CN202814978U - 一种检测髓过氧化物酶的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供一种检测髓过氧化物酶的试剂盒，包括塑料盒体、衬垫、附着在衬垫上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层和吸收垫。衬垫的两端分别设有样品垫和吸收垫，衬垫中部设有硝酸纤维素膜检测层。检测层与样品垫交界处，设有包被金标记的抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体的金标垫，金标垫一端设置在样品垫之下，另一端设置在检测层之上。检测层上设有检测线和质控线，检测线包被有抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体，质控线包被有羊抗鼠IgG。本实用新型试剂盒灵敏度高、操作简捷、结果判断方便、检测样品范围广，用于辅助诊断或预后过敏性疾病、炎症性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的状态，具有良好的经济效益和社会效益。

Description

一种检测髓过氧化物酶的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，特别是涉及一种检测髓过氧化物酶同型或亚型的免疫快速检测试剂盒。 

背景技术

髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶，主要存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中。成熟的MPO由两个亚单位聚合而成，每个亚单位由一个59-64kDa的重链和一个14kDa的轻链构成，每个亚单位中含有一个共价结合的血红素，具有MPO特有的绿色光谱特性。MPO能催化过氧化氢与氯的反应产生次氯酸，具有很强的抗微生物作用，在机体产生和调节炎症反应方面发挥作用。然而，MPO催化反应生成过量的氧化剂时，会导致氧化应激和氧化性组织损伤。 

髓过氧化物酶的活性与人类多种疾病的发生、发展密切相关，神经炎症疾病方面包括：多发性硬化症，阿尔茨海默氏症，帕金森氏症和中风等。其他炎性疾病如：慢性阻塞性肺病，囊肿性纤维化，动脉粥样硬化，炎症性肠病，疾病，肾小球损伤和类风湿关节炎。肺癌也显示和MPO水平升高有关。此外，根据之前的研究显示，MPO水平和心血管疾病密切相关。然而，这些以往的研究都没有涉及MPO同型和/或亚型与特定的疾病状态存在具体相关。 

目前，用于检测MPO的方法有酶联免疫吸附法、光激化学发光检测法、流式细胞仪测定法、毛细管电泳法等，这些方法操作复杂、反应时间长，且均未涉及到对MPO同型或亚型的检测。因此，急需一种专门检测MPO同型或亚型的检测方法，用于鉴定过敏症、炎症、心血管疾病或自身免疫性疾病的状态。同时，本发明试剂盒操作时间短，结果客观可靠，操作简便、不需要配备复杂仪器设备，结果直观肉眼可判断。 

发明内容

本实用新型的目的在于提供一种特异性强，灵敏度高，操作简便、快速、高效、准确的检测髓过氧化物酶同型或亚型的免疫快速检测试剂盒，辅助诊断或预后过敏性疾病、炎症性疾病、心血管疾病或自身免疫性疾病的状态。 

本实用新型提供的检测髓过氧化物酶同型或亚型的免疫快速检测试剂盒，包括塑料盒体、衬垫、附着在衬垫上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层和吸收垫。衬垫的两端，分别设有样品垫和吸收垫；衬垫中部设有硝酸纤维素膜检测层。硝酸纤维素膜检测层与样品垫交界处，设有包被金标记的抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体的金标垫。金标垫一端部分设置在样品垫之下，另一端部分设置在硝酸纤维素膜检测层之上。在与样品垫延续的检测层上设有检测线T和质控线C，检测线上包被有抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体，质控线上包被有羊抗鼠IgG。 

所述金标垫设置在样品垫之下，与样品垫设有5mm的重叠区；所述金标垫设置在硝酸 纤维素膜检测层之上，与硝酸纤维素膜检测层设有2mm的重叠区，重叠区保证样品在样品垫、金标垫和检测层上无阻碍地流动。 

所述塑料盒体用于固定盒体内衬垫，盒体上设置加样区和检测观察区，用于滴加样品、观测检测结果。 

所述衬垫为PVC板，也可以代之以不吸水的硬质材料，用于固定盒内各组建。 

所述金标垫上抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体的金标记为胶体金颗粒，也可以代之以荧光颗粒、乳胶颗粒、磁性颗粒或其他有色颗粒。 

本实用新型试剂盒具有如下有益效果： 

(1)检测速度快。全过程只需10分钟，可以实现单个样品或大量样品的检测； 

(2)灵敏度高。最低检测单位为ng/ml； 

(3)特异性强。和其他心力衰竭标志物无交叉反应； 

(4)操作简捷。检测过程无需其他试剂，样品无需特殊处理，可肉眼观测也可结合仪器使用。 

(5)结果判断方便。快速检测试剂盒以肉眼可见的红色印记作为结果判断标准，即检测层上只有质控线(C线)显示红色，表示样品不含髓过氧化物酶同型或亚型，检测线(T线)和控制线(C线)上均显示红色，表示样品含有髓过氧化物酶同型或亚型。结果判断明确、直观。 

(6)检测样品范围广。全血、血浆、血清、细胞提取物或组织提取物均可用作试验样本，所需试剂和样品量少，样品量最低可至50-100μL。 

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图，其中1为样品垫、和吸收垫，2为金标垫、，3为硝酸纤维素膜检测层，4为检测线T，5为质控线C，6为吸收垫，7为衬垫。 

