CN103319594A - 含有单克隆抗体AntiDaintain的癌症诊断试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有单克隆抗体AntiDaintain的癌症诊断试剂盒及其用途。该试剂盒还含有抗原Daintain，该单克隆抗体AntiDaintain偶联有FITC或生物素标记。本发明的试剂盒可以方便地利用诊断对象的血清进行，所以操作简单易行，不必切去病人的组织，所以对病人没有痛苦发生，对医务人员的操作也简单，而且该试剂盒是癌症形成过程当中就可以进行检测。能够做到早诊断、早治疗；该试剂盒还可以用于癌症的普查和日常体检。
Description
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体AntiDaintain以及利用该抗体制备的癌症诊断试剂盒，以及该试剂盒在癌症诊断中的用途，属于生物医药技术领域。
背景技术
癌症的早期诊断对于治疗起关键作用，目前对癌症的诊断主要是已形成了一定的征候并通过组织切片切取整块组织进行病理切片，经HE染色，分析细胞核的形态和细胞形态来确诊。所以给病人造成相当的痛苦，也给医生带来了工作的不便，其他的生物化学检测都有局限性。所以癌症的早期诊断还是一个尚未攻克的难题。
近年的研究明确了肿瘤与炎症有着极为密切的关系，炎症可为肿瘤的发生和恶性转化及转移提供有利微环境和动因。Daintain是一个巨噬细胞产生和分泌的新炎症因子，研究证明该因子在癌细胞的激活、分化、增殖、迁移过程中发挥重要作用。该因子能从巨噬细胞中分泌并进入血液循环，在血液中的浓度和肿瘤病变相关。
目前在癌症诊断试剂盒，已在临床应用的有如PSA前列腺癌的检测，这个只能检测前列腺癌症，但是，前列腺炎的情况下，病人血中含量也很高，难以区别炎症和癌症。还有一种是胸苷激酶1(TK1)诊断试剂盒），这种诊断试剂盒也是利用肿瘤血清中TK1浓度大幅上升来检测和预防早期肿瘤，其存在的致命弱点是，一个身体正在发育和成长的青少年的血液中TK1浓度也会大幅度增加，表明DNA合成旺盛，但不会是癌变。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种单克隆抗体AntiDaintain以及利用该抗体制备的诊断癌症的试剂盒，以及该试剂盒在癌症诊断中的用途。
为达到上述目的，本发明提供一种单克隆抗体AntiDaintain，通过以下步骤制得：
1) 抗原Daintain的制备及纯化：根据大炎肽的一级结构及其氨基酸序列设计引物，在大肠杆菌DH5a中进行表达，用超声波破碎菌体，然后纯化表达产物，得到较纯的大炎肽，即抗原Daintain；
2)单克隆抗体AntiDaintain的制备及纯化：通过杂交瘤技术制备含有大炎肽的单克隆抗体AntiDaintain，并进行纯化，之后通过FITC方法进行荧光标记。
进一步地，其中所述单克隆抗体AntiDaintain属于IgG1（κ）亚型。
本发明还提供一种试剂盒，含有上述单克隆抗体AntiDaintain。
进一步地，其中所述试剂盒还含有抗原Daintain。
进一步地，其中所述单克隆抗体AntiDaintain偶联有FITC或生物素标记。
本发明进一步提供上述试剂盒在癌症诊断中的用途。
进一步地，其中，通过ELISA技术和化学发光技术分析对象的血液中大炎肽的浓度高低，从而判断发生肿瘤的危险性，当大炎肽在血液中的含量等于或小于6ng/ml血清时为正常，大于6ng/ml时为预警信号，并建议病人进一步检查。
进一步地，其中所述癌症选自肝癌、肺癌、乳腺癌或胃癌。
本发明的优点在于：
本发明通过将大炎肽Daintain制成单克隆抗体，之后制成诊断试剂盒，通过ELISA技术和化学发光技术分析对象的血中大炎肽的浓度的高低，从而判断发生肿瘤的危险性；可以方便地利用诊断对象的血清进行，所以操作简单易行，不必切去病人的组织，所以对病人没有痛苦发生，对医务人员的操作也简单，而且本方法是癌症形成过程当中就可以进行检测。能够做到早诊断、早治疗。本方法还可以用于癌症的普查和日常体检；而本发明的Daintain是由巨噬细胞和活化的T淋巴细胞产生和分泌，来维持免疫系统的稳定，所以正常人的Daintain含量在正常的生长旺盛时期呈低水平状态（小于6ng/ml）；但一旦机体发生癌前病变，人的免疫系统要识别和消除癌变细胞，才会使血中Daintain的含量比健康状态高，所以就克服了TK1的假阳性缺陷，所以我们可以通过检测对象血液中的浓度，而来确定是否有恶性肿瘤在体内发生。本方法是针对所有的肿瘤的早期诊断，在国内外还是第一次，判断率高，且用途广。
附图说明
图1为单克隆抗体制备的主要流程示意图；
图2为大炎肽的一级结构图。
具体实施方式
以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。
