CN103728457A

CN103728457A - 一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒制备方法及其应用

Info

Publication number: CN103728457A
Application number: CN201310740120.0A
Authority: CN
Inventors: 夏曦; 胡向明; 郭忠振; 黎俊青
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2013-12-25
Publication date: 2014-04-16

Abstract

本发明公开一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒及其应用。本发明原试剂盒含有Inhibin-B蛋白标准品，包被Inhibin-B特异性多克隆抗体的酶标板，CdTe量子点标记的Inhibin-B单克隆抗体。本发明试剂盒所用的检测抗体为单克隆抗体用CdTe量子点标记，能更好的去除背景信号；本发明检测方法简便，实用性强；直接通过荧光酶标仪测定检测结果，所发射的荧光谱峰狭窄，自发荧光弱，灵敏度高；荧光强度高，稳定时间长，克服了传统酶免疫检测试剂盒灵敏度低，特异性差的现状；可提高卵巢储备功能检测的分辨率、灵敏度及特异性。

Description

一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒制备方法及其应用

技术领域

本发明属于免疫诊断技术领域，涉及基于量子点的免疫荧光定量检测，具体涉及一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒及其制备和应用。

背景技术

目前临床上国内各诊疗单位评估卵巢功能主要根据年龄、窦卵泡的数目（Antral folliclecount）、滤泡刺激激素（FSH）和雌激素（E2）水平等。但上述传统方法检查容易受到各种因素影响而产生误差，同时容易受到检测者主观判断而产生结果偏倚；此外，上述指标的检测受月经周期的时限制约，且其检测数值受到月经周期的波动较大，因而无法准确给予判断。能否寻找某一有效指标，在月经不同时期均能有效评估卵巢功能是目前妇科生殖内分泌面临的主要问题之一。近年来，临床上开始采用抑制素B激素作为卵巢功能评估的一项指标。抑制素B是一种由女性生长期卵泡颗粒细胞分泌的异二聚体蛋白质激素。其通过选择性抑制卵泡刺激素（FSH）的分泌从而调节卵泡的发育。完整的抑制素B分子是一个分子量约为32KD的分子，由两个不同的亚单位（α亚单位和β亚单位）经二硫键连接而成。研究表明，抑制素B水平与卵巢储备功能呈正相关。

目前在欧美，大部分临床诊疗中心已将Inhibin-B作为评估卵巢储备的常规指标。主要所采用酶联免疫显色法测定（enzyme-linked immunoassay,Elisa)。但是，酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性结果。量子点（QDs）具有连续而宽的激发光光谱。其荧光可被波长小于其量子限域峰的任意光源所激发，且荧光谱峰位置可以通过改变量子点物理尺寸进行调控。这样仅用一种波长的激发光源便可激发多种不同颜色荧光的量子点进行多元荧光检测。有效提高了分辨率和灵敏度。因此，量子点免疫分析法远远优于酶免疫测定。

目前国内尚未见检测Inhibin-B的注册试剂盒供应，该项检测在临床上的研究也还未广泛展开。且目前国外的Inhibin-B检测试剂盒多采用的是酶联免疫方法，但是酶免疫分析法灵敏度低，影响因素多，易造成假阴性和假阳性。而根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及临床应用前景来看，量子点免疫分析法远远优于酶免疫测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种量子点免疫荧光定量检测人抑制素B的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒在检测卵巢储备功能中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒，该试剂盒包括Inhibin-B蛋白标准品，包被Inhibin-B特异性多克隆抗体的酶标板，CdTe量子点标记的Inhibin-B单克隆抗体。

进一步的，上述Inhibin-B蛋白标准品为原核细胞表达的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

进一步的，上述Inhibin-B特异性多克隆抗体是以原核表达的Inhibin-B重组蛋白作为免疫原合成的兔抗人Inhibin-B多克隆抗体。

进一步的，上述Inhibin-B单克隆抗体是以原核表达的Inhibin-B重组蛋白作为免疫原合成的鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体。

