CN108845143A - 一种pct-crp双联卡及其制备方法 - Google Patents

一种pct-crp双联卡及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108845143A
CN108845143A CN201810641757.7A CN201810641757A CN108845143A CN 108845143 A CN108845143 A CN 108845143A CN 201810641757 A CN201810641757 A CN 201810641757A CN 108845143 A CN108845143 A CN 108845143A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection line
solution
antibody
liquid
film
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810641757.7A
Other languages
English (en)
Inventor
李洪波
张浦东
秦川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd filed Critical Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201810641757.7A priority Critical patent/CN108845143A/zh
Publication of CN108845143A publication Critical patent/CN108845143A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4727—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4737—C-reactive protein

Abstract

本发明提供了一种PCT‑CRP双联卡，包括试纸条底衬以及搭接在试纸条底衬上的层析膜，所述层析膜上顺序设置有第一检测线、第二检测线和质控线。该试纸条一方面通过利用双抗夹心的方法对PCT进行检测，另一方面通过竞争法的方式对CRP进行检测，不需要进行样本稀释；同时调整检测区中PCT检测线与CRP检测线的位置可以降低非特异性吸附的干扰；通过样本垫中抗人红细胞抗体实现全血的滤过作用，实现对全血样本的检测，综上所述本发明提供的PCT‑CRP双联卡检测方便，检测范围更宽，快速并且灵敏。

Description

一种PCT-CRP双联卡及其制备方法
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种PCT-CRP试剂卡及其制备方法。
背景技术
降钙素原(PCT)是一种无激素活性的糖蛋白，由116个氨基酸组成，相对分子量是13KDa，半衰期在25-30个小时。PCT在临床上具有广泛而又重要的应用价值，正常人体内PCT的含量低于0.5ng/ml，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭发生时，血浆中PCT的水平升高。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。
C反应蛋白(CRP)是一种能与肺炎球菌C多糖体反应形成复合物的急性时相反应蛋白，半衰期19小时，血清CRP由肝脏合成。CRP在正常人体内含量极低(约580ng/ml)，当发生炎症疾病或组织损伤6～8小时内，血清或血浆C-反应蛋白量迅速升高，并在48～72小时达高峰，但随着病情改善或组织结构功能恢复，其含量也恢复正常。因此血清或血浆中CRP的水平，可以作为判断有无感染、疾病是否处于活动期的指标。
张喜，PCT与CRP对感染性疾病的诊断价值[J]，中国医药指南，2017,4(15):165文章中指出将PCT和CRP二者结合来作为临床诊断的依据对于检测感染性疾病具有积极的意义，可以提高诊断的准确率，并可以根据检验结果判断感染性疾病的严重程度，具有临床应用价值。在专利号为201210212105.4的专利中公开了一种PCT/CRP联合检测用胶体金试纸条，在此专利中PCT与CRP的检测都是采用双抗夹心法来进行检测，但是CRP在检测中容易出现hook效应，所以在检测前就需要手动的对检测样本进行稀释，操作较为复杂，并且也满足不了医生对检测结果的紧急需求，所以急需开发一种快速灵敏，方便以及操作简单的PCT-CRP双联卡，并且对血清、全血以及血浆不进行处理的情况下就能够检测。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种快速，方便并且操作简单的PCT-CRP双联卡及其制备方法。
本发明提供了一种PCT-CRP双联卡，双联卡上包括试纸条底衬以及搭接在试纸条底衬上的层析膜，所述层析膜上顺序设置有第一检测线和第二检测线，第一检测线采用竞争法检测C反应蛋白，第二检测线采用双抗夹心法检测降钙素原。
进一步的，所述层析膜上顺序设置有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线的划膜液为C反应蛋白溶液，第二检测线的划膜液为降钙素原单克隆抗体1溶液，质控线的划膜液为羊抗鼠IgG抗体溶液。
进一步的，所述第一检测线上的C反应蛋白溶液的浓度为：0.1-5mg/mL；所述第二检测线上包被的降钙素原单克隆抗体1溶液的浓度为：0.1-5mg/mL；所述质控线包被的羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为：0.1-5mg/mL。
