CN109459572A - 一种原发性膜性肾病诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种原发性膜性肾病诊断试剂盒，属于生物诊断技术领域。本发明提供了一种原发性膜性肾病诊断试剂盒及其制备方法、检测方法与应用，运用此含标记Pla2r抗原的试剂盒对人体血液样本进行检测，可以获得截断值(加解构剂的样品检测信号值与不加解构剂的样品检测信号值之间的比值)，此截断值可以辅助评估IMN患者的病情及监测治疗效果，为下一步准确治疗提供了有力依据，适于大规模推广应用。

Description

一种原发性膜性肾病诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种原发性膜性肾病诊断试剂盒，属于生物诊断技术领域。

背景技术

原发性膜性肾病(IMN)为最常见的肾病类型，约占整个肾病的15～20％；相对于其他的肾病，IMN的预后较差，接近50％的IMN最终发展为肾衰竭，且对于已经明确为IMN的患者，目前尚无有效的治疗措施；若能够在IMN症状尚未出现时，尽早地发现IMN发病风险，并及时采取预防措施，将显著降低IMN的发病率以及IMN的预后较差的情况。

现有的IMN诊断手段，主要依赖于肾脏穿刺后的病理诊断；而对于IMN的预后与治疗效果评估，则依赖于非特异的蛋白尿进行肾脏功能的评估；最为严重的是，目前临床上亟需合适的IMN预后评估产品。

自2009年Beck等发现磷脂酶a2受体(Pla2r)是IMN特异性的标志物以后，IMN的诊治进展迅猛，是近年来，肾病诊疗领域的热点之一。

Pla2r对于IMN的管理有三大作用：

(一)早发现：IMN属于自身免疫性疾病，即患者产生了针对自身肾小球细胞的免疫攻击，造成肾损伤；在临床症状出现之前，患者血清中已经出现了高浓度的Pla2r；通过及时的Pla2r抗体检测，发现阳性的患者，采用免疫阻断的方式，可显著降低IMN的发病率，或有限改善IMN发病后的预后情况。

(二)病情监测：对于确诊的IMN患者，其血清中Pla2r抗体浓度与病情的反复有高度的一致性。

(三)无创检测：传统的诊断技术，需依赖肾脏穿刺，因此无法用于高危人群的筛查；血清Pla2r抗体浓度变化，可以通过简单的抽血检验完成，这大幅提高了IMN患者的管理效率。

现有的原发性膜性肾病的检测方法，仅能适用于诊断与筛查，对病情预后，尤其是治疗效果的预测，无法进行判读。

为了解决存在的上述问题，急需提供一种针对病情预后和治疗效果能够作出预测、成本低、操作简便的诊断试剂盒。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种原发性膜性肾病诊断试剂盒，包括：

(1)用标记物标记的磷脂酶a2受体蛋白；

(2)固定有磷脂酶a2受体蛋白的检测载体；

(3)解构剂；所述解构剂包括尿素、盐酸胍、十二烷基苯磺酸钠、硫酸铵、乙二胺、乙二胺四乙酸钠或氯化钠。

在本发明的一种实施方式中，所述解构剂包括5～11mol/L的尿素溶液、0.5～1.5％的十二烷基苯磺酸钠溶液、1～6mol/L的盐酸胍溶液或3～8％的氯化钠溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述的检测载体为生物载片、酶标板、层析膜、渗滤膜、蛋白质印迹膜、胶乳微球或磁性微球。

在本发明的一种实施方式中，所述的标记物为生物酶如HRP、具有荧光化合物如荧光蛋白或金属的标记物或具有化学发光化合物如三联吡啶钌化合物的标记物。

在本发明的一种实施方式中，所述的磷脂酶a2受体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，试剂盒还包括稀释液、包被缓冲液、封闭液、洗涤液、固定液、显色液和/或终止液。

本发明的第二个目的是提供上述试剂盒的检测方法，将含磷脂酶a2受体蛋白特异性抗体的样品与用标记物标记的磷脂酶a2受体蛋白结合，检测在样品中加入解构剂前后的检测信号。