进一步的，本发明试剂盒还包括：标记抗体稀释液、洗板液、封闭液和样品稀释液。

本发明的有益效果是：

试剂盒中作为检测抗体的单克隆抗体，由于采用的量子点标记法具有激发光谱宽，自发荧光弱，荧光稳定和半衰期长等特点，大大的提高了检测的分辨率、灵敏度和特异性。

本发明的试剂盒以CdTe量子点标记鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体作为检测抗体，更好的去除背景信号，提高检测的分辨率和灵敏度；且通过荧光酶标仪测量荧光强度获得检测结果，所发射的荧光谱峰狭窄，自发荧光弱，灵敏度高；荧光强度高，稳定时间长；克服了现有的抑制素B酶免疫检测试剂盒灵敏度低，特异性差的现状，提高检测的分辨率、灵敏度及特异性，更为有效地对早期卵巢储备功能进行检测及风险评估。

本发明用量子点免疫分析法检测Inhibin-B是先进而有效的方法，能够有效的提供临床检测的分辨率、灵敏度及特异性，且检测方法操作简便，实用性强。

附图说明

图1为人Inhibin-B重组蛋白纯化前后的western blotting图片；

图2为纯化后的兔抗人Inhibin-B多克隆抗体的标准曲线；

图3为纯化后的鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体的标准曲线；

图4为Inhibin-B量子点免疫分析检测试剂盒的检查区间曲线。

具体实施方式

以下结合具实施例对本发明作进一步说明，但并不局限于此。

1）Inhibin-B原核表达载体的构建

选择Inhibin-B的免疫原区，其基因序列如SEQ ID NO.2所示，共330bp，所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，为Inhibin-B完整氨酸酸序列的N端到C端的第298个至第407个氨基酸，共110个氨基酸。

设计扩增Inhibin-B免疫原区序列的特异性引物如下：

EcoR I Up primer：CCGGAATTCGGCCGGACCAACCTCTGTTG（下划线标记部分为内切酶EcoR I的识别序列）（如SEQ ID NO.3所示，），

Xho I Down primer：CCGCTCGAGGGCGCAGCCGCACTCCTCCG（下划线标记部分为内切酶Xho I的识别序列）（如SEQ ID NO.4所示，）。

利用氯仿抽提法从卵巢癌细胞总RNA，通过逆转录及PCR引物扩增出Inhibin-B免疫原区序列，将扩增后的Inhibin-B序列酶切后连接到pGEX-4T-1原核表达载体上，转化至DH5α感受态细胞中，用涂布棒将转化细胞接种到氨苄抗性的LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落并进行小量扩增培养，提取质粒，采用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切质粒后，琼脂糖电泳验证，若能酶切出约300bp的带，将初步鉴定为含目的基因的菌落，进一步测序验证，测序正确，即成功获Inhibin-B的原核重组融合蛋白表达载体，记为pGEX-4T-1-Inhibin-B。

2）Inhibin-B免疫原的表达及纯化

Inhibin-B目的蛋白的表达

将pGEX-4T-1-Inhibin-B转化大肠杆菌RG2，挑取克隆37℃，250rpm震荡培养直到OD值达到0.4～0.6，在0.5mM IPTG诱导下10℃、150rpm培养过夜，然后5000g离心10min收集菌体备用。细菌干沉淀可以保存于-80℃。

Inhibin-B目的蛋白的表达检测

细菌干沉淀中加入适量裂解液，冰浴下超声裂解菌体超声过程中保证蛋白始终处于冰浴中，防止超声过热影响蛋白稳定。12000rpm，4℃离心，收集上清蛋白，Western Blot鉴定蛋白及检测蛋白表达量。