进一步的，所述第一检测线上的C反应蛋白溶液的浓度为：0.5-2.5mg/mL；所述第二检测线上包被的降钙素原单克隆抗体1溶液的浓度为：0.5-2.5mg/mL；所述质控线包被的羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为：1.0-2.5mg/mL。
进一步的，所述第一检测线上的C反应蛋白溶液的浓度为：1mg/mL；所述第二检测线上包被的降钙素原单克隆抗体1溶液的浓度为：1mg/mL；所述质控线包被的羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为：2mg/mL。
进一步的，所述第一检测线上的C反应蛋白溶液，第二检测线上的降钙素原单克隆抗体1溶液以及质控线上的羊抗鼠IgG抗体溶液在层析膜上的用量均为：0.5-2.0μL/cm。
进一步的，所述的第一检测线上的C反应蛋白溶液，第二检测线上包被的降钙素原单克隆抗体1溶液以及质控线上包被的羊抗鼠IgG抗体溶液在层析膜上的用量均为：1ul/cm。
进一步的，所述的PCT-CRP双联卡上的试纸条衬上还搭接有样本垫与涂覆示踪标志物标记的抗体的结合垫，所述的样本垫、涂覆示踪标志物标记的抗体的结合垫与层析膜在试纸条衬上依次紧密搭接。
进一步的，所述的示踪标记物为胶体金；
进一步的，所述的结合垫上的抗体为能与PCT或CRP结合的单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体。
进一步的，所述的结合垫上的抗体包括降钙素原单克隆抗体2和C反应蛋白单克隆抗体，所述的降钙素原单克隆抗体2与所述的降钙素原单克隆抗体1能够与降钙素原表面的不同的抗原决定簇结合。
进一步的，所述结合垫上的C反应蛋白单克隆抗体和降钙素原单克隆抗体2的浓度均为0.01-0.04mg/mL；
进一步的，所述结合垫上的C反应蛋白单克隆抗体和降钙素原单克隆抗体2的浓度均为0.02mg/mL；
进一步的，所述PCT-CRP双联卡还包括吸水纸，所述的所述的样本垫、涂覆示踪标志物标记的抗体的结合垫、层析膜与吸水纸在试纸条衬上依次紧密搭接。
本发明还提供了制备PCT-CRP双联卡的方法，包括如下步骤：
第一检测线，第二检测线以及质控线的制备：
(1)配置包被缓冲液：加入10-50mM缓冲液，0.01-0.1g/L保护剂以及0.001-0.01g/L防腐剂；
(2)用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至0.1-5mg/mL，形成第一检测线的划膜液；
(3)用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体1稀释至0.1-5mg/mL，形成第二检测线的划膜液；
(4)用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.1-5mg/mL，形成质控线的划膜液；
(5)将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为0.5-2.0ul/cm。
结合垫的制备：
(1)将待标记的C反应蛋白单克隆抗体加入胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入封闭液对抗体进行封闭，去除上清液后，加入缓冲液，形成金标液1；
(2)将待标记的降钙素原单克隆抗体2加入胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入封闭液对抗体进行封闭，去除上清液后，加入缓冲液，形成金标液2；
(3)将金标液1：金标液1按照1:1的比例进行混匀，形成混合溶液，再在37℃下将混合溶液进行烘烤，最后再在4-30℃下进行保存，待用；
样本垫的制备：
在缓冲液中加入封闭液，然后加入兔抗人红细胞抗体，进行烘烤，最后再在4-30℃下进行保存，待用。
组装
在试纸条底衬上依次紧密搭接样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸。
进一步的，本发明提供了制备PCT-CRP双联卡的方法，包括如下步骤：
第一检测线，第二检测线以及质控线的制备：
(1)配置包被缓冲液：加入10-50mM缓冲液，0.01-0.1保护剂以及0.001-0.01防腐剂；
(2)用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至0.5-2.5mg/mL，形成第一检测线的划膜液；
(3)用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体1稀释至0.5-2.5mg/mL，形成第二检测线的划膜液；
(4)用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1.0-2.5mg/mL，形成质控线的划膜液；
(5)将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为0.5-2.0ul/cm。
结合垫的制备：
(1)将待标记的C反应蛋白单克隆抗体加入胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入封闭液对抗体进行封闭，去除上清液后，加入缓冲液，形成金标液1；
(2)将待标记的降钙素原单克隆抗体2加入胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入封闭液对抗体进行封闭，去除上清液后，加入缓冲液，形成金标液2；
(3)将金标液1：金标液1按照1:1的比例进行混匀，形成混合溶液，再在37℃下将混合溶液进行烘烤，最后再在4-30℃下进行保存，待用；
样本垫的制备：
在缓冲液中加入封闭液，然后加入兔抗人红细胞抗体，进行烘烤，最后再在4-30℃下进行保存，待用。
