KR102212636B1 - 페스트균 f1 캡슐 단백질에 특이적인 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 1h4, 및 이를 이용한 페스트균 진단 키트 - Google Patents

페스트균 f1 캡슐 단백질에 특이적인 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 1h4, 및 이를 이용한 페스트균 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페스트균(Yersinia pestis) 캡슐 단백질 F1에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 1H4, 상기 항체를 이용한 페스트균 검출용 키트 및 페스트균 검출 방법에 관한 것이다.

Description

페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적인 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 1H4, 및 이를 이용한 페스트균 진단 키트{AN ANTIBODY SPECIFIC FOR F1 CAPSULE PROTEIN OF YERSINIA PESTIS, HYBRIDOMA CELL LINE 1H4 PRODUCING THE SAME, AND A KIT FOR DETECTING YERSINIA PESTIS USING THE SAME}
본 발명은 페스트균(Yersinia pestis) 캡슐 단백질 F1에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 1H4, 상기 항체를 이용한 페스트균 검출용 키트 및 페스트균 검출 방법에 관한 것이다.
페스트의 원인균은 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)로 막대모양의 운동성이 없는, 포자를 형성하지 않는 그람 음성의 통성 혐기성 세균으로 높은 감염률과 치사율로 인하여 생물테러에 사용될 가능성이 높은 고위험병원체이다. 페스트균은 숙주 동물인 쥐에 기생하는 벼룩에 의해 사람에게 전파되는 것으로 알려져 있으나 인수 공통 감염병이나 사람간 전파도 일어날 수 있으며, 감염성 비말을 통하여 전파가 가능한 질환이다. 페스트균에 감염되면 주로 림프절이 붓고 급속한 발열이 동반되는 증상이 발생한다. 페스트는 크게 림프절 페스트, 폐 페스트 및 패혈증 페스트로 분류된다.
림프절 페스트는 림프절에 발생하는 페스트로 발열, 오한, 권태감, 근육통, 구역, 허탈, 인후통, 두통 등이 발생하며, 같은 날 혹은 다음날에는 벼룩에 물린 부위 (90%는 서혜부)의 림프절이 붓고, 종창은 진행하여 농양이 된다. 그 후 균혈증이 일어나 전신으로 퍼지며 심한 경우에는 2∼4일 만에 패혈증으로 사망한다. 치료받지 않은 림프절 페스트 환자의 사망률은 50∼60%에 이르지만, 치료하면 사망률은 5%로 감소한다. 림프절 페스트는 림프절 페스트 환자의 고름에 직접 접촉하지 않으면, 사람에서 사람으로 전파되지 않는다.
폐 페스트는 병원체를 흡입하여 발생하는 원발성 폐 페스트와 패혈증을 일으킨 병원체가 혈액을 타고 폐로 전파되는 속발성 폐 페스트로 나뉜다. 폐를 침범하여 폐렴, 흉수, 종격동염을 일으키며, 하루 만에 환자를 사망하게 하여 3가지 페스트 중 가장 치명적이다.
패혈증 페스트는 림프절 페스트에서 진행하는 경우와 국소 증상 없이 혈행성으로 퍼지는 일차성 패혈증 페스트가 있다. 수막염, 폐렴, 흉막염, 종격동염을 일으키고, 내독소 쇼크, 범발성 혈관 내 응고를 초래하며, 치료하지 않으면 사망한다.
페스트의 초기 발견 시에는 항생제로 치료가 가능하며, 그 예로 streptomycin, tetracycline, chloramphenicol, gentamicin 등이 매우 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나 증상이 나타난 다음 24시간 이내에 치료를 시작하지 않으면 거의 모든 환자가 사망한다. 따라서, 페스트의 신속하고 정확한 진단을 위한 검출 방법이 요구되고 있다.
또한, 페스트균은 에어로졸화하여 공중 살포할 경우 폐를 통하여 감염되고 이후 침이나 기침을 통해 급속히 확산될 수 있어 테러범들이 생물학무기로 사용할 가능성이 높은 균으로 꼽히고 있다. 이 외에도 자연발생 상황에서 페스트 환자와의 접촉을 통하여 지역사회에 확산될 경우 치명적인 피해와 사회적 문제를 야기할 수 있다.
때문에, 페스트균을 이용한 생물테러가 의심되는 상황 또는 자연발생 페스트 환자가 발생하였을 때, 페스트균을 신속하게 진단하고 검출할 수 있는 기술의 개발은 테러상황 또는 페스트 환자 여부를 신속하게 판단하고 대응정책을 결정을 위해 매우 중요하다.
따라서, 페스트균을 신속하게 검출할 수 있는 기술의 개발이 필요하며, 이를 위한 연구가 진행되고 있다. 페스트균의 검출 및 진단 방법으로 FA 검사, antigen capture ELISA 검사, Y. pestis Fraction I 항원을 이용한 PHA법 등이 개발되어 사용하고 있다.
