CN108780095A - 利用简易免疫测定的癌胚纤连蛋白检测方法 - Google Patents

利用简易免疫测定的癌胚纤连蛋白检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明解决了下述问题：通过抑制与作为与fFN相似的抗原成分的血浆FN的交叉反应而减少对血浆FN的检测，使得在简易免疫测定中可以防止假阳性反应并减少测量值误差，从而准确检测fFN。当在本发明所述的特定表面活性剂的存在下抗‑fFN抗体与fFN反应时，甚至在也存在其他FN，如血浆FN时，通过抑制所述抗体与FN之间的交叉反应可以准确检测fFN。所述特定的表面活性剂由通式(1)所示。在该式中，m是4至30，并且R表示烷基。R‑O‑(CH2CH2O)mH…(1)。

Description

利用简易免疫测定的癌胚纤连蛋白检测方法
技术领域
本公开内容涉及利用简易免疫测定的癌胚纤连蛋白检测方法，并且具体地涉及利用免疫色谱的癌胚纤连蛋白检测方法。此外，本发明涉及在样品中可能共存除癌胚纤连蛋白以外的纤连蛋白的情形中能够准确检测癌胚纤连蛋白的方法。
背景技术
临床当场即时检验(Point of Care Testing，POCT)是一个笼统的术语，用于通常在患者周边进行的检验，所述患者周边诸如全科医师(general practitioner)、医院病房或门诊治疗的诊所等。由于可以按照通过简单操作得到的检验结果迅速进行诊断和治疗，所以预计其有助于医学治疗的质量提高。
利用免疫色谱的检测方法是POCT中常用的方法，其在实践中用于多个领域，包括传染病，如流感感染，产科学，如妊娠、早产等，生活方式疾病，如糖尿病、心脏病等。
异质方法包括在操作过程中在检测分析物之前洗涤样品中除了来源于分析物的抗原-抗体复合物之外的成分的步骤(以下也简称为异质方法)。另一方面，同质方法不包括相应的洗涤步骤(以下，还简称为同质方法)。利用免疫色谱的检测方法对应于同质方法。
在样品(样本)中存在具有与分析物相似的抗原性的物质(以下，还称为相似的抗原)的情形中，即使所述物质存在的量在异质方法中不引起问题，在同质方法中，所述物质也可能引起测量结果的误差。
由于血液等对样品的污染而可能包含相似的抗原的分析物可以纤连蛋白为例。多种纤连蛋白组成由单一基因表达的一个蛋白家族。已知血浆和活组织中存在多种纤连蛋白同种型，所述活组织包括结缔组织、皮肤、结肠、肝、脾和肾(Matsuura和Hakomori,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6517-6521(1985))。胎儿组织和一些不同种类的肿瘤细胞包括统称为“胎儿”或“癌胚”纤连蛋白的纤连蛋白同种型。癌胚纤连蛋白(以下，还简称为“fFN”)在没有怀孕的妇女中或妊娠22周后没有胎膜病症的孕妇的阴道分泌物中很少存在，但是当胎膜被细菌感染或物理因素损伤或削弱时，癌胚纤连蛋白渗漏到阴道分泌物中。因此，妊娠22周至33周的孕妇阴道分泌物中的fFN浓度可用作先兆早产的标记。在产科学中检测到的此类癌胚纤连蛋白最初写作“癌胚纤连蛋白”，并且在日语中其已被翻译和用作“癌胎儿性(Gantaijisei)”纤连蛋白。目前，倾向于使用“胎儿”纤连蛋白的表述。除非在本发明中另外指明，此类术语统一为“癌胚纤连蛋白”的表述。
如上文所述，纤连蛋白是由单个基因表达的一个蛋白家族，并且是分子量约为500kDa的、组成细胞外基质的主要蛋白。fFN具有与血浆来源的FN(以下，还简写为血浆FN或FN)相同的氨基酸序列，并且它们彼此仅在糖链结合位点方面不同。fFN具有约9.5％的含糖量，而血浆FN具有5.8％的含糖量。如上文所述，由于fFN和血浆FN具有相同的氨基酸序列并且目前仅鉴定出一个fFN-特异性表位，因此获得两种以上与fFN特异性反应而完全不与血浆FN反应的抗体是非常困难的。
