CN106831976A

CN106831976A - 奶牛pag1多肽、其多克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN106831976A
Application number: CN201710204079.3A
Authority: CN
Inventors: 赫晓燕; 张昱; 王海东; 牛姝; 曹校瑞
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Jinnong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2037-03-30
Also published as: CN106831976B

Abstract

本发明涉及奶牛PAG1多肽及该多肽的多克隆抗体，所述奶牛PAG1多肽的氨基酸序列为Asn Asn Ile His Arg Leu Ile Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro Cys Ser Glu Val Asn Thr，以所述多肽与载体蛋白交联后免疫动物，收集免疫动物血液制备抗血清，分离纯化得到多克隆抗体。本发明抗体应用于奶牛妊娠检测上，特异性好，效价高，具有很强的应用前景。

Description

奶牛PAG1多肽、其多克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及抗原及其多克隆抗体，特别是涉及针对奶牛妊娠相关糖蛋白的多肽，以该多肽为抗原免疫动物得到的多克隆抗体，以及所述多克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术

随着我国养殖事业向着集约化、现代化方向发展，母畜的繁殖效率越来越受到重视。配种时失配、误配、胚胎早期死亡和屡配不孕等会造成母畜的空怀期延长，从而降低母畜的繁殖率，不利于养殖业发展。因此，母畜在配种后必须进行早期妊娠诊断，以便加强怀孕母畜的饲养管理，保证母畜顺利分娩或对未孕母畜及时配种，缩短产仔间隔，提高繁殖效率。

母牛的妊娠诊断一般采用外部观察法、直肠检查法、超声波妊娠诊断法、激素检查法等方法进行。外部观察法后期比较准确，但不能在早期做出诊断；直肠检查法需要操作人员经验丰富，不利于推广；超声波妊娠诊断法检测月龄较大，不适合早期诊断；激素检查法主要使用孕酮诊断，但妊娠确诊率一直低于未妊娠确诊率，而且主要应用于研究工作。同时，上述方法均存在检测时间长、判断结果不够准确等不足，生产上迫切需要提供一种更好更快的进行早期妊娠诊断的方法。

反刍动物胎儿胎盘的滋养层双核细胞在与母体子宫上皮细胞融合时，会释放包括妊娠相关糖蛋白(Pregnancy-associated glycoprotein，PAG)在内的物质到母畜血液中。这些蛋白质对于胎盘组织来说具有特异性，因此，母体血液中的PAG含量能够作为确诊妊娠的指标。

近20年来，人们对母牛怀孕期间血液中PAG浓度进行了研究。Zoli等利用放射免疫分析(RIA)技术，使用PAG多克隆抗体对母牛血液中PAG含量进行测定，结果发现PAG含量在妊娠20～240d持续增长，在妊娠过程最后10d显著增长，产前5d至产前1d PAG浓度达到峰值；在产后阶段，PAG浓度稳定降低并在生产100d后浓度低至无法测量。Green等使用PAG单克隆抗体开发出了应用酶联免疫吸附(ELISA)技术检测PAG的方法，结果发现，在妊娠24～28d，PAG免疫反应大幅增强，在妊娠第5周时，PAG浓度达到(12.3±4.08)ng/mL，随后开始降低，直到第8周PAG浓度继续增加，在分娩数周前剧烈增加并在产前1周达到最高。

因此，通过测定母畜血液中PAG而确定妊娠，为早期妊娠检测提供了一条有效途径。PAG在妊娠检测中非常有效，因为胎儿的任何紊乱都会导致胎盘功能及其分泌物(如PAG)的紊乱。在发生死胎时，母畜血液中PAG含量与同期妊娠的正常母畜相比迅速下降。在奶牛和绵羊妊娠4周后，可用RIA和ELISA技术从外周血液中检测到PAG的多种亚型，并据此建立多种同源和非同源的抗体以检测牛、绵羊和山羊血液中的PAG含量。其中，使用PAG-ELISA法检测PAG含量已成为目前国际上比较流行的奶牛早期妊娠诊断方法。

Juan等(Accuracy of pregnancy specific protein-B test for earlypregnancy diagnosis in dairy cattle. Theriogenology, 2010, 74(1): 932-939)采集妊娠第28、30和35d时的奶牛血样，用ELISA法检测血样中PAG含量，而且假定这些牛都已受孕、可能受孕、不一定受孕或没有受孕，血样采集后立即进行直肠超声波扫描以进行怀孕诊断，结果作为PAG对照的标准检测。结果显示，发情周期第28d时，经诊断有46.3%怀孕，且PAG敏感性达93.9%，与第30和35d的敏感性相似。由此可知，PAG的ELISA检测是对于交配后第28、30和35d奶牛妊娠诊断的一种灵敏、特异、精确的检测方法。