국제특허 공개번호 WO 00/73347에서는 페스트균(Yersinia pestis) F1 항원에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용하여 페스트균을 진단 또는 탐지하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 여전히 병원체의 농도에 따른 검출의 한계를 극복하고, 페스트균을 신속하게 검출할 수 있으며, 민감도가 높은 진단 방법에 대한 요구가 존재한다. 이에 따라, 페스트균 캡슐 단백질을 특이적으로 인지하는 항체를 이용한 진단 방법을 개발하기 위하여 지속적인 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하였다.
국제특허 공개번호 WO 00/73347
본 발명은 페스트균(Yersinia pestis) 캡슐 단백질 F1에 특이적으로 결합하는 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 1H4 및 상기 항체를 이용한 페스트균 검출용 키트 및 페스트균 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 페스트균 F1 캡슐 단백질을 특이적으로 인지하는 항체(단클론항체 및 다클론항체), 및 항체 생산용 하이브리도마 세포주(1H4)를 제공하며, 이를 이용한 페스트균 진단·탐지 키트를 개발하여, 생물테러 의심 검체 검사 및 페스트 의심환자의 실험실 진단에 활용하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균(Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론항체일 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주 1H4에 의해 생산된 것일 수 있고, 이의 isotype은 IgG1 카파(kappa)일 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균(Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주 1H4를 제공한다. 상기 하이브리도마 세포주 1H4는 2019년 5월 31일 한국세포주연구재단에 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 것일 수 있다.
본 발명은 또한 포획 항체(capturing antibody)로서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체; 및 검출 항체(detection antibody)로서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 포함하며, 상기 단클론항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 하이브리도마 세포주 1H4에 의해 생산된 것을 특징으로 하는, 페스트균 검출용 키트를 제공한다. 상기 검출 항체는 검출 표지, 예를 들어, 비오틴과 연결된 것일 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 키트는 샌드위치 효소결합면역측정법(Sandwich ELISA)에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 또한
(a) (i) 검사대상시료;
(ii) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 포획 항체; 및
(iii) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하며 검출 표지에 연결된 다클론항체인 검출 항체이며, 상기 포획 항체와 페스트균 F1 캡슐 단백질이 결합한 부분 이외의 항원결정기(epitope)에 결합하는 검출 항체;
를 포함하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 상기 포획 항체 및 상기 검출 항체가 페스트균 F1 캡슐 단백질과 결합하는 조건 하에 상기 배지를 인큐베이션하는 단계; 및
(c) 상기 포획 항체와 페스트균 F1 캡슐 단백질이 결합한 부분 이외의 항원결정기(epitope)에 결합된 검출 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
를 포함하며, 상기 단클론항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 하이브리도마 세포주 1H4에 의해 생산된 것을 특징으로 하는, 페스트균의 검출 방법을 제공한다. 상기 검출 방법은 샌드위치 효소결합면역측정법(Sandwich ELISA)을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 목적 시료 내 페스트균 특이항원인 F1 캡슐 단백질을 민감하고 특이적으로 검출하는 것이 가능하다. 특히, 본 발명의 페스트균 검출용 키트에 페스트 의심 검체를 적용하는 경우, 6시간 이내에 검사가 가능하며 20 pg 미만의 페스트균 F1 캡슐 단백질을 검출할 수 있을 정도로 민감도가 우수하다.
따라서 본 발명은 페스트균을 이용한 생물테러 또는 페스트 의심 환자 발생 시 신속하고 정확한 실험실 검사에 사용될 수 있으며, 국가 생물테러를 대비하고 대응하는 능력 향상에 기여할 수 있다.
도 1은 페스트균 F1 캡슐 단백질의 유전자 염기서열(서열번호 1)을 나타낸다. 이탤릭체는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적인 프라이머 서열이다.
도 2는 페스트균 F1 캡슐 단백질 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터 pET15b의 모식도이다.
도 3은 실시예 2에서 발현 및 정제된 페스트균 F1 캡슐 단백질에 대해 Western blot을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 페스트균 F1 캡슐 단백질로부터 다클론항체의 생산 여부를 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타낸다. 100,000배 희석 시에도 높은 흡광도 값을 보임을 확인하였다.
도 5는 본 발명에 따른 페스트균 검출용 Sandwich ELISA 키트의 정밀도를 평가하기 위한 Intra-assay의 분석 결과 및 검량선을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 페스트균 검출용 Sandwich ELISA 키트의 정밀도를 평가하기 위한 Inter-assay의 분석 결과 및 검량선을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 페스트균 검출용 Sandwich ELISA 키트의 정밀도를 평가하기 위한 Intermediate-assay의 분석 결과 및 검량선을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 페스트균 검출용 Sandwich ELISA 키트의 민감도를 평가하기 위한 시험의 분석 결과 및 검량선을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 페스트균 검출용 Sandwich ELISA 키트의 특이도를 평가하기 위한 시험의 분석 결과 및 검량선을 나타내는 그래프이다.
