KR101851332B1 - 스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트 - Google Patents

스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단클론 항체는 시료 내의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)만을 선별적으로 인지할 수 있어, 스타필로코커스 아우레우스 검출 진단에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트{Staphylococcus aureus-Specific Novel Monoclonal Antibody, Hybridoma For Producing The Antibody, Method For Detecting The Same Comprising The Antibody And Kit For Detecting The Same}
본 발명은 스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.
식중독은 자연독이나 유해물질이 함유된 음식물을 섭취함으로써 생기는 급성 또는 만성적인 질환으로, 주로 발열, 구역질, 구토, 설사, 복통 등의 증세를 동반한다. 식중독을 원인물질에 따라 분류하면 세균성 식중독, 화학성 식중독, 자연독 식중독, 미생물 독성대사물질에 의한 식중독으로 구분할 수 있다. 각 부류에 속하는 독성물질은 그 종류가 매우 많으며, 독성물질은 당장 건강을 해칠 만한 양이 아니라 하더라도 많은 식품 중에 널리 분포되어 있어서 만성중독레上究볜돌연변이 유발성 및 기형 유발성 알레르기성 반응을 일으키는 원인이 될 수도 있다.
식중독의 대부분은 세균에 의하여 생기는 세균성 식중독으로서, 여기에는 병원대장균에 의한 감염형 식중독과 병원체가 생성한 독소에 의한 독소형 식중독이 있다.
감염형 식중독은 살아 있는 유해세균을 다량으로 섭취함으로써 발생하는 것이므로, 식품을 가열해서 먹으면 세균은 사멸해 버리기 때문에 중독되는 일이 없다. 그러나 독소형 식중독은 세균은 죽어도 독소는 그대로 남아있으므로 음식물을 가열해도 남은 독소가 중독을 일으키는 경우이다.
이러한 식품에서 집단 식중독을 일으킬 수 있는 대표적인 병원성 세균으로는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)가 있다.
스타필로코커스 아우레우스는 통상적으로 건강한 인간의 코 및 피부에서 콜로니화하는 그람 양성 조건적 호기성 응괴 형성 구균이다. 인구의 대략 20% 내지 30%는 임의의 주어진 시점에서 스타필로코커스 아우레우스로 콜로니화된다. 종종 "스타프", "스타프. 아우레우스" 또는 "에스. 아우레우스"로서도 지칭되는 스타필로코커스 아우레우스 세균은 경미한 감염(예를 들면, 뾰루지, 종기) 및 전신 감염을 야기하는 기회감염성 병원체로서 간주된다.
또한, 스타필로코커스 아우레우스 감염은 다양한 질환 또는 병태(condition)를 야기할 수 있으며, 이들 질환 또는 병태의 비-한정적 예로는 세균혈증, 연조직염, 눈꺼풀 감염, 식중독, 관절 감염, 피부 감염, 열상 피부 증후군, 독성 쇼크 증후군, 폐렴, 골수염, 심내막염, 수막염 및 농양 형성이 있다.
따라서, 스타필로코커스 아우레우스에 의한 오염 여부를 신속하게 진단할 필요가 있다.
현재 병원 및 산업체(식품회사, 식육회사 및 유가공업체) 등에서 사용할 수 있는 동정 방법으로는 여러가지 생화학적 검사법을 사용하는 전통적인 방법이 있으나 많은 시간과 인력이 요구되는 비효율적인 방법이다.
스타필로코커스 아우레우스에 의한 감염 여부 및 식품에서의 오염 여부를 신속히 확인하기 위한 진단 방법으로 중합효소 연쇄반응(PCR) 법과 같은 분자 생물학적 방법이 이용되고 있으나 기술력과 정밀성이 요구되기 때문에 실제 임상 및 산업적으로 적용하기에는 부적합한 방법이다. 또한, 효소면역법(EIA: Enzyme immunoassay)과 같은 면역학적 방법이 많이 사용되고 있으나 비특이성이 나타나기 때문에 부정확한 검사 결과가 얻어지거나 추가 확인 시험이 필요한 경우가 생기게 된다
따라서, 식품내 식중독 유발성 병원체인 스타필로코커스 아우레우스의 존재를 신속, 정확하게 판단하여, 식품에 대한 안정성을 보장할 수 있는 방안이 시급히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 스타필로코커스 아우레우스를 검출하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 스타필로코커스 아우레우스 균체 항원을 마우스에 면역시킨 후 항체를 생성하는 면역세포를 분리하여, 종양 세포(myeloma cell)와 융합 시켜서, 스타필로코커스 아우레우스에 대한 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마를 제작하였고, 이 세포가 생산하는 단클론항체를 이용하여 스타필로코커스 아우레우스를 특이적으로 신속하고 용이하게 검출하는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 세포벽-결합 단백질 분획물에 대한 단클론 항체를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(수탁번호 KCTC 12700BP)를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출 방법을 제공하는 데 있다.