在本发明的一种实施方式中，样品与解构剂的体积比为1:(0.1～10)。

在本发明的一种实施方式中，样品与解构剂的体积比为1:1。

在本发明的一种实施方式中，所述检测信号包括荧光强度或吸光度值。

本发明的第三个目的是提供上述的试剂盒在制备膜性肾病诊断或预后评估设备中的应用。

本发明提供了一种原发性膜性肾病诊断试剂盒及其制备方法、检测方法与应用，运用此含标记Pla2r抗原的试剂盒人体血液样本进行检测，可以获得截断值(加解构剂的样品检测信号值与不加解构剂的样品检测信号值之间的比值)，此截断值可以辅助评估IMN患者的病情及监测治疗效果，为下一步准确治疗提供了有力依据，适于大规模推广应用。

具体实施方式

为了能够更清楚地阐述本发明专利的技术内容，特举以下实施例详细说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1解构剂配制

解构剂的配方，可选择以下任意一种：

(1)8mol/L的尿素溶液；

(2)1％的十二烷基苯磺酸钠溶液；

(3)4mol/L的盐酸胍溶液；

(4)6％的氯化钠溶液。

实施例2原发性膜性肾病检测试纸条

一、荧光微球标记

清洗：取荧光微球(Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(pH 5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂EDC、NHS和荧光微球按照质量比为2:1:2进行活化，具体操作如下：称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。

标记：将活化后的胶乳重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速分别加入单链链霉亲和素(盘古基因，货号：MSA-01005)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。

封闭：取上述标记好的微球于13000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后13000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。检测内容、质量标准和检测方法见表1。

表1检测内容、质量标准和检测方法

检测内容	质量标准	检测方法
			包被量	包被量≥40μg单链链霉亲和素/mg微球	BCA蛋白浓度测定法

往标记好的微球溶液中加入生物素化的重组Pla2r蛋白，比例为15μg/mg单链链霉亲和素标记微球。

清洗、重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机13000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬，即为荧光标记Pla2r抗原溶液。

二、结合垫的喷点

荧光标记Pla2r抗原溶液稀释：用荧光标记Pla2r抗原重悬液将上述制备的荧光标记Pla2r抗原结合物稀释4倍；设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为8μL/cm；1号管道为喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于荧光标记Pla2r抗原重悬溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将结合垫按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的结合垫，喷点的荧光标记Pla2r抗原条带均匀、连续和贯通整个结合垫的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片结合垫，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的结合垫置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。

三、硝酸纤维素膜的制备

用于膜性肾病检测的硝酸纤维素膜制备方法如下：取Pla2r抗原500μg，加到5mL刻度离心管中，抗体稀释液至1mL，容器标记T标志。取鼠抗人Pla2r单克隆抗体25μL，加到5mL刻度离心管中，抗体稀释液至1mL，容器标记C标志。设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为1μL/cm；1号管道为检测带喷点通道，2号管道为对照带喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于检测带溶液中，将2号管道置于对照带溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将硝酸纤维素膜按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的硝酸纤维素膜，检测带和对照带为两条均匀、连续和贯通整个硝酸纤维素膜的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片硝酸纤维素膜，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的硝酸纤维素膜置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。

四、贴膜、切膜

将底板上较宽部分的保护纸除去，沿上面保护纸的下边缘，将划好线的硝酸纤维素膜，以C线在上方的方式贴到底板板上；将结合垫贴在T线下方，与NC膜少许接触；将样品垫贴在结合垫下方，与结合垫少许接触；接着除去上方保护纸，将吸水纸贴在NC膜的上方，与NC膜少许接触；将保护纸及指示带纸逐一贴在组装好的试纸条外面，组装成大卡。

接通切割机电源，设定切膜程序，设定切割宽度为4mm；将大卡合格品平放入切割机平台轨道中，正面朝上，按操作面板上“GO”键，开始切割；每放一片大卡合格品，按操作面板上“GO”键一次，直至切割完所有大卡合格品；切割完成后，即为原发性膜性肾病检测试纸条。

