CN106483303A - 人类血型检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人类血型检测试剂盒,包括检测条,该检测条包括金结合物垫和反应膜,金结合物垫包被有胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体、胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体和胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体;反应膜包括包被有鼠抗人B抗原单克隆抗体的B抗原检测线、包被有鼠抗人A抗原单克隆抗体的A抗原检测线、包被有鼠抗人D抗原单克隆抗体的Rh检测线和包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。本发明还提供了该试剂盒的制备方法包括反应膜的制备、金结合物垫的制备及切割装配等步骤。该人类血型检测试剂盒,可同时检测ABO及Rh血型,检测结果直观,并可用于检测溶血样本,具有高灵敏性、特异性与稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域,特别是指一种人类血型检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
血型是指血液成分(包括红细胞、白细胞、血小板及血浆蛋白)表面的抗原类型。通常所说的血型是指红细胞膜上特异性抗原类型,而与临床关系最密切,人们所熟知的是红细胞ABO血型系统及Rh血型系统。
早期ABO血型及Rh血型实验室检测方法主要有血凝试验、微柱凝胶试验,上述方法已广泛应用于临床血型鉴定以及输血科交叉配血等。近年建立了如流式细胞技术、酶联免疫吸附试验、胶体金凝集技术等实验室检测方法。其中,血凝试验是指抗体和红细胞在液体介质中发生肉眼可见的凝集反应,主要分为玻片法、试管法、全自动微板法。微柱凝胶试验采用凝胶技术进行抗球蛋白试验,该方法可提高试验的灵敏度及特异性。目前微柱凝胶试验在国外输血领域已逐渐作为常规应用于ABO及Rh血型定型,未知血型抗体筛查以及直接抗球蛋白试验。
然而,现有技术中血凝试验、微柱凝胶试验、胶体金凝集技术均为反定性产品,检测结果需要进行反向推断才能判定结果,且操作较为繁琐,检测过程受认为因素干扰较多。同时,流式细胞术、酶联免疫检测,需要有专业人员进行操作,并且需要特殊设备进行判读。此外,上述传统方法使用的血液样本不能出现溶血,溶血样本会干扰检测结果,导致错误判读。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提出一种人类血型检测试剂盒,可同时检测ABO及Rh血型,检测结果直观,并可用于检测溶血样本,具有高灵敏性、特异性与稳定性。
基于上述目的本发明提供的人类血型检测试剂盒包括检测条,所述检测条包括金结合物垫和反应膜,所述金结合物垫包被有胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体、胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体和胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体;所述反应膜包括包被有鼠抗人B抗原单克隆抗体的B抗原检测线、包被有鼠抗人A抗原单克隆抗体的A抗原检测线、包被有鼠抗人D抗原单克隆抗体的Rh检测线和包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。
可选的,所述鼠抗人B抗原单克隆抗体的浓度为1.0-5.0mg/mL,所述鼠抗人A抗原单克隆抗体的浓度为1.0-5.0mg/mL,所述鼠抗人D抗原单克隆抗体浓度为1.0-10.0mg/mL。
可选的,所述羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度为4.0-10.0mg/mL。
可选的,还包括样本稀释液,该样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
较佳的,所述检测条放置于长方形塑料盒中,构成检测卡,该检测卡上设有样品孔和检测孔,所述样品孔与所述检测条的所述样品垫位置对应,所述检测孔对应所述检测条的所述检测线和所述质控线。
基于相同的发明构思,本发明还提供了上述人类血型检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)反应膜的制备:
稀释所述鼠抗人B抗原单克隆抗体、鼠抗人A抗原单克隆抗体、鼠抗人D抗原单克隆抗体和所述羊抗鼠IgG多克隆抗体,并喷涂至所述反应膜上,分别形成所述B抗原检测线、A抗原检测线、Rh检测线与质控线,干燥备用;
(2)金结合物垫的制备:
将所述鼠抗人B抗原单克隆抗体、鼠抗人A抗原单克隆抗体、鼠抗人D抗原单克隆抗体分别与胶体金进行偶联制得胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体溶液,均调整浓度,并混合为混合液,该混合液浸泡所述金结合物垫,铺金,干燥备用;
(3)切割装配:将所述反应膜、金结合物垫、粗纤维滤纸、样品垫装配至所述反应板,切割后形成所述检测条。
可选的,所述鼠抗人A抗原单克隆抗体和鼠抗人B抗原单克隆抗体分别通过以下步骤制备获得:
(1)取正常人的红细胞,洗涤、离心后取上清;
(2)悬液免疫BALB/C小鼠,取脾脏,获得脾淋巴细胞悬液备用;
(3)骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞通过聚乙二醇融合;
(4)选择培养基初步筛选、抗原特异性筛选及有限稀释、克隆化。
可选的,所述胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体、胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体、胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体的制备包括以下步骤:
(1)使用碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.0-9.0;
(2)加入单克隆抗体,搅拌;
(3)加入10%牛血清白蛋白溶液,搅拌;
(4)离心,弃去上清液;
(5)加入胶体金结合物稀释液,即得。
较佳的,使用碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5。
可选的,所述胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体溶液,均调整浓度至6-10μg/mL,混合为混合液。
从上面所述可以看出,本发明提供的人类血型检测试剂盒具有快速、简便、不需特殊设备,适用广泛,特异性好,灵敏度高。可同时检测ABO和Rh血型。整个操作时间仅需3-5分钟,检测结果直观,适用于临床检测、现场调查等。并且,本发明可对溶血样本进行检测,溶血样本与未溶血样本检测结果无明显差异,有效控制临床应用过程中因溶血造成的错误判读,避免患者后期诊疗过程中输入错误血型的高危风险。
附图说明
图1为本发明实施例人类血型检测试剂盒中检测条的结构示意图;
图2为本发明实施例人类血型检测试剂盒中检测卡的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明进一步详细说明。
实施例1;人类血型检测试剂盒
在本实施例中,所述人类血型检测试剂盒,包括检测条或检测卡、样本稀释液。图1为本发明实施例人类血型检测试剂盒中检测条的结构示意图,如图1所示,所述检测条包括反应板1,以及粘附于所述反应板上1的样品垫2、金结合物垫3、反应膜4、粗纤维滤纸5。在本实施例中,所述金结合物垫3包被有胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体、胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体和胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体。
在本实施例中,所述反应膜4为硝酸纤维素膜,包括B抗原检测线6、A抗原检测线7,Rh检测线8、质控线9。B抗原检测线6包被有鼠抗人B抗原单克隆抗体,A抗原检测线7包被有鼠抗人A抗原单克隆抗体,Rh检测线8包被有鼠抗人D抗原单克隆抗体。
在本实施例中,所述鼠抗人A抗原单克隆抗体的浓度为1.0-5.0mg/mL。较佳地,所述鼠抗人A抗原单克隆抗体浓度为1.5mg/mL。该鼠抗人A抗原单克隆抗体是无色澄清透明溶液;用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)测定,上样量为10μL时,该鼠抗人A抗原单克隆抗体显示为重链和轻链各一条带。
