CN105785028A - 一种检测人心力衰竭新型标志物st2的快速诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速检测人全血、血清和/或血浆，尤其是外周血中心力衰竭标志物人可溶性ST2的胶体金试纸条检测试剂盒。试剂盒利用免疫学反应原理，其通过颜色颗粒标记的免疫层析法定性或半定量检测样本中的ST2。本发明的快速检测试纸条是在底板上依次相互搭接，包括吸水纸、样本垫、纤维素膜等组成的试纸条。其中颜色颗粒用于抗体的包被，试纸条包括质控线和检测线。本发明试纸条对人心力衰竭标志物人可溶性ST2进行定性/定量检测，具有较高的特异性和灵敏度，操作简捷。可以用于临床及科研中的检测人心力衰竭等心肌损伤性疾病，用以辅助诊断、指导治疗、预后判断和微量残留心肌坏死(MDR)的动态监测等。

Description

一种检测人心力衰竭新型标志物ST2的快速诊断试剂盒

本申请是申请人于2012年8月10日提交的题为“一种检测人心力衰竭新型标志物ST2的快速诊断试剂盒”的中国专利申请201210288223.3的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速定性/定量检测人全血、血清和/或血浆中心力衰竭标志物人可溶性ST2浓度的快速诊断检测试剂盒。

背景技术

心力衰竭是一种复杂的临床症状群，是各种心脏病的严重阶段，其发病率高，五年存活率与恶性肿瘤相仿。据我国五十家医院住院病例调查，心力衰竭住院率占同期心血管病的20％，死亡率却占40％，提示预后严重。就整个欧洲来说，估计有症状的心力衰竭病人占总人口的0.4％-2％，随着年龄的增加，心力衰竭的患病率迅速增加。心力衰竭已经成为美国主要的公共卫生问题。美国患有心力衰竭的病人大约有500万人，每年新增50万人。每年因心力衰竭而就诊者达到1200-1500万，总住院天数达到650万。

ST2是白介素-1(IL-1)受体家族成员之一，有跨膜ST2(ST2L)和可溶性ST2(sST2)两种，白介素-33(IL-33)是ST2L的功能配体。心肌细胞和纤维原细胞受到机械牵张后，ST2和IL-33产生增加。近年研究发现ST2水平升高和BNP或NT-proBNP一样，可以反映心脏的负荷。

在急性心肌梗死患者，TIMI14和TIMI23研究中的810例患者进行了外周血ST2水平测定，结果发现30天内死亡和发生心衰的患者外周血ST2水平显著升高。在急性呼吸困难患者，Januzzi等对593例急诊患者的研究发现，心衰患者ST2的中位数高于非心衰患者，并且1年内死亡的患者ST2中位数也高于存活的患者，ST2水平的升高是1年死亡率的独立和强力预测指标。还有研究在慢性心衰患者发现，ST2水平的升高和心衰严重程度相关并预测心脏猝死的发生，并且严重心衰患者升高ST2在2周时的变化也是死亡和需要心脏移植的独立预测指标。

SaskiaBoisot等对150名急性不稳定HF住院患者进行研究，通过应用与心脏相关的多参数(包括ST2，BNP，NT-proBNP及血尿素氮)进行分析后发现，患者住院期间的ST2水平变化可预测90天时死亡率，且该作用独立于BNP和NT-proBNP。

总之，人可溶性ST2作为生物标志物已反复被证实具有潜在的价值。测量急性呼吸困难或心肌梗死的急诊患者血清ST2水平可能为分层护理提供一些有用的预后信息。另外，ST2的预测价值不受年龄、肾功能损害和体重指数的影响，而BNP、NT-proBNP的检测通常受到这些因素的影响，因此，ST2的测定结合BNP或NT-proBNP的测定可以更好的提高心衰预后判断的准确性。

发明内容

本发明涉及一种快速定性/定量检测人全血、血清和/或血浆，尤其是外周血中心力衰竭标志物-人可溶性ST2的胶体金试纸条检测试剂盒。本试纸条可对人心力衰竭标志物-人可溶性ST2进行定性/定量检测，具有较高的特异性和灵敏度，操作简捷，也可以用配套仪器进行定量检测。