五、试剂盒组装

将上述的试纸条装入卡盒中，形成检测卡A，以同样的方式制备检测卡B。

取铝箔袋和干燥剂；打开热封机，预热；将待装袋的检测卡、1袋干燥剂装入铝箔袋中；按照规定的长度切断装有检测卡和干燥剂的铝箔袋；用热封机封好铝箔袋；贴上标签。

六、临床样本验证

将上述的检测卡，用临床样本进行验证。

将同一待测样品分别滴加到检测卡A与检测卡B的加样孔中，其中A的样品孔再滴加与样品等体积的解构剂，然后置于荧光检测仪中进行读数。

不加解构剂时，抗原抗体结合，荧光信号会变强；加了解构剂之后，结合力不强的荧光标记抗原和抗体解构，荧光信号值变弱。

计算A与B的荧光强度比值A/B(即截断值)。观察截断值与IMN病情的相关性。

结果表明，截断值越高，病情越重，对治疗措施响应较差；截断值越低，病情越轻，对治疗措施响应较好。

分别测定两组患者的截断值，检测结果与病理确诊结果如表2和表3。

表2截断值与医生判断为预后较差的例数

表3截断值与治疗后判断为有效的例数

上述实施例结果表明本发明的IMN特异性自身抗体的亲和力检测，能够对IMN的病情评估，治疗效果评价做出准确判断，满足临床应用。

实施例3原发性膜性肾病检测微孔板

一、HRP标记磷脂酶a2受体蛋白

将0.1mL HRP标记链霉亲和素(碧云天，货号：A0303，规格：0.2mL/瓶)中加入5μg生物素化的重组Pla2r蛋白，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用0.5小时，即为HRP标记的Pla2r抗原。

HRP标记Pla2r抗原结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融。

二、包被

采用0.01M，pH 10的CBS(碳酸盐缓冲液)将Pla2r抗原稀释至1μg/mL；取96孔微孔板，每孔加入100μL上述包被蛋白；37℃温育1h；甩掉包被液，加入200μL的封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白，pH 7.4)，37℃温育1h，甩掉封闭液；于室温自然干燥12h，放入干燥剂，封入铝箔袋，2-8℃备用。

三、ELISA试剂盒组装

将HRP标记抗原与包被板组装成原发性膜性肾病检测的微孔板，即酶标板。

四、临床样本验证

将上述的微孔板，用临床样本进行验证。

将同一待测样品分别滴加到微孔A与微孔B中，其中A中再滴加与样品等体积的解构剂，加HRP底物TMB溶液和终止液，然后置于酶标仪中检测在450nm处的吸光度值。

不加解构剂时，抗原抗体结合，吸光度值变大；加了解构剂之后，结合力不强的酶标记抗原和抗体解构，吸光度值变小。

计算A与B的吸光度值的比值A/B(即截断值)，观察截断值与IMN病情的相关性。

结果表明，截断值越高，病情越重，对治疗措施响应较差；截断值越低，病情越轻，对治疗措施响应较好。

分别测定两组患者的截断值，检测结果与病理确诊结果如表4和表5。

表4截断值与医生判断为预后较差的例数

表5截断值与治疗后判断为有效的例数

上述实施例结果表明本发明的IMN特异性自身抗体的亲和力检测，能够对IMN的病情评估，治疗效果评价做出准确判断，满足临床应用。

因此，本发明可以通过免疫学方法，提供原发性膜性肾病的病情评估与治疗效果评价，医护人员及患者可以根据检测结果，选择针对性更强的治疗方案。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种原发性膜性肾病诊断试剂盒

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1463

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Leu Leu Ser Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Arg Gly Cys Ala Glu Gly Val Ala Ala Ala Leu Thr Pro Glu Arg Leu

20 25 30

Leu Glu Trp Gln Asp Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu Ser Leu

35 40 45

Lys Lys Cys Ile Gln Ala Gly Lys Ser Val Leu Thr Leu Glu Asn Cys

50 55 60

Lys Gln Ala Asn Lys His Met Leu Trp Lys Trp Val Ser Asn His Gly

65 70 75 80

Leu Phe Asn Ile Gly Gly Ser Gly Cys Leu Gly Leu Asn Phe Ser Ala

85 90 95

Pro Glu Gln Pro Leu Ser Leu Tyr Glu Cys Asp Ser Thr Leu Val Ser

100 105 110

Leu Arg Trp Arg Cys Asn Arg Lys Met Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr

115 120 125

Ser Val Gln Val Ala His Asp Asn Thr Val Val Ala Ser Arg Lys Tyr

130 135 140

Ile His Lys Trp Ile Ser Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ile Cys Glu

145 150 155 160

Tyr Leu His Lys Asp Leu His Thr Ile Lys Gly Asn Thr His Gly Met

165 170 175

Pro Cys Met Phe Pro Phe Gln Tyr Asn His Gln Trp His His Glu Cys

180 185 190

Thr Arg Glu Gly Arg Glu Asp Asp Leu Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser

195 200 205

Arg Tyr Glu Arg Asp Glu Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Pro Thr Ser

210 215 220

Ala Glu Val Gly Cys Asp Thr Ile Trp Glu Lys Asp Leu Asn Ser His

225 230 235 240

Ile Cys Tyr Gln Phe Asn Leu Leu Ser Ser Leu Ser Trp Ser Glu Ala

245 250 255

His Ser Ser Cys Gln Met Gln Gly Gly Thr Leu Leu Ser Ile Thr Asp

260 265 270

Glu Thr Glu Glu Asn Phe Ile Arg Glu His Met Ser Ser Lys Thr Val

275 280 285

Glu Val Trp Met Gly Leu Asn Gln Leu Asp Glu His Ala Gly Trp Gln

290 295 300

Trp Ser Asp Gly Thr Pro Leu Asn Tyr Leu Asn Trp Ser Pro Glu Val

305 310 315 320

Asn Phe Glu Pro Phe Val Glu Asp His Cys Gly Thr Phe Ser Ser Phe

325 330 335

Met Pro Ser Ala Trp Arg Ser Arg Asp Cys Glu Ser Thr Leu Pro Tyr

340 345 350

Ile Cys Lys Lys Tyr Leu Asn His Ile Asp His Glu Ile Val Glu Lys

355 360 365

Asp Ala Trp Lys Tyr Tyr Ala Thr His Cys Glu Pro Gly Trp Asn Pro

370 375 380

Tyr Asn Arg Asn Cys Tyr Lys Leu Gln Lys Glu Glu Lys Thr Trp His

385 390 395 400

Glu Ala Leu Arg Ser Cys Gln Ala Asp Asn Ser Ala Leu Ile Asp Ile

405 410 415

Thr Ser Leu Ala Glu Val Glu Phe Leu Val Thr Leu Leu Gly Asp Glu

420 425 430

Asn Ala Ser Glu Thr Trp Ile Gly Leu Ser Ser Asn Lys Ile Pro Val

435 440 445

Ser Phe Glu Trp Ser Asn Asp Ser Ser Val Ile Phe Thr Asn Trp His

450 455 460

Thr Leu Glu Pro His Ile Phe Pro Asn Arg Ser Gln Leu Cys Val Ser

465 470 475 480

Ala Glu Gln Ser Glu Gly His Trp Lys Val Lys Asn Cys Glu Glu Arg

485 490 495

Leu Phe Tyr Ile Cys Lys Lys Ala Gly His Val Leu Ser Asp Ala Glu

500 505 510

Ser Gly Cys Gln Glu Gly Trp Glu Arg His Gly Gly Phe Cys Tyr Lys

515 520 525

Ile Asp Thr Val Leu Arg Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ser Gly Tyr Tyr

530 535 540

Cys Pro Pro Ala Leu Val Thr Ile Thr Asn Arg Phe Glu Gln Ala Phe

545 550 555 560

Ile Thr Ser Leu Ile Ser Ser Val Val Lys Met Lys Asp Ser Tyr Phe

565 570 575

Trp Ile Ala Leu Gln Asp Gln Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys

580 585 590

Pro Val Gly Gln Lys Pro Glu Pro Val Gln Tyr Thr His Trp Asn Thr

595 600 605

His Gln Pro Arg Tyr Ser Gly Gly Cys Val Ala Met Arg Gly Arg His

610 615 620

Pro Leu Gly Arg Trp Glu Val Lys His Cys Arg His Phe Lys Ala Met

625 630 635 640

Ser Leu Cys Lys Gln Pro Val Glu Asn Gln Glu Lys Ala Glu Tyr Glu

645 650 655

Glu Arg Trp Pro Phe His Pro Cys Tyr Leu Asp Trp Glu Ser Glu Pro

660 665 670

Gly Leu Ala Ser Cys Phe Lys Val Phe His Ser Glu Lys Val Leu Met

675 680 685

Lys Arg Thr Trp Arg Glu Ala Glu Ala Phe Cys Glu Glu Phe Gly Ala

690 695 700

His Leu Ala Ser Phe Ala His Ile Glu Glu Glu Asn Phe Val Asn Glu

705 710 715 720

Leu Leu His Ser Lys Phe Asn Trp Thr Glu Glu Arg Gln Phe Trp Ile

725 730 735

Gly Phe Asn Lys Arg Asn Pro Leu Asn Ala Gly Ser Trp Glu Trp Ser

740 745 750

Asp Arg Thr Pro Val Val Ser Ser Phe Leu Asp Asn Thr Tyr Phe Gly

755 760 765

Glu Asp Ala Arg Asn Cys Ala Val Tyr Lys Ala Asn Lys Thr Leu Leu

770 775 780

Pro Leu His Cys Gly Ser Lys Arg Glu Trp Ile Cys Lys Ile Pro Arg

785 790 795 800

Asp Val Lys Pro Lys Ile Pro Phe Trp Tyr Gln Tyr Asp Val Pro Trp

805 810 815

Leu Phe Tyr Gln Asp Ala Glu Tyr Leu Phe His Thr Phe Ala Ser Glu

820 825 830

Trp Leu Asn Phe Glu Phe Val Cys Ser Trp Leu His Ser Asp Leu Leu

835 840 845

Thr Ile His Ser Ala His Glu Gln Glu Phe Ile His Ser Lys Ile Lys

850 855 860

Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Trp Ile Gly Leu Gln Glu Glu

865 870 875 880

Arg Ala Asn Asp Glu Phe Arg Trp Arg Asp Gly Thr Pro Val Ile Tyr

885 890 895

Gln Asn Trp Asp Thr Gly Arg Glu Arg Thr Val Asn Asn Gln Ser Gln

900 905 910

Arg Cys Gly Phe Ile Ser Ser Ile Thr Gly Leu Trp Gly Ser Glu Glu

915 920 925

Cys Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Cys Lys Arg Lys Lys Val Trp Leu