在本实施例中,所述鼠抗人B抗原单克隆抗体的浓度为1.0-5.0mg/mL。较佳地,所述鼠抗人B抗原单克隆抗体浓度为1.5mg/mL。鼠抗人B抗原单克隆抗体是无色澄清透明溶液,用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)测定,上样量为10μL时,该鼠抗人B抗原单克隆抗体显示为重链和轻链各一条带。
在本实施例中,所述鼠抗人D抗原单克隆抗体浓度为1.0-10.0mg/mL。较佳地,所述鼠抗人D抗原单克隆抗体浓度为1.5mg/mL。该鼠抗人D抗原单克隆抗体是无色澄清透明溶液。用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)测定,上样量为10μL时,该抗体显示为重链和轻链各一条带。可选地,该单克隆抗体购自北京万域美澜科技有限公司。
在本实施例中,所述质控线9包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。作为一个较佳的实施例,所述羊抗鼠IgG多克隆抗体包被前为无色透明液体,浓度为4.0-10.0mg/mL。较佳地,所述羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度为4mg/mL。可选地,该单克隆抗体购自北京万域美澜科技有限公司。
在本实施例中,所述样本稀释液为20mM,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
图2为本发明实施例人类血型检测试剂盒中检测卡的结构示意图,如图2所示,作为一个可选的实施例,所述检测条放置于特定的长方形塑料盒中,构成所述检测卡,该检测卡上设有一样品孔10和检测孔11。所述样品孔10用于滴加实验样品,与所述检测条的样品垫2位置对应;检测孔11对应检测条的B抗原检测线6、A抗原检测线7、Rh检测线8和质控线9,通过检测孔11可以观察到所述反应膜4上B抗原检测线6、A抗原检测线7、Rh检测线8和质控线9的变化。
实施例2:人类血型检测试剂盒的制备方法
在反应膜4上,利用鼠抗人B抗原单克隆抗体包被B抗原检测线6,鼠抗人A抗原单克隆抗体包被A抗原检测线7,鼠抗人D抗原单克隆抗体包被Rh检测线8,重组幽门螺杆菌抗原包被作为检测线;利用羊抗鼠IgG多克隆抗体包被质控线9;标记胶体金的鼠抗人B抗原单克隆抗体、标记胶体金的鼠抗人A抗原单克隆抗体、标记胶体金的鼠抗人D抗原单克隆抗体混合包被金结合物垫3,组装即得检测条。
(1)反应膜的制备:
用包被稀释液分别将鼠抗人B抗原单克隆抗体、鼠抗人A抗原单克隆抗体、鼠抗人D抗原单克隆抗体稀释至最佳包被浓度0.5-1.5mg/mL;用包被稀释液将羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释至最佳包被浓度1-3mg/mL;用点膜机将4种包被液分别喷到反应膜4上,喷点量为0.1μL/mm,分别形成所述B抗原检测线6、A抗原检测线7、Rh检测线8和质控线9;将已包被的反应膜4于37℃干燥3小时,并于室温保存。
较佳地,用包被稀释液分别将鼠抗人B抗原单克隆抗体、鼠抗人A抗原单克隆抗体、鼠抗人D抗原单克隆抗体稀释至最佳包被浓度1mg/mL;用包被稀释液将羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释至最佳包被浓度2mg/mL。在该浓度时,反应膜质控线和检测线显色效果较好,且灵敏度,特异性较好。
所述包被稀释液为0.05M的磷酸盐缓冲液。所述包被稀释液为无色、澄清、透明液体且无悬浮物。将该缓冲液用纯化水两倍稀释,用PH计测定PH值为7.3-7.5。将该缓冲液用纯化水两倍稀释,用电导率仪测定电导率为9000-14000μs/cm。
鼠抗人A抗原单克隆抗体和鼠抗人B抗原单克隆抗体通过以下步骤制备获得:
1)取正常人的红细胞,洗涤、离心后取上清;
2)悬液免疫BALB/C小鼠,取脾脏,获得脾淋巴细胞悬液备用;
3)骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞通过聚乙二醇融合;
4)选择培养基初步筛选、抗原特异性筛选及有限稀释、克隆化。
具体地,所述鼠抗人A抗原单克隆抗体通过以下方法制备获得:
取正常人的A型红细胞,用生理盐水洗涤3次,每次1000r/min离心10min取上清。将上清(悬液)用生理盐水稀释至10%的悬液免疫BALB/C小鼠(腹腔注射0.5ml/只)共3次,每次间隔10天,最后一次注射3天后小鼠拉颈处死,无菌取脾脏,培养液洗一次,脾脏研碎,过不锈钢筛网。离心,细胞用培养液洗2次。脾淋巴细胞悬液备用。