도 10은 페스트균을 이용하여 본 발명에 따른 페스트균 검출용 Sandwich ELISA 키트의 민감도를 평가하기 위한 시험의 분석 결과 및 검량선을 나타내는 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
항체
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균(Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 천연 면역글로불린 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성하여 생산된 면역글로불린이다. 상기 용어는 또한 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편은 Fab, scFv, Fv, dAb, Fd 및 다이아바디(diabody)와 같은 분자이다. 용어 "항체"는 광범위한 의미로 이용되며, 구체적으로 온전한 단일클론항체, 다클론항체, 적어도 두 개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체)를 포함하며, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편도 포함한다.
본원에 사용된 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)"은 당업자에게 통상적으로 알려져있으며, 구체적으로, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 항원-항체 복합체를 형성할 수 있으며, 또한 면역학적 반응을 하는 것을 의미할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 항체는 단클론항체일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단클론항체(monoclonal antibody)"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단클론항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.
발명의 일 실시태양에서, 상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주에서 생산되는 것일 수 있다. 상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 하이브리도마 세포는 면역원인 페스트균 F1 캡슐 단백질을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포(myeloma cell)와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 하이브리도마 세포주는 1H4일 수 있으며, 바람직하게는, 2019년 5월 31일 한국세포주연구재단에 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 하이브리도마 세포주 1H4일 수 있다.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주 마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다.
피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다.
상기 방법으로 얻은 하이브리도마를 배양하여 단클론항체를 얻는다. 배양 방법은, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절하게 선택할 수 있으며, 예컨대 상기 하이브리도마 세포주를, 미리 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸)을 투여한 마우스의 복강 내에 이식하여 배양하는 방법을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 마우스의 복강 내에 이식하고 10 내지 14일 후에 복수를 회수하여, 얻어진 복수로부터 상기 단클론항체를 얻을 수 있다.
또한, 상기 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다.
상기 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.
한편, 바람직한 실시태양에서, 단클론항체는 IgG 면역글로불린 이소타입, 예를 들어, IgG1 카파일 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 다클론항체일 수 있다.
다클론항체는 통상적으로 체내의 다양한 B 세포 클론에서 생산되는 불균일한 항체분자 집단이다. 이들은 단일 항원의 여러가지 많은 에피토프(epitope)를 인식하여 이에 결합할 수 있다.
다클론항체는 면역원을 동물에 주입하여 체액성 면역반응을 유도하여 수득한다. 동물에 특정 항원을 주입하여 1차 면역 반응을 유도한 후, 동물을 다시 2차 또는 3차 면역화시켜 특정 항원에 대한 높은 역가의 항체를 생성한다. 면역화 후, 다클론항체는 혈청으로부터 직접 수득될 수도 있고, 또는 정제하여 다른 혈청 단백질이 제거된 용액을 수득할 수도 있다.
페스트균 검출 키트 및 검출 방법
본 발명은 포획 항체(capturing antibody)로서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체; 및 검출 항체(detection antibody)로서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균(Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 페스트균(Yersinia pestis) 검출용 키트를 제공한다. 상기 단클론항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 하이브리도마 세포주 1H4에 의해 생산된 것일 수 있다.
본 발명의 페스트균 검출 키트에는 검사대상시료를 채취 또는 검출 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 항원 단백질의 존재유무를 확인하는 통상의 검출 또는 진단 키트에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 키트는 페스트균을 면역분석 방법에 따라 검출하여 페스트균 감염여부를 진단하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은, 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 효소결합면역측정법(ELISA), 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 면역친화성 정제, 면역 크로마토그래피(immunochromatography) 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 키트는 샌드위치 효소결합면역측정법(Sandwich ELISA)에 사용하기 위한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 페스트균 검출 키트를 사용하여, 상기 단클론항체 및 다클론항체를 검사대상시료와 접촉시켜, 이로부터 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 페스트균 검출 방법을 제공한다. 일 실시태양에서, 본 발명의 검출 방법은
(a) (i) 검사대상시료;
(ii) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 포획 항체; 및
(iii) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하며 검출 표지에 연결된 다클론항체인 검출 항체이며, 상기 포획 항체와 페스트균 F1 캡슐 단백질이 결합한 부분 이외의 항원결정기(epitope)에 결합하는 검출 항체;
를 포함하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 상기 포획 항체 및 상기 검출 항체가 페스트균 F1 캡슐 단백질과 결합하는 조건 하에 상기 배지를 인큐베이션하는 단계; 및
(c) 상기 포획 항체와 페스트균 F1 캡슐 단백질이 결합한 부분 이외의 항원결정기(epitope)에 결합된 검출 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
를 포함한다. 상기 단클론항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 하이브리도마 세포주 1H4에 의해 생산된 것일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 검출 방법은 샌드위치 효소결합면역측정(Sandwich ELISA)법일 수 있다. 구체적 실시태양에서, 상기 다클론항체의 검출 표지로 비오틴을 사용하고, Avidin-HRP(Horseradish peroxidase, 호스래디쉬 퍼옥시다제)와 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 사용하여 발색을 유도한 뒤, 흡광도로 측정하는 것을 포함할 수 있다.
