JPH01291790A

JPH01291790A - 新しいモノクローナル抗体およびハイブリドーマ

Info

Publication number: JPH01291790A
Application number: JP63120508A
Authority: JP
Inventors: Kahori Yoshinari; 吉成　河法吏; Masayo Kondou; 真代近藤
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1988-05-19
Filing date: 1988-05-19
Publication date: 1989-11-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、癌血清診断に有用なモノクローナル抗体およ
び該抗体を分泌するハイブリドーマに関する。

（従来の技術）癌の血清診断において、今まで癌関連抗原として、アル
ファ７エトプロテイン（ＡＦＰ’）、カルシノエンプリ
オニツクアンチゲン（ＣＩＡ）が知られてい友。さらに
、　１９８０年に入って膵癌の血清診断に有用な癌マー
カーとしてＣＡ１９−９が発見され（Ｂ、　Ｆ、　Ａｔ
ｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、
、　４２゜４ａｚｏ（１９ｓｚ）：）、癌血清診断薬は
ますます癌の臨床における重要性を高めている。

（発明が解決しようとする課題）しかしながら、既知の癌マーカーおよびヤれらに対する
定量キットだけでは、各種癌に対して充分な診断が可能
ではない。たとえば、肝癌の診断にＡＦＰがよく用いら
れているが、肝癌以外の肝疾患で４陽性となる場合があ
シ、充分満足できる肝癌マーカーではない、したがって
１本発明者らは。

広範囲の癌に対して、もしくは特定の癌に対して陽性率
および癌特異性のさらに良好な新規癌血清抗原（癌マー
カーＡＴＭ−１）を発見し、該抗原に対する定量キット
を、モノクローナル抗体を用いて開発した（％願昭６２
−２１９２１５）。該新規癌血清抗原ＡＴＭ−１に対し
て、親和性のよシ高いモノクローナル抗体が得られれば
、該定量キットは、その性能が一段と向上するので、新
規モノクローナル抗体の作製が強く求められている。

（課題を解決するための手段）モノクローナル抗体ＮＭ２４は、このような観点から、
ヒト癌抗原に対するモノクローナル抗体を多数作製し、
癌血清診断定量キットの性能向上を指標として、モノク
ローナル抗体の検索を行なった結果得られたものである
。すなわち、ヒト膀胱癌細胞ＮＢＴ−２由来のＣｏｎ　
Ａ結合性糖たんばくをＢａ１ｂ／ｃマウスに免疫し、免
疫マウス牌細胞とマウスミエローマ株Ｐ３Ｕ１を融合さ
せて得られた多数のハイブリドーマをスクリーニングす
ることにより、ヒト癌抗原に対して親和性の高いモノク
ローナル抗体産生ハイプリドーマを得た。該モノクロー
ナル抗体を用いて、エンザイムイムノアツセイ（ＥＩＡ
）の系を作製し、各種血清中のＡＴＭ−１量を定量した
ところ、従来のｇＩＡに比して性能が一段と向上するこ
とが判明した。

すなわち１本発明は、寄託番号（微工研菌寄第９９９８
号）のハイブリドーマおよび該ノーイブリドーマが分泌
するモノクローナル抗体に関するものである。

（発明の効果）本発明の糖たんばく抗原（ＡＴＭ−１）に対するモノク
ローナル抗体を用いて、イムノアッセイキラ）（ＥＩＡ
キット）を作製し、各種癌患者血清ＡＴＭ−１量を測定
したところ、感度が２倍程度上昇し、ＡＴＭ−１癌マー
カーの検出に、非常に有用であることが判明した。した
がって、該モノクローナル抗体を用いたＥＩＡキットを
使用することにより、肝癌、乳癌、胃癌、肺癌等の癌血
清診断を、高感度に行なうことができることになる。