取对数生长SP2/0骨髓瘤细胞离心,用无血清培养液洗涤2次后用于融合。按1:5的比例混合脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞,用无血清不完全培养液洗1次,离心1000rpm,10min;弃上清,吸净残留液体。在90s内于37℃水浴中加入0.2ml 50%聚乙二醇4000(PEG4000),37℃继续温育90s,然后1000r/min离心6min,用无血清RPMI1640培养基终止其反映,然后离心10min(1000r/min),去上清,加入20%1640-HAT培养基40ml,混匀后加入4块96孔组织培养板中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养,10-15天后,用A、B、O三型红细胞检测培养孔上清的凝集情况,筛选出对A型细胞凝集、对B、O型细胞不凝集的阳性孔,然后用有限稀释法克隆化。
腹腔注射0.5ml液体石蜡于BALB/C鼠,1-2周后腹腔注射杂交瘤细胞,接种细胞7-10天后(小鼠频于死亡之前)处死小鼠,用无菌注射器抽提腹水。1000r/min 10min离心后取上清进行冻存包藏。
具体地,所述鼠抗人B抗原单克隆抗体通过以下方法制备获得:
取正常人的B型红细胞,用生理盐水洗涤3次,每次1000r/min离心10min取上清。将上清(悬液)用生理盐水稀释至10%的悬液免疫BALB/C小鼠(腹腔注射0.5ml/只)共3次,每次间隔10天,最后一次注射3天后小鼠拉颈处死,无菌取脾脏,培养液洗一次,脾脏研碎,过不锈钢筛网。离心,细胞用培养液洗2次。脾淋巴细胞悬液备用。
取对数生长SP2/0细胞离心,用无血清培养液洗涤2次后用于融合。按1:5的比例混合脾细胞与骨髓瘤细胞,用无血清不完全培养液洗1次,离心1000rpm,10min;弃上清,吸净残留液体。在90s内于37℃水浴中加入0.2ml 50%PEG4000,37℃继续温育90s,然后1000r/min离心6min,用无血清RPMI1640培养基终止其反映,然后离心10min(1000r/min),去上清,加入20%1640-HAT培养基40ml,混匀后加入4块96孔组织培养板中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养,10-15天后,用A、B、O三型红细胞检测培养孔上清的凝集情况,筛选出对B型细胞凝集、对A、O型细胞不凝集的阳性孔,然后用有限稀释法克隆化。
腔注射0.5ml液体石蜡于BALB/C鼠,1-2周后腹腔注射杂交瘤细胞,接种细胞7-10天后(小鼠频于死亡之前)处死小鼠,用无菌注射器抽提腹水。1000r/min 10min离心后取上清进行冻存包藏。
(2)金结合物垫的制备:
分别将鼠抗人B抗原单克隆抗体、鼠抗人A抗原单克隆抗体、鼠抗人D抗原单克隆抗体与胶体金进行偶联制得胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体溶液。将上述3种胶体金标记的单克隆抗体溶液分别按混合后最佳浓度6-10μg/mL调整并混合,以1-3mL/条,浸泡所述金结合物垫,铺金,37℃干燥3小时,并于室温保存。
较佳地,所述3种胶体金标记的单克隆抗体溶液分别按混合后最佳浓度8μg/mL调整并混合,以1.5mL/条,浸泡所述金结合物垫,铺金。该浓度时试纸条的特异性和敏感性较好,灵敏度较高。
在本实施例中,胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体的制备步骤如下:
1)用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金PH值至8.0-9.0;
2)加入6-20μg/mL鼠抗人B抗原单克隆抗体,搅拌40分钟;
3)再加入10%的牛血清白蛋白至终浓度为1%,搅拌15分钟;
4)12000rpm/min,4℃离心15分钟,小心弃去上清液;
5)加入原体积(原体积以胶体金体积计算)的1/2体积的胶体金结合物稀释液。
较佳地,步骤1)中用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金PH值至8.5。该PH值试纸条效果较好,稳定性好。
较佳地,步骤2)中,加入10μg/mL鼠抗人B抗原单克隆抗体。该浓度时胶体金与鼠抗人B抗原单克隆抗体结合充分,且稳定,原料利用率高,制备出的试纸条稳定、效果佳。
在本实施例中,胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体的制备步骤如下:
1)用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金PH值至8.0-9.0;
2)加入6-20μg/mL鼠抗人A抗原单克隆抗体,搅拌40分钟;
3)再加入10%的牛血清白蛋白至终浓度为1%,搅拌15分钟;
4)12000rpm/min,4℃离心15分钟,小心弃去上清液;
5)加入原体积(原体积以胶体金体积计算)的1/2体积的胶体金结合物稀释液。
较佳地,步骤1)中用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金PH值至8.5。该PH值试纸条效果较好,稳定性好。
较佳地,步骤2)中,加入10μg/mL鼠抗人A抗原单克隆抗体。该浓度时胶体金与鼠抗人A抗原单克隆抗体结合充分,且稳定,原料利用率高,制备出的试纸条稳定、效果佳。
在本实施例中,胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体的制备步骤如下:
1)用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金PH值至8.0-9.0;
2)加入6-20μg/mL鼠抗人D抗原单克隆抗体,搅拌40分钟;
3)再加入10%的牛血清白蛋白至终浓度为1%,搅拌15分钟;
4)12000rpm/min,4℃离心15分钟,小心弃去上清液;
5)加入原体积(原体积以胶体金体积计算)的1/2体积的胶体金结合物稀释液。
较佳地,步骤1)中用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金PH值至8.5。该PH值试纸条效果较好,稳定性好。
较佳地,步骤2)中,加入10μg/mL鼠抗人D抗原单克隆抗体。该浓度时胶体金与鼠抗人D抗原单克隆抗体结合充分,且稳定,原料利用率高,制备出的试纸条稳定、效果佳。
以上所述胶体金结合物稀释液是将磷酸氢二钠5.372g、磷酸二氢钠0.78g、牛血清白蛋白5g、氯化钠8.5g、酪蛋白0.5g溶于1L去离子水中,混匀制备而成。
(3)切割装配:在内包间内将反应膜、金结合物垫、粗纤维滤纸、样品垫装配成反应板,再用切割机切成4mm宽的检测条组装成成品。
实施例3:人类血型检测试剂盒的检测方法
1.检测前准备:检验前将试剂盒和样本恢复至室温。实验湿度应小于60%,实验温度为18-30℃。
2.样本准备:全血为指尖采血或者采用静脉采血。全血样本采集后不做保存,即采即用。
3.检测条检测方法
(1)从原包装铝箔袋中取出检测条,平置于台面上;
(2)取20μL全血,加到检测条样品垫2处,再加样本稀释液100μL(约2-3滴);
(3)3-5分钟内判读结果,10分钟后检验结果无效。
(4)检测结果判定:
ABO血型系统判定(B抗原检测线6、A抗原检测线7、质控线9有参照意义):
A型血:质控线9和A抗原检测线7位置各出现一条红色条带。
B型血:质控线9和B抗原检测线6位置各出现一条红色条带。
AB型血:质控线9、A抗原检测线7和B抗原检测线6位置各出现一条红色条带。
O型血:只在质控线9位置出现一条红色条带。
无效:质控线9位置没有出现红色条带。
RhD血型系统判定(Rh检测线8、质控线9有参照意义):
RhD阳性血:质控线9和Rh检测线8位置各出现一条红色条带。
RhD阴性血:只在质控线9位置出现一条红色条带。
无效:质控线9位置没有出现红色条带
4.检测卡检测方法
(1)从铝箔袋中取出检测卡,放在水平工作台面上平置,并做好样本标记;
(2)取20μL全血样本,直接加入到加样孔10中,再加样本稀释液100μL(约2-3滴);
(3)3-5分钟内判读结果,10分钟后检验结果无效。
(4)检测结果判定:
ABO血型系统判定(B抗原检测线6、A抗原检测线7、质控线9有参照意义):
A型血:质控线9和A抗原检测线7位置各出现一条红色条带。
B型血:质控线9和B抗原检测线6位置各出现一条红色条带。
AB型血:质控线9、A抗原检测线7和B抗原检测线6位置各出现一条红色条带。
O型血:只在质控线9位置出现一条红色条带。
无效:质控线9位置没有出现红色条带。
RhD血型系统判定(Rh检测线8、质控线9有参照意义):
RhD阳性血:质控线9和Rh检测线8位置各出现一条红色条带。
RhD阴性血:只在质控线9位置出现一条红色条带。
无效:质控线9位置没有出现红色条带
实施例4:人类血型检测试剂盒有效性验证
1.阴性、阳性符合率检测:
(1)检测10份A型血液质控样本(Rh型阳性),A型及Rh型结果检测结果均为阳性,B型为阴性。
(2)检测10份B型血液质控样本(Rh型阳性),B型及Rh型结果检测结果均为阳性,A型为阴性。