杂交瘤技术制备单克隆抗体的步骤包括：制备抗原、免疫动物、免疫脾细胞及制备骨髓瘤细胞、细胞融合、杂交瘤细胞选择培养、杂交瘤细胞筛选、杂交瘤细胞克隆及冻存、单克隆抗体的鉴定、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系的建立、单克隆抗体的大量制备及纯化。图1为单克隆抗体制备的主要流程示意图。
实施例1：大炎肽(Daintain抗原)的制备及纯化
（1）从天然材料中纯化大炎肽
以猪小肠为原料（500千克），沸水处理10分钟，灭活内源性蛋白酶。经过0.2M稀乙酸低温浸提10小时，海藻酸（5千克）吸附，以320g/L氯化钠盐析，过滤收集盐析物，异丙醇分级提取、葡聚糖Sephadex G-25凝胶过滤和纤维素弱阴离子DEAE交换柱层析，最后以反相高效液相色谱方法分离纯化出大炎肽（见图2）。大炎肽外观为白色的粉末，易溶于水，分子量为17000道尔顿。
（2）以基因工程法制备
设计一对引物如下：
5’GGGAATTCTATGAGCCAAACCAGGGATT3’
5’GCCTGCATTTCCCATATCTGGGTATTAG 3’
应用PGR（链式聚合酶扩增）技术，将大炎肽基因cDNA扩增，经酶切后与原核表达载体pKK223-3连接，转化大肠杆菌DH5a,在异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后筛选阳性表达株，将其表达产物按照上述从天然材料中提取的办法纯化大炎肽。
实施例2：Daintain单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
1、实验动物与细胞株
年龄分别为3－5周和3个月的雌性BALB/c小鼠。
2、细胞融合所需溶液
1）0.2 M L-G溶液：称取2.9 g L-G，用三蒸水或去离子水溶解至100 ml，0.22 μm滤器过滤除菌后，分装为4-5 ml/瓶，-20℃冻存。
2）青、链霉素(双抗)溶液：称取青霉素G100万单位和链霉素1 g溶于100 ml三蒸水或去离子水中，分装为4-5 ml/瓶，-20℃冻存。
3）7.5% NaHCO3溶液：称取NaHCO37.5 g用三蒸水或去离子水溶解至100 ml，0.22 μm滤器过滤除菌后，分装为4-5 ml/瓶，盖紧瓶塞，-20℃冻存。
4）完全细胞培养基（20%FBS）：90％DMEM＋20％胎牛血清，4℃保存。
5）细胞冻存液：含10％DMSO的完全细胞培养基。
6）100×次黄嘌呤(H) 贮存液：称取136.1 mg次黄嘌呤溶于100 ml蒸馏水中，加温至40-50℃ 1 h使之完全溶解。
7）100×氨基蝶呤(A) 贮存液：称取1.76 mg氨基蝶呤溶于100 ml蒸馏水中，滴加0.5 m1 1N NaOH使之溶解。校正总量至100 m1后，加入0.5m1 1N HCl中和。氨基蝶呤贮存液必须避光保存。
8）100×胸腺嘧啶核苷(T)贮存液：称取37.8 mg溶于100 m1蒸馏水中。
9）100×HT贮存液：于45-50℃条件下将次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷一起溶于100 ml水中。溶液经0.22 μm滤器过滤除菌后，-20℃冻存。
10）制备杂交瘤细胞所需溶液
DMEM培养基
20 % FBS完全培养基（wt%）
HAT培养基：向78 ml DMEM培养基中依次加入1 ml 100×A 贮存液、1 ml 100×HT贮存液和20 ml 胎牛血清。
HT培养基：向79 ml DMEM培养基中依次加入1 ml 100×HT贮存液和20 ml 胎牛血清。
11）50% PEG：称取PEG 1 g，放入合适玻璃小瓶中，塞紧橡皮塞，塞上插一9号针头(排气用)，高压蒸气灭菌15 min或水浴煮沸30 min，使PEG融化，待冷却至50～60℃时(在此温度以上PEG仍为均匀的液体状态)，加入已在37 ℃预热的不完全培养液1 ml，充分混匀，盖紧瓶塞，4℃保存，用前可置于37℃加温助溶。
12）100×8-氮杂鸟嘌呤贮存液：称取200 mg 8-氮杂鸟嘌呤，加入4 N NaOH 溶液1 ml，待其溶解后，加三蒸水或去离子水至100 ml，0.22 μm滤器过滤除菌后，分装小瓶，-20℃冻存，使用时使之终浓度为20 μg/ml。
3、酶联免疫吸附测定（ELISA）所需溶液
1）包被缓冲液（0.85 mol/L的碳酸缓冲液，pH9.6）：分别称取1.59 g Na2CO3， 2.93 g NaHCO3，加蒸馏水至1000 ml。
2）封闭液：含1%明胶（wt%）的包被缓冲液。
3）洗涤缓冲液（PBST， pH7.4）：含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS(V/V)。
4）抗体稀释液（PBST，pH7.4）：含0.1%明胶的洗涤缓冲液。
5）底物缓冲液（磷酸-柠檬酸缓冲液，pH5.0）：0.2 M Na2HPO4 (28.4 g/L) 25.7 ml；0.1 M柠檬酸 (19.2 g/L) 24.3 ml；加蒸馏水至100 ml。
6）OPD底物显色液(A492nm)：称取OPD 40 mg溶于100 ml底物缓冲液中，最后待用时再加入30%（wt%）的H2O2 20 μl。