*또한, 본 발명의 또 다른 목적은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC 12700BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 세포벽-결합 단백질 분획물에 대한 단클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 당해 분야에 공지된 용어로서, 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다.
본 발명의 항체는 스타필로코커스 아우레우스에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv (twochain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "중쇄"는, 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "경쇄"는, 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
통상적으로, 상이한 결정기(epitope)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다.
단클론 항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 융합 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역 글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Mislstein(1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991 등 참조) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "하이브리도마"는 2 개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포를 의미한다. 하이브리도마 세포는 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 특정 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포를 융합시킴으로써 제조되는데, 하이브리도마 세포를 형성시킴으로써 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포에 통합시킬 수 있게 된다.
이러한 하이브리도마 세포는 일반적으로 시험관 내에서도 증식이 되는 암세포와 생체로부터 추출한 어느 특정의 분화 형질을 가진 대형 세포를 융합시켜 제조될 수 있다. 대표적인 하이브리도마는 림프구 하이브리도마로서, 골수종세포와 B세포를 융합시킨 하이브리도마 세포, T세포와 그 종양세포인 하이브리도마 세포, 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리도마 세포 등이 있으며, 본 발명의 하이브리도마 세포주는 당업자의 선택에 따라 본 발명의 단클론 항체를 효과적으로 생산하기 위한 최적의 조건으로 융합 및 배양될 수 있음은 자명하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 마우스의 비장세포를 확보하고 이를 마우스 골수종 세포와 융합하여 배양한 후, 스타필로코커스 아우레우스 항체가 확인된 하이브리도마 세포만을 선택하였으며, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2014년 11월 03일 자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12700BP).
본 발명의 하이브리도마 세포가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 이를 포함하는 세포 배양액 상태로 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체가 인식하는 항원은 (a) 스타필로코커스 아우레우스를 용해시키는 단계; 및 (b) 상기 (a)의 용해물로부터 세포벽-결합 단백질(Cell wall-associated proteins)을 분획하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되며, 약 75kDa의 크기를 갖는다.
또한, 본 발명의 항체가 특이적으로 인식하는 한 스타필로코커스 아우레우스의 균주는 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 스타필로코커스 아우레우스의 균주는 수탁번호가 ATCC 25923인 스타필로코커스 아우레우스의 균주이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체의 중쇄는 IgG2b형이고, 상기 항체의 경쇄는 람다(lambda)형이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단클론 항체를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상술한 단클론 항체를 포함하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단클론 항체를 검체 시료에 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성을 확인하는 단계를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항원-항체 복합체의 형성 확인은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의해 실시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-항체 복합체"는, 시료 중의 스타필로코커스 아우레우스의 존재 또는 부재를 확인하기 위한, 스타필로코커스 아우레우스와 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 바람직하게는 상기 항원-항체 복합체는 스타필로코커스 아우레우스 및 본 발명에 따른 단클론 항체의 복합체이다.
상기 항원-항체 복합체 형성의 확인은, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포 분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩(Protein Chip) 또는 키트 등에 의해 이루어질 수 있으며 이로 제한되지는 않는다. 상기 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코오스 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코오스 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 상기 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 상기 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 상기 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 상기 방사성 동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검체 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 초유, 관절액, 타액, 분변, 세포 배양 상등액 및 식품으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이다.
*본 명세서에서 사용되는 용어 "시료"는, 스타필로코커스 아우레우스의 검출 여부를 확인하고자 하는 식품 뿐만 아니라, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 초유, 관절액,타액, 배변, 세포 배양 상등액 또는 상층액 등의 생물학적 시료를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 상기 생물학적 시료는, 인간, 돼지, 햄스터, 파란 여우, 에뮤, 사슴, 개, 기니 피그, 말, 레서스 마커스 원숭이, 타조, 토끼, 쥐 등의 각종 동물로부터 채취할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
*본 발명의 방법은 상술한 단클론 항체를 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단클론 항체를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 검출하기 위한 검출키트를 제공한다.