상기 검사대상시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 개체는 척추동물일 수 있다. 상기 척추동물은 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 채취되거나 분리된 것, 예를 들어, 혈액 또는 혈액 구성성분(blood constituent), 체액(bodily fluid), 타액, 가래, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 페스트균 F1 캡슐 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단클론항체 및 다클론항체의 결합물을 의미하며, 이 때 다클론항체는 검출 항체로서, 페스트균 F1 캡슐 단백질이 단클론항체(포획 항체)결합한 부분 이외의 항원결정기(epitope)에 결합될 수 있다. 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particlecounting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 상기 검출에 의해, 페스트균을 정성적 또는 정량적 분석할 수 있다.
본 발명의 항원-항체 복합체를 검출하기 위해 다클론항체는 여러가지 검출 표지와 연결될 수 있다. 검출 표지의 구체적인 예로는 화학물질(예를 들어, 비오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase, HRP) 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 검출 표지는 비오틴이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
페스트균 F1 캡슐 단백질의 유전자 클로닝
본 실시예에서는 페스트균 F1 캡슐 단백질의 유전자 서열을 확인한 뒤, 페스트균 F1 캡슐 단백질을 대장균에서 발현시키고 분리·정제하였다.
우선, 페스트균(Yersinia pestis ATCC 19428)을 BHI(Brain Heart Infusion) 액체배지 5 ml에 접종한 후 27℃에서 24시간 배양하였다. 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 회수하여 genomic DNA isolation kit(Intron biotechnology)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 분리한 genomic DNA는 100 ng을 주형으로 하고 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. F1 단백질 유전자는 putative secretion signal sequence(DNA 1-63 bp, 21 amino acids) 부분이 포함되지 않도록 디자인한 프라이머(아래 프라이머)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
F1 forward primer: CATATGGCAGATTTAACTGCAAGCACCACT
F1 reverse primer: CTCGAGTTATTGGTTAGATACGGTTACGGTTAC
PCR 조건은 다음과 같다.
Figure 112019063729573-pat00001
위의 조건으로 PCR을 수행한 후, 그 유전자 증폭 산물을 T 벡터에 클로닝한 후 염기서열 분석을 통하여 페스트균 F1 캡슐 단백질의 유전자 서열을 확인하였다(도 1). 유전자 증폭 산물은 1% agarose gel에 전기영동한 후 유전자 밴드 부분만을 gel 상에서 절단하고 gel extraction kit(Intron biotechnology)를 이용하여 회수하였다. 회수한 F1 유전자 DNA는 pGEM-T easy 벡터(Promega), T4 DNA ligase(Promega)와 함께 16℃에서 밤새 반응하고 DH5α 형질전환허용세포(competent cells)에 형질전환함으로써 클로닝하였다. 삽입된 F1 DNA는 T7과 SP6 프라이머를 이용하여 염기서열분석(Sequencing)을 수행하였으며 데이터베이스 분석결과 기존에 보고된 F1(Genbank number: AE017042) DNA 염기서열과 100% 일치하였다.
T 벡터에 클로닝되어있는 F1 DNA는 NdeI과 XhoI 제한효소로 절단한 후 1% agarose gel에 전기영동하였다. F1 DNA 밴드는 절단하여 gel extraction kit(Intron Biotechnology)를 이용하여 정제하였으며, 정제된 DNA는 pET15b 벡터, T4 DNA ligase를 이용하여 16℃에서 밤새 반응하고 DH5α 형질전환허용세포(competent cells)에 형질전환함으로써 대장균 발현벡터인 pET15b 벡터에 클로닝하였다. 제작된 벡터 pET15b-F1의 구조를 도 2에 나타내었다.
[실시예 2]
대장균 발현 시스템을 이용한 페스트균 F1 캡슐 단백질 발현 및 정제
실시예 1에서 클로닝이 확인된 pET15b-F1 DNA를 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환하고 1 mM IPTG 농도로 37℃에서 18시간 단백질 발현을 유도하였다. His6가 발현된 단백질의 앞쪽에 붙어 있으므로, Ni-NTA 컬럼과 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography)를 이용하여 단백질을 분리·정제하였다. 분리·정제한 단백질에 대해 F1 특이 항체를 이용하여 Western blot을 수행하여 F1 단백질임을 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
[실시예 3]
페스트균 F1 캡슐 단백질에 대한 항체 제조
실시예 2에서 분리·정제한 페스트균 F1 캡슐 단백질을 이용하여 항체를 제조하였다.