7） 终止液(4 M H2SO4)：向156.6 ml蒸馏水中逐滴加入98%浓硫酸43.4 ml。
4、抗体纯化所需溶液
1）巴比妥缓冲盐水（VBS，pH7.2）：含 4 mM巴比妥，0.15 M NaCl，0.8 mM Mg2+，0.3 mM Ca2+。
2）饱和硫酸铵溶液：称取180 g结晶硫酸铵溶于200 ml蒸馏水中；80℃水浴溶解，趁热过滤，溶液温度降至室温后有结晶析出。使用前吸出所需的量，用28% 氨水调pH7.2。
5、免疫原的准备
为了提高小分子半抗原的免疫原性以及节省抗原蛋白的目的，将抗原大炎肽分子交联到BSA(小牛血清白蛋白)。
1）称取5 mg BSA，溶于0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(CB，pH9.0，含1 g/L SDS)中，加入2.5 g/L戊二醛溶液10 μl作为连接剂，充分混匀。将反应系统置于室温暗处反应1 h。
2）将反应液上样至Sephadex G-25凝胶柱中，待反应充分后，用0.1 mol/L pH9.0 CB(碳酸盐缓冲液)洗脱，以除去过量的戊二醛，同时收集蛋白洗脱峰，得到交联上戊二醛的BSA。
3）向洗脱液中加入2 mg的重组蛋白Daintain，充分混匀后将反应系统置室温暗处反应16 h以上，最后加入终浓度为1 mol/L的甘氨酸溶液终止反应6 h。
4）将终止后的混合液加入截流分子量为3000 Da的透析带中脱去甘氨酸和盐，于4℃下浸入预冷的PBS中透析48 h，其间换液 3-4次。待透析完成，得到纯度较高的交联成功的BSA-Daintain，BCA法测定蛋白浓度，分装后冻干，保存备用（大炎肽瓶装放在零下20度的冰箱）。
6、免疫动物
(1) 初次免疫
免疫小鼠前，需要对免疫原进行乳化。将1000 μg BSA-Daintain溶于500 μl生理盐水，混匀后再加入500 μl完全弗氏佐剂，利用超声破碎仪进行乳化，直到形成均匀的油包水乳液。取5周龄雌性BALB/c小鼠10只，编号，初次免疫时将乳化好的免疫原经背部皮下多点注射，剂量为100 μl/只。
(2) 加强免疫
分别在第28、42、56天将免疫原与弗氏不完全佐剂乳化，乳化剂量与步骤同前，按上述方法追加免疫，注射剂量为50 μl/只。每次追加免疫后，鼠尾取血分离血清，使用间接ELISA方法检测小鼠抗血清效价，挑选效价高的小鼠继续后面的实验，淘汰效价低的小鼠。第3次加强免疫后，被选中的小鼠在融合前3-4天，不加佐剂将免疫原以50 μg/只的剂量经腹腔注射，刺激脾脏中浆细胞分化为B细胞。
7、间接ELISA方法的建立及血清效价的测定
ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）原理：基于抗原抗体的特异性反应。将已知浓度的抗体或抗原固定于固相载体上，并保持其免疫活性。依次将待测样品和酶标抗原或抗体按不同步骤加入，使之与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生特异性反应。当反应平衡后，洗去未反应的游离成分，而被固定于固相载体表面的抗原抗体复合物会因酶催化底物发生显色反应，从而实现待测样品的定性或定量测定。
每次加强免疫后，BALB/c小鼠经尾部采血约100 μl/只，室温下6000 rpm离心5 min，收集血清。用间接ELISA法检测血清效价。
包被：用包被缓冲液将检测抗原Daintain稀释至适当的工作浓度(2-10 μg/ml)，加入酶标板中，100 μl/孔，4℃孵育过夜；弃去板内液体。
封闭：加封闭液120 μl/孔，37℃置湿盒孵育30 min。
洗涤：用洗涤缓冲液洗3次，每次5 min，拍干。
加待测血清样品：将血清样品倍比稀释成8个梯度，加入酶标板中，100 μl/孔，同时设空白对照（空酶标孔）、阴性对照（抗体稀释液，100 μl/孔）和阳性对照（一抗，100 μl/孔）各2孔。37 ℃置湿盒孵育1 h；洗涤、拍干。
加酶标二抗：先用稀释液将酶标二抗稀释到适当的工作浓度（1：3000（wt%）），每100 μl/孔，37℃置湿盒孵育1 h；洗涤、拍干。
显色：加新鲜配置的OPD底物显色液，100 μl/孔，37 ℃避光孵育10-30 min。
终止反应：加终止液50 μl/孔。
读数：测定A492nm，以空白对照数值调零，若待测孔A值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。
8、细胞融合
(1) 饲养细胞的制备
1）6-10周龄BALB/c小鼠经摘眼球放血处死，浸泡于75%（wt%）酒精，放入超净台内，腹部朝上固定于小鼠解剖台上。
2）用眼科镊子提起小鼠腹部外层皮肤，用眼科剪小心剪一小口，然后用两支镊子向上下两侧方向将皮撕开，使腹膜充分暴露，并用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