本发明的另一个目的是在于提供了一种人心力衰竭标志物-人可溶性ST2免疫快速诊断试纸条的制备方法，包括抗可溶性ST2特异性抗体和/或抗原特异片段的制备、ST2免疫检测试纸条的制备及其检测方法和/或使用。该试纸条操作简捷、快速、高效、准确，全过程只需要10分钟，不受环境条件干扰，特异性好，且检测灵敏度高，最低检测级别可为ng/ml。本发明适用于医院和急诊单位等，可实现心力衰竭等心肌疾病的快速检测和/或现场检测。

本发明的检测人可溶性ST2免疫胶体金试纸条由样品垫、涂覆胶体金标记的抗-人可溶性ST2抗体的金标垫、在检测线和质控线包被有抗-人可溶性ST2抗体和IgG的硝酸纤维素膜、吸水垫依次构成(见图1)。在该PVC底板的两端，分别设有样品垫和吸收垫；在该PVC底板中部设有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫交界处，设有包被金标记抗-人可溶性ST2抗体的金标垫，在金标垫一端部分设置在样品垫之下，另一端部分设置在检测层之上；在与样品垫延续的检测层上设有检测线和质控线，在该检测线和质控线上分别包被有抗-人可溶性ST2抗体和羊抗IgG。

所述的胶体金标记的结合垫按照以下方法制备得到：将抗-人可溶性ST2抗体和羊抗鼠IgG分别用金溶液标记后，包被于玻璃纤维上即得；其中所述的硝酸纤维素膜可以用尼龙膜等代替。

所述的背衬可以是各种硬质的支持物，只要具有一定的硬度，具有附载或支持的功能都可用于本发明，例如可以是塑料板(PVC)、硬纸板等，优选为PVC。

本发明试剂盒的使用方法及评判标准：

(1)检测对象：具有特征性病症和/或胸痛或不舒服、呼吸困难、恶心、呕吐、嗳气、出汗、心悸、头晕、疲劳、晕厥等非特征性症状的患者和/或普通人群。

(2)样本：患者和/或普通人群的全血、血清和/或血浆，尤其是外周血。

(3)检测：用吸滴管将标本(全血、血清和/或血浆，尤其是外周血)收集在加样本中，将试纸刻度线(标记)一下浸入样本中，等候5-10分钟，样本被完全吸附之后，便可判读结果。

(4)检测原理：本发明检测试剂盒采用免疫层析法定性检测人外周血中人可溶性ST2蛋白的浓度。在试剂盒的检测区分别包被有抗-人可溶性ST2抗体结合片段，质控区包被有羊抗鼠IgG抗体。检测时，人外周血中的人可溶性ST2蛋白与试剂盒上事先包被有胶体金标记抗-人可溶性ST2抗体和/抗原结合片段结合形成结合物，出现一条颜色条带。无论样本中是存在和/或较低浓度人可溶性ST2抗体，当液面迁移至固定有羊抗鼠IgG抗体的质控区时，质控区应该会出现一条颜色的条带。

如果检测区出现一条颜色检测带，表示阳性(+)结果，即在质控区内和测试区内均出现一条颜色条带。(注意：由于待检样本中人可溶性ST2的浓度有所不同，因而测试区内的颜色条带可能出现颜色深浅的现象。但是，在一定时间内，不论测试区内的颜色条带颜色深浅，都可判定为阳性。)则表明患者已经患有心力衰竭等心肌疾病，和/或具有发展为心力衰竭等心肌疾病的风险。如果只有质控区出现一条颜色条带，而检测区无颜色条带，则说明患者没有患有心力衰竭等心肌疾病，和/或没有具有发展为心力衰竭等心肌疾病的风险。如果质控区没有出现颜色条带，则需要重新判定样本量是否足够或需要分析层析过程是否正常等。

本发明与现有技术相比具有如下优点：(1)检测速度快，全过程只需10分钟，可以实现单个样品或大量样本的检测；(2)灵敏度高，最低检测单位为ng/ml；(3)特异性强，和其它心力衰竭标志物无交叉干扰；(4)操作简捷，操作人员无需经过专业培训，按说明书即可完成操作，易于推广使用；(5)不需要任何仪器，特别适合现场检测；(6)将侧样本范围广，全血、血清和/或血浆均可用作试验样本，尤其是外周血，所需试剂和样本量少，样本量最低可至50-100ul。