실시예 2에서 분리·정제한 페스트균 F1 캡슐 단백질을 토끼에 4회 면역시켜 다클론항체를 제조하였다. 구체적으로, 분리·정제한 페스트균 F1 캡슐단백질 500 μg을 Complete Freund's Adjuvant(CFA)와 혼합하여 2마리의 8~10주령의 New Zealand white rabbit의 피하에 1차 면역하였다. 1차면역 4주 후 F1 캡슐단백질 200 μg을 Incomplete Freund's Adjuvant(IFA)와 혼합하고 피하주사하여 1차 추가면역하였다(1st boost injection). 1차 추가면역 2주 및 4주 후 각각 200 μg의 F1 단백질을 Incomplete Freund's Adjuvant(IFA)와 혼합하고 피하주사하여 2차, 3차 추가면역하였다(2nd, 3rd boost injection). 3차 추가면역 1주 후 토끼에서 심장 채혈하고 혈청을 분리하여 F1 항원에 대한 항체가 ELISA를 수행하였다. 100,000배 희석 시에도 높은 흡광도 값을 보임을 확인하였다(표 1 및 도 4).
Figure 112019063729573-pat00002
또한, 단클론항체 제작을 위하여 마우스에 2회 면역 후 비장세포를 분리하여 골수종(myeloma) 세포와 융합하였다. 구체적으로, 분리·정제한 페스트균 F1 캡슐단백질 100 μg을 Incomplete Freund's Adjuvant(IFA)와 혼합하여 4마리의 6주령 female BALB/c 마우스의 다리부위에 면역하였다. 1차 면역 2주 후 마우스의 꼬리에서 채혈을 진행하고 ELISA로 항체역가를 측정하였으며, 역가가 fusion 기준(serum dilution 1:1000에서 O.D.> 1.5)을 만족함을 확인하였다. 1차 면역 2주 후 100 μg의 F1 단백질을 PBS와 혼합하여 다리부분에 2차 면역하였다. 2차 면역(boost injection) 3일 후 마우스 다리부위의 림프절을 적출하고 세포를 분리한 후 골수종(Sp2/0-Ag14) 세포와 PEG를 이용하여 세포융합을 유도하고 선택배지인 1X HAT media(DMEM, 20% FBS, 1X HAT, 1% PS(penicillin, streptomycin))에서 배양하였다. 세포융합 12일 후 배양 상층액을 이용하여 ELISA를 수행하였다. ELISA 결과에서 양성결과를 보인 well의 세포를 24 well 플레이트로 옮겨 배양하였다. 세포밀도가 적절한 수준이 되면 세포를 떼어낸 후 counting 하여 클론별로 100개의 세포를 20ml의 HT media(DMEM, 20% FBS, 1X HT, 1% PS)에 넣어주고 96 well plate에 200μl씩 분주하였다. 1차 클로닝 10~12일 후 콜로니가 형성되면 ELISA를 수행하여 양성결과를 나타낸 well 중에서 O.D.값이 높고 well 내 콜로니가 1개이며, 콜로니 크기가 작은 것을 기준으로 1개의 well을 선정하여 24 well 플레이트로 옮기고 최종 클론으로 확인될 때까지 클로닝을 반복하였다. 최종적으로 흡광도(O.D.) 및 항체 생산성을 고려하여 1H4 클론(하이브리도마 세포주 1H4; 수탁번호 KCLRF-BP-00467)를 선별하였고, 이를 배양하여 단클론항체를 얻었다.
표 2는 F1 단클론항체의 1H4 클론의 특성을 분석한 데이터를 나타낸다. 이를 통해 항체의 isotype은 IgG1(kappa)임이 확인되었다.
Figure 112019063729573-pat00003
[실시예 4]
페스트균 검출용 ELISA 키트 제작 및 이의 최적화 조건 확인
실시예 2에서 제조된 페스트균 F1 캡슐 단백질(항원)과 실시예 3에서 제조된 단클론항체(1H4) 및 다클론항체를 이용하여 페스트균 F1 캡슐 단백질(항원) 검출용 Sandwich 효소결합면역측정법(ELISA) 키트를 제작하였다. 이 때 페스트균 F1 캡슐 단백질 검출을 위하여 단클론항체를 포획 항체(capture antibody)로 사용하고, 비오틴(biotin)과 결합한 다클론항체를 검출 항체(detection antibody)로 사용하였으며, Avidin-HRP와 TMB를 사용하여 발색을 유도하였다.
