CN203101402U

CN203101402U - 甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒

Info

Publication number: CN203101402U
Application number: CN 201320033212
Authority: CN
Inventors: 韩一玮; 刘围; 杨小姣
Original assignee: JINAN ZHUOGUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JINAN ZHUOGUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2023-01-22

Abstract

本实用新型专利公开了一种甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和胶体金定量读数仪组成。试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人甲胎蛋白（AFP）特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C（6），T线为和标记抗体配对的AFP抗体，C线为抗鼠IgG抗体，NC膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。检测时用胶体金定量读数仪或比色卡对结果进行定量或半定量判定，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒

技术领域

本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法制备的甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒。

背景技术

甲胎蛋白是一种糖蛋白，英文缩写AFP。正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生约两周后甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升。

但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。甲胎蛋白是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。(1)肝细胞再生时期，AFP在血液中呈阳性，急、慢性肝炎、肝硬化时会有肝细胞再生，因而AFP在血液中的浓度升高。(2)某些胚胎癌、生殖细胞瘤、某些消化道癌症等，血液中的AFP也有不同程度升高。 (3)妊娠妇女的AFP可有不同程度的升高。(4)最值得注意的是肝癌，其血液中的AFP可明显增高，并且是持久性的升高。这是由于肝癌的癌细胞能合成或分泌较多的AFP释放入血的缘故。正因为如此，医生们就把检测人体血液中的AFP作为诊断肝癌的重要依据，并把AFP称为“肝癌标志物”。检测AFP是诊断肝癌的一种简便、灵敏、快捷的方法，现认为它在发现早期肝癌方面有独一无二的价值，用AFP诊断肝癌的“专一性”仅次于病理学检查。

目前常用化学发光法、酶标法、酶标电泳法、放射免疫法检测。一般认为：定性法阳性或定量>400毫微克/毫升、>200毫微克/毫升，持续8周，而谷丙转氨酶（SGPT）正常，并排除妊娠和生殖腺胚胎瘤，原发性肝癌的诊断确立。特别应用在早期亚临床肝癌的诊断并及时手术可大大提高患者的存活率。对肝癌手术、化疗、中西医结合治疗、放疗等疗效及预后判断、动态测定血清甲胎蛋白有其重要的临床价值。　　

　放射免疫电泳甲胎蛋白AFP正常值：≤25μg/L　放射免疫分析AFP正常值：≤20μg/L　酶联免疫法AFP正常值：≤25μg/L 最常用的定量试验为放射免疫法（正常值为0～25ug/L），若超过25ug/L为阳性，若再25～400 ug/L之间为低浓度阳性，超过400ug/L即为高浓度阳性。

免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线，在一定的条件下，T线的强弱和样品中的浓度呈正相关或负相关，从而实现检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

发明内容

本实用新型的目的是提供甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，具有全程定量或半定量检测能力，操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和胶体金定量读数仪构成。

所述试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人甲胎蛋白特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C（6），检测线为和标记抗体配对的AFP抗体，质控线为抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

所述试纸卡的抗体为高敏AFP配对抗体，分别识别AFP不同表位，抗体可以为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。

所述试纸卡的NC膜为孔径8-12微米的多孔样结构膜，上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。

所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板，用于对检测结果的对比判定。不同深浅的红色线条共6条，分别对应600、400、200、100、50、25ng/ml的AFP浓度。

所述胶体金定量读数仪是一种光学检测系统，用于对检测结果的定量判定，对AFP的检测范围为0-600ng/ml。

所述试纸卡，NC膜抗体的包被过程为：以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）将AFP抗体配制成0.5－2mg/ml的溶液，将抗鼠IgG配制成0.5-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜上部和下部以1-1.5ul/cm的参数进行分别划线，包被C、T线，划线后将NC膜在干燥间，温度20-25℃，湿度小于30%，干燥2-5小时。

所述试纸卡，胶体金垫制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30－50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K₂CO₃调至pH8.0左右，按100ml胶体金溶液加入0.5－2mg和包被AFP配对的另一AFP抗体，室温搅拌2小时，加入终浓度为1%牛血清白蛋白，1%聚乙二醇20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30%，干燥2-5小时，制成胶体金垫。

所述试纸卡的装配过程为：在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于40%，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫,搭胶体金垫的1/4粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3－5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂试纸卡。

