CN108314732A - 一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：合成抗体位点序列多肽，并偶联载体蛋白，采用B细胞杂交瘤技术建立一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株，偶联产物免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合，经阳性杂交瘤细胞筛选、细胞克隆获得能稳定传代并分泌抗牛早孕单克隆抗体的杂交瘤细胞；用构建的杂交瘤细胞对BALB/C小鼠进行腹腔注射，制备腹水单克隆抗体。本发明提供的抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株及抗牛早孕因子单克隆抗体，为牛早期妊娠的快速检测提供服务。

Description

一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体来说涉及B细胞杂交瘤技术，更具体地，涉及一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法。
背景技术
对牛精准及时的怀孕检测在当今的牧场繁殖管理程序中是一项十分重要的内容。兽医和牧场工作人员对牛进行早期怀孕检测，筛查出空怀牛(没有怀孕的牛)，这样的工作可以尽快重配空怀牛以及缩短产犊间隔，从而为牧场带来最高的牛奶产量和收益。
目前，通过对牛进行直肠触诊(PPR)或超声(TU)来诊断牛是否怀孕，是筛查空怀牛的主要方法。这两种方法各有利弊：直肠触诊，是兽医最常用的奶牛妊娠诊断方法之一，主要根据触摸到的生殖器官的形态变化来确认。有经验的兽医最早可以在第35天通过直肠触诊来确定奶牛是否妊娠。这种方式最大的缺点是需要耗费大量人力，同时还可能会触及子宫和胎膜对早期胚胎造成伤害，破坏母牛直肠组织甚至导致胚胎丢失。此外，要熟练掌握直肠触诊手法困难很大，并有感染人畜共患病(牛布氏杆菌病等)的风险；超声波检测是利用超声波的物理特征，不同的子宫组织会出不同的回声，从而确定胚胎是否存在，并就此进行妊娠诊断。与直肠触诊相比有很多优点，包括准确率高、妊娠诊断早、可判断胎儿的活力等等。但这种方法需要购置昂贵的仪器，熟练诊断也需要大量的训练，同时超声波检测对早期胚胎也有一定损伤，造成胚胎早期流失。
牛早孕因子是牛胎盘滋养层细胞表达出的一类蛋白物质，从外周血液中测定这种蛋白可以确定是否有胚胎着床，从而判断母牛是否妊娠。在牛妊娠的第 22天，妊娠母牛和非妊娠母牛体内的牛早孕因子浓度有了显著差别，这是牛早孕因子进行早期妊娠诊断的理论依据。制备这种早孕因子抗体，利用抗体的高特异性、高灵敏性建立高特异性高灵敏度免疫检测方法，精准进行早期妊娠检测。这种检测具有很高的准确性，其不怀孕检出率高达99％，怀孕检出率97％ (这包括妊娠后期的意外流产)，同时避免了对早期胚胎的损伤，也最大可能的避免了人畜共患病的感染，保护相关从业人员的安全。
一种可以精准检测怀孕的实验室检测方法，可以早在牛配种后28天检测到牛是否怀孕，为兽医和奶牛场的工作人员提供检测怀孕牛的重要工具。
发明内容
本发明的目的在于：获得建立动物(特别是牛)早孕免疫检测方法不可缺少的高质量单克隆抗体细胞株，从而制备早孕因子单克隆抗体，最终开发出能够快速、准确检测动物(特别是牛)早孕的免疫检测产品。
本发明的目的通过以下技术方案实施：
分析牛早孕因子氨基酸序列，确定其可能的抗体位点，合成多肽并将多肽交联于大分子蛋白载体KLH，采用多肽-KLH交联物免疫Balb/c小鼠，通过B细胞杂交瘤技术，经过动物免疫、细胞融合、筛选(BSA交联物用于单抗的筛选) 及亚克隆，获得可以稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，并制备腹水，Protein G亲和纯化特异性抗体。
本发明的特点在于：一、采用混合多肽免疫动物，制备单抗，鉴定单抗反应多肽。二、采用与不同多肽反应的抗体，ELISA双抗体夹心法配对检测蛋白。
基于本发明，通过棋盘法评价抗体配对检测牛早孕因子，对可以配对的抗体进行实验条件的优化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是根据本发明实施例所述的双抗体夹心检测牛早孕因子蛋白中2D8-6E4 抗体对检测牛早孕因子标准曲线。以抗原浓度为横坐标，以抗体对平均吸光度为纵坐标。