최적화 실험을 통하여 상기 Sandwich ELISA의 최적화된 프로토콜을 확인하였다. 포획 항체로서 단클론항체의 농도는 2.5 μg/mL이고, 검출 항체로서 비오틴(biotin)이 결합된 다클론항체의 농도는 0.5 μg/mL이며, Avidin-HRP는 1:10,000의 비로 희석하여 사용한다. 그 후 표준액(standard protein; F1)을 농도별로 플레이트에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝난 후 약 5분 동안 플레이트를 세척한다. Biotinylation 된 다큰론항체(Secondary antibody)를 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨다. 약 5분 동안 플레이트를 세척한다. Avidin-HRP 용액을 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 약 5분 동안 플레이트를 세척한다. TMB substrate를 넣고 실온에서 10분간 반응시킨다(즉, 발색시간 10분). 반응이 끝난 후 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한다. 구체적인 최적화 프로토콜은 표 3에 나타낸 바와 같다.
이와 같이 최적화된 프로토콜에 따르면, 본 발명의 페트스균 검출용 키트에 페스트 의심 검체를 적용하는 경우, 6시간 이내, 바람직하게는, 최대 4시간 이내에 검사가 가능하며 20 pg 미만의 페스트균 F1 캡슐 단백질을 검출할 수 있을 정도로 민감도가 우수하다.
Figure 112019063729573-pat00004
[실시예 5]
페스트균 검출용 ELISA 키트의 정밀도(Precision) 평가
정밀도 시험은 항체의 정밀성을 확인하는 지표로 반복 측정한 결과들의 변동량 크기(%CV: Coeficient of variation)로 확인하였다. 정밀도는 Intra-assay, Inter-assay, Intermediate assay를 통해서 확인하였다.
(가) Intra-assay
실시예 4에서 확립한 Sandwich ELISA 최적화 결과에 따라 설정된 동일한 분석 조건으로 생산된 동일한 ELISA 키트 배치에서 12번의 반복 실험을 수행하였다. 얻어진 값들을 평균하여 검량선과 수식을 구하였다. 그 결과를 표 4 및 도 5에 나타내었다. 표 4에서 박스 안에 나타낸 값은 실험 결과에서 23.4375~1500 pg/mL의 검출 범위에서 평균 O.D, 표준편차, 변동계수(%CV)를 나타낸다.
Figure 112019063729573-pat00005
설정된 수식을 이용하여 실험상의 표준 농도와 수식을 통해 계산한 농도와의 표준편차를 분석하였고, 이 표준편차를 이용하여 변동계수(%CV)를 계산하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다. 분석 결과, 23.4375~1500 pg/mL의 검출 범위에서 변동계수(%CV)는 10% 미만의 가용 기준을 만족하였다.
Figure 112019063729573-pat00006
(나) Inter-assay
실시예 4에서 확립한 Sandwich ELISA 최적화 결과에 따라 설정된 동일한 분석 조건으로 생산된 서로 다른 6개의 ELISA 키트 배치에서 각각 2번씩 총 12번의 반복 실험을 수행하였다. 얻어진 값들을 평균하여 검량선과 수식을 구하였다. 그 결과를 표 6 및 도 6에 나타내었다. 표 6에서 박스 안에 나타낸 값은 실험 결과에서 23.4375~1500 pg/mL의 검출 범위에서 평균 O.D, 표준편차와 변동계수(%CV)를 나타낸다.
Figure 112019063729573-pat00007
설정된 수식을 이용하여 실험상의 표준 농도와 수식을 통해 계산한 농도와의 표준편차를 분석하였고 표준편차를 이용하여 변동계수(%CV)를 계산하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다. 분석 결과, 23.4375~1500 pg/mL의 검출 범위에서 변동계수(%CV)는 10% 미만의 가용 기준을 만족하였다.
Figure 112019063729573-pat00008
(다) Intermediate assay
실시예 4에서 확립한 Sandwich ELISA 최적화 결과에 따라 설정된 동일한 분석 조건으로 생산된 ELISA 키트를 서로 다른 날짜, 서로 다른 분석자가 각각 12번씩 총 24번의 반복 실험을 수행하였다. 얻어진 값들을 평균하여 검량선과 수식을 구하였다. 그 결과를 표 8 및 도 7에 나타내었다. 표 8에서 박스 안에 나타낸 값은 실험 결과에서 23.4375~1500 pg/mL의 검출 범위에서 평균 O.D, 표준편차와 변동계수(%CV)를 나타낸다.
Figure 112019063729573-pat00009
설정된 수식을 이용하여 실험상의 표준 농도와 수식을 통해 계산한 농도와의 표준편차를 분석하였고 표준편차를 이용하여 변동계수(%CV)를 계산하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다. 분석 결과, 23.4375~1500 pg/mL의 검출 범위에서 변동계수(%CV)는 10% 미만의 가용 기준을 만족하였다.
