CN204330777U - 人髓过氧化物酶(mpo)快速定量免疫层析检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型专利公开了一种人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒，试剂盒由试纸卡、比色卡组成。试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人髓过氧化物酶特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)、(6)、(7)和质控线C(8)，T线为和标记抗体配对的定量的MPO抗体，C线为羊抗鼠IgG抗体，NC膜的另一端连接吸样垫(9)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。检测时通过多条检测线与待检样品的定量结合，不需要任何仪器就可实现对人血清、血浆和全血样品中MPO的定量区间测定，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等特点，可对心肌梗塞进行早期快速预警。

Description

人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒

技术领域

本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法制备的人髓过氧化物酶MPO快速定量免疫层析检测试剂盒。

背景技术

根据世界卫生组织专家预测，至2030年，心肌梗死将成为导致人类死亡的头号疾病。实际情况也确实如此，死亡原因检测结果显示，心脏病已成为我国城镇居民最主要的死因，而且发病和死亡呈现明显低龄化趋势。因此心肌梗死的早期预防和及时治疗对于挽救病人的生命具有极大的意义。髓过氧化物酶(MPO)与心肌梗塞和冠状动脉的炎症密切相关，是心梗的早期预警生物标志物之一。MPO是一种过氧化物酶，主要存在于嗜中性粒细胞或单核细胞的嗜天青颗粒中，炎症时激活的嗜中性粒细胞发生脱颗粒并释放髓过氧化物酶，它导致冠状动脉粥样硬化病灶不稳定甚至是破裂，使血管内皮下胶原组织暴露,随之发生血小板粘附聚集和血栓形成,造成冠状动脉阻塞，发生急性冠状动脉综合症(ACS)，甚至是严重的心肌不可逆缺血损伤。MPO通过产生自由基和多种反应性物质，促进斑块形成和不稳定性增加，引起急性冠脉综合症。大量临床研究资料表明，急性冠状动脉综合症的病人血清中MPO水平显著地升高，是预测ACS患者发生不良心血管事件的一个新的预测因子，特别是在肌钙蛋白(cTnI)水平较低的患者，MPO能够识别那些将来发生心血管事件危险性较高的患者，并可在心梗发生前3小时发出预警。

目前国内外已有检测MPO的试剂盒，主要采用酶联免疫法(ELISA)、化学发光法、非均相免疫法和半定量胶体金法等，少数公司的产品已经获得FDA注册或CE认证。酶联免疫法(ELISA)和化学发光法的缺陷是检测时间长，需要大型仪器设备或经过专业训练的技术人员，此定量检测的方法耗时1小时以上，对于急性心梗病人而言可能丧失了最佳治疗时间。而免疫比浊法虽然检测时间短，但需要仪器设备进行检测。定性或半定量胶体金法没有准确定量几个关键的区间值，必须借助仪器才能半定量地判断MPO的数值。而MPO的定量是具有积极临床价值的，我们对临床肌钙蛋白检测阴性和阳性的心梗患者各100例进行MPO检测，结果发现，不同心梗阶段病人的MPO数值差距巨大，可从6.25至6000ng/ml，而不同阶段的数值又代表心梗的严重程度，因而对MPO进行快速定量是具有积极的临床意义的，尤其对于急性胸痛病人。

针对上述缺陷，本实用新型采用免疫层析胶体金技术，根据检测线的强弱和样品中的浓度呈正相关原理，发明了一种即可快速检测，又可准确定量MPO浓度的方法，以克服现有技术中检测时间长、需要配备特殊的仪器设备和技术人员、快速检测试剂不能定量等缺陷。本实用新型不需使用任何设备，只需一滴血样即可在15分钟内检测出MPO的数值，可以方便地在各级医疗机构、急诊中心、老年保健机构进行使用，为急性胸痛病人提供一种快速的、初步的心梗分型指南，指导临床医生更好地采取下一步诊治措施，以挽救病人的生命。该实用新型具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点，用于心肌梗塞的预警。