Inhibin-B目的蛋白的分离纯化

细菌干沉淀中加入适量裂解液，冰浴下超声裂解菌体超声过程中保证蛋白

终处于冰浴中，防止超声过热影响蛋白稳定。12000rpm，4℃离心，收集上清蛋白，0.44um过滤。将离心收集的蛋白裂解液和预清洗GSH–agarose充分混匀，4℃震荡共孵育4h。细胞裂解液清洗3次，TBS清洗3次，加入10mM谷胱甘肽洗脱液洗脱蛋白。洗脱后的蛋白可以通过10KD的蛋白浓缩柱浓缩蛋白并去除液体中的谷胱甘肽，并用PBS洗涤。纯化后的蛋白用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度并通过western blot鉴定其纯度（见图1）。

二、兔抗人Inhibin-B多克隆抗体制备与鉴定

1）兔抗人Inhibin-B多克隆抗体制备

动物免疫

准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm～2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。每4～6周注射抗原，并在注射后的7天～10天按照收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。

收集血清

将家兔轻轻放入固定架上，二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm～0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒～20秒确定血流停止后方可。将血液在37℃恒温箱中放置30分钟，再在4℃放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4℃，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20℃保存数年。

抗体纯化

将抗血清放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37℃预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4℃，15,000g离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。

将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5ml的速度将抗血清上到柱上，为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100ul中和缓冲溶液的1.5ml EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。在柱中加入10ml，pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至Aλ280nm<0.008。

利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量，抗体浓度为2.9mg/ml，将纯化的抗体分装后在2～8℃保存。

2）抗Inhibin-B多克隆抗体的鉴定

兔抗人Inhibin-B多克隆抗体灵敏度的初步检测

采用间接Elisa法，将重组蛋白Inhibin-B分别按1ug、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的量进行包被，分别加入按1：500、1：1000、1：2000、1：5000，1：10000稀释的兔免疫血清作为一抗，加入按1：80000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG作为二抗，TMB显色，450nm测OD值。以蛋白稀释度为横坐标，以450nm处的OD值为纵坐标，绘出曲线图，结果显示1:10000稀释的血清存在良好的线性关系的检测区间100pg～100ng。

兔抗人Inhibin-B多克隆抗体的Western blotting鉴定

将重组蛋白Inhibin-B分别按1ng、100pg、10pg、1pg的量进行SDS-PAGE胶点样、电泳，孵抗体时，分别加入1：500、1：1000、1：2000倍稀释的多克隆抗体血清作为一抗，加入1：10000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG作为二抗，通过Western鉴定抗体效价，结果显示1：2000稀释的多克隆抗体血清可以很好的识别1ng Inhibin-B重组蛋白。

纯化后抗Inhibin-B多克隆抗体的效价测定

采用间接Elisa法，用重组蛋白Inhibin-B抗原1μg/100μl包被，4℃过夜；洗涤后5%脱脂奶粉封闭过夜；将纯化的多克隆抗体进行系列稀释作为一抗，37℃温育2h；洗涤后加入1︰50,000稀释的HRP-标记的山羊抗兔IgG作为二抗，37℃温育1h；洗涤后加底物显色并及时终止，测OD_450nm值。

检测结果如图2所示，多克隆抗体的效价为1:25600，其中横坐标为稀释度的Log值，纵坐标为OD值。

三、鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体制备与鉴定

1）鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体的制备

i动物免疫

将纯化的重组人Inhibin-B抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，制成油包水抗原乳剂，SPF级纯系BALB/c雌性小鼠6～8周龄，背部皮下多点注射，100μg/只，两星期后用等量抗原加体积相同的弗氏不完全佐剂，进行乳化，免疫。分别于首次免疫后的第2、4、6周末进行加强免疫，每次用相同剂量的目的蛋白。用间接Elisa法检测血清抗体的效价。细胞融合前3天小鼠尾静脉注射或腹腔注射100μg Inhibin-B蛋白以加强免疫。