因此，由于两种抗体形成夹心复合物，所以可能需要一对抗体：特异性结合fFN但不结合另一种纤连蛋白的一种抗体，和结合这两种纤连蛋白的另一种抗体。
具体而言，为了得到特异性结合fFN的单克隆抗体，本申请人尝试使用包含fFN特有的糖链结构部分的肽作为免疫原获得单克隆抗体，结果，所得到的单克隆抗体是与fFN特异性反应但是显示出与血浆FN轻微交叉反应的抗体。
作为目前以fFN的体外诊断医学产品分销的试剂，已知“免疫测试剂(immunotester，注册商标)fFN”(由积水医疗株式会社制备)，其是利用ELISA法的试剂(非专利参考文献1)。
所述免疫测试剂利用使用免疫平板的两步夹心ELISA法并且利用包括洗涤步骤的异质方法。基于先兆早产的危险，该试剂具有的截止值为50ng/mL。由于所述洗涤步骤，所以即使样本被血液污染，也几乎不发生假阳性反应，并且不引起临床问题。
同时，由于使用免疫色谱的检测方法是不包括洗涤步骤的同质方法，因此存在该方法易受血液污染等影响的问题。例如，具有0.1％以上的血液污染的样本可以通过颜色区分，但是难以在视觉上区分血液污染小于0.1％的样本。因此，甚至在血液污染小于0.1％时也不引起假阳性反应的试剂是合乎需要的。
关于利用免疫色谱检测人fFN的方法，已知专利文献1和2中的那些方法。然而，没有特异性检测fFN的商业化的试剂。专利文献1是公开通用免疫色谱的文献，并且该文献仅提及fFN作为分析物。专利文献2公开向样品中添加BSA等，从而抑制抗-fFN抗体与背景物质的非特异性结合。
此外，在专利文献1和2的任一个中都没有描述或启示与fFN同其他纤连蛋白之间的抗原相似性相关的问题。
引用列表
专利参考文献
专利文献1:日本专利申请公开号2008-514900
专利文献2:日本专利申请公开号2011-39068
非专利参考文献
非专利文献1:体外诊断医学产品“免疫测试剂(immunotester，注册商标)fFN”(积水医疗株式会社)的附带文件
发明概述
技术问题
当使用免疫色谱检测可能被血液污染的样品中的fFN时，也检测到血浆来源的纤连蛋白，这可能引起获得测量值误差或假阳性结果的问题。
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种利用免疫色谱的检测方法，所述方法抑制与(作为与fFN相似的抗原成分的)其他FN的交叉反应，减少相似的抗原的检测，并且防止测量值误差和假阳性反应，由此允许对fFN的准确检测。
问题的解决方案
作为解决上述问题的深入研究的结果，发现当使fFN与抗-fFN抗体在特定表面活性剂的存在下反应时，即使共存其他FN，如血浆FN，也可以抑制所述抗体与FN之间的交叉反应性，并且可以准确检测fFN，由此完成了本发明。
具体地，本发明如下所述：
(1)一种利用免疫色谱检测癌胚纤连蛋白的检测方法，所述方法包括步骤(A)至(C)：
(A)向下述测试条的样品供给部提供样品和液体组合物，所述样品可能包含癌胚纤连蛋白和除癌胚纤连蛋白之外的纤连蛋白，所述液体组合物包含式(1)所示的非离子表面活性剂；
所述测试条包括由多孔体组成的膜，所述多孔体至少具备所述样品供给部、展开部和检测部，其中包含用标记物质标记的第一抗体的缀合物以可溶方式保留在所述展开部的一部分上，并且其中固定了第二抗体的所述检测部提供在所述展开部的相对于保留所述缀合物的部分的下游侧的一部分上，并且其中所述第一抗体和所述第二抗体中的任一种是抗-癌胚纤连蛋白抗体，并且另一种是结合癌胚纤连蛋白的抗体；
