CN203101403U

CN203101403U - 肌钙蛋白i快速定量免疫层析检测试剂盒

Info

Publication number: CN203101403U
Application number: CN 201320033213
Authority: CN
Inventors: 韩一玮; 刘围; 杨小姣
Original assignee: JINAN ZHUOGUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JINAN ZHUOGUAN BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2023-01-22

Abstract

本实用新型专利公开了一种肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和胶体金定量读数仪组成。试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人肌钙蛋白I（cTnI）特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C（6），T线为和标记抗体配对的cTnI抗体，C线为抗鼠IgG抗体，NC膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。检测时用胶体金定量读数仪或比色卡对结果进行定量或半定量判定，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒

技术领域

本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法制备的肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒。

背景技术

肌钙蛋白是组成横纹肌细肌丝的结构蛋白，其亚单位I、T 和C 组成复合物，在肌肉收缩和舒张过程中起着重要调节作用。其中，肌钙蛋白I( cTnI) 经大量的研究，已被证实为心肌损伤最特异、最敏感的血清标志物之一。正常人血液中含量一般低于0.3μg /L，当心肌细胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流。因此，在发病初期，快速、灵敏且准确地测定人血中的cTnI及其变化趋势对于急性心肌梗死的诊断、急性冠状动脉综合征的危险分层、监测各种因素导致的心肌损伤等有着重要的临床意义。

目前国内外已有检测肌钙蛋白I的试剂盒上市，主要采用酶联免疫法（ELISA）、化学发光法、金标层析法、生物芯片等，少数公司产品已获FDA注册或CE认证。

免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线，在一定的条件下，T线的强弱和样品中的浓度呈正相关或负相关，从而实现检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

发明内容

本实用新型的目的是提供肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒，具有全程定量或半定量检测能力，操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和胶体金定量读数仪构成。

所述试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人肌钙蛋白I特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C（6），检测线为和标记抗体配对的cTnI抗体，质控线为抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

所述试纸卡的抗体为高敏cTnI配对抗体，分别识别cTnI不同表位，抗体可以为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。

所述试纸卡的NC膜为孔径8-12微米的多孔样结构膜，上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。

所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板，用于对检测结果的对比判定。不同深浅的红色线条共5条，分别对应5、2、1、0.5、0.25ng/ml的cTnI浓度。

所述胶体金定量读数仪是一种光学检测系统，用于对检测结果的定量判定，对CTNI的检测范围为0-5ng/ml。

所述试纸卡，NC膜抗体的包被过程为：以0.01M pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）将cTnI抗体配制成0.5－2mg/ml的溶液，将抗鼠IgG配制成0.5-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜上部和下部以1-1.5ul/cm的参数进行分别划线，包被C、T线，划线后将NC膜在干燥间，温度20-25℃，湿度小于30%，干燥2-5小时。

所述试纸卡，胶体金垫制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30－50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K₂CO₃调至pH8.0左右，按100ml胶体金溶液加入0.5－2mg和包被cTnI配对的另一cTnI抗体，室温搅拌2小时，加入终浓度为1%牛血清白蛋白，1%聚乙二醇20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间，温度20-25℃，湿度小于30%，干燥2-5小时，制成胶体金垫。

所述试纸卡的装配过程为：在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于40%，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫,搭胶体金垫的1/4粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3－5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试剂试纸卡。

所述试剂盒，检测方法为：1）将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2）精确吸取10μl 血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入洁净的离心管中，再加入500ul样本稀释液（生理盐水或PBS），充分混匀；3）用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液，15-20分钟内用胶体金定量读数仪或比色卡（半）定量判定结果；4）仪器判定时，设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仪器内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果；5）用比色卡判定结果时，将试纸卡T线的颜色和比色卡上标准线的颜色深浅进行对比，半定量判定样品的浓度区间。

本实用新型的有益效果是：提供一种利用免疫层析胶体金技术制备的肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒，定量检测范围宽，适合血清、血浆和全血样本，并适合临床上单人份检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