（実施例）以下１本発明の実施例について説明する。

実施例１（ＡＴＭ−１抗原の定量）（１）モノクローナル抗体の製造ＮＭ２４上２４モノクローナル抗リドーマ５　Ｘ　１　０”個をＲＰＭＩ培地０．５−に
浮遊させる。これを１週間前にグリスタン（　２，６，
１０．１４−テトラメチルペンタデカン、シグマ製，　
Ｕ．Ｓ．Ａ．）０、５−を腹腔内投与したＢ　Ａ　Ｌ　
Ｂ　／　ｅマウス腹腔に投与した。１０日後に腹水の貯
留が認められた。

腹水を注射器で採取した後．１１０００ｒｐ．１０分遠
心分離し．１匹あた＃）３−の腹水を得た。これに等量
の２　０　ｍＭ　）リス塩酸バッファー（ｐＨ７．４。

２　０　ｍＭ　　ＮａＣｔ）　′ｆｒ加え、水冷下で５
０ｆｉ飽和度となるように硫安を添加し．１時間保持し
た。

１１００００ｒｐ，１０分間遠心分離し．上清をすて、
ベレットを２　０　ｍＭ　）リス塩酸バッファー（　ｐ
Ｈ　７．４　、　２　０ｍＭ　ＮａＣＬ　）に溶解させ
、溶解液を２　０　ｍＭ）ソー４２バツフアー（　ｐＨ
７．４　、２　０ｍＭＮａＣ１　）に対して透析して硫
安を除去した。これをあらかじめ２　０　ｍＭ　）　！
Ｊス塩酸バッファー（ｐＨ７、４．　２　０　ｍＭ　　
ＮａＣｔ）で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（フ
ァルｉシア社製，スウェーデン）（ゲル量２０ゴ）に流
し、不純たんばくを５００−の２　０　ｍＭ　トリス塩
酸バッファー（　ｐ　Ｈ　７．４　。

２　０　ｍＭ　　ＮａＣ１　）を流して除去し友。２　
０　ｍＭ　）リス塩酸バッファー（　ｐ　Ｈ　７．４　
、　１　０　０　ｍＭ　ＮａＣ２）１０（ｌｄを流して
ＩｇＧを遊離させ、ＩｇＧ分画を得た。これをアミコン
ＰＭ−１０でＩＩＩ縮シ．リン酸バッファーで置換した
。このようにしてＮＭ２４上２４モノクローナル抗１０ｍ９得た。

（２）　　アッセイブレートの作製ＮＭ２４抗体あるいはＮ７０７２抗体を１０ｍＭリン酸
バッファー（ｐＨ７．４）で希釈して５０μｔ／−の濃
度にする。これをイミュロン６００ー２００μｍ９６穴
プレート（グライナー社製，西ドイツ）の各ウェルに１
００μｔずつ分注し、４ｃで２日間放置し，抗体をルー
トに結合させた。リン酸バッファーで１回洗浄した後．
１俤牛血清アルブミン含有リン酸バツフアー（ＢＳＡ−
ＰＢＳ）２００μｔを各ウェルに分注し，４ｃで放置し
ブロッキングを行なった。

（３）パーオキシダーゼ結合二次抗体の調製Ｎ２４２１
モノクローナル抗体に標識剤としてパーオキシダーゼを
結合する方法は，公知の方法（　Ｅ．　Ｉｓｈｉｋａｗ
ａ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｊ．　Ｉｒｒｍｕｎｏａｓｓａｙ
　４　、　２　０　９（１９８３））を用いて行なった
。０．１Ｍリン酸バッファー（ｐ　）１６．５　）で透
析したＮ２４２１モノクローナル抗体Ｐ２ｉ、（１０ｒ
ｓ９／ｌｒｔ　）を−に対し。

Ｓ−アセチルメルカプト無水コ／Ｓり酸９．１！ｎｇを
Ｎ、Ｎ−ジメチルフォルムアミド１５０μｔに溶解させ
た液２０μｔｔ添加し、マグネチツクスクーラーで攪拌
しながら室温で５０分間反応させた。反応液に、　　０
．１’Ｍ　）リスー塩酸バッファー（ｐ　Ｉ’ｌ　７．
ｏ）を２００μｔ、０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７，０）を
４０μ４１　Ｍヒトロチジルアミン溶液（ｐ）１７．Ｏ
’ｌを１００μを添加し、振盪しながら、５０Ｃで４分
間民心させた。反応液をアミコンＰＭＩＯにより０．１
Ｍす／酸バッファー（ｐ　Ｈ６，０、５ｍＭ　ＥＤＴＡ
　）に置換し、最終量１Ｗｔのチオール基導入Ｎ２４２
１抗体を得た。