3）注射器吸取DMEM培养基6-8 ml，缓慢注入小鼠腹腔（注意针头的深度，不能刺破内脏），右手固定注射器针头，使针头留置于腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1-2 min，也可用注射器在腹腔内反复缓慢抽吸、注射数次。
4）用原注射器抽出腹腔内液体，注入50 ml离心管中。室温1000 rpm离心10 min，弃上清。
5）用5 ml HAT培养基将细胞充分悬浮混匀，根据细胞计数结果，补加合适体积HAT培养基，使细胞浓度为2×105个/ml。
6）将细胞悬液加入96孔培养板内，100 μl/孔。置于37℃、5% CO2（wt%）细胞培养箱内培养。
(2) 脾细胞悬液的制备
1）选择经间接ELISA检测效价最高的小鼠，摘除眼球放血，取血样1 ml，室温下6000 rpm离心5 min，收集血清，作为后面筛选阳性杂交瘤细胞上清步骤的阳性对照。
2）用颈椎脱臼法将小鼠处死，浸泡于75%（wt%）酒精中，放入超净台。用无菌操作取出完整脾脏，放入盛有5-10 ml DMEM培养基的平皿中小心清洗一次，同时小心剥去周围结缔组织。
3）将处理过的脾脏移入另一个盛有5 ml DMEM培养基的平皿中。用吸取DMEM培养液的注射器针头插入脾脏后缓慢吹出，反复几次直至脾细胞被完全吹出，此时脾脏颜色明显变浅。
4）将脾细胞悬液注入50 ml离心管，加DMEM培养基至30 ml，充分混匀。室温1000 rpm离心5 min，弃去上清。
5）沉淀细胞用30 ml DMEM培养基再次洗涤离心一次。最后将脾细胞重悬至10 ml DMEM培养基中，充分混匀。
6）取脾细胞悬液，根据细胞计数结果，补加合适体积DMEM培养基，使细胞浓度为2×108个/ml，备用。
(3) 骨髓瘤细胞悬液的制备
融合前二周复苏骨髓瘤细胞SP2/0于20%（wt%）FBS培养基中。为了保证对HAT呈均一的敏感性，需要用20 μg/ml的8-氮杂鸟嘌呤处理SP2/0，选择呈对数生长中期的细胞，2-3天传代一次，扩大培养。融合当天，收集SP2/0于50 ml离心管内。1000 rpm离心5 min，弃去上清。细胞沉淀中加入30 ml DMEM培养基，重复洗涤离心一次。然后将细胞重悬至10 ml DMEM培养液中，充分混匀。取脾细胞悬液，根据细胞计数结果，补加合适体积DMEM培养基，使细胞浓度为2×108个/ml，备用。
(4) 细胞融合
1）分别吸取含1×108个脾细胞和2-3×107个骨髓瘤细胞的细胞悬液混合，加入到同一支50 ml离心管中，补加DMEM培养基至30 ml，充分混匀。
2）1000 rpm离心8 min，小心将上清去除干净，以免影响PEG浓度。
3）轻轻弹击离心管底，使细胞松散均匀成糊状。左手使离心管呈水平45度均匀转动，右手用玻璃吸管吸取1 ml 50%（wt%）PEG溶液，并沿转动的管壁（尽量接近细胞处）加入，时间控制在60 s；随后立即将细胞悬液全部吸入吸管，时间控制在30 s；再静置30 s后再吹入离心管内时间也控制30 s；5 min内加入25 ml DMEM培养基，稀释PEG中止融合反应：具体操作为第1 min加1 ml，第2 min加4 ml （边加边轻轻转动离心管），随后3 min内将剩余体积加完。此步中所需溶液均要37 ℃预热。
4）800 rpm离心7 min，弃上清。加入合适体积HAT培养基（按96孔板中，2×105个脾细胞/孔计算HAT培养基需要体积），小心吹散沉淀细胞，使充分混匀。将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，100 μl/孔，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。
(5) 杂交瘤细胞的选择培养
将融合后的细胞重悬于HAT培养基中，置于37℃、含5%（wt%）CO2的细胞培养箱内培养。根据细胞状态每2-3天更换培养基一次。换液时吸去1/2-2/3旧培养基，加入等量新鲜培养基。注意培养基的选择按融合后培养时间的不同有所不同：在融合后7 d内用需用HAT培养基；第7-14 d改用HT培养基，第14 d以后用20% FBS培养基即可。
(6) 染色体鉴定
通过染色体染色鉴定可以帮助判断细胞融合是否成功，以及观察融合后的细胞状态。操作步骤如下：
1）培养细胞，将杂交瘤细胞传代1-2天后，加入秋水仙素。
2）秋水仙素处理：在细胞培养瓶中加入秋水仙素，使终浓度达0.1-0.4 μg/ml，并继续培养4-6 h，然后将细胞吹打下来，移入离心管。
3）1000 rpm，离心10 min，弃上清。
4）低渗处理：加入37℃的0.075 M KCl 15ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，放37℃水浴20-30 min。
5）预固定：向细胞悬浮液中加入新配制的固定液1 ml混匀，然后1000 rpm，离心10 min，弃上清。
6）固定：加入固定液5 ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30 min，然后1000 rpm离心10 min，弃上清。