(B)使所述样品与所述缀合物接触；并且
(C)在所述检测部中检测所述样品中的癌胚纤连蛋白与所述缀合物的复合物：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
(2)(1)所述的检测方法，其中所述液体组合物中所述表面活性剂的浓度在大于0.2％(W/V)并且小于1.0％(W/V)的范围内。
(3)在利用免疫色谱测试条检测样品中的癌胚纤连蛋白的方法中减少交叉反应的方法，所述交叉反应是在癌胚纤连蛋白与除癌胚纤连蛋白之外的纤连蛋白之间的交叉反应，所述减少交叉反应的方法包括下述步骤：
(A)向下述测试条的样品供给部提供样品和液体组合物，所述样品可能包含癌胚纤连蛋白和除癌胚纤连蛋白之外的纤连蛋白，所述液体组合物包含式(1)所示的非离子表面活性剂；
所述测试条包括由多孔体组成的膜，所述多孔体至少具备所述样品供给部、展开部和检测部，其中包含用标记物质标记的第一抗体的缀合物以可溶方式保留在所述展开部的一部分上，并且其中固定了第二抗体的所述检测部提供在所述展开部的相对于保留所述缀合物的部分的下游侧的一部分上，并且其中所述第一抗体和所述第二抗体中的任一种是抗-癌胚纤连蛋白抗体，并且另一种是结合癌胚纤连蛋白的抗体；
(B)使所述样品与所述缀合物接触；并且
(C)在所述检测部中检测所述样品中的癌胚纤连蛋白与所述缀合物的复合物：
R-O-(CH2CH2O)mH(1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
(4)(3)所述的减少交叉反应性的方法，其中所述液体组合物中所述表面活性剂的浓度在大于0.2％(W/V)并且小于1.0％(W/V)的范围内。
(5)用于癌胚纤连蛋白的免疫色谱检测试剂盒，其包括下述组件(i)和(ii)：
(i)免疫色谱测试条，所述测试条包括由多孔体组成的膜，所述多孔体至少具备样品供给部、展开部和检测部，其中包含用标记物质标记的第一抗体的缀合物以可溶方式保留在所述展开部的一部分上，并且其中固定了第二抗体的所述检测部提供在所述展开部的相对于保留所述缀合物的部分的下游侧的一部分上，并且其中所述第一抗体和所述第二抗体中的任一种是抗-癌胚纤连蛋白抗体，并且另一种是结合癌胚纤连蛋白的抗体；和
(ii)包含下式(1)所示的非离子表面活性剂的液体组合物：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
(6)(5)所述的检测试剂盒，其中(ii)所述的液体组合物用作展开液或样本提取液。
(7)(5)或(6)所述的检测试剂盒，其中所述液体组合物中所述表面活性剂的浓度在大于0.2％(W/V)并且小于1.0％(W/V)的范围内。
(8)用于利用免疫色谱检测癌胚纤连蛋白的液体组合物，所述液体组合物包含下式(1)所示的非离子表面活性剂：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
(9)(8)所述的液体组合物，其中所述液体组合物用作展开液或样本提取液。
(10)(8)或(9)的液体组合物，其中所述液体组合物中所述表面活性剂的浓度在大于0.2％(W/V)并且小于1.0％(W/V)的范围内。
(11)用于检测癌胚纤连蛋白的样本提取液，其包含下式(1)所示的非离子表面活性剂：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
(12)利用免疫色谱检测癌胚纤连蛋白的方法，所述方法包括使可能包含癌胚纤连蛋白和除癌胚纤连蛋白之外的纤连蛋白的样品与抗-癌胚纤连蛋白抗体在下式(1)所示的非离子表面活性剂的存在下接触：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