Giordano等(Changes in serum pregnancy-associated glycoprotein,pregnancy-specific protein B, and progesterone concentrations before andafter induction of pregnancy loss in lactating dairy cows. J Dairy Sci, 2012,95(2): 683-697)采集了61头人工授精后第20、22、25、27d牛的血样，其中奶牛56头、肉牛5头，这些牛在人工授精39d通过超声波检测确认怀孕，并用ELISA法检测PAG含量，结果表明从配种25d开始，PAG含量明显增加。

李艳艳等(牛妊娠相关糖蛋白ELISA对早期妊娠诊断效果的影响. 家畜生态学报,2013, 34(3): 54-57)选取273头配种28和75d的荷斯坦奶牛，分别使用PAG-ELISA法和直肠检查法进行妊娠诊断，旨在评价配种28d奶牛早期妊娠诊断的准确性。结果表明，PAG-ELISA法妊娠诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%，与75d直肠检查结果相同，表明PAG-ELISA法是一种准确的妊娠检测技术，可用于母牛的早期妊娠诊断。同时试验结果未出现假阳性(PAG检测阴性、直肠触诊为妊娠)，这对于牧场繁殖管理至关重要。使用PAG-ELISA试剂盒不会将已孕牛诊断为空怀，从而避免了繁育人员错误的为已妊娠牛进行发情处理，导致已妊娠奶牛流产现象的出现。

国外PAG-ELISA检测试剂盒已经在奶牛早孕诊断方面得到广泛使用，国内也有养殖场引进PAG-ELISA试剂盒做早孕检测。但是目前PAG检测试剂盒及相关抗体产品均未实现国产化，市场上也没有牛PAG抗原及抗体产品在售。免疫学检测的关键就在于是否能得到合适的抗体，只有质量好的抗原和适当的免疫途径才能产生质量好(特异性强和效价高)的抗体。因此，制备高质量的PAG1抗原和针对PAG1蛋白不同抗原表位的抗体，就成为开发奶牛PAG1检测产品的关键。

因此，在奶牛早期妊娠诊断领域，迫切需要制备出牛PAG1的抗原及抗体产品，以用于PAG1免疫产品的开发。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种奶牛PAG1多肽作为新型抗原，进而以该新型抗原免疫动物获得多克隆抗体。

本发明的目的之二是提供所述基于奶牛PAG1多肽的多克隆抗体的制备方法。

本发明的目的之三是提供所述多克隆抗体的用途。

本发明所提供的奶牛PAG1多肽的氨基酸序列如Seq ID No.4所示，具体为Asn AsnIle His Arg Leu Ile Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro Cys SerGlu Val Asn Thr。

继而，本发明以上述奶牛PAG1多肽作为免疫原，对动物进行免疫后，获得了奶牛PAG1多克隆抗体。

本发明所述多克隆抗体的具体制备方法是：将所述奶牛PAG1多肽与载体蛋白交联后得到交联的多肽，以所述交联的多肽为免疫原免疫动物，收集免疫动物血液制备抗血清，将抗血清分离纯化得到所述多克隆抗体。

其中，所述用于交联的载体蛋白优选为KLH。

其中，所述抗血清的分离纯化采用常规技术手段进行，即采用抗原亲和层析法对所述抗血清进行纯化，以得到纯化的多克隆抗体。

本发明上述制备方法中，所述交联的多肽对动物的免疫方法并不是唯一的，可以皮下注射，也可以皮内注射或腹腔注射，免疫剂量由免疫动物的种类而定。

本发明首先设计合成了PAG1多肽，之后以PAG1多肽为免疫原，成功免疫动物获得了纯化的PAG1多克隆抗体，为PAG1免疫检测产品的研发奠定了物质基础。

本发明合成的奶牛PAG1多肽可以作为奶牛妊娠检测试剂使用。大大方便了PAG1检测产品的研发和调试工作，也为抗PAG1单克隆抗体的制作奠定了基础。

具体地，是使用本发明制备的奶牛PAG1多肽或基于奶牛PAG1多肽的多克隆抗体作为奶牛妊娠检测试剂的原材料。

经实验证实，由本发明所得的PAG1多肽具有很好的免疫原性，其PAG1多克隆抗体特异性好，效价高，可以达到1∶102400，具有很强的应用前景。

附图说明

图1是PAG1各纯化多克隆抗体的SDS-PAGE电泳结果（M：蛋白质电泳分子标记；1：anti PAG1-1；2：anti PAG1-2；3：anti PAG1-3；4：anti PAG1(54～380aa)）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案进行进一步的说明。本发明所述实施例仅用于解释本发明，而不应理解为对本发明范围的限制。在不背离本发明技术方案的前提下，对本发明所作出的本领域技术人员容易实现的任何改动，都应认为是本发明的内容。