ii小鼠脾细胞的分离

取加强免疫的BALB/c小鼠，摘眼球采血处死，75%酒精浸泡5～10分钟，固定于蜡盘；用75%酒精消毒皮肤后，剪开腹部皮肤，暴露腹膜并用75%酒精擦拭消毒；用玻璃注射器吸取无血清DMEM培养液5ml注入小鼠腹腔，用注射器在腹腔内反复抽吸(注意不可刺破小鼠的消化器官)；用该注射器抽出腹腔内液体，注入50ml离心管内；换镊子，提起腹膜，换剪刀，暴露腹腔，无菌摘取脾脏，小心快速剪去周边脂肪和筋膜，用无血清DMEM培养液洗1～2次，再将脾放入盛200目铜筛的平皿中，剪破包膜，用注射器芯研磨、挤压脾细胞过网，吸取无血清DMEM培养液5ml吹打铜筛，收集过网后的脾细胞放入50ml无菌离心管中；将两离心管l000rpm，离心5min；弃上清，加入5ml无血清DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，待用；用完全培养液重悬沉淀的腹腔内巨噬细胞，加入96孔培养板，100μl/孔，然后置于37℃、5%CO₂培养箱内培养，备用。

iii SP2/0细胞的复苏与培养

从液氮罐中取出含有SP2/0细胞冻存管，立即投入37℃水浴锅中，融化后于1000rpm离心5～10min，弃上清；配制含10%小牛血清的DMEM培养液培养复苏细胞。将细胞接种于正常BALB/c小鼠背部两侧皮下，待瘤生长至3～5cm左右，即进行无菌摘瘤，用无血清DMEM培养液洗涤3次后，用小剪刀剪成直径约2mm左右小块，加入预先加了2～3ml无血清DMEM培养液的200目铜筛中，用注射器芯研磨、挤压出单个肿瘤细胞，置含10%FBS的DMEM培养液中常规培养，使细胞维持对数生长期。融合前1天给SP2/0细胞换一次液，调节细胞密度为1～5×10⁵/ml，融合当天取约1～5×10⁷个SP2/0细胞收集至50ml无菌离心管中，离心弃上清，加入5ml无血清DMEM培养液，混匀，细胞计数，备用。

iv细胞融合及选择培养

将SP2/0细胞与脾细胞按1:5比例混合50ml无菌离心管中，l000rpm，离心5min；弃上清，轻弹管底，使沉淀松动，沿离心管壁缓慢滴加37℃预温的45%PEG溶液lml，同时缓慢转动离心管以混匀细胞，1min内将PEG4000加完；置37℃水浴中1min后，再于5min内缓慢加入37℃预温的无血清DMEM培养液8ml，同时轻轻搅动使细胞成均一的悬液；置37℃水浴中5min后，l000rpm，离心5min，弃上清；加入37℃预温的HAT培养液，轻悬细胞，按1×10⁵个脾细胞/孔滴加到含饲养层细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。融合后5～10天可根据克隆生长情况用HAT培养液半量换液；2周后可换HT培养液，3周后可换完全培养液；培养3～5天即可见小克隆出现，杂交细胞较大，呈圆形且透明，其他细胞透光性差并逐渐死亡；培养8～2天，克隆生长至孔底面积的1/3～1/2，此时可取培养上清液，进行抗体检测；一旦检测到分泌预定抗体的克隆细胞，及时将阳性克隆转种到24孔培养板，再进一步转入培养瓶扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养。

v杂交瘤细胞的筛选

细胞融合后，一旦长出大小适宜的克隆时，应及时选择灵敏、快速、可靠的免疫学方法筛选分泌预定抗体的杂交细胞克隆。本实验采用重组人ES抗原的间接Elisa法检测，其中一抗为杂交瘤细胞的上清液，二抗为HRP-山羊抗鼠IgG(1:80,000)。具体操作步骤同鼠血清效价检测。