组装
在试纸条底衬上依次紧密搭接样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸。
进一步的，本发明还提供了制备PCT-CRP双联卡的方法，包括如下步骤：
第一检测线，第二检测线以及质控线的制备：
(1)配置包被缓冲液：加入20mM缓冲液，0.02g/L保护剂以及0.005g/L的防腐剂；
(2)用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至1mg/mL，形成第一检测线的划膜液；
(3)用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体1稀释至1mg/mL，形成第二检测线的划膜液；
(4)用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至2mg/mL，形成质控线的划膜液；
(5)将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为1ul/cm。
结合垫的制备：
(1)将待标记的C反应蛋白单克隆抗体加入胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入封闭液对抗体进行封闭，去除上清液后，加入缓冲液，形成金标液1；
(2)将待标记的降钙素原单克隆抗体2加入胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入封闭液对抗体进行封闭，去除上清液后，加入缓冲液，形成金标液2；
(3)将金标液1：金标液1按照1:1的比例进行混匀，形成混合溶液，再在37℃下将混合溶液进行烘烤，最后再在4-30℃下进行保存，待用；
样本垫的制备：
在缓冲液中加入封闭液，然后加入兔抗人红细胞抗体，进行烘烤，最后再在4-30℃下进行保存，待用。
组装
在试纸条底衬上依次紧密搭接样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸
本发明中的层析膜可以为玻璃纤维素膜，尼龙膜，聚偏氟乙烯膜，硝酸纤维素膜中的一种，以及常规材料的作为层析膜的双联卡也在本发明的保护范围内，同样的，对于样品垫也是如此；
进一步的，所述的封闭液为BSA溶液、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或PBST溶液中的一种或者多种。
进一步的，所述缓冲液为PBS缓冲液，Tris-HCI缓冲液，甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种；
进一步的，所述保护剂为牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA、蔗糖和明胶中的一种或多种；
进一步的，所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、Proclin300和Proclin200中的一种或多种；
本发明中的封闭液、缓冲液以及防腐剂不仅仅局限于本权利要求所限定的封闭液，采用其他常规的封闭液制备本发明中的PCT-CRP双联卡也在本发明的保护范围内。
本发明中的PCT是降钙素原，CRP是C反应蛋白。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：该试纸条一方面通过利用双抗夹心的方法对PCT进行检测，另一方面通过竞争法的方式对CRP进行检测，不需要进行样本稀释；同时调整检测区中PCT检测线与CRP检测线的位置可以降低非特异性吸附的干扰；通过样本垫中抗人红细胞抗体实现全血的滤过作用，实现对全血样本的检测，综上所述本发明提供的PCT-CRP双联卡检测方便，检测范围更宽，快速并且灵敏。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1检测线上CRP与PCT单克隆抗体1浓度的确定
1.实验设置
按照上述过程制备抗PCT、CRP抗体胶体金蛋白复合物，将胶体金蛋白复合物均匀涂布在玻璃纤维上，干燥后备用。
取浓度为0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3.0、3.5、4、5、6mg/mL的降钙素原单克隆抗体1包被溶液及0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3.0、3.5、4、5、6mg/mL C反应蛋白包被溶液适量，用点膜仪将包被液包被到硝酸纤维素膜上的检测线上，包被速率为1μL/cm，45℃干燥。
将制备好的结合垫与包被好的硝酸纤维素膜组装成大板，设置切条机将大板切成3mm宽的半成品试纸条，用阴阳性参考品检测。根据显色效果比较不同包被浓度的划线效果。
2、实验结果
表1检测线包被浓度实验结果
从上表1看出，检测线包被浓度为0.1-5mg/mL时(PCT单克隆抗体1与CRP的浓度均为0.1-5mg/mL)，显色效果较佳，检测线包被浓度为0.5-2.5mg/mL时(PCT单克隆抗体1与CRP的浓度均为0.5-2.5mg/mL)，显色效果更佳，考虑成本及具体显色状态等因素首选1mg/mL作为检测线的包被浓度(PCT单克隆抗体1与CRP的浓度均为1mg/mL)，其中具体显色状态为：当检测线上包被溶液的浓度均为0.1或0.5mg/mL时(PCT单克隆抗体1与CRP的浓度均为0.1或0.5mg/mL)，其检测线上的显色程度没有当检测线上包被溶液的浓度均为1mg/mL时(PCT单克隆抗体1与CRP的浓度均为1mg/mL)的显色程度饱满。
实施例2PCT与CRP包被在检测线上的顺序的确定