心力衰竭是一个复杂的临床综合症，单一标记物不能反映心力衰竭全部特征。人可溶性ST2蛋白作为一个新的心力衰竭标记物，它和心肌肌钙蛋白I、BNP具有同等重要的地位。因为BNP的浓度似乎不能解释心力衰竭的严重性，因此人可溶性ST2蛋白和心肌肌钙蛋白I和/或BNP的联合测定，将为心力衰竭病情分级、治疗提供一个可靠的评断标准。在心力衰竭治疗过程中，除根据患者的临床症状外还可以根据患者人可溶性ST2蛋白水平和/或心肌肌钙蛋白I水平和/或BNP的水平，制定和调整治疗策略。因此人可溶性ST2蛋白水平和/或心肌肌钙蛋白I水平和/或BNP的水平联合，或者人可溶性ST2蛋白水平独立测定可以为心力衰竭患者提供一个客观的评估方法。

本发明所述的方法在医疗领域具有广泛的应用。例如，本方法可以用来普通人群筛查，包括被医生筛查，包括医院、门诊院所和紧急医疗部门。

附图说明

图1胶体金试纸条结构示意图

顺序依次为：

■：样本垫

■：金标垫

□：背衬

□：硝酸纤维素膜

□：吸水纸

图2检测结果判读示意图

依次为：阳性、阴性、无效、无效。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但这些实施例仅用于说明目的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解为，在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明胶体金诊断试剂盒的制备

制备抗-人可溶性ST2单克隆抗体

分别用纯化的人可溶性ST2抗体和/或抗原结合片段免疫纯系小鼠，小鼠血清产生相应的抗体时，即可将小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合。利用HAT选择杂交瘤细胞，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)或者WB对McAb进行检测。对于检测抗体阳性的杂交瘤细胞应用有限稀释液进行克隆，同时保存阳性细胞株，利用BALB/c纯系小鼠制备大量的单克隆抗体，同时对抗体特异性的鉴定、识别抗原表位的鉴定、亲和力的鉴定及配对试验，筛选出效果最好的一对细胞株。将筛选到的细胞株重新植入小鼠腹腔中，过5-6天取出腹水，利用硫酸铵盐析及亲和层析纯化得到的单克隆抗体。

胶体金试纸条的制备

胶体金的制备

(1)用5毫升微量移液器取3毫升1％四氯金酸于500毫升的圆底烧瓶中，量取297毫升的超纯水亦加入烧瓶中，配制成0.01％的四氯金酸反应液，充分搅拌混匀；

(2)连接上蛇形冷凝管，开启冷凝水，并置于磁力加热搅拌器上，加热煮沸；

(3)放入搅拌子，剧烈搅拌，然后一次性快速准确地加入3毫升柠檬酸铵溶液；

(4)金黄色的氯金酸水溶液首先变成灰色，约2分钟后变成紫红色，继续煮沸5分钟；

(5)关闭磁力加热搅拌器，待胶体金冷却后，分装于500毫升的玻璃试剂瓶中，外面覆上铝箔，按规定贴上标签；

制备的胶体金应呈现透亮的紫红色，没有聚合物及肉眼可见的沉淀；取适量于530纳米波长处测定，紫外吸收值在1.1-1.3之间。

制备胶体金结合物

(1)根据用拟标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量，工本艺每毫升胶体金标记12微克/抗体，标记的抗体量为3.6毫克；

(2)用0.1M的碳酸钾或0.1M盐酸调节胶体金的pH值为7.8；

(3)在电磁搅拌器下，将抗体蛋白质溶液加入胶体金溶液中，加入蛋白质时应逐滴加入，1毫克蛋白质大约5分钟加完；

(4)抗体和胶体金反应5分钟后，在磁力搅拌器下加入5％的牛血清蛋白(BSA)，使其终浓度为1％；

(5)10分钟后，加入3％的PEG2000，至终浓度为0.3％；

(6)继续反应1小时或者过夜；

(7)将标记好的胶体金溶液于2000r/min，4℃离心10分钟，吸出上清，弃去沉淀，以去除大的聚合物；

(8)调整好离心机的转速为10000r/min，4℃离心30分钟，弃上清，将沉淀以原体积的0.01MPBSpH8.2(内含1％BSA)溶解，重复离心三次；

(9)最后一次小心弃去上清，沉淀溶于原体积的1/50PBS(内含1％BSA)中，即得免疫金。

检测线和对照线包被(将检测抗体包被在硝酸纤维素膜上)