vi亚克隆化培养

克隆化培养对于获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞株至关重要，一般需要进行3～4次亚克隆化培养，以保证分泌性克隆生长的稳定性。采用有限稀释法，详细步骤如下：制备饲养层，取正常小鼠腹腔细胞，制成细胞悬液，接种96孔培养板，每孔50μl，约含2×10⁴细胞，37℃、5%CO₂培养箱中培养过夜；次日用微量移液器吹打杂交瘤细胞培养板中孔内的克隆，悬浮于完全培养液中；取样，用血球计数板计数，调整细胞浓度分别为20个/ml、5个/ml；分别将二种密度的杂交瘤细胞悬液接种于含饲养层细胞的培养板中，每孔50μl，使每孔分别含2、1、0.5个细胞；置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，一周后加100μl培养基。培养12～15天，对有克隆的培养上清进行抗体检测；对阳性单克隆细胞再克隆化培养，直到100%的克隆分泌特异性抗体为止；同时将阳性克隆进一步扩大培养、冻存。

vii鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体的大量制备及纯化

在细胞培养过程中杂交瘤能产生和分泌单克隆抗体约10～100μg/ml。为了获得大量高效价抗体，通常将杂交瘤细胞植入BALB/c小鼠体内，制备并收集含特异性单克隆抗体的腹水，方法如下：选用8～10周BALB/c雌性小鼠，在接种杂交瘤细胞前1～2周，先给小鼠腹腔注射0.5ml福氏不完全佐剂，预处理过的小鼠在2～3个月均可使用；收集生长良好的杂交瘤细胞，离心洗涤1次，重悬于无血清培养液中，调整细胞密度为1～2×10⁶/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml细胞悬液；密切观察小鼠的健康状况与腹水征象，接种细胞7～12天，可见小鼠腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可消毒腹部皮肤，用5ml注射器接8号针头，刺入腹腔，卸下注射器，抬高小鼠头部，使腹水滴入离心管中；间隔2～3天，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠一般可抽取2～3次。3000rpm离心15min，弃去上层油脂、细胞成分和其他沉淀物，吸取淡黄色腹水；采用饱和硫酸铵沉淀法粗纯化，Protein G Sepharose4FF亲和层析柱法纯化杂交瘤细胞腹水，纯化后的抗体浓度为1.2mg/ml。

2）抗Inhibin-B单克隆抗体的鉴定

i间接Elisa初步检测抗Inhibin-B单克隆抗体灵敏度

将重组蛋白Inhibin-B分别按1ug、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的量进行包被，分别加入按1：500、1：1000、1：2000、1：4000稀释的含杂交瘤细胞的腹水作为一抗，加入1：80000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，TMB显色，450nm测OD值。以蛋白稀释度为横坐标，以OD_450nm值为纵坐标，绘出曲线图，结果显示1:4000稀释的腹水存在良好的线性关系的检测区间100pg～100ng。

ii鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体的Western blotting鉴定

将重组蛋白Inhibin-B分别按1ng、100pg、10pg、1pg的量进行SDS-PAGE胶点样、电泳，分别加入按1：500、1：1000倍稀释的单克隆抗体腹水作为一抗，加入1：10000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，Western检测抗体效价。检测结果显示1：1000稀释的单克隆抗体腹水可以很好的识别100pg Inhibin-B重组蛋白。

iii纯化后抗Inhibin-B单克隆抗体的效价测定

采用间接Elisa法，用重组人ES抗原1μg/100μl包被，4℃过夜；洗涤后5%脱脂奶粉封闭过夜；纯化后将单克隆抗体进行系列稀释作为一抗，37℃温育2h；洗涤后将1:80,000稀释的HRP-标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，37℃温育1h；洗涤后加底物显色并及时终止，测OD_450nm值。检测结果如图3所示，单克隆抗体的效价为1:512。