具体实施方式
下面结合以下具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株的建立
S1抗原合成
S1.1表位预测
以牛早孕因子氨基酸残基蛋白序列为模板，经软件分析预测抗原表位，获得5段抗原表位序列。每段序列在N-端或C-端添加一个半胱氨酸，以便与载体交联。
牛早孕因子蛋白序列：
IVKIPLRRLK TMRNVVSGKN MLNNFLKEHA YSLASQISFR
GSNLTTHPLR NIKDLVYMGN ITIGTPPQEF QVVFDTASSD
LWVPSDFCTS PACSTHVRFR HLQSSTFRLT NKTFRITYGS
GRMKGVVVHD TVRIGNLVST DQPFGLSIEE YGFEGRIYDG
VLGLNYPNIS FSGAIPIFDK LKNQRAISEP VFAFYLSKDE
REGSVVMFGG VDHRYYEGEL NWVPLIQAGD WSVEMDRISI
ERKIIACSDG CKALVDTGTS DIVGPRRLVN NIHRLIGAIP
RGSEHYVPCS EVNTLPSIVF TINGINYPVP GRAYILKDDR
GRCYTTFQEN RVSSSTETWY LGDVFLRLYF SVFDRGNDRI
GLARAV(SEQ NO.1)
经软件分析得出抗原表位：
CFDRGNDRIGLARAV(SEQ NO.2)
VDHRYYEGELNWC(SEQ NO.3)
CLKNQRAISEP(SEQ NO.4)
CSKDEREGSVVM(SEQ NO.5)
CKDDRGRCYTT(SEQ NO.6)
S1.2免疫多肽与载体KLH交联
采用碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)两步法：称取多肽10-20mg，EDC·HCl 50-150mg，NHS 5-20mg，于单口瓶中，加入1-4mL DMF使其充分溶解，放入一颗磁力搅拌子，密封避光，室温反应10-20小时，得到多肽反应液，为A液；另称取KLH 10-50mg充分溶解于1-8mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，为B液；将 A液逐滴加入B液中，密封避光，2-8℃条件下搅拌过夜；将上述反应液转移至采用PBS预处理10-32小时的透析袋中，在2-8℃条件下，置磁力搅拌器上搅拌并用PBS透析12-72小时，透析过程中多次换液；对透析后产生多肽-KLH的交联产物进行冰冻干燥。
S2建立单克隆抗体细胞株
S2.1免疫小鼠
将5段多肽-KLH交联物等量混合，做为免疫抗原，免疫Balb/c纯系小鼠。
a.初次免疫：以每只小鼠取抗原30-150μg，与等量弗氏完全佐剂混合并充分乳化，小鼠颈背部皮下多点注射；
b.第二次免疫：于初次免疫3周后进行，取与第一次相同剂量抗原，与等量弗氏不完全佐剂乳化，小鼠颈背部皮下多点注射；
c.第三次免疫：于第二次免疫3周后进行，用相同剂量的抗原溶于生理盐水，腹腔注射；
d.免疫结束后5-15天，小鼠断尾采血，分离抗血清。
S2.2抗血清效价检测
间接ELISA法测定抗体对牛早孕因子蛋白的效价。
a.抗原处理：用PBS将牛早孕因子蛋白稀释至1-5μg/ml，100μl/孔加入酶标板，2-8℃过夜，洗板3次。取1-5％BSA封闭液，100-300μl/孔加入酶标板，室温孵育1-3小时，洗板。
b.样品处理：取抗血清，从1：500开始做倍比稀释，取100μl依次加入酶标板各孔，37℃孵育1小时，洗板3次。每孔加入100μl HRP标记的羊抗鼠Ig(H+L)， 37℃孵育30分钟，洗板3次，加100μlTMB底物，室温避光显色5-15分钟，加 50μl终止液。
c.测定：用酶标仪测定OD值(检测波长：450nm，参考波长：630nm)。检测结果见表1。
表1小鼠抗血清效价ELISA检测结果
抗血清稀释度 1# 2# 3# 4# 5#
1∶500 1.936 0.785 1.147 0.746 1.297
1∶1000 0.947 0.43 0.671 0.584 0.867
1∶2000 0.682 0.305 0.387 0.39 0.541
1∶4000 0.409 0.167 0.179 0.188 0.292