7）再固定：同步骤6）
8）第三次固定：加入固定液5 ml，将细胞悬浮并混匀，封上管口后4℃过夜。
9）制片：1000 rpm离心5 min，轻轻吸掉上清液，视细胞多少而留下0.5-1 ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，用滴管吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，立即用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。
10）染色：用新配制的10%（wt%）Giemsa染色液染色10 min，然后用自来水洗去染液，自然干燥。
11）镜检：于镜下选择染色体分散良好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析，计数100个完整的中期核细胞，记录其染色体数目。
(7) 杂交瘤细胞的筛选
融合后7 d，收集每个杂交瘤细胞培养孔中的培养基，100 μl/孔，用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。
(8) 杂交瘤细胞的克隆
采用有限稀释法对筛选出的阳性细胞株进行克隆，具体步骤如下：
1）制备饲养细胞，可于克隆化前一天制备，也可于克隆化当天制备。
a）6-10周龄BALB/c小鼠经摘眼球放血处死，浸泡于75%酒精，放入超净台内，腹部朝上固定于小鼠解剖台上。
b）用眼科镊子提起小鼠腹部外层皮肤，用眼科剪小心剪一小口，然后用两支镊子向上下两侧方向将皮撕开，使腹膜充分暴露，并用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
c）注射器吸取DMEM培养基6-8 ml，缓慢注入小鼠腹腔（注意针头的深度，不能刺破内脏），右手固定注射器针头，使针头留置于腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1-2 min，也可用注射器在腹腔内反复缓慢抽吸、注射数次。
d）用原注射器抽出腹腔内液体，注入50 ml离心管中。室温1000 rpm离心10 min，弃上清。
e）用5 ml HAT培养基将细胞充分悬浮混匀，根据细胞计数结果，补加合适体积HAT培养基，使细胞浓度为2×105个/ml。
f）将细胞悬液加入96孔培养板内，100 μl/孔。置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养。
2）将待做克隆化的细胞孔内杂交瘤细胞用移液枪反复吹打均匀后，转至24孔细胞培养板中扩大培养，同时进行细胞计数。根据细胞计数结果，用20% FBS培养基对细胞悬液做适当稀释。
3）取250个活细胞悬浮于4.6 ml 20% FBS培养基中（此时平均5个细胞/100μl），接种96孔板中36孔，100 μl/孔。向余下的1.0 ml细胞悬液中，加入4 ml 20% FBS培养基（此时平均1个细胞/100μl），充分混匀，接种96孔板中接下来的36孔，100 μl/孔。最后向剩余细胞悬液1.4 ml，再补加培养液1.4 ml（此时平均0.5个细胞/100μl），充分混匀，接种最后的24孔，100 μl/孔。将此96孔培养板置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。
适时进行换液及检测（步骤同前）。有多孔呈阳性时，应尽可能及早取单克隆孔进行再次克隆化，直至所有细胞孔的上清培养基均为阳性。
(9) 杂交瘤细胞的冻存与复苏
杂交瘤细胞属于半贴壁细胞，收集时不需要用胰酶消化，可以直接用培养基轻轻吹打下来。其冻存与复苏过程如下。
细胞冻存
1）选对数生长期细胞，收集细胞24 h前换液1次。
2）用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬液。
3）细胞计数，调整细胞密度至5×106-1×107/ml，1000 rpm×5min，弃上清。
4）滴加相同容量的含10% （wt%）DMSO的DMEM培养液，重新悬浮细胞。
5）分装入无菌冻存管中，每管加不超过1.5 ml细胞悬液。
6）做好标记和记录，冻存管在4℃预冷40 min，转至-20℃ 放置2 h，最后在-70℃过夜后移入液氮罐中。
细胞复苏
1）从液氮罐中取出冻存管，迅速放入盛有37℃水的搪瓷缸中, 不时摇动，使之尽快融化。
2）配平，1000 rpm离心3 min。
3）在超净台内，用酒精棉球消毒冻存管表面，小心吸出上清，用PBS洗一次。
4）再次1000 rpm离心3 min，小心去除上清。
5）用FBS培养基重新悬浮细胞, 移入培养瓶中, 在37℃、5%CO2培养。
(10) 单克隆抗体的大量制备
大量制备MAb的方法主要有动物体内诱生法和体外培养法两种，这里选用的是动物体内诱生MAb法。
