CN111587252A

CN111587252A - 与牛妊娠相关糖蛋白1特异性结合的抗体及其用途

Info

Publication number: CN111587252A
Application number: CN201880074377.8A
Authority: CN
Inventors: 金奉辉; 河英柱; 金世泳; 金志娜
Original assignee: Sls Biology Ltd
Current assignee: Sls Biology Ltd
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2038-11-08
Also published as: CA3082923A1; EP3712167A4; WO2019098603A2; CN111587252B; JP7013051B2; AU2018370072B2; US20200326347A1; US11953504B2; JP2021503014A; KR20190055741A; CA3082923C; AU2018370072A1; KR102189893B1; WO2019098603A3; EP3712167A2

Abstract

本发明涉及一种与牛妊娠相关糖蛋白1(bovine Pregnancy‑associated glycoprotein 1，bPAG1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段；产生所述抗体的杂交瘤细胞；包括所述抗体作为有效成分的用于诊断牛妊娠的组合物；用于诊断牛妊娠的试剂盒；以及诊断牛妊娠的方法。由于所述抗体与牛妊娠血浆蛋白bPAG1特异性结合，因此可以容易地诊断对繁殖很重要的牛等动物的妊娠，从而可以通过提高繁殖效率而有效地应用于畜牧业。

Description

与牛妊娠相关糖蛋白1特异性结合的抗体及其用途

技术领域

本申请要求于2017年11月15日提交的韩国专利申请第10-2017-0152257号的优先权和权益，其通过引用合并于此用于所有目的，如同在此完全阐述一样。

本发明涉及一种与牛妊娠相关糖蛋白1(bovine Pregnancy-associatedglycoprotein 1，bPAG1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

背景技术

在作为工业动物的牛的饲养中，农家收入主要通过生产小牛来实现。另一方面，在繁殖牛时，进行受孕很重要，但如果早期诊断出受精的牛是否怀孕，则可以在早期阶段对非受孕动物进行单独管理并减少空怀期间，从而也可以降低农家成本。目前，大多数的牛妊娠通过兽医或人工授精师在怀孕30天到42天之间进行的胎膜触诊法来诊断。另外，还有一种使用放射免疫分析法(radiommunoassay，RIA)检测牛奶中孕酮的方法。根据该方法，孕酮为妊娠的正常进展和维持所需的类固醇类激素，由于孕酮的血清滴度在孕早期升高，因此可以确认牛奶中所述激素的增加程度。然而，所述放射免疫分析法的问题在于，不仅因为使用放射性物质而具有危险性，还需要使用复杂的实验设备，并由于每头牛的孕酮含量不同且标准不清楚，因此至少需要进行两次实验才能进行准确诊断。因此，除了解决现有问题外，还需要开发一种新的方法，以使得可以在早期阶段更轻松快速地准确诊断牛的怀孕。

发明内容

技术问题

本发明一方面提供一种与牛妊娠相关糖蛋白1(bovine Pregnancy-associatedglycoprotein 1，bPAG1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

本发明另一方面提供一种产生与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞(保藏号为KCLRF-BP-00416)。

本发明另一方面提供一种组合物，其包括与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

本发明另一方面提供一种用于诊断牛妊娠的试剂盒，其包括上述组合物。

本发明另一方面提供一种诊断牛妊娠的方法，其包括：将与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段与受试体试料接触；以及检测与所述抗体或抗原结合片段结合的bPAG1。

技术方案

本发明人通过制备产生与牛妊娠血浆蛋白bPAG1特异性结合的新型单克隆抗体的杂交瘤细胞，从所述细胞中分离并纯化所述大量抗体，使用相对简单的方法确认牛是否怀孕来完成本发明。

在本说明书中，术语“牛妊娠相关糖蛋白1(bovine Pregnancy-associatedglycoprotein 1，bPAG1)”为牛妊娠血浆蛋白，其统指随着怀孕而出现或增加的血流蛋白。所述bPAG1包括蛋白质的天然形式、其变体及其功能等同物。所述bPAG1可以从天然细胞或重组细胞中分离，也可以人工合成。