(1)检测线划线：分别将抗-人可溶性ST2单克隆抗体装入喷膜机中(蛋白微量喷膜系统)，在硝酸纤维素膜上按1ul/cm的量划上；

(2)质控划线：羊抗鼠IgG抗体包被液装入喷膜机中(蛋白微量喷膜系统)，在硝酸纤维素膜上按1ul/cm的量划上；

(3)包被：37℃包被2小时；

(4)封闭：37℃封闭30分钟；

(5)干燥：将包被后的硝酸纤维素膜放入真空干燥器内干燥20小时，密闭保存待用。

结合垫制备

(1)开启点膜仪，预热30分钟，用蒸馏水做10个循环；

(2)调整免疫金的OD值为30，将免疫金加入机器左边的塑料容器内，设置程序，调整2#喷头喷量为2ul/cm，将免疫金喷涂在玻璃纤维结合垫上，喷线的位置在结合垫的中央；

(3)喷完结合垫后，置于37℃烘箱中干燥30分钟；

(4)干燥：将标记后玻璃纤维放入真空干燥器内干燥20小时，取出密闭保存待用。

检测卡制备

(1)在塑料底板的中央撕去覆于上面的胶带，贴上包被好抗体的硝酸纤维素膜；

(2)撕去塑料板中央下面的宽为5毫米的胶带，贴上喷上胶体金的结合垫，结合垫前端的硝酸纤维素膜重叠2毫米；

(3)撕去塑料板最下面宽为20毫米的胶带，贴上经过预处理的样品垫，样品垫的前端与结合垫重叠约5毫米；

(4)撕去塑料底板的最上端约为25毫米的胶带，贴上吸水纸，吸水纸与硝酸纤维素膜重叠约2毫米；

(5)组装完成后，将每一个配件都压实，检查粘贴结果，将组装好的大卡用切条机切成3毫米宽的试纸条；

(6)把切好的试纸条装在测试卡中，即得。

试剂盒的组装

将吸滴管、样品加样杯、一次性注射器、制备好的检测卡和使用说明书组装在一个盒子里，即得本发明的试剂盒。

实施例2临床试验研究

样本采集：于晨起7～10时对20例心力衰竭患者进行空腹抽前臂血，立即加入EDTA和/或肝素等抗凝剂，离心后取血清置于-20℃备检。

检测及结果：

将组装完成的检测试剂盒平放，用所配吸管吸取适量外周血，缓慢滴加4-5滴于检测盒的加样孔中(尽量滴加于加样孔中部，以保证测试结果准确)。在吸水材料的作用下，待检样品缓慢移动到检测区和质控区，膜反应体系启动。无论待检样本中有无人可溶性ST2，质控区处都应显现一条颜色条带，这是重要的判断标准，可以确定是否加入足够量的外周血，层析过程是否正常等，同时也可以作为判断检测盒是否合格的一个内在标准。

结果判定：

通过观察窗检测待检人可溶性ST2是否存在。

(1)在层析过程中，若待测的外周血样本中不含有人可溶性ST2或其浓度低于检测灵敏度时，即样本中没有特异性抗原与膜上的检测带内的单抗发生免疫反应，因而检测区内不会出现一条颜色检测带，表示阴性(-)结果，即仅在质控区内出现一条颜色带。

(2)若待检样本中人可溶性ST2的浓度高于检测阈值时，即样本中的人特异性ST2与固定在膜上的检测带内的单抗结合，因而检测区内会出现一条颜色检测带，表示阳性(+)结果，即在质控区内和检测区内内均出现一条颜色条带。(注意：由于待检样本中人可溶性ST2的浓度有所不同，因而测试区内的颜色条带可能出现颜色深浅的现象。但是，在一定时间内，不论测试区内的颜色条带颜色深浅，都可判定为阳性。)