参考：在硝酸纤维素膜上的第一检测线上包被CRP，第二检测线上包被PCT，用吸水垫，结合垫，样本垫在试纸条底衬上进行组装，将PCT/CRP用参考品用PBS缓冲液进行稀释，共8个梯度。取待测样本80μL进行检测，15min后，通过配套的免疫定量分析仪读取信号值。
对比：在在硝酸纤维素膜上的第一检测线上包被PCT，第二检测线上包被CRP，用吸水垫，结合垫，样本垫在试纸条底衬上进行组装，将PCT/CRP用参考品用PBS缓冲液进行稀释，共8个梯度。取待测样本80μL进行检测，15min后，通过配套的免疫定量分析仪读取信号值。
其实验结果如下表2与表3所示：
由上表2与上表3看出，当第一检测线用于检测PCT时，并且当PCT的浓度很低时，试剂卡上的第一检测线上显示出来的吸光度值很接近，无法真实的反应出PCT的浓度，但是当第二检测线用于检测PCT时，能够检测出低浓度与高浓度的PCT；综合以上信息，PCT-CRP双联卡中第一检测线用于检测CRP，第二检测线用于检测PCT时，其检测范围更宽。
实施例3一种制备PCT-CRP双联卡的方法，包括如下步骤：
第一检测线，第二检测线以及质控线的制备
(1)配置包被缓冲液：配置20mM PBS溶液，在溶液中加入0.02g/L的蔗糖，0.005g/L的叠氮钠；
(2)用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至1mg/mL，形成第一检测线的划膜液；
(3)用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体稀释至1mg/mL，形成第二检测线的划膜液；
(4)用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/mL，形成质控线的划膜液；
(5)将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为1ul/cm。
结合垫的制备
(1)将30μg待标记的PCT单克隆抗体2加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液1；
(2)将30μg待标记的CRP单克隆抗体加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液2；
(3)将金标液1：金标液2按1：1的比例进行混匀，混匀后铺于5mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为结合垫。
样本垫的制备
配制30mM的柠檬酸缓冲液加入0.5％的BSA，2mg/mL的兔抗人红细胞抗体，混匀后铺于22mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为样本垫。
组装
在PVC塑料底板上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫。样品垫为玻璃纤维素膜，作为待检样品收集区以及滤过红细胞。
实施例4一种制备PCT-CRP双联卡的方法，包括如下步骤：
第一检测线，第二检测线以及质控线的制备
(1)配置包被缓冲液：配置10mM甘氨酸缓冲液，在溶液中加入0.01g/L的卵清蛋白OVA，0.001g/L的Proclin300；
(2)用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至0.1mg/mL，形成第一检测线的划膜液；
(3)用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体稀释至0.1mg/mL，形成第二检测线的划膜液；
(4)用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.1mg/mL，形成质控线的划膜液；
(5)将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为0.5μL/cm。
结合垫的制备
(1)将30μg待标记的PCT单克隆抗体2加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液1；
(2)将30μg待标记的CRP单克隆抗体加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液2；
(3)将金标液1：金标液2按1：1的比例进行混匀，混匀后铺于5mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为结合垫。
样本垫的制备
配制30mM的柠檬酸缓冲液加入0.5％的BSA，2mg/mL的兔抗人红细胞抗体，混匀后铺于22mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为样本垫。
组装
在PVC塑料底板上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫。样品垫为玻璃纤维素膜，作为待检样品收集区以及滤过红细胞。
实施例5一种制备PCT-CRP双联卡的方法，包括如下步骤：
第一检测线，第二检测线以及质控线的制备
(1)配置包被缓冲液：配置10mM甘氨酸缓冲液，在溶液中加入0.01g/L的卵清蛋白OVA，0.001g/L的Proclin300；
(2)用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至5mg/mL，形成第一检测线的划膜液；
(3)用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体稀释至5mg/mL，形成第二检测线的划膜液；
(4)用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至5mg/mL，形成质控线的划膜液；
(5)将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为2μL/cm。