iv鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体的免疫球蛋白类别及亚型鉴定

参照Sigma公司抗体亚型检测试剂盒说明书，采用Antigen-Mediated Elisa法测定单克隆抗体的Ig类别和亚型。

四、量子点标记

1）CdTe量子点的合成

CdCl₂·2.5H₂O（2.5×10^-4mol）溶于25ml的超纯水中，加入谷胱甘肽GSH（3×10^-4mol），二水合柠檬酸三钠（0.1g），Na₂TeO₃（0.5×10^-4mol）和NaBH₄（2.4×10^-4mol），在磁力搅拌的条件下用NaOH调节pH到10.5，所有反应都是在室温环境下，Cd²⁺、TeO₃ ^2－和GSH的摩尔比为5:1:6，放入带回流的微波装置中（功率设为600W），当溶液颜色变成淡绿色时开始回流，随着回流时间的不同形成一系列不同粒径的以谷胱甘肽为稳定剂的量子点。选择合适的量子点将反应后的溶液冷却至室温后用无水乙醇进行沉淀，在4000rpm的条件下离心5min。去除上清中过量的Cd²⁺、TeO₃ ^2－等杂质，重复3遍，待乙醇完全挥发后，将沉淀重悬于pH7.4的PBS中。

2）CdTe量子点与鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体的偶联及纯化（量子点标记的二抗）

取上述浓度的量子点（QDs）CdTe600μl，加入18ul的EDC（1mg/ml）和800μl的甲醇混合后避光震荡30min，再加入8ul的β－巯基乙醇进行终止，取0.75mg的二抗用PBS稀释至适当体积加入活化的QDs中与之混合，避光震荡2h，反应结束后再加入巯基乙醇稳定量子点，进行透析。透析后在16300g条件下离心3min，去除上清，沉淀（即为纯化的偶联有量子点的Inhibin-B重组蛋白抗体）重悬于PBS中，4℃保存。

经过间接ELISA法检测发现标记二抗在1:10000的稀释条件下检测效果最好。

所有所述的间接Elisa法的具体步骤为：

a包板：pH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原至最适浓度1μg/孔，且100μl/孔，放入湿盒，4℃过夜；

b封闭：次日弃去包被液，PBST洗涤酶标反应孔4次，每次5min，甩干，5%牛血清白蛋白300μl/孔封闭，放入湿盒，4℃过夜；

c弃去封闭液，同上洗涤，PBS倍比稀释兔血清样品100μl/孔，同时设立空白，阳性和阴性对照，37℃湿盒温育1.5h；

d弃去血清样品，同上洗涤，PBS稀释成1:80,000的HRP-山羊抗兔IgG100μl/孔，37℃温育1h；

e弃去酶标二抗，同上洗涤，TMB显色，底物A和B各50μl/孔，37℃避光显色10min，每孔加入50μL2mol/L H₂SO₄终止液，全自动酶标仪测定OD_450nm值。

五、基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B试剂盒及其检测方法

1）试剂盒检测方法

利用纯化的兔抗人Inhibin-B多克隆抗体作为捕获抗体，偶联有量子点的鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体作为检测抗体，建立Inhibin-B的单抗和多抗双夹心量子点检测法。

i酶标板的包被及封闭

pH9.6碳酸盐缓冲液稀释多克隆抗体至最适浓度1μg/孔，且100μl/孔，放入湿盒，4℃过夜；次日弃去包被液，PBST洗涤酶标反应孔4次，每次5min，甩干，5%牛血清白蛋白300μl/孔封闭，放入湿盒或干燥的金属薄袋内，4℃过夜。

ii标准品或被检血清的处理

Inhibin-B蛋白标准品（阳性标准品）或被检血清用样品稀释液（含1%BSA和0.05%的吐温-20的PBS）做适当比例的稀释，不加血清的样品稀释液作为阴性标准品，100μl/孔，37℃反应1小时后用洗板液洗板3次，将酶标板拍干。

iii单克隆抗体检测

Inhibin-B单克隆抗体1:5000稀释后使用，现配现用。100μl/孔，37℃反应1小时后用洗板液洗板3次，拍干后加入100μl PBS。将处理好的酶标板经由荧光酶标仪测定荧光强度值。建立标准曲线，得到检测限。