1∶8000 0.247 0.117 0.142 0.154 0.191
1∶16000 0.158 0.096 0.105 0.122 0.126
1∶32000 0.124 0.087 0.087 0.088 0.093
PBS 0.082 0.082 0.08 0.084 0.077
结果表明：小鼠抗血清倍比稀释1：32000，测得抗体效价均高于对照PBS。抗体水平满足细胞融合要求。
S2.3建立杂交瘤细胞
a.骨髓瘤细胞培养：融合前5-10天复苏SP2/0细胞，于5-10％FBS的 RPMI-1640培养基中传代培养。收集处于对数生长期的SP2/0于50ml离心管中，计数，取1-5×107个骨髓瘤细胞，1000-1500rpm离心5-10分钟，弃上清，加入 20-50ml无血清RPMI-1640，洗涤2次。
b.冲击免疫：于融合前3-5天，取多肽-KLH交联免疫抗原，对经3次免疫的小鼠进行冲击免疫，每只小鼠腹腔注射30-150μg抗原。
c.制备滋养细胞板：于融合前一天，断颈处死小鼠，将小鼠浸泡于75％酒精中消毒3-5分钟后移入超净工作台，剪开腹部皮肤，钝性剥离，剪开腹膜，吸取 1-5ml无血清培养基注入腹腔冲洗2-3遍，吸入离心管中。1000-1500rpm离心5-10 分钟，弃上清，将小鼠腹腔巨噬细胞移入适量完全培养基混匀，制备5块滋养细胞板。将滋养细胞悬液加入96孔板，37℃孵育10-24小时。将0.5-1.5ml PEG 和5-20ml无血清RPMI-1640置于37℃孵箱预热。
d.制备小鼠免疫脾细胞：将经冲击免疫的小鼠摘眼球放血，断髓处死，浸泡于75％的酒精中消毒3-5分钟，无菌操作，剪开腹腔，取出脾脏。将脾脏置于 200目钢网，加少量RPMI-1640研磨，制成脾单细胞悬液，移入50ml离心管中，加RPMI-1640至20-40ml，1000-1500rpm离心5-10分钟，洗涤2次。
e.细胞融合：骨髓瘤细胞和脾细胞充分混合，加RPMI-1640，1000-1500rpm 离心5-10分钟，弃上清。30-60秒内缓缓加入37℃预热的PEG 0.5-1.5ml，反应 30-60秒后，加入无血清培养基5-20ml以终止PEG的作用，此操作先慢后快，每1-3分钟加入1ml，加2ml后，余量培养基在3-5分钟内加完。1000-1500rpm 离心5-10分钟，弃上清，加入10-30ml含有5-20％FBS的RPMI-1640，轻轻吹打混匀。将细胞加入5块已铺有滋养细胞的96孔板。一天后加入HAT选择性培养基，每天观察细胞形态。加入HAT3-5天后，融合的细胞会有单克隆形成，此时用负压吸引器吸出1/3-1/2培养基，加入新的HAT培养基。细胞培养过程中，换液1-3次为杂交瘤细胞筛选做准备，筛选前一天必须换液。一般，融合后8-15 天，未融合的骨髓瘤细胞和其他细胞全部死亡，融合细胞克隆生长。在细胞铺满孔低1/2或2/3时可进行进行细胞筛选。
f.阳性筛选细胞亚克隆：采用间接ELISA筛选方法鉴定细胞培养液中的融合细胞，以确定是否产生特异性抗体。筛选方法同抗血清效价的检测。区别在于，样品为单克隆细胞培养上清液。同时，以骨髓瘤细胞培养液做对照。对阳性孔进行细胞亚克隆，亚克隆前一天制备小鼠腹腔巨噬细胞滋养板。取需要亚克隆的细胞轻轻吹打，制成单细胞悬液，加入计数板，计算细胞密度。按每板100 个细胞，取所需体积，加入适量完全培养基中，充分混匀后加入96孔板。
S2.4杂交瘤细胞亚型检测
用PBS将羊抗鼠Ig(H+L)稀释至1-5μg/ml，100μl/孔加入酶标板。2-8℃过夜，洗板3次。加1-5％BSA封闭液，100-300μl/孔，室温反应1-3小时，洗板。取筛选好的杂交瘤细胞培养上清，每孔100μl，加入一条酶标板中(竖条A-H，8孔)， 37℃孵育60分钟，洗板3次。向A-H孔中按顺序依次加入以下HRP标记的抗亚型抗体：IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，kappa和lambda，每孔100μl， 37℃孵育30-60分钟，洗板3次。每孔加TMB底物100μl，室温避光显色5-15 分钟，加终止液50μl。酶标仪测定OD值(检测波长：450nm，参考波长：630nm)。检测结果见表2。对建株的杂交瘤细胞，采用5段多肽分别检测，以确认杂交瘤细胞株的识别表位(表3)。
表2杂交瘤细胞ELISA检测测结果
2A1 2D8 3H7 5A3 6E4