发明的有益效果
在利用免疫色谱检测样品中的fFN(癌胚纤连蛋白)的方法中，即使当样品被血液污染由此共存作为与fFN相似的抗原的血浆FN时，可以减少抗-fFN抗体与血浆FN之间的交叉反应性，并且可以防止测量误差或假阳性反应，由此允许准确检测fFN。
附图简述
[图1]图1是显示检验多种不同的非离子表面活性剂对抗-fFN抗体与血浆FN之间的交叉反应性的影响的实验结果的图；
[图2]图2是显示检验Brij的添加浓度的差异对抗-fFN抗体与血浆FN之间的交叉反应性的影响的实验结果的图；
[图3]图3是显示检验Brij链长的差异对抗-fFN抗体与血浆FN之间的交叉反应性的影响的实验结果的图；
[图4]图4是显示检验EMULGEN链长的差异对抗-fFN抗体与血浆FN之间的交叉反应性的影响的实验结果的图；和
[图5]图5显示本发明示例性的免疫色谱测试条的示意结构。
具体实施方案
(分析物)
本发明的分析物是癌胚纤连蛋白(fFN)。
(样品)
在本发明中，“样品”可以是任一种，只要其可能包含作为分析物的fFN即可，并且所述样品可以举例为宫颈阴道液、宫颈液、阴道液等。
通过离心、过滤、纯化等从样品分离和分级的成分、用有机溶剂等提取的成分、通过表面活性剂等溶解的成分、用缓冲液等稀释的成分和通过化学反应等改性/改变的成分也包括在本发明的样品内。
在本说明书中，“样品”也可以称作“样本”，并且它们用作同义词，并且当添加样品并展开到本发明的免疫色谱的固相上时，所述“样品”是液体(流体)。
(特定的表面活性剂)
本发明特定的表面活性剂是下式(1)所示的聚氧乙烯烷基醚：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
在利用免疫色谱检测fFN的方法中，所述聚氧乙烯烷基醚用于抑制样品中血浆FN与抗-fFN抗体之间的交叉反应性。
在本发明式(1)所示的聚氧乙烯烷基醚中，作为其疏水基团的R(烷基)的碳数可以为8-20。具体而言，例如，所述疏水基团可以是月桂基(12)、鲸蜡基(16)、硬脂基(18)、油基(18)等(括号中的数字值是所述烷基的碳数)。另外，m，即上式中乙烯氧基团(其为聚氧乙烯烷基醚的亲水基团)的数目优选为4个以上且30个以下，更优选为10个以上且30个以下，并且特别优选为12个以上且25个以下。此类聚氧乙烯烷基醚可以例举为聚氧乙烯(12)月桂醚，聚氧乙烯(23)月桂醚，聚氧乙烯(13)油基醚等。特别优选聚氧乙烯(23)月桂醚。关于聚氧乙烯烷基醚，可以使用商购的EMULGEN(商品名)、Brij(商标)、NIKKOL(商品名)或EMALEX(商品名)。
关于式(1)所示的聚氧乙烯烷基醚，其在样品中共存fFN和作为与fFN相似的抗原的FN的情形中抑制抗-fFN抗体与FN之间的交叉反应性的功能是未知的。
作为本发明特定的表面活性剂的使用方式，优选地，在使样品与检测抗体接触之前，使所述样品中与fFN相似的抗原(例如，血浆FN)与所述表面活性剂接触，或者所述表面活性剂可以通常包含在样本提取液(还称为样本稀释液)或展开液中。其中所述表面活性剂包含在样本提取液中是优选的。
(样本提取液)
在本说明书中，样本提取液作为样本稀释液的同义词使用。
样本提取液可以在按照样品中分析物的浓度需要提取和稀释所述样品时使用。样本提取液可以是任意组成的提取液，只要其不显著抑制抗原-抗体反应，或相反地，不显著促进导致标记物质过量聚集的反应(该反应引起通过毛细管作用的展开失败)，或者不完全防止对抗原-抗体反应的抗原浓度依赖性的信号检测。