在本说明书中，术语“抗体”是指与单个抗原位点特异性结合的抗体。除非另有说明，否则所述抗体可以为包括由本领域已知的重链多肽和轻链多肽形成的抗原结合特异性位点的分子或其抗原结合片段。所述抗体可以由浆细胞(plasma cell)或杂交瘤细胞产生。所述抗体可以为单克隆抗体(monoclonal antibody)。具体地，其可以为与由保藏号为KCLRF-BP-00416的杂交瘤细胞产生的bPAG1特异性结合的单克隆抗体。在本说明书中，术语“抗原-抗体复合体”是指bPAG1和将其识别的抗体的结合物。所述复合体可用于检测试料中的bPAG1。所述复合体可用于例如检测生物试料(如牛的尿、血清或血浆)中的bPAG1。

本发明一方面提供一种与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。具体地，根据本发明的抗体可以包括抗原结合片段，只要所述抗体可以选择性地识别牛妊娠血浆蛋白bPAG1即可，并且所述抗原结合片段可以包括F(ab')2、Fab、Fab、Fv片段等。

在一实施例中，通过分析与针对bPAG1的单克隆抗体特异性结合的表位(epitope)的结果，可以确认与所述抗原特异性结合的抗体的量根据抗原的浓度而增加。尤其，在相同的抗原浓度下，与具有序列号2至4的氨基酸序列的多肽相比，所述抗体与具有序列号1的氨基酸序列的多肽的特异性结合量明显更高。因此，与所述bPAG1特异性结合的抗体可以与具有序列号1的氨基酸序列的表位多肽结合。另外，所述抗体的完整形式为具有两个全长轻链和两个全长重链的结构，并且每个轻链与重链可以通过二硫键连接。所述重链可以为包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3的全长重链及其片段，其中，所述可变区结构域包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。所述轻链可以是指包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL的全长轻链及其片段，其中，所述可变区结构域包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。此时，所述重链包括伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)和伊普西龙(ε)的恒定区，而轻链包括卡帕(κ)和兰布达(λ)型的恒定区。所述抗体可以例如为免疫球蛋白M(IgM)。

本发明另一方面提供一种产生与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞(保藏号为KCLRF-BP-00416)。所述与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的具体内容如上所述。具体地，在本发明一实施例中，在获得小鼠脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合培养后，仅选择鉴定出与牛妊娠血浆蛋白bPAG1特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。然后，将所述杂交瘤细胞保藏于韩国细胞系研究基金会(Korean Cell Line ResearchFoundation，KCLRF)，并于2017年12月22日获得保藏号KCLRF-BP-00416。

产生所述抗体的杂交瘤细胞可以用于将其在体外或体内大量培养。由所述杂交瘤细胞产生的抗体可以不经纯化而使用，但为了获得最佳结果，可以根据已知的方法通过以高纯度例如95％以上的纯度进行纯化来使用。可以使用纯化方法例如透析、盐沉淀和色谱法等从培养基或腹水(ascites fluid)分离所述抗体。

本发明另一方面提供一种用于诊断牛妊娠的组合物，其包括与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。所述与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的具体内容如上所述。所述组合物可以包括用于抗体的载体，例如稀释剂、缓冲剂、稳定剂等。所述组合物可以包括用于检测抗原-抗体复合体的检测试剂。

本发明另一方面提供一种用于诊断牛妊娠的试剂盒，其包括所述抗体或抗原结合片段。所述与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的具体内容如上所述。具体地，根据本发明的用于诊断牛妊娠的试剂盒可以包括特异性识别bPAG1的抗体或其抗原结合片段以及用于免疫学分析的工具或试剂。所述抗体可以与具有序列号1的氨基酸序列的表位多肽特异性结合。此时，用于免疫学分析的工具或试剂可以包括合适的载体、可以产生可检测信号的标记物质、增溶剂和清洁剂等。当所述标记物质为酶时，所述试剂盒可以包括可以测量酶活性的底物和反应终止试剂等。

