후 상층액을 취하여 각각의 세균에 대한 용해질을 확보하였으며, 브래드포드 실험으로 단백질 정량을 수행하여 하기 표 3에 나타냈다.
* A562 Values 　 　 　
　 MRSA MS-CNS MR-CNS MSSA
원액 1.436 0.743 1.122 1.158
1/2 diluent 0.848 0.45 0.669 0.628
1/4 diluent 0.571 0.283 0.428 0.401
* 농도(mg/ml) 　
원액 1,620.3 785.7 1,242.2 1,285.5
1/2 diluent 1,824.3 865.6 1,393.1 1,294.4
1/4 diluent 2,314.2 926.7 1,625.3 1,495.2
평균 1,919.6 859.3 1,420.2 1,358.4
2-2: ELISA를 통한 MRSA 특이적 반응의 확인
MRSA, MR-CNS, MSSA, MS-CNS 용해질 각각을 세균별로 두개의 웰을 준비하고, 웰 당 400ng 씩 PBS에 희석하여 Maxisorp plate(Nunc.)에 넣고 37℃에서 1시간씩 배양하여 코팅시켰다. 그 후, 3% BSA/PBS 로 37℃에서 추가로 1시간 더 배양하여 반응을 차단하였다.
이에 대하여 PBP2a 에 대한 폴리세라(polysera)항체를 3% BSA/PBS를 차단 용액으로 하여 위에서 분리한 혈청원액으로부터 1:4000으로 희석하였으며, 동일 차단용액을 사용하여 1:8000으로 희석한 코아글라아제 폴리세라(polysera)항체를 각각 상기 병원균에 처리하고 1시간동안 배양하여 항체를 결합시켰다.
네 차례 세척한 후, 결합된 항체는 산양 항-마우스 Ig-HRP를 처리하여 37℃에서 30분간 배양하고, 다시 네 차례 세척하고 반응 효소에 대하여 기질로 TMB 용액을 웰당 100 ul 처리하여 10분간 반응시킨 후, 반응정지액을 웰당 100 ul 처리하여 반응을 정지하고 발색반응을 450nm로 측정하여 폴리세라 항체별 측정결과를 도 5A 및 도 5B에 나타냈다. 또한, 도 5C에서는 PBP2a 및 코아글라아제 폴리세라 항체를 동시에 처리한 경우의 MRSA, MR-CNS, MSSA 및 MS-CNS 균에 대한 검출결과를 나타냈다.
도 5A 및 도 5B에 나타나듯이, MRSA에서 OD 값이 1.312로 PBP2a에 대하여 강한 양성반응이 나타났고, MR-CNS는 0.372로 비교적 낮지만 역시 PBP2a에 대하여 양성반응을 나타냈다. MR-CNS의 PBP2a에 대한 반응이 약한 것은 본발명의 PBP2a에 대한 폴리세라가 MRSA 특이적인 PBP2a 일부분을 재조합하여 만들어 항체를 제조하였기 때문이다. 반면, MSSA 및 MS-CNS는 알려져 있는대로 음성치를 나타냈다.
코아굴라제에 대하여는 MRSA 및 MSSA가 각각 OD 값 1.117 과 1.446으로 높게 나왔으며, MR-CNS와 MS-CNS는 음성값을 나타냈다. MR-CNS 및 MS-CNS에서 OD 값이 0.407, 0.453으로 나온 것은 코아굴라제 폴리세라의 고정값이 높았기 때문으로 사료된다.
도 5C에서 나타나듯이, MRSA만이 PBP2a 및 코아굴라제에 대하여 더블 양성반응을 보이고, MR-CNS는 PBP2a만 양성인 싱글 양성반응, MSSA는 코아굴라제만이 양성인 싱글 양성반응, 그리고 MS-CNS의 경우는 두 단백질이 모두 음성인 더블 음성반응을 나타내며, 이는 표 4의 결과와 일치한다.
MRSA MR-CNS MSSA MS-CNS
PBP2a + + - -
Coagulase + - + -
따라서, 본 발명의 진단키트와 같이 PBP2a 뿐만 아니라, 코아굴라제에 대한 더블 진단 마커를 항체로 사용하여 항원-항체 반응을 진행함으로써 황색포도상구균 그 중에서도 특히 MRSA 균을 효과적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 메치실린 내성 황색포도상구균의 검출용 탐지키트 및 메치실린 내성 황색포도상구균의 포함여부 탐지방법은 PBP2a 및 코아굴라제 단백질을 항원으로 하여 이에 특이적인 항체를 이용함으로써 별도의 균 배양시간이 소모되지 아니하여 신속하고 정확한 황색포도상구균의 검출여부를 판단할 수 있는 효과를 갖는다.