본 발명의 키트에는 본 발명의 단클론 항체뿐만 아니라, 스타필로코커스 아우레우스를 선별적으로 인지할 수 있는 한, 다른 항체, 예를 들어 다클론 항체, 키메릭-항체, 인간화-항체, 단일클론항체의 단편 등도 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트에는 면역학적 분석에 사용되는 도구 및 시약이 포함될 수 있다. 상기 도구 및 시약으로는 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 함께 포함할 수 있다. 상기 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS; 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립, 방사분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow through) 디바이스 등을 포함한다.
본 발명의 키트는 상술한 단클론 항체를 포함하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단클론 항체를 유효성분으로 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)으로 인한 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체(carrier) 또는 성분(ingredient)을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 스트렙토마이신(streptomycin), 페니실린(penicillin) 및 반코마이신(vancomycin) 등과 같은 항생물질 제제(antibiotic drugs), 바람직하게는 본 발명의 단일클론 항체에 결합된 항생물질 제제(antibiotic drugs)를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 용도, 사용목적, 환자의 상태, 나이, 성별, 체중, 처방약 및 질병의 종류에 따라 적절하게 조절하는 것이 바람직하며, 통상적으로는 투여 용량(dosage range) 0.1 내지 100 mg/kg 체중의 단클론 항체를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 비경구 또는 경구용으로 사용될 수 있으며, 비경구로는 정맥 주사의(intravenous), 근육내(intra-muscular), 피내(intra-dermal), 피하의(subcutaneous), 복강내의(intra-peritoneal), 국부의(topical), 비강내의(intra-nasal) 투여, 또는 흡입 스프레이(inhalation spray)와 같은 어떤 알려진 조건으로 투여될 수 있다.
*상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 첨가제를 더욱 포함할 수 있으며, 이때 상기 첨가제의 종류는 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 산제, 정제, 캡슐제, 액제 또는 과립제 등으로 제형화될 수 있다.
상기 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)으로 인한 질환은 예컨대, 스타필로코커스 아우레우스 감염에 의한 감염증으로 유발되는 감염성 질환, 바람직하게는 식중독, 세균혈증, 연조직염, 눈꺼풀 감염, 관절 감염, 피부 감염, 열상 피부 증후군, 독성 쇼크 증후군, 폐렴, 골수염, 심내막염, 수막염 또는 농양 형성을 포함한다.
본 발명의 조성물은 상술한 단클론 항체를 포함하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 단클론 항체는 시료 내의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)만을 선별적으로 인지할 수 있어, 스타필로코커스 아우레우스 검출 진단에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 세포벽-결합 단백질의 SDS-PAGE 결과를 보여준다.
도 2는 본 발명의 단클론 항체의 특이성을 확인하기 위하여, 다양한 균주들의 분획물(정제된 단백질)를 이용하여 ELISA를 실시한 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 단클론 항체의 특이성을 확인하기 위하여, 다양한 균주들의 전체세포를 이용하여 ELISA를 실시한 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 시료 내 스타필로코커스 아우레우스의 검출을 확인하기 위하여, 다양한 식품 및 인간으로부터 분리된 스타필로코커스 아우레우스를 이용하여 ELISA를 실시한 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 단클론 항체의 균주 특이성을 확인하기 위하여, 다양한 균주들의 단백질 조추출물(crude protein extracts)을 이용하여 웨스턴 블롯을 실시한 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 단클론 항체에 대한 스타필로코커스 아우레우스 항원을 동정(identification)하기 위하여, 웨스턴 하이브리디제이션을 실시한 결과를 보여준다.