本发明所述实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1：PAG1多肽的设计与合成。

根据NCBI公布的PAG1氨基酸序列，经大肠杆菌密码子优化，克隆得到Seq ID No.1所示的PAG1重组蛋白。分析PAG1重组蛋白抗原的二级结构及空间分布，确定以PAG1蛋白抗原表位N端284～308位的25个氨基酸作为靶标，其氨基酸序列为Asn Asn Ile His Arg LeuIle Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro Cys Ser Glu Val Asn Thr，如Seq ID No.4所示。最终委托北京华大基因有限公司合成上述多肽，记为anti PAG1-3。

实施例2：PAG1多肽与载体蛋白的交联。

将交联剂SPDP试剂置于室温下复温5min后，取4.6mgSPDP，溶解在740µl DMSO中得到终浓度为20mM的SPDP溶液。

取10mg KLH，溶解在2ml PBS-EDTA溶液中，加入上述SPDP溶液50µl，室温静置1h后，上HiTrap^TM Deaslting column脱盐柱，洗脱掉多余的SPDP，得到偶联的BSA-SPDP。

取4mg上述合成好的多肽，加入偶联的BSA-SPDP体系中室温过夜，得到多肽与KLH偶联的免疫原PAG1-3-KLH。

实施例3：PAG1多肽免疫及制备多抗血清。

取200µg实施例2制备的免疫原，用生理盐水稀释到200～500µl，加入等体积弗氏佐剂(初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂)混匀，形成油包水。免疫动物采用2.0kg左右的新西兰大白兔，将混匀的免疫原进行背部皮下注射免疫，打8～10个点，免疫量400µg蛋白。两周后第一次加强免疫，免疫量200µg蛋白，一个月后第二次加强免疫，免疫量200µg蛋白，一个月后第三次加强免疫，免疫量200µg蛋白。

免疫用兔子免疫前耳静脉取阴性血清。免疫后再耳静脉采血，以间接ELISA法检测免疫血清效价，达到要求后停止免疫。颈动脉放血，收集血液，5000rpm离心10min，两次离心后收取多抗血清。

实施例4：多克隆抗体的纯化。

从4℃冰箱中取出Sulfo-link Gel，颠倒混匀，吸取2ml Sulfo-link Gel悬浮液(浆度50%)到亲和层析柱中，放干柱中溶液，用1体积×3次的偶联缓冲液洗柱。

用偶联缓冲液溶解PAG1多肽得到浓度为1mg/ml(以实际测得为准)的多肽溶液，加入亲和层析柱中，轻轻混匀，室温颠倒混匀1h或4℃过夜，完成偶联过程。以DTNB测定流穿液活性，应为无色，在413nm处的OD值明显下降，表示多肽已经完全偶联到柱料上。用至少5个体积的偶联缓冲液洗去多余的配基，加入封闭液(2ml左右)，轻轻混匀，室温下在混匀器上封闭1h或4℃封闭过夜，封闭未完全的基团。最后用至少5个体积的偶联洗液洗柱，然后用2倍柱体积的储存液平衡。

将实施例3的多抗血清用偶联缓冲液以1∶1稀释，0.22µm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质，得到待纯化的样本。测定样本浓度，计算其中IgG含量，轻轻混匀，室温颠倒混匀1h或4℃过夜。以5～10倍柱体积的纯化洗液洗掉没有结合的样本，收集流穿液并测浓度，当流穿液无浓度时表示已洗杂干净。用0.1M Gly-HCl pH2.2作为洗脱液洗脱下特异性结合的蛋白。收集洗脱峰，测定收集组分中的蛋白质浓度和活性，保存于适当溶液中。

以3～4体积甘氨酸洗柱进行再生，用至少2体积储存液平衡柱子，20%乙醇保存。

实施例5：多克隆抗体比较例的制备。

合成SEQ ID No.1所示PAG1重组蛋白的编码基因，构建pET30a-PAG1重组质粒，大肠杆菌表达纯化制备得到高浓度的PAG1重组蛋白。同时，选取PAG1重组蛋白上的另外2处抗原表位，委托北京华大基因有限公司设计合成了Seq ID No.2和Seq ID No.3所示氨基酸序列的多肽。

