CN203101403U - 肌钙蛋白i快速定量免疫层析检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型专利公开了一种肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒,其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和胶体金定量读数仪组成。试纸卡结构为:在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2),上样垫的一端紧密压接含有标记抗人肌钙蛋白I(cTnI)特异性抗体的胶体金垫(3),胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4),NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C(6),T线为和标记抗体配对的cTnI抗体,C线为抗鼠IgG抗体,NC膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸,试纸装入塑料卡内形成试纸卡。检测时用胶体金定量读数仪或比色卡对结果进行定量或半定量判定,具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。
Description
技术领域
本实用新型是涉及生物应用技术领域,特别是涉及一种以胶体金免疫层析法制备的肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒。
背景技术
肌钙蛋白是组成横纹肌细肌丝的结构蛋白,其亚单位I、T 和C 组成复合物,在肌肉收缩和舒张过程中起着重要调节作用。其中,肌钙蛋白I( cTnI) 经大量的研究,已被证实为心肌损伤最特异、最敏感的血清标志物之一。正常人血液中含量一般低于0.3μg /L,当心肌细胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时,游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流。因此,在发病初期,快速、灵敏且准确地测定人血中的cTnI及其变化趋势对于急性心肌梗死的诊断、急性冠状动脉综合征的危险分层、监测各种因素导致的心肌损伤等有着重要的临床意义。
目前国内外已有检测肌钙蛋白I的试剂盒上市,主要采用酶联免疫法(ELISA)、化学发光法、金标层析法、生物芯片等,少数公司产品已获FDA注册或CE认证。
免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术,基本原理如下:利用胶体金标记一种抗原或抗体,在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体,检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时,胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物,然后在NC膜上层析,再被包被抗原或抗体捕获,形成肉眼可见的检测T线,在一定的条件下,T线的强弱和样品中的浓度呈正相关或负相关,从而实现检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
发明内容
本实用新型的目的是提供肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒,具有全程定量或半定量检测能力,操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒,其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和胶体金定量读数仪构成。
所述试纸卡结构为:在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2),上样垫的一端紧密压接含有标记抗人肌钙蛋白I特异性抗体的胶体金垫(3),胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4),NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C(6),检测线为和标记抗体配对的cTnI抗体,质控线为抗鼠IgG抗体,硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸,试纸装入塑料卡内形成试纸卡。
所述试纸卡的抗体为高敏cTnI配对抗体,分别识别cTnI不同表位,抗体可以为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。
所述试纸卡的NC膜为孔径8-12微米的多孔样结构膜,上样垫为玻璃纤维膜或无纺布,吸样垫由吸水滤纸构成。
所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板,用于对检测结果的对比判定。不同深浅的红色线条共5条,分别对应5、2、1、0.5、0.25ng/ml的cTnI浓度。
所述胶体金定量读数仪是一种光学检测系统,用于对检测结果的定量判定,对CTNI的检测范围为0-5ng/ml。
所述试纸卡,NC膜抗体的包被过程为:以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将cTnI抗体配制成0.5-2mg/ml的溶液,将抗鼠IgG配制成0.5-2mg/ml的溶液,用喷膜仪在NC膜上部和下部以1-1.5ul/cm的参数进行分别划线,包被C、T线,划线后将NC膜在干燥间,温度20-25℃,湿度小于30%,干燥2-5小时。
所述试纸卡,胶体金垫制备过程为:以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液,制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内,用0.2M K2CO3调至pH8.0左右,按100ml胶体金溶液加入0.5-2mg和包被cTnI配对的另一cTnI抗体,室温搅拌2小时,加入终浓度为1%牛血清白蛋白,1%聚乙二醇20000封闭20min,12000r/m离心30分钟,弃上清,用胶体金工作液复溶至50ml,按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥间,温度20-25℃,湿度小于30%,干燥2-5小时,制成胶体金垫。
所述试纸卡的装配过程为:在干燥室内,温度20-25℃,湿度小于40%,取塑料底板,将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴,将胶体金垫裁切成合适的宽度,在NC膜T线一侧搭接胶体金垫,搭胶体金垫的1/4粘贴,在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫,搭胶体金垫的1/3粘贴;在NC膜C线一侧搭接吸样垫,搭吸样垫的1/10粘贴;最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3-5mm宽的试纸条,再装入塑料卡内,形成试剂试纸卡。
所述试剂盒,检测方法为:1) 将检测试剂及样本平衡至室温,取出试纸卡,平放;2)精确吸取10μl 血清、血浆样本,样本为全血时吸取20ul样本,加入洁净的离心管中,再加入500ul样本稀释液(生理盐水或PBS),充分混匀;3)用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中,再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液,15-20分钟内用胶体金定量读数仪或比色卡(半)定量判定结果;4)仪器判定时,设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仪器内进行检测,仪器将显示出样品浓度的定量测定结果;5)用比色卡判定结果时,将试纸卡T线的颜色和比色卡上标准线的颜色深浅进行对比,半定量判定样品的浓度区间。