도 7은 본 발명의 단클론 항체의 민감도를 확인하기 위하여, 다양한 농도의 스타필로코커스 아우레우스를 ELISA 플레이트에 코팅한 후, 본 발명의 항체(7D6) 또는 상업적으로 판매되고 있는 스타필로코커스 아우레우스 항체(SA com)를 이용하여 ELISA를 실시한 결과를 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험 방법 및 재료
세포벽 분획물(cell wall fraction) 분리
당업계에 공지된 방법(Jonquieres et al., 1999)을 이용하여 그램양성균의 세포벽 분획물을 분리하였다. 간략하게는, 1 ml 지수 단계(exponentional phase) 세포의 침전물(pellet)을 PBS로 1회 세척하였다. 다시 TS 버퍼(10 mM Tris HCl pH 6.9, 10 mM MgCl2, 0.5 M sucrose)로 1회 세척하였다. 용해액(Lysis solution, TS buffer containing 60 mg/ml mutanolysin, 250 mg/ml RNAseA, 2 mM serine protease inhibitor AEBSF) 첨가 후 30℃에서 1시간 배양하였다. 상층액을 16% TCA로 침전 후 보관하였다.
준비된 항원을 이용한 마우스(Balb/c) 면역화
항원 50 ㎍과 동량의 프레운드 완전 어쥬번트(Freud's Complete adjuvant)를 이용하여 항원을 유제화하고, 마우스의 복강에 항원을 1차로 주입한 후, 2 주 간격으로 불완전 어쥬번트(Incomplete adjuvant)를 이용하여 부스팅하였다. 4 차례 부스팅 후 마우스로부터 비장세포(Splenocyte)를 획득하였다.
또한, 마우스 혈청을 획득하여, 전체세포를 이용하여 ELISA로 항체 역가(titer)를 분석하였다.
하이브리도마 세포의 제작
면역된 마우스에서 수득한 비장세포(Splenocyte)를 PEG(50%)을 이용하여 골수종세포(SP2/0-Ag 14)와 융합하여 하이브리도마 세포를 제조하였다. 이 후, HAT를 첨가한 배지를 사용하여 비융합 세포를 제거하였다.
*하이브리도마 세포를 선별하기 위하여, 제한적 희석 방법(limited dilution method)을 통해 확장 배지(DMEM+10% FBS+마우스 흉선 추출물)에 플레이팅한 후 ELISA로 역가(titer)를 분석하였다.
세포 배양을 이용한 단클론 항체의 대량 생산
단클론 항체를 생산하는 클론들을 특정배지(DMEM)에서 배양한 후 상층액의 단클론 항체의 농도와 역가(titer)를 분석하였다.
인 비보 모델을 이용한 단클론 항체의 대량 생산(복수액)
단클론 항체를 대량 생산하기 위하여, 8 주령 마우스(Balb/c)에 250 ㎕ 인컴플리트 애쥬번트(Incomplete adjuvant)를 복강 내 주사하였다. 2 주 후 5x106 세포를 주입하고, 7-10일 후 복수(ascite)를 획득하였다.
단클론 항체(MAb)의 순수분리
복수액 또는 하이브리도마 세포 배양 상층액을 이용하여 대량 생산한 후, 프로테인 A 또는 프로테인 G 결합(affinity) 크로마토그래피를 이용하여 단클론 항체를 순수분리하였다.
Indirect ELISA를 통한 MAb의 특이성 분석
다양한 세균(whole cell)의 배양액(Overnight culture)을 카보네이트 코팅 버퍼(carbonate coating buffer)에 재현탁한 후 96-웰 ELISA 플레이트에 첨가하고 냉장온도에서 밤새 보관하였다. 다양한 농도로 희석된 Ab와 반응시키고, AP- 또는 HRP-결합(conjugated) 항-래빗 Ab와 반응시켰다. 그 후 용해성 기질(soluble substrate)을 첨가하여 효소반응 확인하고, 적정 파장에서 흡광도를 측정하였다.
웨스턴 블롯을 이용한 MAb의 특이성 분석
항원으로 이용된 세균의 단백질(overnight culture protein, cell wall fraction )을 SDS-PAGE 이용하여 분리하였다. PVDF 막에 단백질을 트랜스퍼시킨후 준비된 MAb와 반응시켰다. 그 후 불용성 기질(insoluble substrate)을 첨가하여 효소반응 확인하였다.
상업적으로 판매되고 있는 유해균 대상 MAb와 본 MAb의 특이성 비교시험
시험 대상 세균을 대상으로 ELISA와 웨스턴 블롯을 실시하였다. 이 때 이미 개발된 MAb와 본 발명의 신규한 MAb를 동시 적용하여 MAb의 특이성을 비교 확인하였다.