A 1.505 1.188 1.467 0.727 1.362
B 1.495 1.108 1.153 0.676 0.605
C 1.308 1.099 0.527 0.537 0.178
D 0.96 0.736 0.171 0.32 0.072
E 0.427 0.328 0.09 0.156 0.058
F 0.165 0.136 0.06 0.077 0.05
G 0.088 0.069 0.057 0.085 0.071
H 0.06 0.063 0.063 0.056 0.059
5株杂交瘤细胞上清(2A1、2D8、3H7、5A3、6E4)与牛早孕因子全部反应。
表3杂交瘤细胞亚型
Code of mab clones Isotype
2A1 IgG1/κ
2D8 IgG1/κ
3H7 IgG1/κ
5A3 IgG2a/κ
6E4 IgGl/κ
五株单克隆抗体轻链均为Kappa，其中四株单抗(2Al，2D8，3H7和6E4) 亚型为IgG1，5A3亚型为IgG2a。
实施例2抗牛早孕因子单克隆抗体的制备
S1腹水制备：选取亚克隆筛选后，可稳定分泌特异性抗体的细胞株进行培养，至细胞达到一定数量后，离心，收集细胞，按照2×105-1×106细胞/小鼠腹腔注射。对小鼠注射杂交瘤细胞株前一周，富强注射0.5ml液体石蜡，使致小鼠敏。观察小鼠状态，注射杂交瘤细胞1-2周后，待小鼠腹部膨隆，进行腹腔穿刺收集腹水。
S2腹水预处理
取新鲜(或冻存)的腹水，1000-4000rpm，2-8℃离心10-20分钟，取上清。量取腹水上清液体积，每毫升腹水上清液中，加2-5mgCaCl2，立即混匀，再加 5-15mg二氧化硅粉末，混匀。混悬液置室温下旋转孵育15-30分钟， 4000-10000rpm，2-8℃离心10-20分钟，收集上清液。用一次性0.22μm滤器过滤，即可得澄清腹水。
S3 Protein G亲和纯化
取Protein G层析柱，使用前解冻至室温，并用3-5倍柱床体积平衡缓冲液预平衡。开启蠕动泵、记录仪和UV监测器，并调整记录仪和UV监测器的基线。将预处理的腹水用等体积的平衡缓冲液稀释，经蠕动泵上样至Protein G层析柱中。收集流出液，继续用平衡缓冲液洗柱以彻底去除杂蛋白，至基线处。更换洗脱缓冲液，用含适量中和缓冲液的收集管收集洗脱峰。纯化抗体用过量0.01M PBS，pH7.4条件下透析，其间更换3次缓冲液，最后一次透析过夜。
透析抗体可超滤浓缩，浓度＞1mg/ml。浓缩后抗体经5000-10000rpm，2-8℃离心5-15分钟。取上清，用一次性0.22μm滤器过滤除菌。测定纯化后抗体效价，并加入防腐剂分装冻存。结果见表4。
表4纯化抗体效价
纯化抗体浓度 2A1 2D8 3H7 5A3 6E4
10000 2.113 1.147 1.116 1.282 0.834
2000 2.136 1.02 1.064 1.002 0.732
400 1.868 0.698 0.497 0.385 0.381
80 1.204 0.246 0.161 0.121 0.127
39 0.54 0.115 0.081 0.062 0.075
16 0.186 0.061 0.056 0.049 0.055
3.2 0.119 0.068 0.065 0.067 0.066
0 0.085 0.07 0.066 0.067 0.086
S4单克隆抗体与HRP交联
称取HRP 25mg溶于1.25％戊二醛，室温静置过夜。溶液经SephadexG-25 层析柱，用生理盐水洗脱，控制流速1ml/分钟，收集棕色流出液。棕色流出液体积多于5ml，则以PEG浓缩至5ml，置25ml小烧杯中，缓慢搅拌，即为HRP 酶溶液。取待标记的抗体12.5mg，用生理盐水稀释至5ml，边搅拌边逐滴加入HRP酶溶液中，加1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时，加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀，置室温放置2小时。边搅拌边逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃放置1小时。3000rpm离心半小时，弃上清。用半饱和硫酸铵洗沉淀物二次，溶于少量PH7.4，0.15M PBS中。将上述溶液装入透析袋，透析去除铵离子 (用萘氏试剂检测)，10000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，即为抗体与酶结合物，分装冻存。