(3)若检测区和质控区未出现颜色条带，则检测过程失败。可能的原因为操作过程不正确、试剂盒已变质损坏或出现质量问题。

14例心力衰竭确诊患者和6例健康实验人员随机采集外周血标本，盲检结果如下：

实验结果显示，本发明的试纸条具有较高的特异性和灵敏度，试纸条和ELISA盲检结果符合率达100％。

Claims (12)

1.一种快速定性/定量检测人心力衰竭标志物ST2的胶体金试剂盒，其特征在于：试剂盒组分为可快速检测人心力衰竭等心肌疾病的胶体金试纸条，所述条上包被有胶体金标记的抗可溶性ST2抗体结合片段；设有检测线和质控线，检测线上固定有抗可溶性ST2捕获抗体或抗原结合片段；质控线上固定有鼠IgG，所述试剂盒的结构包括所述肢体金试纸条和PVC底板，所述胶体金试纸条由样品垫、涂覆胶体金标记的抗-人可溶性ST2抗体的金标垫、在检测线和质控线上分别包被有抗-人可溶性ST2抗体和IgG的硝酸纤维素膜、吸水垫依次构成；在所述PVC底板的两端，分别设有样品垫和吸收垫；在该PVC底板中部设有硝酸纤维素膜，其中仅硝酸纤维素膜在PVC底板的中间部上，硝酸纤维素膜的右侧部分和左侧部分分别设置在金标垫和吸水垫之下；金标垫的左侧部分设置在样品垫之下，其右侧部分设置在硝酸纤维素膜之上；样品垫的右侧部分设置在金标垫之上；吸水垫的左侧部分设置在硝酸纤维素膜之上；在硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，在该检测线和质控线上分别包被有抗-人可溶性ST2抗体和IgG。

2.根据权利要求1所述的胶体金试剂盒，其包括：塑料衬垫、纤维素膜、金标垫、样本垫、吸收垫。

3.权利要求2的胶体金试剂盒，其特征在于，所述金标垫中所包含的颜色颗粒可以是一种胶体金颗粒、或者其他银、铁、磁性、燃料、乳胶、荧光颗粒。

4.根据权利1所述的胶体金试剂盒，其特征在于：试纸条上包被的胶体金标记的抗ST2抗体或抗原结合片段，以及检测线上固定的抗-人抗溶性ST2捕获抗体或抗原结合片段，是经过免疫非人类哺乳动物，重组从人类细胞分离到的人类可溶性ST2产生的。

5.根据权利1所述的胶体金试剂盒，其特征在于：质控线上固定的IgG为能够识别不同表位的单克隆抗体。

6.根据权利1所述的胶体金试剂盒，其特征在于：用于快速检测人心力衰竭标志物ST2的实验样本包括全血、血清或血浆，尤其是外用血。

7.根据权利要求4所述的胶体金试剂盒，其特征在于：，所述的抗体，可以是通过发酵法或免疫法制备的兔、鼠、羊或马的单克隆抗体或者或多克隆抗体。

8.根据权利要求6所述的胶体金试剂盒，其特征在于：当待测的外用血样本中不含有人可溶性ST2或其浓度低于检测灵敏度时，检测区内不会出现一条彩色检测带，而仅在质控区内出现一条彩色带，表示阴性(-)结果。

9.根据权利7所述的胶体金试剂盒，其特征在于：当待检样本中人可溶性ST2的浓度高于检测阔值时，检测区内会出现一条彩色检测带，同时在质控区内出现一条彩带，表示阳性(+)结果。

10.根据权利7所述的胶体金试剂盒，其特征在于：由于待检样本中人可溶性ST2的浓度有所不同，因而检测区内的彩色条带可能出现颜色深浅的现象。但是，在一定时间内，不论检测区内的彩色条带颜色深浅，都可判定为阳性。

11.根据权利7所述的胶体金试剂盒，其特征在于：当质控区未出现彩色条带，即使检测区出现彩色条带，也判检测结果无效。

12.根据权利1所述的胶体金试剂盒，其特征在于：本发明胶体金试纸条可以用于临床及科研中的检测选自人心力衰竭的心肌损伤性疾病，用以辅助指导治疗、预后判断和/或微量残留心肌坏死(MDR)的动态监测。