按照实施例2～实施例4方法，对上述PAG1重组蛋白和多肽进行免疫纯化，得到相应的多克隆抗体，分别记为anti PAG1(54～380aa)、anti PAG1-1和anti PAG1-2。

其中，所述的PAG1重组蛋白按照下述方法制备。

合成SEQ ID No.1所示奶牛PAG1重组蛋白的编码基因到pUC57载体中，得到目的基因。

EcoR I和Xho I双酶切载体pET30a和目的基因，胶回收酶切产物DNA，取1µl载体pET30a，3µl基因片段，1µl连接酶BPI，5µl 2×Rapid Buffer，混匀，室温反应30min，连接得到重组质粒pET30a-PAG1。

取100µl感受态细胞BL21，冰上缓慢解冻，加入1µl重组质粒，冰上放置30min，42℃热激90s。冰浴2min后，加入800µl无抗性的LB培养基，37℃培养45min。5000rpm离心3min，弃大部分上清，留约100～150µl，重悬菌体，选择涂抹卡那霉素的LB平板涂板，于37℃培养箱中倒置培养过夜。次日挑取培养板上的单克隆菌落，置于加有卡那霉素的液体LB培养基中，200rpm、37℃摇菌培养12h。得到重组质粒菌液。

从转化平板挑取单克隆到1.5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD=0.6，0.5mM IPTG诱导，37℃、200rpm培养2h。取诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳检测，显示IPTG诱导的菌液在分子量约45kd下方有明显变粗的蛋白条带，与PAG1蛋白理论分子量42.85kd相符，未诱导菌液未出现增粗现象。

挑选验证正确的菌株5～10µl，接种到5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养。将培养的菌液转接到500ml LB液体培养基混合，37℃，200rpm培养至OD=0.6，0.5mM IPTG诱导4h。用400ml大离心筒6000rpm离心5min，弃上清。沉淀用25ml 10mM Tris-HCl pH8.0溶液吹散，超声得到菌悬液。

将超声后的菌悬液离心，取上清，并将沉淀重悬，以50µl 2×loading buffer 100℃煮5min后，分别电泳，以确定蛋白的表达形式。结果显示沉淀样品在45kd下方有增粗条带，而上清样品在同样位置没有类似条带，说明PAG1蛋白主要以包涵体的形式表达。

用20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液反复重悬离心洗涤得到的沉淀，加入少量10mM Tris-HCl pH8.0溶液重悬沉淀，再加5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl pH8.0溶液溶解蛋白，12000rpm离心10min，收集上清，得到纯化的PAG1重组蛋白。

纯化后的PAG1重组蛋白经SDS-PAGE电泳验证，蛋白条带单一，大小正确。

实施例6：抗体的检测。

对上述实施例5制备的多克隆抗体anti PAG1(54～380aa)、anti PAG1-1、antiPAG1-2和实施例4制备的多克隆抗体anti PAG1-3的纯度和效价进行检测。

1、SDS-PAGE电泳检测。

取20µl纯化后的抗体进行SDS-PAGE电泳，并对得到的凝胶做考马斯亮蓝染色。实验结果见图1，图中：1：蛋白质电泳分子标记；2：anti PAG1-1；3：anti PAG1-2；4：antiPAG1-3；5：anti PAG1(54～380aa)。图中可见明显的两条轻重链，说明各抗体纯化效果极好。

2、ELISA测定多克隆抗体效价。

包被液稀释抗原，终浓度2µg/ml，100µl/孔，4℃过夜，洗液洗涤2次。封闭液封闭，200µl/孔，37℃孵箱2h，用洗液洗涤1次。多抗从200倍开始2倍梯度稀释(in PBS)，空白对照为PBS，阴性对照为阴性血清200倍稀释(in PBS)。均为100µl/孔，37℃孵箱1h，用洗液洗涤3次。加入PBS稀释20000倍的二抗，100µl/孔，37℃孵箱1h，用洗液洗涤3次。显色液100µl/孔，显色时间5～15min。每孔加入50µl终止液终止。

双波长(450，630nm)测吸光值，记录数据。效价为1/2最大OD值对应的稀释倍数。

结果如下表所示，4组多抗的效价均高于1∶12800。

本发明使用PAG1偶联抗原和重组抗原成功免疫新西兰大白兔，获得了效价较高的多克隆抗体。同时，使用偶联抗原PAG1-3免疫得到的多抗效价显著高于另外3组，为之后制作PAG1单克隆抗体的免疫原选择提供了重要材料。