2）试剂盒性能指标检测

i试剂盒的检测区间

取包被好兔抗人Inhibin-B多克隆抗体并进行封闭的酶标板，将Inhibin-B蛋白标准品做适当比例的稀释，每个样品做3个重复孔。100μl/孔，37℃反应1小时后用洗板液洗板3次，将酶标板拍干。用PBS稀释鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体1:10000稀释后使用，现配现用，100μl/孔，37℃反应1小时后用洗板液洗板3次，拍干后加入100μl PBS，将处理好的酶标板经由荧光酶标仪测定荧光强度值。检测数据如下表1所示，以不同浓度的Inhibin-B的标准品蛋白为横坐标，以相应的荧光强值为纵坐标，绘制曲线如图4所示，本试剂盒具有良好的线性关系的检测区间为0.14pg/ml～213.28ng/ml，在该区间的标准曲线方程为y=2.9179x+271.51（R²=0.9931）。

表1Inhibin-B量子点免疫分析检测试剂盒可检测的蛋白浓度区间

Inhibin-B蛋白浓度（pg/ml）	荧光值（a.u.）
		0	259.032±10.129
0.14	272.159±12.325
		1.57	301.584±11.538
52.42	401.493±12.252
		109.77	565.593±10.105
151.92	730.432±14.766
		213.28	901.645±13.986
249.42	950.392±14.322

ii试剂盒的灵敏度检测

以零浓度标准品（即空白对照同，不含蛋白）当作标本测量20次，计算其荧光值均值及标准差。以测定值的均值加上2倍的标准差所得的荧光值代入标准曲线方程y=2.9179x+271.51（R²=0.9931）。计算得出的浓度为其最低检测量。

表2本发明试剂盒测量Inhibin-B蛋白浓度为零的标准品的荧光值

标本号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

荧光值	251.021	258.321	263.394	258.491	244.429	241.439	259.492	269.792	245.649	264.386	267.647
												标本号	12	13	14	15	16	17	18	19	20	平均值	标准差
荧光值	267.593	253.593	261.694	256.693	251.593	254.593	249.598	255.194	262.593	256.86	8.00

检测结果见上表，按上面的方法将结果代入标准曲线方程计算得到的最低检测量为0.46pg/ml，表明本发明试剂盒和检测方法对人Inhibin-B的检测具有高度的灵敏性。

iii试剂盒的特异性检测

①本发明Inhibin-B检测试剂盒只检测人血清中的Inhibin-B蛋白

用本发明的检测剂盒分别检测24份的人、小鼠血清中的Inhibin-B含量（pg/ml），检测数据如下表3。

表3本发明检测剂盒分别检测24份的人、小鼠血清中的Inhibin-B含量（pg/ml）

人血清样品号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													Inhibin-B（pg/ml）	39.75	49.56	89.76	35.03	57.56	48.38	60.785	45.18	67.90	71.67	79.59	62.59
人血清样品号	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24
													Inhibin-B（pg/ml）	49.42	30.45	30.35	35.01	38.10	80.67	45.07	53.28	78.32	45.91	43.01	35.39
鼠血清样品号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													Inhibin-B（pg/ml）	-0.022	0.019	0.935	0.045	-0.013	0.310	0.001	0.702	-0.180	0.051	0.221	0.501
鼠血清样品号	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24
													Inhibin-B（pg/ml）	0.206	0.067	0.013	0.018	0.012	0.023	0.013	-0.021	0.334	0.009	-0.110	0.318

结果显示人血清的Inhibin-B蛋白的含量大约在30.35pg/ml-89.76pg/ml之间，鼠的含量检测低于检测限0.46pg/ml，表明该试剂盒只对人血清敏感，对其他动物血清不敏感。