所述载体为可溶性载体，例如本领域已知的生理学可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、不溶性载体，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、如乳胶中镀有金属的磁性细颗粒的高分子、其他纸张、玻璃、金属、琼脂糖及其组合。

本发明另一方面提供一种诊断牛妊娠的方法，其包括：将与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段与受试体试料接触；以及检测与所述抗体或抗原结合片段结合的bPAG1。所述与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的具体内容如上所述。

根据一实施例的诊断牛妊娠的方法包括将与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段与受试体接触的步骤。所述试料可以为从牛分离的生物试料。具体地，所述试料可以为要确认妊娠与否的牛的乳汁、组织、细胞、血液、血清、血浆、唾液或尿液。所述接触的步骤可以为在液体介质中孵育所述抗体或其抗原结合片段和试料。所述孵育可以在适合试料中抗原和所述抗体之间的抗原-抗体结合的温度、pH和搅拌条件下进行。所述孵育可以在2℃至37℃下进行。所述孵育可以在pH6至pH8下进行。

根据一实施例的诊断牛妊娠的方法包括检测所述抗体或抗原结合复合体的步骤。所述检测的步骤可以通过直接分离抗原-抗体复合体以确认其存在来进行，或者通过分离或不分离而进行诸如生化学或免疫化学分析等的方法来进行。所述检测方法可以为选自酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹法(stern Blotting)、免疫荧光法(Immunofluorescence)、免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry staining)、流式细胞术(Flow cytometry)、免疫细胞化学法、放射免疫分析法(RIA)、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation Assay)、免疫扩散分析法(Immunodiffusion assay)、补体固定分析法(Complement Fixation Assay)和蛋白芯片((Protein Chip)中的任何一种。

在所述方法中，抗原-抗体复合体可以用可检测标记(detectable label)或可以产生可检测标记的物质标记。所述可检测标记或可以产生可检测标记的物质可以选自酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒(microparticle)、氧化还原分子和放射性同位素。所述酶可以例如为β-葡萄糖醛酸苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDPase、RNase、葡萄糖氧化酶和荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶、β-内酰胺酶或其组合。所述荧光物质包括但不限于荧光素、异硫氰酸酯、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝素、邻苯二甲醛、荧光胺等。配体包括生物素衍生物等。所述发光物质包括吖啶酯、荧光素和萤光素酶等。所述微粒包括但不限于胶体金和经着色的乳胶等。氧化还原分子可以为二茂铁、钌络合物、紫精、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、对苯二酚、K₄W(CN)₈、[Os(bpy)₃]²⁺、[RU(bpy)₃]²⁺或[MO(CN)₈]^4-等。所述放射性同位素可以为³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I或¹⁸⁶Re等。

如上所述，根据本发明的与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段通过与根据牛是否怀孕而出现或增加的血浆蛋白特异性结合来形成抗原-抗体复合体，并且通过对所述抗原-抗体复合体的分析，可以使用相对简单的方法来诊断牛是否怀孕，所以可以通过提高牛的繁殖效率而有效地应用于畜牧业。

有益效果

本发明一方面涉及一种与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中，由于所述抗体与牛妊娠血浆蛋白bPAG1特异性结合，因此可以容易地诊断对繁殖很重要的牛等动物的妊娠，从而可以通过提高繁殖效率而有效地应用于畜牧业。

附图说明

图1示出根据本发明的bPAG1的分子信息。

图2示出同种型筛选测试的结果。

图3示出在分离免疫球蛋白M后通过Bradford测定法确认的结果。在图3中，图3a示出分离后的3B1克隆的定量图标，图3b示出分离后的3B3克隆的定量图标，图3c示出分离和纯化后的抗体在膜上的活性程度的照片。