(3)检测10份AB型血液质控样本(Rh型阳性),A型、B型及Rh型结果检测结果均为阳性。
(4)检测10份O型血液质控样本(Rh型阳性),A型、B型及Rh型结果均为阴性。
(5)检测4份Rh型阴性血液质控样本(A、B、AB、O型各一支),Rh型结果均为阴性。其中A型Rh型阴性血液质控样本A型检测结果为阳性,B型为阴性;B型Rh型阴性血液质控样本B型检测结果为阳性,A型为阴性;AB型Rh型阴性血液质控样本A型、B型检测结果均为阳性;O型Rh型阴性血液质控样本A型、B型检测结果均为阴性。
2.灵敏度检测:
(1)A型最低检出限质控样本检测,最低检出限样本原液,按1:4稀释后检测,A型检测结果为阳性。
(2)B型最低检出限质控样本检测,最低检出限样本原液,按1:4稀释后检测,B型检测结果为阳性。
(3)Rh型最低检出限质控样本检测,最低检出限样本原液,按1:4稀释后检测,Rh型检测结果为阳性。
3.精密性检测:
选择AB型及Rh型阳性的样本作为精密性质控样本检测,采用10个检测卡平行测定精密性质控样本,各检测卡相同血型检测线显色速度及强度一致,均一性无差别。
4.特异性检测:
红细胞A型抗原、B型抗原与D型抗原间无干扰。
检测含内源性干扰物质和潜在交叉反应物质的样本,结果如下:
高甘油三酯(<10mmol/L)的样本、高胆红素(<200μmol/L)的样本、以及溶血样本不会对本发明造成干扰。
抗核抗体、抗线粒体抗体,抗双链DNA抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、艾滋病毒、戊型肝炎病毒为阳性的样本不会对本发明造成干扰。
5.稳定性检测:
在长期稳定性实验过程中,4~30℃干燥避光保存14月依然可以满足产品性能指标要求;加速稳定性实验过程中,37℃条件下,16天后检测结果依然可以满足产品性能指标要求。
6.溶血样本检测:采用溶血样本进行上述实验,依然符合上述结果。
本发明提供的人类血型检测试剂盒具有以下优势,
(1)同时检测ABO和Rh血型
本发明提供的人类血型检测试剂盒的反应膜具有包被有鼠抗人B抗原单克隆抗体的B抗原检测线、包被有鼠抗人A抗原单克隆抗体的A抗原检测线和包被有鼠抗人D抗原单克隆抗体的Rh检测线,可同时对ABO和Rh血型定型。
(2)检测结果直观
本发明提供的人类血型检测试剂盒通过“双抗体夹心法”直接检测细胞表面A抗原、B抗原、D抗原,检测线变色即表明存在相应抗原,代表为该血型。避免了传统方法检测结果需要进行反向推断才能判定结果,且操作较为繁琐,检测过程受认为因素干扰较多等问题。
(3)操作简便、快捷
本发明提供的人类血型检测试剂盒操作快速、简便、不需特殊设备,准确和灵敏度高等特点,整个操作时间仅需3-5分钟。
(4)可用于溶血样本的检测
由于本发明提供的人类血型检测试剂盒直接检测细胞表面抗原,进而可进行溶血样本的检测,溶血样本与未溶血样本检测结果无明显差异,有效控制临床应用过程中因溶血造成的错误判读,避免患者后期诊疗过程中输入错误血型的高危风险。
可见,本发明提供的人类血型检测试剂盒具有快速、简便、不需特殊设备,适用广泛,特异性好,灵敏度高。可同时检测ABO和Rh血型。整个操作时间仅需3-5分钟,检测结果直观,适用于临床检测、现场调查等。并且,本发明可对溶血样本进行检测,溶血样本与未溶血样本检测结果无明显差异,有效控制临床应用过程中因溶血造成的错误判读,避免患者后期诊疗过程中输入错误血型的高危风险。
所属领域的普通技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的,并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子;在本发明的思路下,以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合,步骤可以以任意顺序实现,并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化,为了简明它们没有在细节中提供。因此,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何省略、修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种人类血型检测试剂盒,其特征在于,包括检测条,所述检测条包括金结合物垫和反应膜,所述金结合物垫包被有胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体、胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体和胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体;所述反应膜包括包被有鼠抗人B抗原单克隆抗体的B抗原检测线、包被有鼠抗人A抗原单克隆抗体的A抗原检测线、包被有鼠抗人D抗原单克隆抗体的Rh检测线和包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。