附图说明：

图1是肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒的试纸卡

附图符号说明：

1：塑料底板；2：上样垫；3：胶体金垫；4：NC膜；

5：检测线T；6：质控线C；7：吸样垫

具体实施方式

实施例：肌钙蛋白I快速定量免疫层析检测试剂盒制备及检测

1　主要材料

1.1 cTnI特异性配对抗体、cTnI标准品：中检所；鼠抗人IgG抗体：美国Arista公司产品；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素（NC）膜：SARTORIUS（德国），CN140；德国赛多利斯公司产品；牛血清白蛋白（BSA），聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。

1.2 临床样本　由公司在相关医院获得，共200份，其中血清样本100份，血浆和全血样本各50份，cTnI含量分布区间为0.25-5ng/ml之间的定值血清。

1.3金标读数仪：型号：DS/TMYQ-CGR100，杭州弘科生物技术有限公司产品。

2　方法

2.1 cTnI抗体胶体金标记　氯金酸－柠檬酸三钠还原法制备直径为30-40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K₂CO₃将溶液调到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg将标记用cTnI抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入到终浓度为1%的PEG2000和1%的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000 r/m离心，弃上清，沉淀按50%原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中（pH8.0,含BSA，羊血清，蔗糖和表面活性剂）。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm²的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥2-5小时，制成胶体金垫。

2.2　NC膜包被　用0.01M pH7.4PBS将包被cTnI抗体稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml，鼠抗人IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜在温度20-25℃，相对湿度在＜30%的干燥间干燥2-5小时。

2.3　试纸卡组装　在干燥室内，温度20-25℃，湿度小于40%，取塑底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/4粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3－5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡。

2.4　试纸工艺参数调试　将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用CTNI标准品对试剂进行测试，寻找最佳组合。

2.5 比色卡制备和仪器曲线参数设置确定好试纸工艺参数后，分别用5、2、1、0.5、0.25ng/ml的cTnI标准品对试纸进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，将相应强度的色带印刷到比色卡上，完成比色卡制备；将相应强度的色带数字化后输入胶体金定量读数仪中，完成仪器曲线参数设置。

2.6　检测方法　1）将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2）精确吸取10μl 血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul样本，加入洁净的离心管中，再加入500ul样本稀释液（PBS），充分混匀；3）用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL样本稀释液（PBS），15-20分钟内用胶体金定量读数仪或比色卡（半）定量判定结果；4）仪器判定时，设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果；5）用比色卡判定结果时，将试纸卡T线的颜色和比色卡上标准线的颜色深浅进行对比，半定量判定样品的浓度区间。

2.7　临床样本检测　试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。

3　结果

3.1　试纸参数确定　根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8.0；cTnI抗体最佳标记量为1mg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为20mM硼酸盐缓冲液，pH8.0，含1%BSA、10%羊血清，2%蔗糖，0.2% Tween 20；最佳包被cTnI抗体浓度为1.5mg/ml。检测结果的最佳判定时间为15-20分钟。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。

3.2　临床样本检测　对200份临床定值样本检测，用仪器定量判定结果时，在检测范围内的195份样品平均偏差值均小于15%，最大偏差小于20%，R²>0.97，一致性系数>0.88。用比色卡判定结果时，区间判定结果和样本值的符合率为95.3%，一致性系数>0.85。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

Claims

1.一种肌钙蛋白I( cTnI)快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡、比色卡和胶体金定量读数仪构成，所述比色卡是白色背景上印有系列不同深浅红色线条的纸板，用于对检测结果的对比判定，不同深浅的红色线条共5条，分别对应5、2、1、0.5、0.25ng/ml的cTnI浓度，胶体金定量读数仪是一种光学检测系统，用于对检测结果的定量判定，对cTnI的检测范围为0-5ng/ml。

2.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I( cTnI)快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人肌钙蛋白I（cTnI）特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)和质控线C（6），检测线为和标记抗体配对的cTnI抗体，质控线为抗鼠IgG抗体，硝酸纤维素膜的另一端连接吸样垫(7)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

3.根据权利要求1和2所述的肌钙蛋白I( cTnI)快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于所述试纸卡的抗体为高敏cTnI配对抗体，分别识别cTnI识别不同表位，抗体可以为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.根据权利要求1和2所述的肌钙蛋白I( cTnI)快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于所述试纸卡的NC膜为孔径8-12微米的多孔样结构膜，上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。