图4示出针对bPAG1的单克隆抗体的表位分析结果。

图5示出牛妊娠的诊断方法的示意图。

图6示出通过使用简单制备的试剂盒来诊断牛妊娠的结果的照片。

具体实施方式

下面将提供优选实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

【准备例】

用于产生抗体的抗原肽选自bPAG1的第150至200个和第350至400个氨基酸序列中的40个，并根据有无匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)的情况将其分为4种类型。bPAG1片段的氨基酸序列具有序列号5(PAG1_100)和序列号6(PAG1_300)的序列。

【实施例】

实施例1、使用抗原诱导免疫反应

1-1、bPAG1_100

使用100μl准备例的抗原(bPAG1_100)和等量的完全佐剂(Complete adjuvant)制备抗原乳化液后，通过向8周龄的雌性小鼠(BALB/C)皮下施用来诱导免疫反应。第一次施用后，每两周向小鼠皮下施用100μl相同抗原和等量的不完全佐剂(Incomplete adjuvant)。与抗原施用时间表有关的项目如下表1所示。

1-2、bPAG1_100-KLH

除了使用抗原bPAG1_100-KLH以外，以与所述实施例1-1相同的方法进行。

1-3、bPAG1_300

除了使用抗原bPAG1_300以外，以与所述实施例1-1相同的方法进行。

1-4、bPAG1_300-KLH

除了使用抗原bPAG1_300-KLH以外，以与所述实施例1-1相同的方法进行。

【表1】

实施例2、确认抗体的滴度

2-1、bPAG1_100

在将所述实施例1-1的抗原施用三次后，从所述小鼠的尾静脉收集少量血清(serum)，并通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)试验确认血清中多克隆抗体的滴度。具体地，将2μg/ml的bPAG1_100抗原在4℃下以每孔100μl反应18小时，然后进行涂覆。第二天，使用封闭缓冲液(blocking buffer)在室温下反应(blocking)1小时。接下来，使用从小鼠血液中获得的血清根据倍数稀释，并将100μl分配到孔中，然后在室温下反应1小时。使用PBST洗涤反应完成后的板，然后将缀合(conjugation)有HRP的山羊抗小鼠(Goat anti-mouse)IgG-HRP以1∶2000的比例稀释，将100μl分配到孔中，并在室温下反应1小时。此后，使用PBST进行洗涤，分配TMB溶液并反应15分钟，然后使用反应终止液终止反应。在450/620nm处测量吸光度值以确认血清中的滴度(titer)，其结果如下表2和表3所示。

2-2、bPAG1_100-KLH

除了使用抗原bPAG1_100-KLH以外，以与所述实施例2-1相同的方法进行。

2-3、bPAG1_300

除了使用抗原bPAG1_300以外，以与所述实施例2-1相同的方法进行。

2-4、bPAG1_300-KLH

除了使用抗原bPAG1_300-KLH以外，以与所述实施例2-1相同的方法进行。

【表2】

【表3】

其结果如表2和表3所示，可以确认通过bPAG1的抗原性分析合成的PAG1-100和PAG1-300肽产生了大量的bPAG1抗体。

实施例3、制备产生针对bPAG1的单克隆抗体的杂交瘤细胞并分离单克隆抗体

3-1、制备杂交瘤细胞

基于通过所述实施例2的抗体滴度确认实验鉴定出的小鼠血清中的滴度，确认产生了具有高滴度的抗体，并且分离了所述小鼠的淋巴细胞以进行细胞融合。具体地，将所述实施例1-1至1-4中诱导免疫反应的小鼠的脾脏无损伤地取出，并用DMEM(Dulbecco/Vogtmodified Eagle's minimal essential medium)培养基洗涤，分离淋巴细胞，将DMEM培养基置于60mm培养皿(dish)以分离成单细胞。接下来，使用RBC裂解缓冲液(lysis buffer)去除混有淋巴细胞的红细胞后，用DMEM培养基洗涤，并将所准备的骨髓瘤细胞(Myelomacell，SP2/0Ag 14-ATCC#CRL-1581)和淋巴细胞以与细胞数相比为1：5的比例混合。然后，将1.7ml PEG1500添加至所述混合细胞以诱导细胞融合，将细胞以每孔200μl分配在96孔板中，并在CO₂培养箱(incubator)中培养。细胞融合后两天，将每个孔的50％替换为次黄嘌呤-氨基喋呤胸苷培养基(HAT培养基，hypoxanthine-aminopterinthymidine medium)，在12天后检查菌落(colony)，并通过与所述实施例2相同的ELISA(Asb.450nm)方法进行操作来决定是否与bPAG1蛋白肽反应。在ELISA结果中，当基于O.D值为1.0以上时，将其选定为阳性(positive)并选定为产生单克隆抗体的母细胞，其结果如下表4所示。