结合垫的制备
(1)将30μg待标记的PCT单克隆抗体2加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液1；
(2)将30μg待标记的CRP单克隆抗体加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液2；
(3)将金标液1：金标液2按1：1的比例进行混匀，混匀后铺于5mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为结合垫。
样本垫的制备
配制30mM的柠檬酸缓冲液加入0.5％的BSA，2mg/mL的兔抗人红细胞抗体，混匀后铺于22mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为样本垫。
组装
在PVC塑料底板上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫。样品垫为玻璃纤维素膜，作为待检样品收集区以及滤过红细胞。
实施例6一种制备PCT-CRP双联卡的方法，包括如下步骤：
第一检测线，第二检测线以及质控线的制备
(1)配置包被缓冲液：配置10mM甘氨酸缓冲液，在溶液中加入0.01g/L的卵清蛋白OVA，0.001g/L的Proclin300；
(2)用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至0.5mg/mL，形成第一检测线的划膜液；
(3)用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体稀释至0.5mg/mL，形成第二检测线的划膜液；
(4)用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/mL，形成质控线的划膜液；
(5)将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为2μL/cm。
结合垫的制备
(1)将30μg待标记的PCT单克隆抗体2加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液1；
(2)将30μg待标记的CRP单克隆抗体加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液2；
(3)将金标液1：金标液2按1：1的比例进行混匀，混匀后铺于5mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为结合垫。
样本垫的制备
配制30mM的柠檬酸缓冲液加入0.5％的BSA，2mg/mL的兔抗人红细胞抗体，混匀后铺于22mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为样本垫。
组装
在PVC塑料底板上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫。样品垫为玻璃纤维素膜，作为待检样品收集区以及滤过红细胞。
实施例7一种制备PCT-CRP双联卡的方法，包括如下步骤：
第一检测线，第二检测线以及质控线的制备
(1)配置包被缓冲液：配置50mM甘氨酸缓冲液，在溶液中加入0.1g/L的卵清蛋白OVA，0.01g/L的Proclin300；
(2)用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至2.5mg/mL，形成第一检测线的划膜液；
(3)用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体稀释至2.5mg/mL，形成第二检测线的划膜液；
(4)用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至2.5mg/mL，形成质控线的划膜液；
(5)将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为0.5μL/cm。
结合垫的制备
(1)将30μg待标记的PCT单克隆抗体2加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液1；
(2)将30μg待标记的CRP单克隆抗体加入1ml的胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入0.5％的BSA溶液进行封闭，离心去除上清，加入0.5ml的(30mM)柠檬酸缓冲液，形成金标液2；
(3)将金标液1：金标液2按1：1的比例进行混匀，混匀后铺于5mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为结合垫。
样本垫的制备
配制30mM的柠檬酸缓冲液加入0.5％的BSA，2mg/mL的兔抗人红细胞抗体，混匀后铺于22mm玻璃纤维上，37℃进行烘烤，烘干后4-30℃干燥保存，即为样本垫。
组装
在PVC塑料底板上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫。样品垫为玻璃纤维素膜，作为待检样品收集区以及滤过红细胞。
实施例8实施例3中的PCT-CRP双联卡的性能测定
1、准确性
取质控品作为样本，按试剂盒说明书的规定进行测定，重复测试10次，计算样本测定结果均值，用相对偏差表示测定结果的准确性。
测试项目：PCT 单位：ng/mL
测试项目：CRP 单位：ng/mL
2、线性范围
用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品或0浓度样品，混合成至少5个稀释浓度；或直接采用5个浓度的质控品，每一浓度样本重复检测2次，计算平均值，取其测定浓度值(y)与对应的理论浓度值或者稀释倍数(x)进行回归分析。