实施例3双抗体夹心检测牛早孕因子蛋白
采用棋盘法将不同多肽免疫的单抗做捕获抗体或检测抗体，评价它们检测牛早孕因子蛋白的可能性。
捕获抗体5-20ug/ml包被，100ul/孔，4℃过夜，加入1ug/ml及0ug/ml牛早孕因子蛋白，每孔100μl，37℃孵育30-60分钟，洗板3次。每孔加入1-5ug/ml HRP 标记的检测抗体，37℃孵育30分钟，洗板3次，加TMB底物100μl，室温避光显色5-15分钟，加终止液50μl。酶标仪测定OD值(检测波长：450nm，参考波长：630nm)。筛选结果见表5。
表5抗不同多肽单抗棋盘筛选结果
选择背景OD值＜0.1，阳性孔OD值＞1.0的抗体对，进行捕获抗体、检测抗体浓度的优化，并将牛早孕因子做系列稀释，检测标准曲线。检测结果见表6。
表6 2D8-6E4配对检测牛早孕因子检测结果
SEQUENCE LISTING
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Ile Val Lys Ile Pro Leu Arg Arg Leu Lys Thr Met Arg Asn Val Val
1 5 10 15
Ser Gly Lys Asn Met Leu Asn Asn Phe Leu Lys Glu His Ala Tyr Ser
20 25 30
Leu Ala Ser Gln Ile Ser Phe Arg Gly Ser Asn Leu Thr Thr His Pro
35 40 45
Leu Arg Asn Ile Lys Asp Leu Val Tyr Met Gly Asn Ile Thr Ile Gly
50 55 60
Thr Pro Pro Gln Glu Phe Gln Val Val Phe Asp Thr Ala Ser Ser Asp
65 70 75 80
Leu Trp Val Pro Ser Asp Phe Cys Thr Ser Pro Ala Cys Ser Thr His
85 90 95
Val Arg Phe Arg His Leu Gln Ser Ser Thr Phe Arg Leu Thr Asn Lys
100 105 110
Thr Phe Arg Ile Thr Tyr Gly Ser Gly Arg Met Lys Gly Val Val Val
115 120 125
His Asp Thr Val Arg Ile Gly Asn Leu Val Ser Thr Asp Gln Pro Phe
130 135 140
Gly Leu Ser Ile Glu Glu Tyr Gly Phe Glu Gly Arg Ile Tyr Asp Gly
145 150 155 160
Val Leu Gly Leu Asn Tyr Pro Asn Ile Ser Phe Ser Gly Ala Ile Pro
165 170 175
Ile Phe Asp Lys Leu Lys Asn Gln Arg Ala Ile Ser Glu Pro Val Phe
180 185 190
Ala Phe Tyr Leu Ser Lys Asp Glu Arg Glu Gly Ser Val Val Met Phe
195 200 205
Gly Gly Val Asp His Arg Tyr Tyr Glu Gly Glu Leu Asn Trp Val Pro
210 215 220
Leu Ile Gln Ala Gly Asp Trp Ser Val Glu Met Asp Arg Ile Ser Ile
225 230 235 240
Glu Arg Lys Ile Ile Ala Cys Ser Asp Gly Cys Lys Ala Leu Val Asp
245 250 255
Thr Gly Thr Ser Asp Ile Val Gly Pro Arg Arg Leu Val Asn Asn Ile
260 265 270
His Arg Leu Ile Gly Ala Ile Pro Arg Gly Ser Glu His Tyr Val Pro
275 280 285