图2为本实用新型的检测结果判读示意图，图2.a为阳性结果，图2.b为阴性结果，图2.c结果无效，图2.d结果无效。其中8为观察区，9为加样区，10为塑料盒体，T为检测线，C为质控线。 

具体实施方式

以下结合附图和实施例详细描述本实用新型试剂盒的结构和使用方法。 

如图1显示的本实用新型试剂盒的结构示意图：衬垫7由PVC板制成，衬垫7的两端，分别设有样品垫1和吸收垫6，衬垫7中部设有硝酸纤维素膜检测层3。硝酸纤维素膜检测层3与样品垫1交界处，设有包被金标记的抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体的金标垫2，金标垫2一端部分设置在样品垫1之下，另一端部分设置在硝酸纤维素膜检测层3之上。在与样品垫1延续的检测层3上设有检测线T4和质控线C5，检测线4上包被有抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体，质控线5上包被有羊抗鼠IgG。金标垫2设置在样品垫1之下，与样品垫设有5mm的重叠区；金标垫2设置在硝酸纤维素膜检测层3之上，与硝酸纤维素膜检测层设有2mm 的重叠区。 

使用本实用新型试剂盒检测髓过氧化物酶同型或亚型实施例 

样本采集：于晨起7～10时对患者进行空腹抽前臂血，立即加入EDTA或肝素等抗凝剂，离心后取血清置于-20℃备检。 

检测方法： 

将试剂盒平放，取待测样品缓慢滴加4-5滴于试剂盒的加样区中(尽量滴加于加样区中部，以保证测试结果准确)，静置等待10分钟。在吸水材料的作用下，待检样品缓慢移动到检测区和质控区，膜反应体系启动。无论待检样本中有无髓过氧化物酶同型或亚型，质控区处都应显现一条颜色条带，这是重要的判断标准，可以确定是否加入足够量的样品，层析过程是否正常，同时也可以作为判断检测盒是否合格的一个内在标准。 

结果判定： 

1.若待检样品中髓过氧化物酶同型或亚型的浓度高于检测阈值时，即样品中的髓过氧化物酶同型或亚型与固定在膜上的检测区内的单抗结合，因而检测区内会出现一条红色检测带，表示阳性(+)结果，即在质控区内和检测区内内均出现一条颜色条带，如图2.a所示。(注意：由于待检样品中髓过氧化物酶同型或亚型的浓度有所不同，因而测试区内的颜色条带可能出现颜色深浅的现象。但是，在一定时间内，不论测试区内的颜色条带颜色深浅，都可判定为阳性。) 

2.在层析过程中，若待测的外周血样品中不含有髓过氧化物酶同型或亚型或其浓度低于检测灵敏度时，即样本中没有特异性抗原与膜上的检测带内的单抗发生免疫反应，因而检测区内不会出现一条颜色检测带，表示阴性(-)结果，即仅在质控区内出现一条颜色带，如图2.b所示。 

3.若质控区未出现颜色条带，则检测过程失败。可能的原因为操作过程不正确、试剂盒已变质损坏或出现质量问题，如图2.c和2.d所示。 

.取本实施例所述的试剂盒对10份急性冠状动脉综合症(ACS)患者血样和6份正常人血样随机采集外周血标本，盲检结果如下： 

病例	性别	年龄	诊断	盲检结果
					1	女	40	ACS	+
2	男	41	-	-
					3	男	54	ACS	+
4	男	37	ACS	+
					5	女	22	ACS	+
6	男	31	-	-
					7	男	33	ACS	+
8	男	39	ACS	+

[0032] 

9	女	10	-	-
					10	女	47	ACS	+
11	女	49	ACS	+
					12	男	28	-	-
13	女	42	ACS	+
					14	男	26	-	-
15	女	28	-	-
					16	男	33	ACS	+

实验结果显示，本实施例的试纸条具有较高的特异性和灵敏度。 

本实用新型试剂板的制备包括MPO亚型单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金结合物的制备、检测线和质控线的包被和金标垫的制备。 

1.制备MPO亚型单克隆抗体 

分别用纯化的MPO亚型蛋白免疫纯系小鼠，小鼠血清产生相应的抗体时，即可将小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合。利用HAT选择杂交瘤细胞，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测。对于检测抗体阳性的杂交瘤细胞应用有限稀释液进行克隆，同时保存阳性细胞株，利用BALB/c纯系小鼠制备大量的单克隆抗体，同时对抗体特异性的鉴定、识别抗原表位的鉴定、亲和力的鉴定及配对试验，筛选出效果最好的一对细胞株。将筛选到的细胞株重新植入小鼠腹腔中，过5-6天取出腹水，利用硫酸铵盐析及亲和层析纯化得到的单克隆抗体。 