Figure 112019063729573-pat00010
[실시예 6]
페스트균 검출용 ELISA 키트의 민감도(Sensitivity) 평가
실시예 4에서 확립한 Sandwich ELISA 최적화 결과에 따라 설정된 동일한 분석 조건으로 생산된 동일한 ELISA 키트 배치에서 12번의 반복 실험을 수행하였다. 얻어진 값들을 평균하여 검량선과 수식을 구하였다. 그 결과를 표 10 및 도 8에 나타내었다. 표 10에서 박스 안에 나타낸 값은 실험 결과에서 23.4375~1500 pg/mL의 검출 범위에서 평균 O.D, 표준편차와 변동계수(%CV)를 나타낸다.
Figure 112019063729573-pat00011
검출 가능한 최소 농도(LLD: low limit of detection)는 최종적으로 확인된 표준곡선의 0 pg/mL 농도의 평균값과 표준 편차를 이용하여 계산하였는데, 구체적으로 평균값에 표준편차 3배 값을 더해 O.D 값을 구하고 4 parameter 방식을 사용하여 LLD를 계산하였다.
AVE+3SD=LLD (AVE: 평균값, SD: 표준편차)
정량 가능한 최소 농도(LOQ: limit of quantitation)는 최종적으로 확인된 표준곡선의 0 pg/mL 농도의 평균값과 표준 편차를 이용하여 계산하였는데, 구체적으로 평균값에 표준편차 10배 값을 더해 O.D 값을 구하고 4 parameter 방식을 사용하여 LOQ를 계산하였다.
AVE+10SD =LOQ (AVE: 평균값, SD: 표준편차)
계산 결과 LLD O.D는 0.104이었고, LLD는 2.292 pg/ml이었으며, LDQ는 10.630 pg/ml이었다(표 11). 공지된 ELISA 키트의 LLD가 4 ng/mL임을 고려할 때, 상기 결과로부터 본 발명의 ELISA 키트가 기존의 ELISA 키트에 비해 우수한 민감도를 나타냄을 확인할 수 있다.
Figure 112019063729573-pat00012
[실시예 7]
페스트균 검출용 ELISA 키트의 특이도 평가
본 발명에 따른 페스트균 검출용 ELISA 키트의 특이도 분석을 위하여 다른 항원과의 교차반응성을 조사하였다.
구체적으로, 실시예 4에서 확립한 Sandwich ELISA 최적화 결과에 따라 설정된 동일한 분석 조건으로 생산된 동일한 ELISA 키트 배치에서 2번의 반복 실험을 수행하였다. 양성대조군으로 F1 단백질을 사용하였다. 음성대조군으로 보툴리눔 독소(BoNT) A, B(Metabiologics), 직접 피마자에서 분리정제한 리신(ricin) 독소, 대장균(E. coli)에서 분리정제한 host cell protein(HCP)을 sample dilution buffer를 이용하여 각각 1500 pg/mL, 750 pg/mL 농도가 되도록 희석하여 사용하였다. 표준항원인 F1 단백질을 이용하여 검량선을 확인하였으며 그 결과를 표 12 및 도 9에 나타내었다. 표 12에서 박스 안에 나타낸 값은 8개 농도(0~1500 pg/mL)의 검출 범위에서 실험 결과의 평균 O.D를 나타낸다. R2 값은 0.9973으로 확인되었다(도 9).
실험결과 F1 항원을 제외한 항원 모두 background 이하의 O.D 값을 가지는 것을 확인하였으며 따라서 교차반응이 없음을 확인하였다(표 12).
Figure 112019063729573-pat00013
[실시예 8]
페스트균을 이용한 ELISA 키트의 민감도(Sensitivity) 평가
실시예 4에서 확립한 Sandwich ELISA 최적화 결과에 따라 설정된 동일한 분석 조건으로 생산된 동일한 ELISA 키트 배치에서 6번의 반복 실험을 수행하였다. 실제 페스트균을 1/10씩 희석하여 농도가 0 ~ 6000000 CFU/mL이 되도록 사용하였다. 하위 5개 농도(0 ~ 6000CFU/mL)의 흡광도를 이용하여 검량선과 수식을 구하였다. 그 결과를 표 13 및 도 10에 나타내었다. 표 13에서 박스 안에 나타낸 값은 실험 결과에서 하위 5개 농도에 대한 평균 O.D, 표준편차와 변동계수(%CV)를 나타낸다.
Figure 112019063729573-pat00014
검출 가능한 최소 농도(LLD: low limit of detection)는 최종적으로 확인된 표준곡선의 0 CFU/mL 농도의 평균값과 표준 편차를 이용하여 계산하였는데, 구체적으로 평균값에 표준편차 3배 값을 더해 O.D 값을 구하고 4 parameter 방식을 사용하여 LLD를 계산하였다.
AVE+3SD=LLD (AVE: 평균값, SD: 표준편차)
계산 결과 LLD O.D는 0.1242이었고, LLD는 19.8 CFU/ml이었으며, LOQ는 41.6 CFU/ml이었다(표 14). 공지된 ELISA kit의 LLD가 6 × 103 CFU/mL임을 고려할 때, 상기 결과로부터 본 발명의 ELISA kit가 기존의 ELISA kit에 비해 우수한 민감도를 나타냄을 확인할 수 있다.