测试项目：PCT 单位：ng/mL
测试项目：CRP 单位：μg/mL
3、精密度
取质控品作为样本，取同一批号试剂按试剂盒说明书的规定进行测定，重复测试10次，计算10次测试结果的均值(X)，计算标准差(SD)与变异系数(CV)。
测试项目：PCT 单位：ng/mL
测试项目：CRP 单位：μg/mL
综上所述，采用在第一检测线上包被C反应蛋白溶液以及在第二检测线上包被降钙素原单克隆抗体1溶液的PCT-CRP双联卡，其检测PCT以及CRP的准确性，线性范围以及精密度都符合要求。

Claims (10)

1.一种PCT-CRP双联卡，其特征在于：包括试纸条底衬以及搭接在试纸条底衬上的层析膜，所述层析膜上顺序设置有第一检测线和第二检测线，第一检测线采用竞争法检测C反应蛋白，第二检测线采用双抗夹心法检测降钙素原；优选的，所述层析膜上顺序设置有第一检测线、第二检测线和质控线，第一检测线的划膜液为C反应蛋白溶液，第二检测线的划膜液为降钙素原单克隆抗体1溶液，质控线的划膜液为羊抗鼠IgG抗体溶液。
2.如权利要求1所述的PCT-CRP双联卡，其特征在于：所述第一检测线上的C反应蛋白溶液的浓度为：0.1-5mg/mL，优选的，所述C反应蛋白溶液的浓度为0.5-2.5mg/mL，更优选的，所述C反应蛋白溶液的浓度为1mg/mL；所述第二检测线上包被的降钙素原单克隆抗体1溶液的浓度为：0.1-5mg/mL，优选的，所述降钙素原单克隆抗体1溶液的浓度为0.5-2.5mg/mL，更优选的，所述降钙素原单克隆抗体1溶液的浓度为1mg/mL；所述质控线包被的羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为：0.1-5mg/mL，优选的，所述羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为：1.0-2.5mg/mL，更优选的，所述羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为：2mg/mL。
3.如权利要求2所述的PCT-CRP双联卡，其特征在于：所述第一检测线上的C反应蛋白溶液，第二检测线上的降钙素原单克隆抗体1溶液以及质控线上的羊抗鼠IgG抗体溶液在层析膜上的用量均为：0.5-2.0μL/cm，优选的，所述的第一检测线上的C反应蛋白溶液，第二检测线上包被的降钙素原溶液以及质控线上包被的羊抗鼠IgG抗体溶液在层析膜上的用量均为：1μL/cm。
4.如权利要求1所述的PCT-CRP双联卡，其特征在于：所述的PCT-CRP双联卡上的试纸条衬上还搭接有样本垫与涂覆示踪标志物标记的抗体的结合垫，所述的样本垫、涂覆示踪标志物标记的抗体的结合垫与层析膜在试纸条衬上依次紧密搭接。
5.如权利要求4所述的PCT-CRP双联卡，其特征在于：所述的示踪标记物为胶体金，优选的，所述的结合垫上的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体。
6.如权利要求5所述的PCT-CRP双联卡，其特征在于：所述的结合垫上的抗体包括C反应蛋白单克隆抗体和降钙素原单克隆抗体2，所述的降钙素原单克隆抗体2与所述的降钙素原单克隆抗体1能够与降钙素原表面的不同的抗原决定簇结合，优选的，所述结合垫上的C反应蛋白单克隆抗体和降钙素原单克隆抗体2的浓度均为0.01-0.04mg/mL，更优选的，所述结合垫上的C反应蛋白单克隆抗体和降钙素原单克隆抗体2的浓度均为0.02mg/mL。
7.如权利要求1-6任意一项所述的PCT-CRP双联卡，其特征在于：所述PCT-CRP双联卡还包括吸水纸，所述的样本垫、涂覆示踪标志物标记的抗体的结合垫、层析膜与吸水纸在试纸条衬上依次紧密搭接。
8.一种制备如权利要求4-7任意一项所述的PCT-CRP双联卡的方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一检测线，第二检测线以及质控线的制备：
(1)配置包被缓冲液：加入10-50mM缓冲液，0.01-0.1g/L保护剂以及0.001-0.01g/L防腐剂；优选的，配置包被缓冲液：加入20mM缓冲液，0.02g/L保护剂以及0.005g/L的防腐剂；
(2)用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至0.1-5mg/mL，形成第一检测线的划膜液，优选的，用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至0.5-2.5mg/mL，形成第一检测线的划膜液，更优选的，用步骤(1)中的包被缓冲液将C反应蛋白稀释至1mg/mL，形成第一检测线的划膜液；
(3)用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体1稀释至0.1-5mg/mL，形成第二检测线的划膜液，优选的，用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体1稀释至0.5-2.5mg/mL，形成第二检测线的划膜液，更优选的，用步骤(1)中的包被缓冲液将降钙素原单克隆抗体1稀释至1mg/mL，形成第二检测线的划膜液；
(4)用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.1-5mg/mL，形成质控线的划膜液，优选的，用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1-2.5mg/mL，形成质控线的划膜液，更优选的，用步骤(1)中的包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至2mg/mL，形成质控线的划膜液；