【表4】

3-2、筛选产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系

在所述实施例3-1中制备的融合细胞组中，选择仅与bPAG1特异性反应的细胞，并使用酶免疫法筛选以确认是否产生抗体。

在细胞融合后第12天更换培养基，并使用更换的培养基作为第一抗体来进行ELISA测试。ELISA测试后，选择对相应抗原呈阳性的孔，并将其转移至24孔中进行培养。再次以相同方法对在24孔中培养的杂交瘤细胞系进行ELISA测试以确认抗体滴度，同时，对产生抗体的细胞系进行第二次筛选。通过ELISA确认24孔中培养的融合细胞的吸光度(O.D值)，仅选择吸光度大于1的融合细胞并将其转移至6孔培养瓶以进行培养，离心后收集上清液并通过ELISA确认来进行第三次筛选。再次将基于第三次筛选选择的融合细胞转移至75T/C培养瓶以进行培养，并通过ELISA确认吸光度，仅选择吸光度大于1的融合细胞。经过所述过程选择的细胞系如下表5所示。

【表5】

bPAG1_100	1A6、2A6、2B6、2C4
		bPAG1_100-KLH	3A6、3B1、3B3、3B5
bPAG1_300	4A1、4A3

如表5所示，最终选择1A6、2A6、2B6、2C4、3A6、3B1、3B3和3B5细胞系作为以bPAG1-100为结合位点的抗体，并选择4A1和4A3细胞系作为以bPAG-300为结合位点的抗体。其中，融合细胞3B1于2017年12月5日保藏于韩国细胞系研究基金会(Korean Cell LineResearch Foundation，KCLRF)(保藏号：KCLRF-BP-00416)。

实施例4、产生和纯化针对bPAG1的单克隆抗体

为了从最终在所述实施例3-2选择的融合细胞中大量产生针对bPAG1的单克隆抗体，将0.5ml不完全佐剂施用于6周龄小鼠(BALB/C)的腹腔。3天后，将鉴定出在所述实施例3-1选择的杂交瘤细胞中O.D值高的每个细胞以100μl(1×10⁶个细胞)施用于每只小鼠。6天至10天后，从所述小鼠腹腔收集腹水(ascite)。

实施例5、分离针对bPAG1的单克隆抗体

为了从所述实施例3中选择的融合细胞中分离与bPAG1特异性结合的抗体，使用注射器向透析包(Dialysis pack)注射腹水。随后，将2mM PB 2L置于烧杯，并放入具有磁条和试料的透析液，然后在4℃下透析3天至4天。此时，缓冲液每天更换一次。透析结束后，收集存在于透析液的液体，进行离心分离并收集上清液以定量蛋白质，并且在膜上确认了抗原-抗体反应。

其结果，如图3a和图3b所示，对3B1融合细胞系而言，每1ml腹水产生约1.5mg抗体；对3B3融合细胞系而言，每1ml腹水产生约2mg抗体。为了通过所述过程确认所分离的抗体在膜上的活性，将少量怀孕牛的血清装载到膜上并进行干燥，然后将结合有金颗粒的每个抗体与展开溶液混合并流动。其结果如图3c所示，在2C4、3B1、3B3和4A1抗体中，可以确认表明与抗原(bPAG1)结合的清晰斑点。

实施例6、分析针对bPAG1的单克隆抗体的表位(epitope)

使用用于产生抗体的肽来进行表位作图(epitope mapping)。作为用于作图的肽，仅使用用于产生现有抗原的PAG1的100、300大小的一部分，并如下表6所示以四种类型进行。