930 935 940

Ile Glu Lys Lys Lys Asp Thr Pro Lys Gln His Gly Thr Cys Pro Lys

945 950 955 960

Gly Trp Leu Tyr Phe Asn Tyr Lys Cys Leu Leu Leu Asn Ile Pro Lys

965 970 975

Asp Pro Ser Ser Trp Lys Asn Trp Thr His Ala Gln His Phe Cys Ala

980 985 990

Glu Glu Gly Gly Thr Leu Val Ala Ile Glu Ser Glu Val Glu Gln Ala

995 1000 1005

Phe Ile Thr Met Asn Leu Phe Gly Gln Thr Thr Ser Val Trp Ile

1010 1015 1020

Gly Leu Gln Asn Asp Asp Tyr Glu Thr Trp Leu Asn Gly Lys Pro

1025 1030 1035

Val Val Tyr Ser Asn Trp Ser Pro Phe Asp Ile Ile Asn Ile Pro

1040 1045 1050

Ser His Asn Thr Thr Glu Val Gln Lys His Ile Pro Leu Cys Ala

1055 1060 1065

Leu Leu Ser Ser Asn Pro Asn Phe His Phe Thr Gly Lys Trp Tyr

1070 1075 1080

Phe Glu Asp Cys Gly Lys Glu Gly Tyr Gly Phe Val Cys Glu Lys

1085 1090 1095

Met Gln Asp Thr Ser Gly His Gly Val Asn Thr Ser Asp Met Tyr

1100 1105 1110

Pro Met Pro Asn Thr Leu Glu Tyr Gly Asn Arg Thr Tyr Lys Ile

1115 1120 1125

Ile Asn Ala Asn Met Thr Trp Tyr Ala Ala Ile Lys Thr Cys Leu

1130 1135 1140

Met His Lys Ala Gln Leu Val Ser Ile Thr Asp Gln Tyr His Gln

1145 1150 1155

Ser Phe Leu Thr Val Val Leu Asn Arg Leu Gly Tyr Ala His Trp

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Ile Gly Leu Phe Thr Thr Asp Asn Gly Leu Asn Phe Asp Trp Ser

1175 1180 1185

Asp Gly Thr Lys Ser Ser Phe Thr Phe Trp Lys Asp Glu Glu Ser

1190 1195 1200

Ser Leu Leu Gly Asp Cys Val Phe Ala Asp Ser Asn Gly Arg Trp

1205 1210 1215

His Ser Thr Ala Cys Glu Ser Phe Leu Gln Gly Ala Ile Cys His

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Val Pro Pro Glu Thr Arg Gln Ser Glu His Pro Glu Leu Cys Ser

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Glu Thr Ser Ile Pro Trp Ile Lys Phe Lys Ser Asn Cys Tyr Ser

1250 1255 1260

Phe Ser Thr Val Leu Asp Ser Met Ser Phe Glu Ala Ala His Glu

1265 1270 1275

Phe Cys Lys Lys Glu Gly Ser Asn Leu Leu Thr Ile Lys Asp Glu

1280 1285 1290

Ala Glu Asn Ala Phe Leu Leu Glu Glu Leu Phe Ala Phe Gly Ser

1295 1300 1305

Ser Val Gln Met Val Trp Leu Asn Ala Gln Phe Asp Gly Asn Asn

1310 1315 1320

Glu Thr Ile Lys Trp Phe Asp Gly Thr Pro Thr Asp Gln Ser Asn

1325 1330 1335

Trp Gly Ile Arg Lys Pro Asp Thr Asp Tyr Phe Lys Pro His His

1340 1345 1350

Cys Val Ala Leu Arg Ile Pro Glu Gly Leu Trp Gln Leu Ser Pro

1355 1360 1365

Cys Gln Glu Lys Lys Gly Phe Ile Cys Lys Met Glu Ala Asp Ile

1370 1375 1380

His Thr Ala Glu Ala Leu Pro Glu Lys Gly Pro Ser His Ser Ile

1385 1390 1395

Ile Pro Leu Ala Val Val Leu Thr Leu Ile Val Ile Val Ala Ile

1400 1405 1410

Cys Thr Leu Ser Phe Cys Ile Tyr Lys His Asn Gly Gly Phe Phe

1415 1420 1425

Arg Arg Leu Ala Gly Phe Arg Asn Pro Tyr Tyr Pro Ala Thr Asn

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Phe Ser Thr Val Tyr Leu Glu Glu Asn Ile Leu Ile Ser Asp Leu

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Glu Lys Ser Asp Gln

1460

<210> 2

<211> 4389

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgctgctgt cgccgtcgct gctgctgctg ctgctgctgg gggcgccgcg gggctgcgcc 60

gagggtgtgg cggcggcgct tacccccgag cggctcctgg agtggcagga taaaggaata 120

tttgttatcc aaagtgagag tctcaagaaa tgcattcaag caggtaaatc ggttctgacc 180

ctggagaact gcaagcaagc aaacaagcac atgctgtgga aatgggtttc aaaccatggc 240

ctctttaaca taggaggcag tggttgcctg ggcctgaatt tctccgcccc agagcagcca 300

ttaagcttat atgaatgtga ctccaccctc gtttccttac ggtggcgctg taacaggaag 360

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tcacggaagt atattcataa gtggatttct tatgggtcag gtggtggaga catttgtgaa 480