(5)将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为0.5-2.0μL/cm，优选的，将第一检测线的划膜液、第二检测线的划膜液以及质控线的划膜液分别喷涂于层析膜上，喷量均为1μL/cm。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：还包括如下步骤：
结合垫的制备：
(1)将待标记的C反应蛋白单克隆抗体加入胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入封闭液对抗体进行封闭，去除上清液后，加入缓冲液，形成金标液1；
(2)将待标记的降钙素原单克隆抗体2加入胶体金溶液中，混匀后静置10min后，加入封闭液对抗体进行封闭，去除上清液后，加入缓冲液，形成金标液2；
(3)将金标液1：金标液2按照1:1的比例进行混匀，形成混合溶液，再在37℃下将混合溶液进行烘烤，最后再在4-30℃下进行保存，待用。
样本垫的制备：
在缓冲液中加入封闭液，然后加入兔抗人红细胞抗体，进行烘烤，最后再在4-30℃下进行保存，待用。
组装：
在试纸条底衬上依次紧密搭接样品垫、结合垫、层析膜和吸水纸。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述的层析膜为玻璃纤维素膜，尼龙膜，聚偏氟乙烯膜和硝酸纤维素膜中的一种，所述缓冲液为PBS缓冲液，Tris-HCI缓冲液，甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种；所述保护剂为牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA、蔗糖和明胶中的一种或多种；所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、Proclin300和Proclin200中的一种或多种；所述的封闭液为BSA溶液、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或PBST溶液中的一种或者多种。
CN201810641757.7A 2018-06-21 2018-06-21 一种pct-crp双联卡及其制备方法 Pending CN108845143A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810641757.7A CN108845143A (zh) 2018-06-21 2018-06-21 一种pct-crp双联卡及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810641757.7A CN108845143A (zh) 2018-06-21 2018-06-21 一种pct-crp双联卡及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108845143A true CN108845143A (zh) 2018-11-20

Family

ID=64203157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810641757.7A Pending CN108845143A (zh) 2018-06-21 2018-06-21 一种pct-crp双联卡及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108845143A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109725150A (zh) * 2018-12-20 2019-05-07 江南大学 一种带有样品分配垫的免疫联检试纸条
CN110579596A (zh) * 2019-09-16 2019-12-17 菲鹏生物股份有限公司 多联检免疫层析试剂卡及其应用和多联检免疫层析试剂盒
CN112505321A (zh) * 2020-10-23 2021-03-16 重庆中元汇吉生物技术有限公司 一种抗体标记的载体的复溶液
CN112763728A (zh) * 2021-04-09 2021-05-07 北京华益精点生物技术有限公司 用于检测液态样品的浓度的检测方法和测试条

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007000048A1 (en) * 2005-06-28 2007-01-04 Zbx Corporation Membrane array and analytical device
WO2007027231A1 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Diagnostic test kits with improved detection accuracy
US20100323392A1 (en) * 2005-04-29 2010-12-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Metering Technique for Lateral Flow Assay Devices
CN106814190A (zh) * 2017-01-19 2017-06-09 深圳市雷诺华科技实业有限公司 Pct与crp联检试纸条及其制备方法