一方、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）３ゴに
パーオキシダーゼ（シグマ製、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　’）　
　２０　ｍ４を溶解した液に対して、Ｎ−サクシニミジ
ル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレート１６■をＮ、Ｎ−ジメチルフォルムア
ミド２００μｔＫ溶解した液を添加し、振盪しながら３
０Ｃで２時間反応させた。ｓ　ｏ　ｏ　ｏ　ｒｐｍ。

１０分間遠心分離して沈殿を除去し、上清をアミｊ：／
ＰＭＩＯで０．１Ｍす／１１！バッファー（ｐＨ６、ｏ
　）　Ｋ置換し、最終１−のマレイミド基導入パーオキ
シダーゼを得た。両者を混合し、３０Ｃで１時間反応さ
せた後、セファロース６Ｂ（ファルマシア社鯛、スウェ
ーデン）カラムにアプライし。

０．１　Ｍリン酸バッファーでゲルクロマトグラフィー
を行ない１分子量２０万のパーオキシダーゼ結合　Ｎ２
４２１モノクローナル抗体の分画を得た（　２００　ａ
ｓ’／ｄＸ１５ｍ　）。

（４）ＡＴＭ−１に対する免疫測定法前記（２）で作製したアッセイプレートをリン酸バッフ
ァーで５回洗浄したｉ、ＮＥＴ−２培養上清より精製し
たＡＴＭ−１を、０．５１　Ｂ　Ｓ　Ａを含有するリン
酸バッファー（ＢｓＡ−ｐＢ）で１０倍希釈し、１００
ｕ／−の標準ＡＴＭ−１液を作製。

これをＢＳＡ−ＰＲで倍々希釈した系列を調製し。

トリプリケイトで６０μｔずつアッセイプレートの各ウ
ェルに分注し、室温で１５時間放置してサンプル中のＡ
ＴＭ−１をアッセイプレート底面に結合した一次抗体に
結合させた。リン酸バッファーで５回洗浄した借、前記
（３）で調製したパーオキシダーゼ結合Ｎ２４２１モノ
クローナル抗体液を、０．１Ｍリン酸バッファー（０，
２慢ＢＳＡ、１４マウス血清、ｐＨ７，ｏ）で１０倍希
釈した二次抗体液８０μｔを各ウェルに分注、室温で２
時間放置した。アッセイプレートをリン酸バッファーで
７回洗浄し、パーオキシダーゼ基質液１００μｔを添加
し１発色させた。基質液は０．１Ｍクエン酸−Ｎ　ａｌ
　ＨＰ　０４バツフアー（ｐＨ５，０）１［１−にｏ−
フェニレンジアミン５０〜を溶解させた液に、５０チＨ
１０，液１０μｔを添加した蒸留水１０＋＋ｔｇを混合
して調製した。５Ｑ分後に、ｌＮ−ＩＣ２を各ウェルに
１００μを添加して反応を停止させ、４９２μｍＫおけ
る吸光度をＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、　Ｕ、Ｓ、Ａ
、　’）　テ測定し。

三重測定の平均値を計算して求めた。なお、コントロー
ルとしては、ＢＳＡ−ＰＲをサンプルのかわシに添加し
たウェルを用いた。結果を第１図に示した。第１図にお
いて、黒丸がＮＭ２４．白丸がＮ７０７２に対応するも
ノテあるが、Ｎ７０７２抗体を１次抗体として用いた場
合よシも、ＮＭ２４抗体を１次抗体として用いた場合の
方法が。