例如，具有这些作用的样本提取液可以是纯净水，生理盐水，或低浓度缓冲液，如10mmol/L至20mmol/L的磷酸盐缓冲液，10mmol/L至20mmol/L的Tris-HCl缓冲液，或10mmol/L至20mmol/L的Bis-Tris缓冲液。
如上文所述，优选的使用方式是本发明的样本提取液包含本发明特定的表面活性剂。
本发明的表面活性剂在样本提取液中的浓度可以是任意浓度，只要其可以抑制除fFN与针对其的特异性抗体之间的反应之外的交叉反应性即可，并且表面活性剂在溶液中浓度的下限可以是大于0.2％(W/V)，0.25％(W/V)，0.3％(W/V)，0.4％(W/V)，或0.5％(W/V)。另外，其上限可以是小于1.0％(W/V)，0.95％(W/V)，0.9％(W/V)，0.8％(W/V)，0.7％(W/V)，或0.6％(W/V)。浓度范围优选是大于0.2％(W/V)并且小于1.0％(W/V)。另外，可以提及任一种上限和任一种下限的组合。
(展开液)
在本发明中，展开液是指在免疫色谱测试条上展开的溶液。因此，在一些情形中，样本提取液和样本稀释液也可以作为展开液，但是在本说明书中，将不含有样本并且目的仅用于展开的溶液特别区分为展开液。在该情形中，检测发生在仅将样本或通过用少量样本稀释液稀释所述样本得到的液体提供到免疫色谱测试条上后的提供展开液的步骤中。作为本发明的展开液，可以使用如用于上文提及的样本提取液中的纯净水、生理盐水溶液或低浓度缓冲液，并且在所述展开液中本发明的表面活性剂的浓度也如在所述样本提取液中的浓度相同。
(免疫色谱测试条)
本发明的免疫色谱测试条是由多孔体组成的膜，所述多孔体至少具备“样品供给部”、“展开部”和“检测部”，并且具有这样的结构：其中标记的针对分析物fFN的抗体以可溶方式保留在展开部的展开起始部分，使得所述标记的抗体在与样品接触后通过展开部并且到达检测部，而针对fFN的抗体固定在展开部的一部分上，从而组成所述检测部。
包括这些元件的实例可以是这样的测试条：其包括起样品供给部作用的样品垫、以可溶方式保留针对fFN的标记的抗体且起展开部作用的缀合物垫和在其一部分上固定了固定化抗体并且起展开部和检测部作用的不溶膜。即，本发明典型的免疫色谱测试条具有下述构型：
(1)样品垫，样品提供在所述样品垫上；
(2)缀合物垫，所述缀合物垫布置在样品垫下游，并且以可溶方式保留缀合物，所述缀合物具有在胶体金表面上敏化的第一抗体；和
(3)不溶膜，在所述不溶膜上固定与所述缀合物和fFN的复合物结合的第二抗体，并且所述膜布置在所述缀合物垫下游，
其中所述样品垫、缀合物垫和不溶膜可以组成各个不同的载体，或所述元件中的两个可以组成一个载体，并且可以采取任意方式，只要所述样品垫、缀合物垫和不溶膜以从样品流动的上游到下游的这一次序布置。
免疫色谱测试条可以是还具有与上述构成部分一起布置和封固的吸收垫和第三个垫中的任意一个或多个的条。所述测试条通常布置在固相支持物上，如布置在塑料粘合板上。明显的是，固相支持物由不妨碍样品的毛细管流动的材料制成，并且粘合剂成分由不妨碍样品的毛细管流动的材料制成。此外，测试条可以用聚酯薄膜等层压，用于增加固定有抗体的膜的机械强度并防止测定过程中水的挥发(干燥)。
(标记)
作为用于本发明的标记的抗体的“标记”，已知可视化的微粒，诸如金属胶体粒子(胶体金等)和着色粒子(着色的胶乳粒子等)，磁性粒子，荧光粒子，酶，诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，和β-D-半乳糖苷酶等，放射性同位素，如碘-125等，发光物质，如吖啶鎓(acridinium)化合物，鲁米诺等，荧光物质，如异硫氰酸荧光素，铕(III)螯合剂等。金属胶体和着色乳胶是优选的。作为标记抗体等的方法(即，引入并结合标记物质的方法)，可以使用任何已知的方法，没有限制。