②其他血清蛋白不影响Inhibin-B检测试剂盒对Inhibin-B的检测

用绝经后女性的血清(Inhibin-B浓度低于检测下限)稀释Inhibin-B标准品抗原，用本发明试剂盒检测Inhibin-B的含量，并与正常稀释后的Inhibin-B标准品检测结果进行比较，检测数据如下表4所示。

表4本发明Inhibin-B检测试剂盒对不同方式稀释的Inhibin-B标准品的检测

结果显示，本发明Inhibin-B检测试剂盒对用绝经后女性的血清((Inhibin-B浓度低于检测下限)稀释的Inhibin-B标准品的检测结果与正常稀释后的Inhibin-B标准品检测结果基本一致，说明血清中的其他蛋白不影响本发明Inhibin-B检测试剂盒对Inhibin-B的检测。

iv本发明检测试剂盒的稳定性

将自制试剂盒的三批试剂分别放置于4℃半年及一年，37℃放置7天后，比较与放置前参考标准品各点荧光强度值间的线性关系及零标准品荧光强度值，检测各批试剂合的稳定性，结果显示与放置前不存在明的差异。

v本发明检测试剂盒的临床运用

检测162例平均年龄为31岁女性月经第3～5天血清中抑制素B的含量，其中68例平均年龄为28岁体检的健康女性作为正常对照组（n=68），另94例为因卵巢储备功能下降进行辅助生殖助孕患者（n=94）。检测结果为：正常对照组血清中抑制素B含量的范围是29.15～82.44pg/ml，均值为54.35±24.22pg/ml；卵巢储备功能下降组血清中抑制素B含量的范围是5.35～36.12pg/ml，均值为19.46±19.80pg/ml，差异具有统计学意义（p<0.05）。

上述临床检测结果说明本试剂盒具有较高的灵敏性和很好的准确性，无假阳性或假阴性的结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 李志荣

<120> 一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒制备方法

及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 110

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Gly Arg Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe Phe Ile Asp Phe Arg

1 5 10 15

Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro Thr Gly Tyr Tyr Gly

20 25 30

Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu Ala Gly Val Pro Gly

35 40 45

Ser Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn Gln Tyr Arg Met Arg

50 55 60

Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys Ile Pro Thr Lys Leu

65 70 75 80

Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr Asn Ile Val Lys

85 90 95

Arg Asp Val Pro Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ala

100 105 110

<210> 2

<211> 330

<212> DNA

<213> 人

<400> 2

ggccggacca acctctgttg caggcaacag ttcttcattg acttccgcct catcggctgg 60

aacgactgga tcatagcacc caccggctac tacgggaact actgtgaggg cagctgccca 120

gcctacctgg caggggtccc cggctctgcc tcctccttcc acacggctgt ggtgaaccag 180

taccgcatgc ggggtctgaa ccccggcacg gtgaactcct gctgcattcc caccaagctg 240

agcaccatgt ccatgctgta cttcgatgat gagtacaaca tcgtcaagcg ggacgtgccc 300

aacatgattg tggaggagtg cggctgcgcc 330

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

ccggaattcg gccggaccaa cctctgttg 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

ccgctcgagg gcgcagccgc actcctccg 29

Claims

1.一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括Inhibin-B蛋白标准品，包被Inhibin-B特异性多克隆抗体的酶标板，CdTe量子点标记的Inhibin-B单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒，其特征在于：所述的Inhibin-B蛋白标准品为原核细胞表达的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒，其特征在于：所述的Inhibin-B特异性多克隆抗体是以原核表达的Inhibin-B重组蛋白作为免疫原合成的兔抗人Inhibin-B多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒，其特征在于：所述的Inhibin-B单克隆抗体是以原核表达的Inhibin-B重组蛋白作为免疫原合成的鼠抗人Inhibin-B单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测人Inhibin-B的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括：标记抗体稀释液、洗板液、封闭液和样品稀释液。