tatctacaca aagatttgca tacaatcaaa gggaacaccc acgggatgcc gtgtatgttt 540

cccttccagt ataaccatca gtggcatcat gaatgtaccc gtgaaggtcg ggaagatgac 600

ttactgtggt gtgccacgac aagccgttat gaaagagatg aaaagtgggg attttgccct 660

gatcccacct ctgcagaagt aggttgtgat actatttggg agaaggacct caattcacac 720

atttgctacc agttcaacct gctttcatct ctctcttgga gtgaggcaca ttcttcatgc 780

cagatgcaag gaggtacgct gttaagtatt acagatgaaa ctgaagaaaa tttcataagg 840

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aattttgagc catttgttga agatcactgt ggaacattta gttcatttat gccaagtgcc 1020

tggaggagtc gggattgtga gtccaccttg ccatatatat gtaaaaaata tctaaaccac 1080

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gaggctctgc gttcttgtca ggctgataac agtgcattaa tagacataac ctcattagca 1260

gaggtggagt ttcttgtaac cctccttgga gatgaaaatg catcagaaac atggattggt 1320

ttgagcagca ataaaattcc agtttccttt gaatggtcta atgactcttc agtcatcttt 1380

actaattggc acacacttga gccccacatt tttccaaata gaagccagct gtgtgtctca 1440

gcagagcagt ctgagggaca ctggaaagtc aaaaattgtg aagaaagact tttttacatt 1500

tgtaaaaaag caggccatgt cctctctgat gctgaatcag gatgtcaaga gggatgggag 1560

agacatggtg gattctgtta caaaattgac acagtccttc gaagctttga ccaagcttcc 1620

agcggttatt actgtcctcc tgcacttgta accattacaa acaggtttga acaggctttt 1680

attaccagtt tgatcagtag tgtggtaaaa atgaaggaca gttatttttg gatagctctt 1740

caggaccaaa atgatacggg agaatacact tggaagccag tagggcagaa acccgagccg 1800

gtgcagtaca cacactggaa cacacaccag ccgcgctaca gtggtggctg tgttgccatg 1860

cgaggaaggc atccacttgg tcgctgggaa gtgaagcact gtcggcactt taaggcaatg 1920

tccttgtgca agcagccagt tgaaaatcag gaaaaagcag agtatgaaga gagatggccc 1980

tttcacccct gctatttgga ctgggagtca gagcctggtc tggccagttg cttcaaggta 2040

tttcatagtg aaaaagttct gatgaaaaga acatggagag aagctgaagc attttgcgaa 2100

gaatttggag ctcatcttgc aagctttgcc catattgagg aagagaattt tgtgaatgag 2160

ctcttacatt caaaatttaa ttggacagaa gaaaggcagt tctggattgg atttaataaa 2220

agaaacccac tgaatgccgg ctcatgggag tggtctgata gaactcctgt tgtctcttcg 2280

tttttagaca acacttattt tggagaagat gcaagaaact gtgctgttta taaggcaaac 2340

aaaacattgc tgcccttaca ctgtggttcc aaacgtgaat ggatatgcaa aatcccaaga 2400

gatgtgaaac ccaagattcc gttctggtac cagtacgatg taccctggct cttttatcag 2460

gatgcagaat acctttttca tacctttgcc tcagaatggt tgaactttga gtttgtctgt 2520

agctggctgc acagtgatct tctcacaatt cattctgcac atgagcaaga attcatccac 2580

agcaaaataa aagcgctatc aaagtatggt gcaagttggt ggattggact tcaagaagaa 2640

agagccaatg atgaatttcg ctggagagat ggaacaccag tgatatacca gaactgggac 2700

acaggaagag aaagaactgt gaataatcag agccagagat gtggctttat ttcttctata 2760

acaggactct ggggtagtga agagtgttca gtttctatgc ctagtatctg taagcgaaaa 2820

aaggtttggc tcatagagaa aaagaaagat acaccaaaac aacatggaac gtgtcccaaa 2880