Figure 112019063729573-pat00015
[실시예 9]
페스트균을 이용한 ELISA 키트의 특이도 평가
본 발명에 따른 페스트균 검출용 ELISA 키트의 특이도 분석을 위하여 페스트균 이외의 다른 세균과의 교차반응성을 조사한 결과를 표 15에 나타내었다. 표 15에서 박스 안에 나타낸 값은 다양한 세균을 O.D 600nm에서 0.55 ~ 0.65 까지 키운 균을 이용한 3번의 반복실험하여 얻어진 흡광도 값의 평균을 나타낸다. 이로부터 본 발명의 키트는 2종의 Yersinia enterocolitica, 2종의 Yersinia pseudotuberculosis, 1종의 Klebsiella pneumoniae, 1종의 Bacillus cereus, 1종의 Bacillus mycoides, 1종의 Escherichia coli, 1종의 Pseudomonas aeruginosa 등 총 9개의 균과 교차반응이 없음을 확인하였다.
Figure 112019063729573-pat00016
한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00467 20190531
<110> KOREA CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION <120> AN ANTIBODY SPECIFIC FOR F1 CAPSULE PROTEIN OF YERSINIA PESTIS, HYBRIDOMA CELL LINE 1H4 PRODUCING THE SAME, AND A KIT FOR DETECTING YERSINIA PESTIS USING THE SAME <130> KCD19P-0003-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence No.1 <400> 1 atgaaaaaaa tcagttccgt tatcgccatt gcattatttg gaactattgc aactgctaat 60 gcggcagatt taactgcaag caccactgca acggcaactc ttgttgaacc agcccgcatc 120 actcttacat ataaggaagg cgctccaatt acaattatgg acaatggaaa catcgataca 180 gaattacttg ttggtacgct tactcttggc ggctataaaa caggaaccac tagcacatct 240 gttaacttta cagatgccgc gggtgatccc atgtacttaa catttacttc tcaggatgga 300 aataaccacc aattcactac aaaagtgatt ggcaaggatt ctagagattt tgatatctct 360 cctaaggtaa acggtgagaa ccttgtgggg gatgacgtcg tcttggctac gggcagccag 420 gatttctttg ttcgctcaat tggttccaaa ggcggtaaac ttgcagcagg taaatacact 480 gatgctgtaa ccgtaaccgt atctaaccaa taa 513

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균(Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하며, 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 하이브리도마 세포주 1H4에 의해 생산된 것을 특징으로 하는, 단클론항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단클론항체는 IgG1 카파(kappa)인 것을 특징으로 하는, 단클론항체.
  3. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균(Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산할 수 있으며, 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 하이브리도마 세포주 1H4.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단클론항체는 IgG1 카파(kappa)인 것을 특징으로 하는, 하이브리도마 세포주 1H4.
  5. 포획 항체(capturing antibody)로서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체; 및
    검출 항체(detection antibody)로서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론항체
    를 포함하며, 상기 단클론항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 하이브리도마 세포주 1H4에 의해 생산된 것을 특징으로 하는, 페스트균 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 검출 항체는 검출 표지와 연결된 것을 특징으로 하는, 페스트균 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 검출 표지는 비오틴인 것을 특징으로 하는, 페스트균 검출용 키트.
  8. 제5항에 있어서, 상기 키트는 샌드위치 효소결합면역측정법(Sandwich ELISA)에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, 페스트균 검출용 키트.
  9. (a) (i) 검사대상시료;
    (ii) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 포획 항체; 및
    (iii) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하며, 검출 표지에 연결된 다클론항체인 검출 항체이며, 상기 포획 항체와 페스트균 F1 캡슐 단백질이 결합한 부분 이외의 항원결정기(epitope)에 결합하는 검출 항체;
    를 포함하는 배지를 제공하는 단계;
    (b) 상기 포획 항체 및 상기 검출 항체가 페스트균 F1 캡슐 단백질과 결합하는 조건 하에 상기 배지를 인큐베이션하는 단계; 및
    (c) 상기 포획 항체와 페스트균 F1 캡슐 단백질이 결합한 부분 이외의 항원결정기(epitope)에 결합된 검출 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하며, 상기 단클론항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00467로 기탁된 하이브리도마 세포주 1H4에 의해 생산된 것을 특징으로 하는, 페스트균의 검출 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 검출 방법은 샌드위치 효소결합면역측정법(Sandwich ELISA)을 사용하는 것을 특징으로 하는, 페스트균의 검출 방법.
KR1020190074001A 2019-06-21 2019-06-21 페스트균 f1 캡슐 단백질에 특이적인 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 1h4, 및 이를 이용한 페스트균 진단 키트 KR102212636B1 (ko)

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HSU 등, BMC Infectious Disease (2018) 18:402*

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