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  7. 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 페니실린 결합단백질 2A(PBP2a) 특이적 항체와, 코아굴라제 특이적 항체를 각각 검체시료와 항원-항체 반응을 수행하는 단계; 및
    상기 항원-항체 반응의 결과를 면역분석법으로 분석하여 PBP2a 특이적 항체에 대한 양성반응 및 코아굴라제 특이적 항체에 대한 양성반응을 나타내는 시료를 메치실린 내성 황색포도상구균 양성으로 판단하는 단계를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법으로서,
    상기 PBP2a 특이적 항체는
    a) SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 페니실린 결합단백질 2A(PBP2a)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 항체;
    b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성균에 특이적인 페니실린 결합단백질 2A의 단편과 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-Transferase, GST)의 융합펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 항체; 또는
    c) 상기 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 PBP2a의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 또는 상기 융합펩타이드를 마우스에 면역화하여 얻어진 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 폴리클로날 항체이고,
    상기 코아굴라제 특이적 항체는
    d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 코아굴라제(coagulase)단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 항체;
    e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 코아굴라제(coagulase)단백질의 단편과 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-Transferase, GST)의 융합펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 항체; 또는
    f) 상기 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 코아굴라제 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 상기 융합펩타이드를 마우스에 면역화하여 얻어진 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 폴리클로날 항체인,
    메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 검체시료는 혈액, 객담, 또는 소변인 것인 탐지방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 면역분석법은 항체를 이용한 방사성 면역분석법, 효소-연관 면역분석법(ELISA), 또는 샌드위치 면역분석법인 탐지방법.
  10. 페니실린 결합단백질 2A(PBP2a) 항체와, 코아굴라제 특이적 항체를 포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지용 키트로서,
    상기 PBP2a 특이적 항체는
    a) SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 페니실린 결합단백질 2A(PBP2a)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 항체;
    b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성균에 특이적인 페니실린 결합단백질 2A의 단편과 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-Transferase, GST)의 융합펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 항체; 또는
    c) 상기 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 PBP2a의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 또는 상기 융합펩타이드를 마우스에 면역화하여 얻어진 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 폴리클로날 항체이고,
    상기 코아굴라제 특이적 항체는
    d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 코아굴라제(coagulase)단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 항체;
    e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 코아굴라제(coagulase)단백질의 단편과 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-Transferase, GST)의 융합펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 항체; 또는
    f) 상기 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 코아굴라제 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 상기 융합펩타이드를 마우스에 면역화하여 얻어진 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 폴리클로날 항체인,
    메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지용 키트
  11. 제 10항에 있어서, 상기 키트는
    고체상 지지체;
    상기 PBP2a 특이적 항체와 상기 코아굴라제 특이적 항체; 및
    기질과의 반응을 위한 효소표지항체액 및 효소반응을 나타내는 발색액을 함유하는 효소-연관 면역분석용(ELISA) 반응액을 포함하는, 메치실린 내성 황색포도상구균의 탐지용 키트.
  12. 페니실린 결합단백질 2A(PBP2a) 항체와, 코아굴라제 특이적 항체를 포함하는포함하는 메치실린 내성 황색포도상구균 검출용 시약 조성물로서,
    상기 PBP2a 특이적 항체는
    a) SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 페니실린 결합단백질 2A(PBP2a)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 항체;
    b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성균에 특이적인 페니실린 결합단백질 2A의 단편과 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-Transferase, GST)의 융합펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 항체; 또는
    c) 상기 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 PBP2a의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 또는 상기 융합펩타이드를 마우스에 면역화하여 얻어진 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 PBP2a 특이적 폴리클로날 항체이고,
    상기 코아굴라제 특이적 항체는
    d) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 코아굴라제(coagulase)단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 항체;
    e) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 메치실린 내성 황색포도상구균에 특이적인 코아굴라제(coagulase)단백질의 단편과 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-Transferase, GST)의 융합펩타이드를 항원으로 하여 얻어진, 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 항체; 또는
    f) 상기 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 코아굴라제 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 상기 융합펩타이드를 마우스에 면역화하여 얻어진 메치실린 내성 황색포도상구균 탐지용 코아굴라제 특이적 폴리클로날 항체인,
    메치실린 내성 황색포도상구균 검출용 시약 조성물.
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