2.根据权利要求1所述的人类血型检测试剂盒,其特征在于,所述鼠抗人B抗原单克隆抗体的浓度为1.0-5.0mg/mL,所述鼠抗人A抗原单克隆抗体的浓度为1.0-5.0mg/mL,所述鼠抗人D抗原单克隆抗体浓度为1.0-10.0mg/mL。
3.根据权利要求1所述的人类血型检测试剂盒,其特征在于,所述羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度为4.0-10.0mg/mL。
4.根据权利要求1所述的人类血型检测试剂盒,其特征在于,还包括样本稀释液,该样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的人类血型检测试剂盒,其特征在于,所述检测条放置于长方形塑料盒中,构成检测卡,该检测卡上设有样品孔和检测孔,所述样品孔与所述检测条的所述样品垫位置对应,所述检测孔对应所述检测条的所述检测线和所述质控线。
6.一种如权利要求1所述的人类血型检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)反应膜的制备:
稀释所述鼠抗人B抗原单克隆抗体、鼠抗人A抗原单克隆抗体、鼠抗人D抗原单克隆抗体和所述羊抗鼠IgG多克隆抗体,并喷涂至所述反应膜上,分别形成所述B抗原检测线、A抗原检测线、Rh检测线与质控线,干燥备用;
(2)金结合物垫的制备:
将所述鼠抗人B抗原单克隆抗体、鼠抗人A抗原单克隆抗体、鼠抗人D抗原单克隆抗体分别与胶体金进行偶联制得胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体溶液,均调整浓度,并混合为混合液,该混合液浸泡所述金结合物垫,铺金,干燥备用;
(3)切割装配:将所述反应膜、金结合物垫、粗纤维滤纸、样品垫装配至所述反应板,切割后形成所述检测条。
7.根据权利要求6所述的人类血型检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述鼠抗人A抗原单克隆抗体和鼠抗人B抗原单克隆抗体分别通过以下步骤制备获得:
(1)取正常人的红细胞,洗涤、离心后取上清;
(2)悬液免疫BALB/C小鼠,取脾脏,获得脾淋巴细胞悬液备用;
(3)骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞通过聚乙二醇融合;
(4)选择培养基初步筛选、抗原特异性筛选及有限稀释、克隆化。
8.根据权利要求6或7所述的人类血型检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体、胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体、胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体的制备包括以下步骤:
(1)使用碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.0-9.0;
(2)加入单克隆抗体,搅拌;
(3)加入10%牛血清白蛋白溶液,搅拌;
(4)离心,弃去上清液;
(5)加入胶体金结合物稀释液,即得。
9.根据权利要求8所述的人类血型检测试剂盒的制备方法,其特征在于,步骤(1)中使用碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5。
10.根据权利要求6所述的人类血型检测试剂盒的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述胶体金标记的鼠抗人B抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人A抗原单克隆抗体溶液、胶体金标记的鼠抗人D抗原单克隆抗体溶液,均调整浓度至6-10μg/mL,混合为混合液。
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