发明内容

本实用新型的目的是提供人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒，具有全程定量或半定量检测能力，操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点，用于心肌梗塞的预警。

一种人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒，其可以快速检测人血浆或血清中的MPO含量，以预警早期发生心肌梗塞的风险，该试剂盒由试纸卡和比色卡构成，其中：

试纸卡结构为：在塑料底板一端粘贴上样垫,上样垫的一端紧密压接含有标记抗人髓过氧化物酶(MPO)特异性抗体的胶体金垫，胶体金垫的一端紧密压接硝酸纤维素NC膜，硝酸纤维素NC膜上包被有相互分离的检测线T和质控线C，检测线T为和标记抗体配对的定量MPO抗体，质控线C为IgG抗体，硝酸纤维素NC膜的另一端连接吸样垫形成试纸条，试纸条装入塑料垫中形成试纸卡，所述定量MPO抗体是定量的MPO捕获抗体、可以对样品中的MPO浓度进行定量区间检测，所述检测线T有三条，分别对应6.25、100、400ng/ml的MPO浓度。

进一步地，所述标记抗体为MPO抗体，分别识别人髓过氧化物酶的不同表位，该MPO抗体为纯化的人髓过氧化酶特异性单克隆抗体或多克隆抗体。

进一步地，所述比色卡是白色背景上印有7条不同深浅红色线条，用于对检测结果的对比判断及定量判断，分别对应400、200、100、50、25、12.5、6.25ng/ml的MPO浓度。

进一步地，硝酸纤维素NC膜为孔径5～12μm的多孔样结构膜，上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。

所述试纸卡，NC膜抗体的包被过程为：以0.01MpH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)将MPO抗体配制成0.5～2mg/ml的溶液，将羊抗鼠IgG配制成0.5～2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜上以1～1.5ul/cm的参数进行分别划线，包被C、T线，三条T线的用量比例分别为1倍、16倍、64倍。划线后将NC膜在温度20～25℃，相对湿度小于30％的干燥间，干燥2～5小时。

所述试纸卡，胶体金垫制备过程为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30～50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2MK₂CO₃调至pH8.0左右，按100ml胶体金溶液加入0.5～2mg和包被MPO配对的另一MPO抗体，室温搅拌2小时，加入终浓度为1％牛血清白蛋白，1％聚乙二醇20000封闭20min，12000r/min离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至50ml，按1ml溶液铺20cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置温度20～25℃，相对湿度小于30％的干燥间，干燥2～5小时，制成胶体金垫。

所述试纸卡的装配过程为：在温度20～25℃，相对湿度小于40％的干燥室内，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/4粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘帖；最后用裁剪机将贴好的塑料板切成3～5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡。

所述试剂盒，检测方法为：

1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

2)精确吸取10μl血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul，加入洁净的离心管中，再用样本稀释液(生理盐水或PBS)进行10倍稀释，充分混匀；

3)用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中，15～20分钟内用胶体金比色卡(半)定量判定结果；

4)用比色卡判定结果时，将试纸卡T线显示的条数和比色卡上标准线进行对比，定量判定样品的浓度区间。

本实用新型的有益效果是：提供一种利用免疫层析胶体金技术制备的人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒，定量检测范围宽，适合血清、血浆和全血样本，并适合临床上单人份检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点，对胸痛患者进行心肌梗死预警。

附图说明：

图1是人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒的试纸条。

附图符号说明：

1：塑料底板；2：上样垫；3：胶体金垫；4：NC膜；

5、6、7：检测线T；8：质控线C；9：吸样垫。

图2是人髓过氧化物酶(MPO)快速定量检测试剂盒的试纸卡对样本检测结果的显示。

具体实施方式

实施例：人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒制备及检测

1.主要材料

1.1MPO标准品：中检所；MPO特异性配对抗体、IgG抗体：北京盛齐杨桓科技有限公司产品；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜：SARTORIUS(德国)，CN140，德国赛多利斯公司产品；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇PEG20000、水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。