실시예 1: 스타필로코커스 아우레우스( Staphylococcus aureus ) 항원의 제조
본 발명자들은 스타필로코커스 아우레우스 균주(수탁번호 ATCC 25923)를 배양하여 항원으로 사용하였다. 보다 구체적으로는, 상기 균주를 배양한 후, 배양 상층액을 수거하여 원심 분리하여 침전물을 수득하였다. 상기 수득된 침전물을 PBS로 1회, TS 버퍼(10 mM Tris HCl pH 6.9, 10 mM MgCl2, 0.5 M 수크로즈)로 1 회 세척하였다. 여기에 용해(lysis) 버퍼(60 mg/ml 뮤타노리신, 250 mg/ml RNAse A, 2 mM 세린 단백질분해효소 억제제 AEBSF를 함유한 TS 버퍼)를 첨가하고 30℃에서 60 분 동안 배양한 후, 원심분리하여 상층액을 획득하였고 이를 16% TCA로 침전 후 보관하여 항원으로 이용하였다.
또한, SDS-PAGE를 이용하여 상기 정제된 단백질의 정성 및 정량을 확인하였다(도 1).
실시예 2: 스타필로코커스 아우레우스에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조
2-1. 항체 생성 세포 수득
본 발명자들은 스타필로코커스 아우레우스 균주(수탁번호 ATCC 25923)에 대한 마우스 면역을 유도하기 위하여 실시예 1에서 수득한 항원을 마우스(Balb/c)에 접종한 후, 면역세포를 수득하였다.
간략하게, 실시예 1에서 수득한 항원 50 ㎍과 동량의 Freud's 컴플리트 애쥬번트(Complete adjuvant)를 이용하여 항원을 유제화하고, 마우스의 복강에 항원을 1차로 주입한 후, 2 주 간격으로 Incomplete adjuvant를 이용하여 부스팅하였다. 4 차례 부스팅 후 마우스로부터 비장세포(Splenocyte)를 획득하였다.
또한, 마우스 혈청을 획득하여, 전체세포를 이용하여 ELISA로 항체 역가(titer)를 분석하였다.
2-2. 하이브리도마 세포의 제조 및 대량 생산
본 발명자들은 실시예 2-1의 면역된 마우스에서 수득한 비장세포를 PEG(50%)을 이용하여 골수종세포(SP2/0-Ag 14)와 융합하여 하이브리도마 세포를 제조하였다. 이 후, HAT를 첨가한 배지를 사용하여 비융합 세포를 제거하였다.
2-3. 하이브리도마 세포의 선별 및 단클론 항체 분리
본 발명자들은 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여, 제한적 희석 방법(limited dilution method)을 통해 확장 배지(DMEM+10% FBS+ 마우스 흉선 추출물)에 플레이팅한 후 ELISA로 역가(titer)를 분석하였다.
또한, 단클론 항체를 생산하는 클론들을 특정배지(DMEM)에서 배양한 후 상층액의 단클론 항체의 농도와 역가(titer)를 분석하였다.
최종적으로 높은 특이성을 나타내는 클론을 선별하고, 선별된 스타필로코커스 아우레우스 균주에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 한국세포주연구재단에 2014년 11월 03일 자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12700BP).
한편, 본 발명자들은 단클론 항체를 대량 생산하기 위하여, 8 주령 마우스(Balb/c)에 250 ㎕ 인컴플리트 애쥬번트(Incomplete adjuvant)를 복강 내 주사하였다. 2 주 후 5x106 세포를 주입하고, 7-10일 후 복수(ascite)를 획득하였다.
복수액 또는 하이브리도마 세포 배양 상층액을 이용하여 대량 생산한 후, 프로테인 A 또는 프로테인 G 결합(affinity) 크로마토그래피를 이용하여 단클론 항체를 순수분리하였다.
실시예 3: 스타필로코커스 아우레우스에 대한 단클론 항체의 아이소타입 확인 및 단클론 항체의 특이성 확인
3-1. 단클론 항체의 아이소타입 확인
본 발명자들은 수탁번호 KCTC 12700BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는스타필로코커스 아우레우스에 대한 단클론 항체의 아이소타입을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112017128391770-pat00001
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체의 중쇄는 IgG2a 형이고,경쇄는 람다형임을 확인하였다.