SEQUENCE LISTING

<110> 山西农业大学

<120> 奶牛PAG1多肽、其多克隆抗体及应用

<160> 4

<170> Patentin version 3.2

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Trp Leu Val Leu Leu Gly Leu Val Ala Phe Ser Glu Cys Ile

5 10 15

Val Lys Ile Pro Leu Arg Arg Leu Lys Thr Met Arg Asn Val Val Ser

20 25 30

Gly Lys Asn Met Leu Asn Asn Phe Leu Lys Glu His Ala Tyr Ser Leu

35 40 45

Ser Gln Ile Ser Phe Arg Gly Ser Asn Leu Thr Thr His Pro Leu Arg

50 55 60

Asn Ile Lys Asp Leu Val Tyr Met Gly Asn Ile Thr Ile Gly Thr Pro

65 70 75 80

Pro Gln Glu Phe Gln Val Val Phe Asp Thr Ala Ser Ser Asp Leu Trp

85 90 95

Val Pro Ser Asp Phe Cys Thr Ser Pro Ala Cys Ser Thr His Val Arg

100 105 110

Phe Arg His Leu Gln Ser Ser Thr Phe Arg Leu Thr Asn Lys Thr Phe

115 120 125

Arg Ile Thr Tyr Gly Ser Gly Arg Met Lys Gly Val Val Val His Asp

130 135 140

Thr Val Arg Ile Gly Asn Leu Val Ser Thr Asp Gln Pro Phe Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ile Glu Glu Tyr Gly Phe Glu Gly Arg Ile Tyr Asp Gly Val Leu

165 170 175

Gly Leu Asn Tyr Pro Asn Ile Ser Phe Ser Gly Ala Ile Pro Ile Phe

180 185 190

Asp Lys Leu Lys Asn Gln Arg Ala Ile Ser Glu Pro Val Phe Ala Phe

195 200 205

Tyr Leu Ser Lys Asp Glu Arg Glu Gly Ser Val Val Met Phe Gly Gly

210 215 220

Val Asp His Arg Tyr Tyr Glu Gly Glu Leu Asn Trp Val Pro Leu Ile

225 230 235 240

Gln Ala Gly Asp Trp Ser Val His Met Asp Arg Ile Ser Ile Glu Arg

245 250 255

Lys Ile Ile Ala Cys Ser Asp Gly Cys Lys Ala Leu Val Asp Thr Gly

260 265 270

Thr Ser Asp Ile Val Gly Pro Arg Arg Leu Val Asn Asn Ile His Arg

275 280 285

Leu Ile Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro Cys Ser

290 295 300

Glu Val Asn Thr Leu Pro Ser Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly Ile Asn

305 310 315 320

Tyr Pro Val Pro Gly Arg Ala Tyr Ile Leu Lys Asp Asp Arg Gly Arg

325 330 335

Cys Tyr Thr Thr Phe Gln Glu Asn Arg Val Ser Ser Ser Thr Glu Thr

340 345 350

Trp Tyr Leu Gly Asp Val Phe Leu Arg Leu Tyr Phe Ser Val Phe Asp

355 360 365

Arg Gly Asn Asp Arg Ile Gly Leu Ala Arg Ala Val

370 375 380

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

Phe Arg His Leu Gln Ser Ser Thr Phe Arg Leu Thr Asn Lys Thr Phe

5 10 15

Arg Ile Thr Tyr Gly

20

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

Val Met Phe Gly Gly Val Asp His Arg Tyr Tyr Glu Gly Glu Leu Asn

5 10 15

Trp Val Pro Leu Ile

20

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

Asn Asn Ile His Arg Leu Ile Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His

5 10 15

Tyr Val Pro Cys Ser Glu Val Asn Thr

20 25

Claims

1.一种奶牛PAG1多肽，所述PAG1多肽的氨基酸序列为Asn Asn Ile His Arg Leu IleGly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro Cys Ser Glu Val Asn Thr。

2.以权利要求1所述的奶牛PAG1多肽为抗原免疫动物得到的多克隆抗体。

3.权利要求2所述多克隆抗体的制备方法，是将所述奶牛PAG1多肽与载体蛋白交联后免疫动物，收集免疫动物血液制备抗血清，将抗血清分离纯化得到多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的多克隆抗体的制备方法，其特征是所述的载体蛋白为KLH。

5.根据权利要求3所述的所克隆抗体的制备方法，其特征是所述制备的多克隆抗体的效价为1∶102400。

6.权利要求1所述的PAG1多肽作为制备奶牛妊娠检测试剂原料的应用。

7.权利要求2所述的多克隆抗体作为制备奶牛妊娠检测试剂原料的应用。