CN107290529A (zh) * 2017-08-08 2017-10-24 广州市微米生物科技有限公司 一种检测心梗心衰的免疫层析试纸及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100323392A1 (en) * 2005-04-29 2010-12-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Metering Technique for Lateral Flow Assay Devices
WO2007000048A1 (en) * 2005-06-28 2007-01-04 Zbx Corporation Membrane array and analytical device
WO2007027231A1 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Diagnostic test kits with improved detection accuracy
CN106814190A (zh) * 2017-01-19 2017-06-09 深圳市雷诺华科技实业有限公司 Pct与crp联检试纸条及其制备方法
CN107290529A (zh) * 2017-08-08 2017-10-24 广州市微米生物科技有限公司 一种检测心梗心衰的免疫层析试纸及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOPING QI等: "Dual-Quantum-Dots-Labeled Lateral Flow Strip Rapidly Quantifies Procalcitonin and C-reactive Protein", 《NANOSCALE RESEARCH LETTERS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109725150A (zh) * 2018-12-20 2019-05-07 江南大学 一种带有样品分配垫的免疫联检试纸条
CN110579596A (zh) * 2019-09-16 2019-12-17 菲鹏生物股份有限公司 多联检免疫层析试剂卡及其应用和多联检免疫层析试剂盒
CN112505321A (zh) * 2020-10-23 2021-03-16 重庆中元汇吉生物技术有限公司 一种抗体标记的载体的复溶液
CN112763728A (zh) * 2021-04-09 2021-05-07 北京华益精点生物技术有限公司 用于检测液态样品的浓度的检测方法和测试条
CN112763728B (zh) * 2021-04-09 2023-10-13 北京华益精点生物技术有限公司 用于检测液态样品的浓度的检测方法和测试条

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108845143A (zh) 一种pct-crp双联卡及其制备方法
CN202794178U (zh) 降钙素原快速定量免疫层析检测试剂盒
CN102207507A (zh) 心肌肌钙蛋白半定量检测试纸及制备方法
CN107255726A (zh) 定量检测人甲状旁腺激素的荧光免疫层析试纸及其制备方法
CN106814190A (zh) Pct与crp联检试纸条及其制备方法
CN202794189U (zh) C反应蛋白快速全程定量免疫层析检测试剂盒
CN107748252A (zh) 基于荧光微球的检测山羊传染性胸膜肺炎抗体的免疫试纸卡、制备及检测方法
CN111454913A (zh) 一种新型冠状病毒SARS-Cov-2保存液及其制备方法和应用
CN102879586A (zh) 微量白蛋白荧光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
CN109142758A (zh) 一种检测糖化血红蛋白的免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法
CN105759057A (zh) 一种检测阿尔兹海默综合症ms4a6a的干式免疫荧光试剂盒和制备方法
CN105929154A (zh) 快速检测布鲁氏菌病抗体的试纸条及其试剂盒
CN102830234A (zh) 一种检测人心力衰竭新型标志物st2的快速诊断试剂盒
CN108398565A (zh) 用于检测犬c-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡与制备方法
CN204330777U (zh) 人髓过氧化物酶(mpo)快速定量免疫层析检测试剂盒
CN114441766B (zh) 一种定量检测抗pla2r抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法
CN106546750A (zh) 一种微量白蛋白快速定量检测试纸条的制备及检测方法
CN203101403U (zh) 肌钙蛋白i快速定量免疫层析检测试剂盒
CN105785028A (zh) 一种检测人心力衰竭新型标志物st2的快速诊断试剂盒
CN110514828A (zh) 一种快速检测孕妇胎盘生长因子的免疫层析检测卡及其制备方法
CN202631543U (zh) D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条
CN201087838Y (zh) 心肌钙蛋白i颜色颗粒诊断试纸
CN205333641U (zh) 一种pct时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条
CN114609391A (zh) 人胎盘生长因子测定试剂盒及其制备方法
CN110221066A (zh) 一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181120