1.2临床样本由公司在相关医院获得，共200份，其中血清样本100份，血浆和全血样本各50份，MPO含量分布区间为6.25～400ng/ml之间的定值血清。

2.方法

2.1MPO抗体胶体金标记氯金酸－柠檬酸三钠还原法制备直径为30～40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2MK₂CO₃将溶液调到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg将标记用MPO抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入到终浓度为1％的PEG2000和1％的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/min离心，弃上清，沉淀按50％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(pH8.0,含BSA，羊血清，蔗糖和表面活性剂)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm²的比例加样于玻璃纤维膜或无纺布上，在温度20～25℃，相对湿度＜30％的干燥间干燥2～5小时，制成胶体金垫。

2.2NC膜包被用0.01M pH7.4PBS将包被MPO抗体稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜在温度20～25℃，相对湿度＜30％的干燥间干燥2～5小时。

2.3试纸卡组装在温度20～25℃，湿度小于40％的干燥室内，取塑底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/4粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘 贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3～5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡。

2.4试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用MPO标准品对试剂进行测试，寻找最佳组合。

2.5比色卡制备和仪器曲线参数设置确定好试纸工艺参数后，分别用400、100、6.25ng/ml的MPO标准品对试纸进行测定，不同浓度的标准品显示出不同条数的色带，将相应条数的色带印刷到比色卡上，完成比色卡制备。

2.6检测方法

1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

2)精确吸取10μl血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul，加入洁净的离心管中，用样本稀释液(PBS)进行10倍稀释，充分混匀；

3)用移液枪吸取10ul稀释后的样本加入到样本孔中，15～20分钟内用胶体金定量比色卡(半)定量判定结果；

4)用比色卡判定结果时，将试纸卡T线的条带及颜色和比色卡上标准线进行对比，半定量判定样品的浓度区间。

2.7临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。

3结果

3.1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8.0；MPO抗体最佳标记量为1mg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为20mM硼酸盐缓冲液，pH8.0，含1％BSA、10％羊血清，2％蔗糖，0.2％Tween20；最佳包被MPO抗体浓度为1.5mg/ml。检测结果的最佳判定时间为15～20分钟。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。

3.2临床样本检测对200份临床定值样本检测，用仪器定量判定结果时，在检测范围内的195份样品平均偏差值均小于15％，最大偏差小于20％，R²>0.97，一致性系数>0.88。用比色卡判定结果时，区间判定结果和样本值的符合率为95.5％，一致性系数>0.85。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

Claims (4)

1.一种人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于可以快速检测人血浆或血清中的MPO含量，以预警早期发生心肌梗塞的风险，所述试剂盒由试纸卡和比色卡构成，其中：

所述试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，所述上样垫(2)的一端紧密压接含有标记抗人髓过氧化物酶(MPO)特异性抗体的胶体金垫(3)，所述胶体金垫(3)的一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，所述硝酸纤维素NC膜(4)上包被有相互分离的检测线T(5、6、7)和质控线C(8)，所述检测线T(5、6、7)为和标记抗体配对的定量MPO抗体，所述质控线C(8)为IgG抗体，所述硝酸纤维素NC膜(4)的另一端连接吸样垫(9)形成试纸条，所述试纸条装入塑料垫中形成所述试纸卡，所述定量MPO抗体是定量的MPO捕获抗体、可以对样品中的MPO浓度进行定量区间检测，所述检测线T(5、6、7)有三条，分别对应6.25、100、400ng/ml的MPO浓度。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述标记抗体为MPO抗体，分别识别人髓过氧化物酶的不同表位，该MPO抗体为纯化的人髓过氧化酶特异性单克隆抗体或多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述比色卡是白色背景上印有7条不同深浅红色线条，用于对检测结果的对比判断及定量判断，分别对应400、200、100、50、25、12.5、6.25ng/ml的MPO浓度。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述硝酸纤维素NC膜(4)为孔径5～12μm的多孔样结构膜，所述上样垫(2)为玻璃纤维膜或无纺布，所述吸样垫(9)为吸水滤纸。