2.胶体金的制备 

(1)用5毫升微量移液器取3毫升1％四氯金酸于500毫升的圆底烧瓶中，量取297毫升的超纯水亦加入烧瓶中，配制成0.01％的四氯金酸反应液，充分搅拌混匀； 

(2)连接上蛇形冷凝管，开启冷凝水，并置于磁力加热搅拌器上，加热煮沸； 

(3)放入搅拌子，剧烈搅拌，然后一次性快速准确地加入3毫升柠檬酸铵溶液； 

(4)金黄色的氯金酸水溶液首先变成灰色，约2分钟后变成紫红色，继续煮沸5分钟； 

(5)关闭磁力加热搅拌器，待胶体金冷却后，分装于500毫升的玻璃试剂瓶中，外面覆上铝箔，按规定贴上标签。 

制备的胶体金应呈现透亮的紫红色，没有聚合物及肉眼可见的沉淀；取适量于530纳米波长处测定，紫外吸收值在1.1-1.3之间。 

3.制备胶体金结合物 

(1)根据备用标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量，每毫升胶体金标记12微克/抗体，标记的抗体量为3.6毫克； 

(2)用0.1M的碳酸钾或0.1M盐酸调节胶体金的pH值为7.8； 

(3)在电磁搅拌器下，将抗体蛋白质溶液加入胶体金溶液中，加入蛋白质时应逐滴加入，1毫克蛋白质大约5分钟加完； 

(4)抗体和胶体金反应5分钟后，在磁力搅拌器下加入5％的牛血清蛋白(BSA)，使其终浓度为1％； 

(5)10分钟后，加入3％的PEG2000，至终浓度为0.3％； 

(6)继续反应1小时或者过夜； 

(7)将标记好的胶体金溶液于2000r/min，4℃离心10分钟，吸出上清，弃去沉淀，以去除大的聚合物； 

(8)调整好离心机的转速为10000r/min，4℃离心30分钟，弃上清，将沉淀以原体积的0.01M PBS pH8.2(内含1％BSA)溶解，重复离心三次； 

(9)最后一次弃去上清，沉淀溶于原体积的1/50PBS(内含1％BSA)中，即得免疫金。 

4.检测线和质控线包被(将检测抗体包被在硝酸纤维素膜上) 

(1)检测线划线：分别将MPO亚型单克隆抗体装入喷膜机中(蛋白微量喷膜系统)，在硝酸纤维素膜上按1ul/cm的量划上； 

(2)质控划线：羊抗鼠IgG抗体包被液装入喷膜机中(蛋白微量喷膜系统)，在硝酸纤维素膜上按1ul/cm的量划上； 

(3)包被：37℃包被2小时； 

(4)封闭：37℃封闭30分钟； 

(5)干燥：将包被后的硝酸纤维素膜放入真空干燥器内干燥20小时，密闭保存待用。 

5.金标垫制备 

(1)开启点膜仪，预热30分钟，用蒸馏水做10个循环； 

(2)调整免疫金的OD值为30，将免疫金加入机器左边的塑料容器内，设置程序，调整2#喷头喷量为2ul/cm，将免疫金喷涂在玻璃纤维结合垫上，喷线的位置在金标垫的中央； 

(3)喷完金标垫后，置于37℃烘箱中干燥30分钟； 

(4)干燥：将标记后玻璃纤维放入真空干燥器内干燥20小时，取出密闭保存待用。 

6.试剂盒制备 

(1)在塑料底板的中央撕去覆于上面的胶带，贴上包被好抗体的硝酸纤维素膜； 

(2)撕去塑料板中央下面的宽为5毫米的胶带，贴上喷上胶体金的结合垫，结合垫前端的硝酸纤维素膜重叠2毫米； 

(3)撕去塑料板最下面宽为20毫米的胶带，贴上经过预处理的样品垫，样品垫的前端与结合垫重叠约5毫米； 

(4)撕去塑料底板的最上端约为25毫米的胶带，贴上吸水纸，吸水纸与硝酸纤维素膜重叠约2毫米； 

(5)组装完成后，将每一个配件都压实，检查粘贴结果，将组装好的大卡用切条机切成3毫米宽的试纸条； 

(6)把切好的试纸条装在测试盒中，即得。 

Claims (5)

1.一种检测髓过氧化物酶的试剂盒，包括塑料盒体、衬垫、附着在衬垫上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层和吸收垫，其特征在于：衬垫的两端，分别设有样品垫和吸收垫，衬垫中部设有硝酸纤维素膜检测层，硝酸纤维素膜检测层与样品垫交界处，设有包被金标记的抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体的金标垫，金标垫一端部分设置在样品垫之下，另一端部分设置在硝酸纤维素膜检测层之上，在与样品垫延续的检测层上设有检测线T和质控线C，检测线上包被有抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体，质控线上包被有羊抗鼠IgG。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述金标垫设置在样品垫之下，与样品垫设有5mm的重叠区；所述金标垫设置在硝酸纤维素膜检测层之上，与硝酸纤维素膜检测层设有2mm的重叠区。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述塑料盒体上设置加样区和观察区。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述衬垫为PVC板，也可以代之以不吸水的硬质材料。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述金标垫上抗髓过氧化物酶同型或亚型抗体的金标记为胶体金颗粒，也可以代之以荧光颗粒、乳胶颗粒、磁性颗粒或其他有色颗粒。

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