Cys Ser Glu Val Asn Thr Leu Pro Ser Ile Val Phe Thr Ile Asn Gly
290 295 300
Ile Asn Tyr Pro Val Pro Gly Arg Ala Tyr Ile Leu Lys Asp Asp Arg
305 310 315 320
Gly Arg Cys Tyr Thr Thr Phe Gln Glu Asn Arg Val Ser Ser Ser Thr
325 330 335
Glu Thr Trp Tyr Leu Gly Asp Val Phe Leu Arg Leu Tyr Phe Ser Val
340 345 350
Phe Asp Arg Gly Asn Asp Arg Ile Gly Leu Ala Arg Ala Val
355 360 365
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Cys Phe Asp Arg Gly Asn Asp Arg Ile Gly Leu Ala Arg Ala Val
1 5 10 15
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Val Asp His Arg Tyr Tyr Glu Gly Glu Leu Asn Trp Cys
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Cys Leu Lys Asn Gln Arg Ala Ile Ser Glu Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Cys Ser Lys Asp Glu Arg Glu Gly Ser Val Val Met
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Cys Lys Asp Asp Arg Gly Arg Cys Tyr Thr Thr
1 5 10

Claims (6)

1.一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1建立抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株：通过表位预测获得抗原表位免疫多肽，与载体KLH交联，免疫小鼠获得抗血清并测定效价，SP2/0细胞与小鼠脾细胞融合，细胞克隆获得能稳定传代并分泌抗牛早孕单克隆抗体的杂交瘤细胞，筛选阳性克隆；
S2制备单克隆抗体：收集S1建立的抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株阳性克隆，对小鼠进行腹腔注射，收集腹水，去细胞、除杂，澄清处理，应用Protein G层析柱对单克隆抗体进行亲和纯化。
2.如权利要求1所述的一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株的建立，通过表位预测获得5段抗原表位序列，分别为：SEQ NO.2，SEQ NO.3，SEQ NO.4，SEQ NO.5，SEQ NO.6。
3.如权利要求2所述的一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的5段抗原表位序列N-端或C-端添加一个半胱氨酸，与载体KLH交联。
4.如权利要求1所述的一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法，其特征在于，对构建的单克隆抗体细胞株进行杂交瘤细胞亚型检测，采用5段多肽分别检测，以确认杂交瘤细胞株的识别表位。
5.如权利要求1所述的一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将制备的单克隆抗体与HRP交联形成酶结合物。
6.如权利要求1所述的一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法，其特征在于，采用棋盘法将不同多肽免疫的单克隆抗体交叉做捕获抗体或检测抗体，评价它们检测牛早孕因子蛋白的可能性。
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