1）小鼠预处理：接种杂交瘤细胞前1-2周，选择健康BALB/c雌性小鼠，腹腔注射液体石蜡剂量为0.5 ml/只，备用。
2）接种杂交瘤细胞：将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞经1000 rpm离心5 min收集，弃上清。用DMEM培养基重悬细胞，充分混匀，细胞计数，并将细胞数调至106/ml，对每只预处理的小鼠腹腔注射1 ml阳性克隆杂交瘤细胞悬液。
3）采集腹水：接种杂交瘤细胞越7-12天后，小鼠腹部明显膨大，可用注射器抽取腹水。由右下腹进针，注意不要刺破内脏，缓慢吸取，一般每只小鼠可抽取腹水1-5 ml。此后每间隔2-3天，腹水再生积聚时，可再抽取，方法同前，可重复1-3次。
4）腹水处理：源于同一株杂交瘤细胞的来自不同小鼠的腹水可以混合。于3000 rpm离心20 min，弃去上层脂肪层和下层细胞层，仅收集中间澄清层，分装后可于-70℃冻存。
(11)单克隆抗体的纯化
1）腹水的预处理
采用二氧化硅（SiO2）吸附法：取合适体积的腹水，加等体积巴比妥缓冲盐水(VBS)稀释于三角瓶中充分混匀。向每10ml稀释后腹水中加入150mg SiO2粉末，室温下，缓慢摇动约30 min，使SiO2能充分吸附除去脂质等杂质。2000 g离心20 min去沉淀，得到澄清的腹水。
2）辛酸-硫酸铵沉淀法
此方法简单易行，适用于纯化IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化则效果差。
a）向一体积预处理过的澄清腹水中加入两体积0.06 M、pH5.0的乙酸缓冲液，充分混匀，并用0.1 N HCl 调pH至4.8。于室温在30 min内逐滴缓慢地加入辛酸（所需辛酸体积按每ml稀释前的腹水加33 μl计算），边加边缓缓搅拌，待辛酸完全加入后，将溶液于4 ℃静置2 h，然后4 ℃下15000 g离心30 min，弃沉淀。
b）上清经砂心漏斗过滤，加入1/10体积的0.1 M PBS，充分混匀，并用1 N NaOH调pH至7.4。于4 ℃冰浴下在30 min内加入0.277 g/ml的硫酸铵溶液，使其达到45%的饱和度，将溶液于4 ℃静置1 h以上，然后4 ℃下10000 g离心30 min，弃上清。
c）将沉淀溶于适量PBS（pH7.4，含137 mM NaCl，2.6 mM KCl，0.2 mM EDTA），加入截流分子量为3000 Da的透析带中脱盐，于4 ℃下浸入预冷的PBS中透析48 h，其间换液 3-4次。最后4 ℃下10000 g离心30 min，除去不溶性沉渣。
d）待透析完成，得到纯度较高的单克隆抗体蛋白溶液，BCA法测定蛋白浓度，分装后冻干，-20℃保存。
(12)单克隆抗体AntiDaintain的鉴定
1）MAb的Ig亚类（型）
取阳性杂交瘤细胞孔的培养基上清，2000 rpm离心8 min去除沉淀，用ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit ?测定MAb的类和IgG亚类及轻链的亚型，采用间接ELISA法，具体操作按照说明书。
2）MAb的亲和常数
用间接ELISA法测定阳性杂交瘤细胞培养基中MAb的亲和常数，步骤如下：
a）包被：分别用1.0 mg/L、2.0 mg/L、5 mg/L三种浓度的抗原蛋白Daintain包被酶标板，100 μl/孔，4℃孵育过夜；弃去板内液体。
b）封闭：加封闭液120 μl/孔，37 ℃置湿盒孵育30 min；
c） 加样：洗涤后，加入稀释成梯度浓度的待测杂交瘤细胞培养基，100 μl/孔，37℃置湿盒孵育1 h。
d）加酶标二抗：洗涤后，加入合适工作浓度（1：3000（wt%））的HRP标记的兔抗鼠IgG抗体，100 μl/孔，37 ℃孵育1 h。
e）加显色液：洗涤后，加新鲜配置的OPD底物显色液，100 μl/孔，37 ℃避光孵育10-30 min。
f）终止反应：加终止液50 μl/孔。酶标仪测A492nm值。
g）做标准曲线：使用作图软件Origin 6.0，以细胞上清中MAb的浓度为横坐标，以其相应的A值为纵坐标，绘制3条测定曲线，以各曲线上部趋于平坦的A值为100%，计算A值为50%时的MAb的浓度[Ab]t，这样每份被检样品可得[Ab] t1﹑[Ab] t2﹑[Ab] t3三个值，然后根据文献公式计算其亲和常数。
3） 腹水的效价
用夹心ELISA法测定腹水的效价，即腹水中MAb的含量，操作步骤如下：
a）包被：取适宜浓度的纯化兔抗鼠IgG抗体包被酶标板，100 μl/孔，4℃孵育过夜；弃去板内液体。
b）封闭：加封闭液120 μl/孔，37 ℃置湿盒孵育30 min；
c） 加样：加入待测的梯度稀释后的腹水样品和梯度稀释的已知浓度小鼠IgG标准品，100 μl/孔，37 ℃湿盒孵育1 h。
d） 加酶标二抗：洗涤后，加入合适工作浓度（1：3000（wt%））的HRP标记的兔抗鼠IgG抗体，100 μl/孔，37 ℃孵育1 h。
e）加显色液：洗涤后，加新鲜配置的OPD底物显色液，100 μl/孔，37 ℃避光孵育10-30 min。