所述试剂盒，检测方法为：1）将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2）精确吸取10μl 血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入洁净的离心管中，再加入500ul样本稀释液（生理盐水或PBS），充分混匀；3）用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液，15-20分钟内用胶体金定量读数仪或比色卡（半）定量判定结果；4）仪器判定时，设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仪器内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果；5）用比色卡判定结果时，将试纸卡T线的颜色和比色卡上标准线的颜色深浅进行对比，半定量判定样品的浓度区间。

本实用新型的有益效果是：提供一种利用免疫层析胶体金技术制备的甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，定量检测范围宽，适合血清、血浆和全血样本，并适合临床上单人份检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

附图说明：

图1是甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒的试纸卡

附图符号说明：

1：塑料底板；2：上样垫；3：胶体金垫；4：NC膜；

5：检测线T；6：质控线C；7：吸样垫

具体实施方式

实施例：甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒制备及检测

1　主要材料

1.1 AFP特异性配对抗体、AFP标准品：中检所；鼠抗人IgG抗体：美国Arista公司产品；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素（NC）膜：SARTORIUS（德国），CN140；德国赛多利斯公司产品；牛血清白蛋白（BSA），聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。

1.2 临床样本　由公司在相关医院获得，共200份，其中血清样本100份，血浆和全血样本各50份，AFP含量分布区间为25-600ng/ml之间的定值血清。

1.3金标读数仪：型号：DS/TMYQ-CGR100，杭州弘科生物技术有限公司产品。

2　方法

2.1 AFP抗体胶体金标记　氯金酸－柠檬酸三钠还原法制备直径为30-40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K₂CO₃将溶液调到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg将标记用AFP抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入到终浓度为1%的PEG2000和1%的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000 r/min离心，弃上清，沉淀按50%原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中（pH8.0,含BSA，羊血清，蔗糖和表面活性剂）。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm²的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥2-5小时，制成胶体金垫。

2.2　NC膜包被　用0.01M pH7.4PBS将包被AFP抗体稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml，鼠抗人IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜在在温度20-25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥2-5小时。

2.3　试纸卡组装　在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于40%，取塑底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/4粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3－5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡。

2.4　试纸工艺参数调试　将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用AFP标准品对试剂进行测试，寻找最佳组合。

2.5 比色卡制备和仪器曲线参数设置确定好试纸工艺参数后，分别用600、400、200、100、50、25ng/ml的AFP标准品对试纸进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，将相应强度的色带印刷到比色卡上，完成比色卡制备；将相应强度的色带数字化后输入胶体金定量读数仪中，完成仪器曲线参数设置。

2.6　检测方法　1）将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2）精确吸取10μl 血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入洁净的离心管中，再加入500ul样本稀释液（PBS），充分混匀；3）用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液（PBS），15-20分钟内用胶体金定量读数仪或比色卡（半）定量判定结果；4）仪器判定时，设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果；5）用比色卡判定结果时，将试纸卡T线的颜色和比色卡上标准线的颜色深浅进行对比，半定量判定样品的浓度区间。

2.7　临床样本检测　试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。

3　结果

3.1　试纸参数确定　根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8.0；AFP抗体最佳标记量为1mg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为20mM硼酸盐缓冲液，pH8.0，含1%BSA、10%羊血清，2%蔗糖，0.2% Tween 20；最佳包AFP抗体浓度为1.5mg/ml。检测结果的最佳判定时间为15-20分钟。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。

3.2　临床样本检测　对200份临床定值样本检测，用仪器定量判定结果时，在检测范围内的195份样品平均偏差值均小于15%，最大偏差小于20%，R²>0.97，一致性系数>0.88。用比色卡判定结果时，区间判定结果和样本值的符合率为95.3%，一致性系数>0.85。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

Claims

1.一种甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和胶体金定量读数仪构成，所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板，用于对检测结果的对比判定，不同深浅的红色线条共6条，分别对应600、400、200、100、50、25ng/ml的AFP浓度，胶体金定量读数仪是一种光学检测系统，用于对检测结果的定量判定，对AFP的检测范围为0-600ng/ml。

2.根据权利要求1所述的甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人甲胎蛋白（AFP）特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C（6），检测线为和标记抗体配对的AFP抗体，质控线为抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

3.根据权利要求1和2所述的甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于所述试纸卡的抗体为高敏AFP配对抗体，分别识别AFP识别不同表位，抗体可以为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1和2所述的甲胎蛋白快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于所述试纸卡的NC膜为孔径8-12微米的多孔样结构膜，上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。