ggatggctat attttaacta taagtgcctt ctgctgaata tccccaaaga cccaagcagt 2940

tggaagaact ggacgcatgc tcaacatttc tgtgctgaag aaggggggac cctggtcgcc 3000

attgaaagtg aggtggagca agctttcatt actatgaatc tttttggcca gaccaccagt 3060

gtgtggatag gtttacaaaa tgatgattat gaaacatggc taaatggaaa gcctgtggta 3120

tattctaact ggtctccatt tgatataata aatattccaa gtcacaatac cactgaagtt 3180

cagaaacaca ttcctctctg tgccttactc tcaagtaatc ctaattttca tttcactgga 3240

aaatggtatt ttgaagactg tggaaaggaa ggctatgggt ttgtttgtga aaaaatgcaa 3300

gatacttctg gacacggtgt aaatacatct gatatgtatc caatgcccaa taccttagaa 3360

tatggaaaca gaacttacaa aataattaat gcaaatatga cttggtatgc agcaataaaa 3420

acctgcctga tgcacaaagc acaactggtc agcatcacag accagtatca ccagtccttc 3480

ctcactgttg tcctcaaccg gctaggatat gcccactgga ttggactgtt caccacagat 3540

aatggtctta attttgactg gtctgatggc accaaatctt ctttcacttt ttggaaagat 3600

gaggagtcct ccctccttgg tgactgcgtt tttgccgaca gcaacggacg ctggcatagc 3660

acagcctgcg agtcatttct gcaaggtgcc atttgtcatg tgccacctga aacaagacaa 3720

tctgaacacc cagagttgtg ctcagaaaca tctattccct ggataaaatt taaaagtaat 3780

tgctacagtt tttctacagt cctagacagt atgagttttg aggctgctca tgaattttgc 3840

aaaaaggaag gttctaatct tttaacaatc aaggatgagg ctgaaaatgc atttctccta 3900

gaagagctgt ttgcttttgg ttcttctgtc cagatggttt ggttgaatgc tcaatttgat 3960

ggtaacaatg aaaccataaa gtggtttgat ggaactccca cagaccagtc aaactggggc 4020

attcggaagc cagacacaga ctacttcaag ccccatcatt gtgttgcctt gaggatccct 4080

gaaggattat ggcagctatc cccgtgtcaa gaaaaaaaag gctttatatg taaaatggag 4140

gcagatattc acactgcaga ggcgctgcca gaaaaaggac caagtcacag catcattcct 4200

cttgcggttg tactgacact gatagtcatt gtggccattt gcacactttc cttctgcata 4260

tacaagcata acggtggctt cttcaggaga cttgcagggt ttcggaatcc ttactatcct 4320

gcaaccaact ttagtacagt atatttagaa gaaaatattc tcatttctga tcttgagaag 4380

agtgaccaa 4389

Claims (10)

1.一种原发性膜性肾病诊断试剂盒，其特征在于，包括：

(1)用标记物标记的磷脂酶a2受体蛋白；

(2)含有或固定有磷脂酶a2受体蛋白的检测载体；

(3)解构剂；所述解构剂包括尿素、盐酸胍、十二烷基苯磺酸钠、硫酸铵、乙二胺、乙二胺四乙酸钠或氯化钠。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述解构剂包括5～11mol/L的尿素溶液、0.5～1.5％的十二烷基苯磺酸钠溶液、1～6mol/L的盐酸胍溶液或3～8％的氯化钠溶液。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测载体为生物载片、酶标板、层析膜、渗滤膜、蛋白质印迹膜、胶乳微球或磁性微球。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物为生物酶、具有荧光化合物或金属的标记物或具有化学发光化合物的标记物。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的磷脂酶a2受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括稀释液、包被缓冲液、封闭液、洗涤液、固定液、显色液和/或终止液。

7.一种检测方法，其特征在于，应用权利要求1～6任一所述的试剂盒，将含磷脂酶a2受体蛋白特异性抗体的样品与用标记物标记的磷脂酶a2受体蛋白结合，检测在样品中加入解构剂前后的检测信号。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，样品与解构剂的体积比为1:(0.1～10)。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测信号包括荧光强度或吸光度值。

10.权利要求1所述的试剂盒在制备膜性肾病诊断或预后评估设备中的应用。