f）终止反应：加终止液50 μl/孔。酶标仪测A 492nm值。
g）做标准曲线：以小鼠IgG标准品的梯度浓度为横坐标，以其相应的A值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据检测各株腹水的A值，计算其中MAb的准确浓度。
4） 经纯化后的MAb效价
方法同腹水效价测定。
5） 蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定单克隆抗体特异性
用常规Western blot检测
6） MAb的表位分析
采用间接ELISA相加实验。
a）根据腹水MAb的效价，将3株腹水分别稀释至饱和时的工作浓度，在此浓度下各取50％两两混匀。
b）用间接ELISA法分别测定3种两两混和的MAb及饱和浓度下3株腹水MAb的A492nm值。
c）利用公式计算加成指数AI=[2A 1+2/(A1+A2)-1]×100%。式中A1、A2分别为2株不同MAb所测的A 492nm值, A 1+2为两两混和抗体所测的A 492nm值。每组重复实验3次，计算其平均值，AI值大于50％即认为两种MAb识别不同的抗原表位。
7） 竞争抑制型ELISA方法的建立
具体步骤如下：
a）包被：用包被缓冲液将检测抗原Daintain稀释至适当的工作浓度(2-10 μg/ml)，加入酶标板中，100 μl/孔，4℃孵育过夜；弃去板内液体。
b）封闭：加封闭液120 μl/孔，37 ℃置湿盒孵育30 min。
c）加样：洗涤后，将Daintain以20 μg/ml的首浓度溶于抗体稀释液中，并依次稀释成15个梯度，100 μl/孔，同时设置第16孔仅加入抗体稀释液作为阴性对照，另将纯化的MAb D5 配成1 mg/ml母液，以1:500稀释为工作浓度，将100 μl抗体溶液与梯度浓度抗原等体积混合后，室温反应1 h，将混合液加入到酶标板中，100 μl/孔，37℃置湿盒孵育1h。
d）加酶标二抗：洗涤后，加入合适工作浓度（1：3000的原始抗体稀释体积浓度）HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，100 μl/孔，37 ℃置湿盒孵育1 h。
e） 显色：加新鲜配置的OPD底物显色液，100 μl/孔，37 ℃避光孵育10-30 min。
f）终止反应：加终止液50 μl/孔，测定各孔的A492nm值。
g）做标准曲线：以梯度抗原浓度为横坐标，对应A值为纵坐标，绘制标准曲线。检测结果用Origin 6.0软件进行分析。
h）处理数据：以各梯度浓度Daintain(包括0 μg/L)的A492nm值转换成B／B0％，其中无Daintain抑制时的A492nm值为B0，各相应质量浓度的Daintain抑制时的A492nm值为B，因为B／B0％值与lg Daintain成线性回归关系，从而可计算回归曲线的方程与相关系数。
9、杂交瘤细胞株的建立
融合7d后，用间接ELISA法对3块96孔细胞培养板筛选阳性杂交瘤细胞孔，如表2所示，共筛得24个阳性孔，阳性率为8%。选择A值高于2的强阳性孔细胞株，再经2次克隆化，最后获得可稳定分泌Daintain抗体的杂交瘤细胞株。
1） 对纯化抗体纯度的测定
将经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到的单克隆抗体D5和E3分别溶于超纯水中，使其浓度为1 mg/ml。分别取5 μl上样，经SDS-PAGE电泳，每个样品泳道仅出现2条明显的蛋白条带，其分子量约为31.5 kDa和51 kDa，符合IgG抗体轻链和重链的大小。条带清楚，无杂带出现，该方法纯化的单克隆抗体纯度高。
2）单克隆抗体AntiDaintain的鉴定
(1) MAb的特性鉴定
用Ig亚类（型）ELISA试剂盒对上述3株杂交瘤细胞板孔中培养基中的MAb进行亚类测定，证明得到的3株MAb均为IgG1（κ）亚型，且腹水效价高，均达到104水平，抗体亲和力强，亲和常数均大于1×1010。对其腹水的效价，以及亲和常数值的详细检测结果。
(2) Western blot鉴定单克隆抗体特异性
分别用5μg 人乳腺癌细胞MCF-7总蛋白，1 μg Daintain和5 μg BSA上样进行SDS-PAGE电泳，选取纯化的抗体D5作为一抗，稀释成1mg/ml，工作浓度为1：10000（wt%）；HRP标记的羊抗鼠IgG（二抗）工作浓度为1：5000（wt%）。Western Bolt检测说明，MAb可特异性地识别重组蛋白Daintain和细胞MCF-7中的天然蛋白Daintain，同时不受交联蛋白BSA的干扰，证明D5 MAb对Daintain的特异性强。
10、竞争抑制型ELISA方法的建立
选取Daintain与单克隆抗体D5进行竞争抑制型ELISA检测实验表明，在高浓度下（20 μg/ ml），游离的Daintain抗原先与MAb结合而大量消耗游离的MAb，从而抑制了下个步骤中MAb与包被抗原Daintain的结合反应；而在低浓度下（10 ng / ml），游离的Daintain不能充分结合游离的MAb，从而不能竞争性地抑制MAb与酶标板底部Daintain的结合反应。此方法进一步证明了制备的MAb D5亲和力高。