【表6】

肽1	ASSDLWVPSDFCTSPACSTH	序列号1
			肽2	CVRFRHLQSSTFRLTNKTFRI	序列号2
肽3	GAIPRGSEHYVPCSEVNTLP	序列号3
			肽4	CSIVFTINGINYPVPGRAYIL	序列号4

具体地，通过分别在每个100μg/孔的孔中分配25μl、50μl、100μl和200μl来涂覆抗原bPAG1_100和bPAG1_300，然后在室温下反应2小时。接下来，在室温下使用封闭缓冲液来封闭1小时后，使用纯化的样品将100μl分配到孔中，并在室温下反应1小时。然后，用PBST洗涤反应完成的板，将缀合有HRP的山羊抗小鼠(Goat anti-mouse)IgM以1：50000的比例稀释，并将100μl分配到孔中以进行反应1小时。反应结束后，用PBST洗涤，并分配TMB溶液以进行反应15分钟。此后，使用反应终止液终止反应，并在450/620nm处测量吸光度值以确认样品中的滴度。

其结果，如图4所示，可以确认与所述抗原特异性结合的抗体的量根据抗原的浓度而增加。尤其，对肽1而言，与相同抗原浓度的肽2至4相比，与抗原特异性结合的量显着，由此可以看出，这是根据本发明的抗体表位的氨基酸序列。

实施例7、使用分离和纯化的抗体来诊断牛妊娠

通过使用所述实施例3中选择的抗体来检测已知存在于怀孕牛的血液的bPAG1。具体地，将所述抗体分配到膜上，通过使用结合有金颗粒的具有不同抗原结合位点的抗体来进行人工授精，在6周，7周和8周后收集牛的血液，并离心分离出血清。将所分离的血清0.05ml加载于简单试剂盒的受试体加载部分，并在15分钟后判断结果。

其结果如图6所示，可以确认在受精6周后在测试线上产生了条带。即，可以通过使用所述抗体确认牛血液中bPAG1的存在来诊断牛妊娠。

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国际格式

关于根据规则7.1签发的原始保藏的保藏证明

收件单位：SLS生物有限公司(SLSbio)

韩国京畿道龙仁市器兴区东柏中央路16番路16-4ACE东柏大厦1-610

格式BP/4(KCLRF格式17) 单页

<110> SLS生物有限公司

<120> bPAG1特异性单克隆抗体及其用途

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<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bPAG1的表位

<400> 1

Ala Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Ser Asp Phe Cys Thr Ser Pro Ala

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Cys Ser Thr His

20

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bPAG1的表位

<400> 2

Cys Val Arg Phe Arg His Leu Gln Ser Ser Thr Phe Arg Leu Thr Asn

1 5 10 15

Lys Thr Phe Arg Ile

20

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bPAG1的表位

<400> 3

Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro Cys Ser Glu Val

1 5 10 15

Asn Thr Leu Pro

20

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bPAG1的表位

<400> 4

Cys Ser Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly Ile Asn Tyr Pro Val Pro Gly

1 5 10 15

Arg Ala Tyr Ile Leu

20

<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bPAG1_100

<400> 5

Thr Ser Pro Ala Cys Ser Thr His Val Arg Phe Arg His Leu Gln Ser

1 5 10 15

Ser Thr Phe Arg Leu Thr Asn Lys Thr Phe Arg Ile Thr Tyr Gly Ser

20 25 30

Gly Arg Met Lys Gly Val Val Val

35 40

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> bPAG1_300

<400> 6

Ser Glu Val Asn Thr Leu Pro Ser Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly Ile