本实用新型的有益效果是:提供一种利用免疫层析胶体金技术制备的肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒,定量检测范围宽,适合血清、血浆和全血样本,并适合临床上单人份检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
附图说明:
图1是肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒的试纸卡
附图符号说明:
1:塑料底板;2:上样垫;3:胶体金垫;4:NC膜;
5:检测线T;6:质控线C;7:吸样垫
具体实施方式
实施例:肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒制备及检测
1 主要材料
1.1 cTnI特异性配对抗体、cTnI标准品:中检所;鼠抗人IgG抗体:美国Arista公司产品;氯金酸:Sigma公司产品;硝酸纤维素(NC)膜:SARTORIUS(德国),CN140;德国赛多利斯公司产品;牛血清白蛋白(BSA),聚乙二醇PEG20000,水解酪蛋白:Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
1.2 临床样本 由公司在相关医院获得,共200份,其中血清样本100份,血浆和全血样本各50份,cTnI含量分布区间为0.25-5ng/ml之间的定值血清。
1.3金标读数仪:型号:DS/TMYQ-CGR100,杭州弘科生物技术有限公司产品。
2 方法
2.1 cTnI抗体胶体金标记 氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-40nm的胶体金溶液,制备完成后取三份胶体金,分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌,按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg将标记用cTnI抗体缓慢滴加到胶体金溶液中,继续搅拌2小时,再加入到终浓度为1%的PEG2000和1%的BSA进行封闭20min,标记结束后以12000 r/m离心,弃上清,沉淀按50%原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(pH8.0,含BSA,羊血清,蔗糖和表面活性剂)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于无纺布上,在温度20-25℃,相对湿度在<30%的干燥间干燥2-5小时,制成胶体金垫。
2.2 NC膜包被 用0.01M pH7.4PBS将包被cTnI抗体稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml,鼠抗人IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml,然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被,包被完成后将NC膜在温度20-25℃,相对湿度在<30%的干燥间干燥2-5小时。
2.3 试纸卡组装 在干燥室内,温度20-25℃,湿度小于40%,取塑底板,将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴,将胶体金垫裁切成合适的宽度,在NC膜T线一侧搭接胶体金垫,搭胶体金垫的1/4粘贴,在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫,搭胶体金垫的1/3粘贴;在NC膜C线一侧搭接吸样垫,搭吸样垫的1/10粘贴;最后用裁剪机将贴好塑料板切成3-5mm宽的试纸条,再装入塑料卡内,形成试纸卡。
2.4 试纸工艺参数调试 将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对,制备小样,利用CTNI标准品对试剂进行测试,寻找最佳组合。
2.5 比色卡制备和仪器曲线参数设置 确定好试纸工艺参数后,分别用5、2、1、0.5、0.25ng/ml的cTnI标准品对试纸进行测定,不同浓度的标准品显示出不同强度色带,将相应强度的色带印刷到比色卡上,完成比色卡制备;将相应强度的色带数字化后输入胶体金定量读数仪中,完成仪器曲线参数设置。
2.6 检测方法 1)将检测试剂及样本平衡至室温,取出试纸卡,平放;2)精确吸取10μl 血清、血浆样本,样本为全血时吸取20ul样本,加入洁净的离心管中,再加入500ul样本稀释液(PBS),充分混匀;3)用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中,再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液(PBS),15-20分钟内用胶体金定量读数仪或比色卡(半)定量判定结果;4)仪器判定时,设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测,仪器将显示出样品浓度的定量测定结果;5)用比色卡判定结果时,将试纸卡T线的颜色和比色卡上标准线的颜色深浅进行对比,半定量判定样品的浓度区间。
2.7 临床样本检测 试剂制备完成后,按检测方法对所有临床样本进行检测,并分析检测结果。
3 结果
3.1 试纸参数确定 根据小样的检测结果,确定了试纸的最佳标记pH值为8.0;cTnI抗体最佳标记量为1mg/100ml胶体金溶液;最佳的胶体金工作液为20mM硼酸盐缓冲液,pH8.0,含1%BSA、10%羊血清,2%蔗糖,0.2% Tween 20;最佳包被cTnI抗体浓度为1.5mg/ml。检测结果的最佳判定时间为15-20分钟。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。
3.2 临床样本检测 对200份临床定值样本检测,用仪器定量判定结果时,在检测范围内的195份样品平均偏差值均小于15%,最大偏差小于20%,R2>0.97,一致性系数>0.88。用比色卡判定结果时,区间判定结果和样本值的符合率为95.3%,一致性系数>0.85。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好,适合用于临床检测,满足不同客户不同检测场合的差异化需要。
Claims (4)
1.一种肌钙蛋白I( cTnI)快速定量免疫层析检测试剂盒,其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和胶体金定量读数仪构成,所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板,用于对检测结果的对比判定,不同深浅的红色线条共5条,分别对应5、2、1、0.5、0.25ng/ml的cTnI浓度,胶体金定量读数仪是一种光学检测系统,用于对检测结果的定量判定,对cTnI的检测范围为0-5ng/ml。
2.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I( cTnI)快速定量免疫层析检测试剂盒,其特征在于试纸卡结构为:在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2),上样垫的一端紧密压接含有标记抗人肌钙蛋白I(cTnI)特异性抗体的胶体金垫(3),胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4),NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C(6),检测线为和标记抗体配对的cTnI抗体,质控线为抗鼠IgG抗体,硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸,试纸装入塑料卡内形成试纸卡。
3.根据权利要求1和2所述的肌钙蛋白I( cTnI)快速定量免疫层析检测试剂盒,其特征在于所述试纸卡的抗体为高敏cTnI配对抗体,分别识别cTnI识别不同表位,抗体可以为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1和2所述的肌钙蛋白I( cTnI)快速定量免疫层析检测试剂盒,其特征在于所述试纸卡的NC膜为孔径8-12微米的多孔样结构膜,上样垫为玻璃纤维膜或无纺布,吸样垫由吸水滤纸构成。
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