使用软件Origin 6.0对建立的竞争抑制型ELISA方法做标准曲线，并根据B/B0％，再对lg Daintain进行回归分析，数据点均匀分布于回归直线上或周围，数据可信。得到回归方程为 y = 6.15863-19.39975x, 其中R＝-0.99033，R2 = 0.9808，符合线性关系的判断标准。其中y值为B/B0％，x值为lg(Daintain)，故最低测限为1.22 ng/ml，最佳检测范围为2-600ng/ml。正常人血清中Daintain水平维持在2-6 ng/ml之间，在多种癌症包括肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等病人血清中Daintain的含量约为正常人的2倍甚至2倍以上，即大于6ng/ml，在最佳检测范围内，故此方法非常适用于检测血清等样品中Daintain的含量。
11、试剂盒的组成及检测
由以上的研究结果，我们研制了AntiDaintain 免疫组化试剂盒，由于本发明的单克隆抗体AntiDaintain具有高度特异性和灵敏性，并且理化性质稳定，可以按照标准方法方便地制备成为癌症诊断试剂盒。
Daintain抗原及其的单克隆抗体AntiDaintain（FTIC或生物素标记）；
样品缓冲液；
洗涤缓冲液；
色原底物溶液(TMB)；
色原终止液(1M HCL)；
反应显色孔板；
ELASA用的酶标仪。
检测原理：该试剂盒是应用一种特异性很高的AntiDaintain单克隆抗体IgG1 且具有 k 轻链包被在常用酶标板上或常用酶标条上。血浆或血清中的可溶性Daintain蛋白和抗体结合，再采用以荧光标记的单克隆抗体对被抗体结合的Daintain蛋白进行夹心式结合，然后用Streptoavidin-HRP复合物结合单克隆抗体AntiDaintain。辣根过氧化酶催化色原底物显色。检测出血中的Daintain浓度。
诊断试剂盒用法：收集病人的血，按照ELASA检测的方法测定，按照本专利多处指定的方法用酶标仪或化学发光仪检测对象中血清中大炎肽的含量，
检测的具体操作为：
1.将Daintain单克隆抗体包埋于酶标板孔或常用酶标条上；
2.洗脱未结合的过剩抗体；
3.将血清点入已有抗体的酶标板上，室温下放置六小时，或摄氏4度冰箱过夜；
4.用显色剂测定daintain的浓度；
5.依据标准曲线计算出血清中daintain的含量。
注意：如含量大于6ng/ml，为预警信号，并建议病人进一步检查。
本发明的癌症诊断试剂盒以血浆或血清为被测样品，使用方便，准确率高，患者依从性好，为癌症诊断提供了一种新的方法和途径。
应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中（应用现行普通的化学发光剂标定在Daintain抗原（大炎肽）分子上或它的单克隆抗体上进行荧光分析测定Daintain在血清中的浓度，都是本专利所保护的范围）。
Claims (8)
1.一种单克隆抗体AntiDaintain，其特征在于，通过以下步骤制得：
1) 抗原Daintain的制备及纯化：根据大炎肽的一级结构及其氨基酸序列设计引物，在大肠杆菌DH5a中进行表达，用超声波破碎菌体，然后纯化表达产物，得到较纯的大炎肽，即抗原Daintain；
2)单克隆抗体AntiDaintain的制备及纯化：通过杂交瘤技术制备含有大炎肽的单克隆抗体AntiDaintain，并进行纯化，之后通过FITC方法进行荧光标记。
2.根据权利要求1 所述的单克隆抗体AntiDaintain，其特征在于，所述单克隆抗体AntiDaintain属于IgG1（κ）亚型。
3.一种试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1、2 所述的单克隆抗体AntiDaintain。
4.根据权利要求3 所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有抗原Daintain。
5.根据权利要求3 所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体AntiDaintain偶联有FITC或生物素标记。
6.权利要求1-5任一所述的试剂盒在癌症诊断中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，通过ELISA技术和化学发光技术分析对象的血液中大炎肽的浓度高低，从而判断发生肿瘤的危险性，当大炎肽在血液中的含量等于或小于6ng/ml血清时为正常，大于6ng/ml时为预警信号。
8.根据权利要求6 所述的用途，其特征在于，所述癌症选自肝癌、肺癌、乳腺癌或胃癌。
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