1 5 10 15

Asn Tyr Pro Val Pro Gly Arg Ala Tyr Ile Leu Lys Asp Asp Arg Gly

20 25 30

Arg Cys Tyr Thr Thr Phe Gln Glu

35 40

<210> 7

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAG1_牛妊娠相关糖蛋白1

<400> 7

Met Lys Trp Leu Val Leu Leu Gly Leu Val Ala Phe Ser Glu Cys Ile

1 5 10 15

Val Lys Ile Pro Leu Arg Arg Leu Lys Thr Met Arg Asn Val Val Ser

20 25 30

Gly Lys Asn Met Leu Asn Asn Phe Leu Lys Glu His Ala Tyr Ser Leu

35 40 45

Ser Gln Ile Ser Phe Arg Gly Ser Asn Leu Thr Thr His Pro Leu Arg

50 55 60

Asn Ile Lys Asp Leu Val Tyr Met Gly Asn Ile Thr Ile Gly Thr Pro

65 70 75 80

Pro Gln Glu Phe Gln Val Val Phe Asp Thr Ala Ser Ser Asp Leu Trp

85 90 95

Val Pro Ser Asp Phe Cys Thr Ser Pro Ala Cys Ser Thr His Val Arg

100 105 110

Phe Arg His Leu Gln Ser Ser Thr Phe Arg Leu Thr Asn Lys Thr Phe

115 120 125

Arg Ile Thr Tyr Gly Ser Gly Arg Met Lys Gly Val Val Val His Asp

130 135 140

Thr Val Arg Ile Gly Asn Leu Val Ser Thr Asp Gln Pro Phe Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ile Glu Glu Tyr Gly Phe Glu Gly Arg Ile Tyr Asp Gly Val Leu

165 170 175

Gly Leu Asn Tyr Pro Asn Ile Ser Phe Ser Gly Ala Ile Pro Ile Phe

180 185 190

Asp Lys Leu Lys Asn Gln Arg Ala Ile Ser Glu Pro Val Phe Ala Phe

195 200 205

Tyr Leu Ser Lys Asp Glu Arg Glu Gly Ser Val Val Met Phe Gly Gly

210 215 220

Val Asp His Arg Tyr Tyr Glu Gly Glu Leu Asn Trp Val Pro Leu Ile

225 230 235 240

Gln Ala Gly Asp Trp Ser Val His Met Asp Arg Ile Ser Ile Glu Arg

245 250 255

Lys Ile Ile Ala Cys Ser Asp Gly Cys Lys Ala Leu Val Asp Thr Gly

260 265 270

Thr Ser Asp Ile Val Gly Pro Arg Arg Leu Val Asn Asn Ile His Arg

275 280 285

Leu Ile Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro Cys Ser

290 295 300

Glu Val Asn Thr Leu Pro Ser Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly Ile Asn

305 310 315 320

Tyr Pro Val Pro Gly Arg Ala Tyr Ile Leu Lys Asp Asp Arg Gly Arg

325 330 335

Cys Tyr Thr Thr Phe Gln Glu Asn Arg Val Ser Ser Ser Thr Glu Thr

340 345 350

Trp Tyr Leu Gly Asp Val Phe Leu Arg Leu Tyr Phe Ser Val Phe Asp

355 360 365

Arg Gly Asn Asp Arg Ile Gly Leu Ala Arg Ala Val

370 375 380

Claims

1.一种与牛妊娠相关糖蛋白1(bPAG1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体与具有序列号1的氨基酸序列的表位多肽特异性结合。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链为免疫球蛋白M(IgM)。

4.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段由保藏号为KCLRF-BP-00416的杂交瘤细胞产生。

5.一种产生与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞(保藏号为KCLRF-BP-00416)。

6.一种用于诊断牛妊娠的组合物，其包括与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

7.一种用于诊断牛妊娠的试剂盒，其包括权利要求6的抗体或其抗原结合片段。

8.一种诊断牛妊娠的方法，其包括：将权利要求1的抗体或其抗原结合片段与受试体试料接触；以及检测与所述抗体或抗原结合片段结合的bPAG1。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述检测方法包括进行选自酶联免疫吸附测定法、免疫印迹法、免疫荧光法、免疫组织化学染色法、流式细胞术、免疫细胞化学法、放射免疫分析法、免疫沉淀分析法、免疫扩散分析法、补体固定分析法和蛋白芯片中的任何一种。