ＡＴＭ−１の定量感度が約２倍上昇した。

なお、前記ＡＴＭ−１ＯＮＢＴ−２培養上清からの１′
ｆＩａｈ、次のようにして行なった。

ヒト膀胱癌細胞株ＮＢＴ−２を１×１０う／−の細胞ａ
置で１０嗟牛脂児血清（Ｆｅ２　’ｌ添加ＲＰＭ１１６
４０培地にツスイ美２日本）に浮遊させ、培養びん（Ｎ
ｕｎｃ　５６５０２．デンマーク）中で３７ｔ、　５チ
ＣＯｔ下で５日間培養を行なった。培養上清は８００　
ｒｐｍ、　１０分の遠心分離を行なって細胞を除去した
ｔｚ、ｓｔの培養上清に対してｓｏ、５のＣｏｎ　Ａ−
セファロース（ファルマシア社製、スウェーデン）を添
加し、４Ｃで１５時間振盪して。

培養上清中の糖たんばく質をＣｏｎ　Ａ−セファロース
に結合させた。

培養上清をガラスフィルター（バリオＧ５．ｙバタ科学
２日本）上で吸引濾過し、ガラスフィルター上のＣｏｎ
　Ａ−セファロースビーズに３ｔのリン酸バッファーを
流下させ、不純物を除去した。

Ｃｏｏ　Ａ−セファロースビーズを集め、０．２Ｍα−
メチルマンノース（シグマ社製、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　含
有リン酸バッファー５００−に浮遊させ、室温で２時間
振盪してＣｏｎ　Ａと弱く結合している糖たんばく質を
遊離させた。ガラスフィルター上で吸引−過したｆｆ１
．ｃｏｎＡ−セファロースビーズを集め。

０．４Ｍα−メチルマンノース含庸リン酸バッファー５
ＱＯｄに浮遊させ、室温で２時間振盪した優。

ガラスフィルター上で濾過してＣｏｎ　Ａ弱結合性のＥ
ＩＡ阻害物質を除去した。

次に、集めたＣｏｎ　Ａ−セファロースビーズを５００
−の０量５Ｍα−メチルマンノース含有リン酸バッファ
ーに浮遊書せ、室温で２時間振盪させた後、ガラスフィ
ルターで吸引濾過し、溶出液を得た。溶出液をアミコン
ＰＭ１１Ｊ（アミコン社製。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）で濃縮し、リン酸バッファーで置換して
。

最終１ｉｔ５１Ｒｔのｆ＃ｆｉＡＴＭ−１を得た。不易
の２８０ｎｍの吸光度で測定したたんば＜Ｓ度はｔ、２
ｍ９７ｓ＜であった。

実施例２（癌患者血清中のＡＴＭ−１定量による癌診断）各種癌
患者血清中のＡＴＭ−１−ｊｉを測定し。

ＮＭ２４モノクローナル抗体の有用性を調べた。

各種血清を０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）で
６倍希釈し、実施例１に示した免疫測定法によりＡＴＭ
−１量を測定した。検量線作成用の標準ＡＴＭ−１とし
ては、ＯＤ値が０である６倍希釈健常人血清を選択し、
これに実施例１で調表したＮＢＴ−２培養上清由来のＡ
ＴＭ−１（１０００ｕ／−）を、１００，５０，２５，
１２．５１７−となるように添加して用いた。すべての
サンプルは三重測定で測定を行ない、得られた三重測定
平均ＯＤｌ’［よりあらかじめ作成した検ｔｈ１線によ
り、ＡＴＭ含量を６倍希釈血清１ゴ中のユニット数とし
て求めた。５ｕ／−をカットオフ値とすると。

乳癌血清２０検体中１６点（陽性率８０９６）、胃癌血
清３０点中２１点（７０％）肺癌血清１８点中１０点（
５６チ）肝癌血清２０点中１８点（９０チ）となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は免疫測定法で得られたＡＴＭ−１ｆｌと吸光度
ＯＤ４１！の関係を示す検量線のグラフである。第１図ＡＴＭ　−１（ｕ　／ｍｆ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）寄託番号「微工研菌寄第９９９８号」のハイブリ
ドーマ。
（２）特許請求の範囲第１項に記載のハイブリドーマが
分泌するモノクローナル抗体。