3-2. 단클론 항체의 특이성 확인
본 발명자들은 수탁번호 KCTC 12700BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는스타필로코커스 아우레우스에 대한 단클론 항체의 특이성을 확인하기 위하여, 다양한 균주들의 분획물(정제된 단백질) 및 전체세포를 이용하여 ELISA를 실시하였고, 그 결과를 도 2 및 3에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체는 다양한 균주들의 분획물 중 스타필로코커스 아우레우스의 분획물에만 반응함을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체는 다양한 균주들(도 3a는 그램 음성균과의 비교 확인, 도 3b는 스타필로코커스 아우레우스들에서의 반응 확인, 도 3c는 그램 양성균과의 비교 확인)의 전체세포 중 스타필로코커스 아우레우스 균주들에만 반응함을 확인하였다.
실시예 4: 스타필로코커스 아우레우스에 대한 단클론 항체를 이용한 검출
본 발명자들은 수탁번호 KCTC 12700BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는스타필로코커스 아우레우스에 대한 단클론 항체를 이용하여 시료 내 스타필로코커스 아우레우스의 검출을 확인하기 위하여, 다양한 식품 및 인간으로부터 분리된 스타필로코커스 아우레우스를 이용하여 ELISA를 실시하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체는 다양한 식품(도 4a) 및 인간(도 4b)으로부터 분리된 스타필로코커스 아우레우스와 반응함을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 수탁번호 KCTC 12700BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는 스타필로코커스 아우레우스에 대한 단클론 항체의 균주 특이성을 확인하기 위하여, 다양한 균주들의 단백질 조추출물(crude protein extracts)을 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단클론 항체는 다양한 균주들의 단백질 조추출물 중 스타필로코커스 아우레우스에만 반응함을 확인하였다.
한편, 본 발명자들은 본 발명의 단클론 항체에 대한 스타필로코커스 아우레우스 항원을 동정(identification)하기 위하여, 웨스턴 하이브리디제이션을 실시하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 약 75kDa 크기의 항원과 특이적으로 반응함을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 단클론 항체의 민감도를 확인하기 위하여, 다양한 농도의 스타필로코커스 아우레우스를 ELISA 플레이트에 코팅한 후, 본 발명의 항체 또는 상업적으로 판매되고 있는 스타필로코커스 아우레우스 항체를 이용하여 ELISA를 실시하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체의 검출한도는 102 CFU/ml이하로 확인되었으며, 이는 대조군인 상업적으로 판매되고 있는 항체에 비해 약 100 배 정도의 높은 민감도를 나타낸 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12700BP 20141103

Claims (6)

  1. 수탁번호 KCTC 12700BP로 기탁된 하이브리도마에 의하여 생산되고, 75 kDa의 분자량을 갖는 스타필로코커스 아우레우스 세포벽-결합 단백질(Cell wall-associated protein)을 항원으로 인식하는 모노클로날 항체 7D6.
  2. 수탁번호 KCTC 12700BP로 기탁된 하이브리도마에 의하여 생산되고, 75 kDa의 분자량을 갖는 스타필로코커스 아우레우스 세포벽-결합 단백질(Cell wall-associated protein)을 항원으로 인식하는 모노클로날 항체 7D6을, 검체 시료에 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성을 확인하는 단계를 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항원-항체 복합체의 형성 확인은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 검체 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 초유, 관절액, 타액, 분변, 세포 배양 상등액 및 식품으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 수탁번호 KCTC 12700BP로 기탁된 하이브리도마에 의하여 생산되고, 75 kDa의 분자량을 갖는 스타필로코커스 아우레우스 세포벽-결합 단백질(Cell wall-associated protein)을 항원으로 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 모노클로날 항체 7D6을 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 검출하기 위한 검출키트.
  6. 수탁번호 KCTC 12700BP로 기탁된 하이브리도마에 의하여 생산되고, 75 kDa의 분자량을 갖는 스타필로코커스 아우레우스 세포벽-결합 단백질(Cell wall-associated protein)을 항원으로 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 모노클로날 항체 7D6을 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Infection and Immunity, Vol 80, Pages 3460-3470(2012.10.)
The Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Vol 48, Pages 523-533(2000.)
포스터 발표초록, Page 89, P-10-057, 2014 81th Annual Meeting(2014.04.28.)

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