JP2021503014A - 牛妊娠関連グリコタンパク質1に特異的に結合する抗体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
1−1.bPAG1_100
準備例の抗原(bPAG1_100)100μlと、同量のコンプリートアジュバント(complete adjuvant)とを利用して抗原乳化液を作った後、8週齢のメスマウス(BALB/C)皮下に投与し、免疫反応を誘導した。一次投与後、2週間隔で、同一抗原100μlと、同量のインコンプリートアジュバント(incomplete adjuvant)とを利用し、前記マウスの皮下に投与した。抗原投与日程などに係わる事項は、下記表1に示されている通りである。
抗原bPAG1_100−KLHを使用したという点を除いては、前記実施例1−1と同様方法で遂行した。
抗原bPAG1_300を使用したという点を除いては、前記実施例1−1と同様方法で遂行した。
抗原bPAG1_300−KLHを使用したという点を除いては、前記実施例1−1と同様方法で遂行した。
2−1.bPAG1_100
前記実施例1−1の抗原投与を3回進めた後、前記マウスの尾静脈から血清(serum)を少量採血し、ELISA testを介し、血清内多クローン抗体の力価を確認した。具体的には、bPAG1_100抗原2μg/mlを、ウェル当たり100μlずつ4℃で18時間反応させた後、コーティングした。翌日、ブロッキングバッファ(blocking buffer)を利用し、室温で1時間反応(blocking)させた。その後、マウス血液から得た血清を使用し、倍率に合うように希釈し、ウェルに100μlを分注した後、1時間室温で反応させた。反応が完了したプレートは、PBSTを使用して洗浄した後、HRPがコンジュゲーション(conjugation)されているヤギ抗マウスIgG−HRPを、1:2,000比率で希釈し、ウェルに100μlを分注し、室温で1時間反応させた。その後、PBSTを使用して洗浄し、TMB溶液を分注し、15分間反応させた後、反応停止液を使用して反応を終結させた。450/620nmで吸光度値を測定し、血清内力価(titer)を確認し、その結果を下記表2及び表3に示した。
抗原bPAG1_100−KLHを使用したという点を除いては、前記実施例2−1と同様方法で遂行した。
抗原bPAG1_300を使用したという点を除いては、前記実施例2−1と同様方法で遂行した。
抗原bPAG1_300−KLHを使用したという点を除いては、前記実施例2−1と同様方法で遂行した。
3−1.ハイブリドーマ細胞の製造
前記実施例2の抗体力価確認実験を介して確認されたマウスの血清内力価を基準に、高力価を有する抗体が生成されたことを確認し、前記マウスのリンパ球を分離し、細胞融合を実施した。具体的には、前記実施例1−1ないし1−4において、免疫反応が誘導されたマウスの脾臓を、損傷なしに摘出し、DMEM(Dulbecco/Vogt modified Eagle’s minimal essential medium)培地で洗浄し、リンパ球を分離し、60mmディッシュ(dish)にDMEM培地を入れ、単一細胞に分離させた。その後、RBC溶解バッファ(lysis buffer)を使用し、リンパ球に混ざっている赤血球を除去した後、DMEM培地で洗浄し、準備された骨髄腫細胞(myeloma cell;SP2/0 Ag 14−ATCC #CRL−1581)とリンパ球とを、細胞数対比で1:5で混合した。その後、前記混合された細胞にPEG1500 1.7mlを添加して細胞融合を誘導し、96ウェルプレートに、ウェル当たり200μlずつ細胞を分注した後、CO2インキュベータ(incubator)で培養した。細胞融合2日後、各ウェル当たり50%を、HAT培地(hypoxanthine-aminopterinthymidine medium)に交換し、12日後、コロニー(colony)を確認し、bPAG1タンパク質ペプチド(ELISA確認用抗原)との反応いかんを、前記実施例2と同一ELISA(Asb.450nm)方式で進めて決定した。前記ELISAの結果において、O.D値を基準に、1.0以上である場合、陽性(positive)と選定し、単一クローン抗体を生産するための母細胞として選定し、その結果を下記表4に示した。
前記実施例3−1で製造した融合細胞群において、bPAG1にのみ特異的に反応する細胞を選別し、抗体生成いかんを確認するために、酵素免疫方法を利用してスクリーニングした。
前記実施例3−2で最終選択した融合細胞から、bPAG1のタンパク質に係わる単一クローン抗体を量産するために、6週齢マウス(BALB/C)の腹腔に、0.5mlインコンプリートアジュバントを投与した。3日後、前記実施例3−1で選定されたハイブリドーマ細胞において、O.D値が高いと確認されたそれぞれの細胞を、マウス1匹当たり100μl(1x106cell)ずつ投与した。6〜10日後、前記マウスの腹腔から腹水(ascite)を採取した。
前記実施例3で選別した融合細胞から、bPAG1に特異的に結合する抗体を分離するために、透析パック(dialysis pack)に、注射器を使用して腹水を入れておいた。その後、2mM PB 2Lをビーカに入れ、マグネチックバーと試料とが入っている透析袋を入れた後、4℃で3〜4日間透析した。ここで、バッファは、1日に1回ずつ交換した。透析が完了した後、透析液内に存在した液体を収去して遠心分離した後、上澄み液を収去し、タンパク質の定量を行い、さらにメンブレン上で抗原・抗体反応を確認した。
抗体生産に使用したペプチドを使用し、エピトープマッピング(epitope mapping)を実施した。マッピングに使用されたペプチドは、既存抗原生産に使用されたPAG1タンパク質の100,300sizeの一部のみを使用し、下記表6に示されているように、4種類で進めた。
前記実施例3で選別した抗体を利用し、妊娠した牛の血液内に存在すると知られているbPAG1を検出した。具体的には、前記抗体をメンブレンに分注し、金粒子が結合された抗原結合部位の異なる抗体を利用し、人工受精後6週、7週及び8週になった牛の血液を採取し、遠心分離して血清を分離した。分離された血清0.05mlを、簡易製造したキットの検体積載部にローディングし、15分経過した後で結果を判定した。
Claims (9)
- 牛の妊娠関連グリコタンパク質1(bPAG1)タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体は、配列番号1のアミノ酸配列を有するエピトープポリペプチドに特異的に結合するものである請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体の重鎖は、免疫グロブリンM(IgM)である請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片は、受託番号KCLRF−BP−00416であるハイブリドーマ細胞によって生産されるものである請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- bPAG1タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を生産するハイブリドーマ細胞(受託番号KCLRF−BP−00416)。
- bPAG1タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む牛の妊娠診断のための組成物。
- 請求項6に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む牛の妊娠を診断するためのキット。
- 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片を検体試料に接触させる段階と、および前記抗体または抗原結合断片に結合されたbPAG1タンパク質を検出する段階と、を含む牛の妊娠を診断する方法。
- 前記検出する方法は、酵素免疫分析法(ELISA)、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光、免疫組織化学染色、流細胞分析法、免疫細胞化学法、放射能免疫分析法(RIA)、免疫沈澱分析法、免疫拡散分析法、補体固定分析法及びタンパク質チップからなる群のうちから選択されたいずれか一つを遂行することを含むものである請求項8に記載の牛の妊娠を診断する方法。
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