胶体金可以是任意胶体金，只要其能够通过抗体敏化(固定)形成缀合物并且在通过与样品接触检测样品中的靶标对象(抗原)的方法中作为标记。
作为胶体金，胶体铂以及胶体金包括在本发明的胶体金之内。
已知胶体金粒子的粒径显著影响检测灵敏性，并且例如，当胶体金粒子保留并用在免疫色谱测试条中时，胶体金粒子的粒径优选为20nm至60nm，更优选为40nm至60nm，并且特别优选为45nm至55nm。胶体金可以由通常已知的方法制备，例如，通过将柠檬酸三钠水溶液或柠檬酸三铵水溶液滴加到加热的四氯金(III)酸水溶液中并搅拌而制备。
(用胶体金对抗体的敏化)
通常通过物理吸附实现将针对分析物的抗体固定在胶体金上。在这一点上，抗体的浓度优选调节至1μg/mL至5μg/mL缓冲液的浓度。缓冲液的类型和pH优选是2mmol/L至10mmol/L的Tris缓冲液(pH 7至pH 9)。然而，可以使用另一种缓冲液，对其没有限制。在本说明书中，其上固定了针对分析物的抗体或对照抗体(或抗原)的上述胶体金称为“缀合物”。
(封闭)
本发明的缀合物可以由封闭剂在不被胶体金表面上的抗体结合的区域封闭。
胶体金缀合物的封闭剂通常是来源于活生物体的成分或来源于非活生物体的成分，并且所述来源于活生物体的成分可以是任意成分，只要其是来源于活生物体的并且具有封闭作用，并且例如，所述成分包括动物蛋白或动物蛋白衍生的肽。具体地，所述成分可以包括牛血清白蛋白(BSA)，来源于微生物的封闭肽片段(由TOYOBO制备)，来源于丝蛋白(丝胶蛋白的水解物)的NEO PROTEIN SAVER(由TOYOBO制备)，StartingBlockTM(PBS)封闭缓冲液(由PIERCE制备)，StabilCoatTM(由SurModics制备)，以及酪蛋白。
来源于活生物体的成分的浓度可以依据所用的成分适当确定。例如，加入抗体溶液，并与调节至1OD/mL的胶体金溶液混合，然后向混合的溶液中加入来源于活生物体的成分至终浓度在0.1％至10％范围内以用于封闭，并且更优选地在0.2％至5％范围内使用。
备选地，来源于非活生物体的成分和来源于活生物体的成分的混合物可以用作胶体金的封闭剂。
术语“检测”或“测量”用在本文中必须以最宽泛的意义解释，包括验证和/或定量分析物的存在，并且不得以任何意义上的限制方式解释。
(样品垫)
在本发明中，“样品垫”是作为接收样品的样品供给部并且定型为吸收液体样品的垫的部分，并且所述样品垫可以包括允许液体和分析物成分通过的任何物质和形式。
样品垫可以包含缓冲液。在这一情形中，所述缓冲液可以至少包含在样品垫的一部分中或包含在整个样品垫中。
适用于样品垫的材料的具体实例可以包括，但不限于，玻璃纤维，丙烯酸纤维，亲水聚乙烯材料，干燥纸，纸浆，织物等。优选使用玻璃纤维垫。样品垫可以另外赋予下文所述的缀合物垫的功能。样品垫可以包含常用的封闭剂，其在不影响反应系统并且不背离本发明的目的的范围内按需使用。
(缀合物垫)
用于本文时，“缀合物垫”是指通过用与分析物特异性反应的检测剂浸渍下文所述的适用于缀合物垫的材料然后干燥而得到的垫。缀合物垫具有在样品通过所述缀合物垫时允许检测剂和分析物形成复合物的功能。所述缀合物垫可以自身布置与固定有抗体的膜接触。备选地，缀合物垫可以布置与样品垫接触，从而接收通过毛细管流动已经通过样品垫的样品，然后通过毛细管流动将所述样品转移到另一个垫(以下，还称作“第三个垫”)，所述另一个垫接触的表面与样品垫的接触表面不同。样品垫和缀合物垫的一个或多个部分的选择以及怎样将所选的部分布置在固定有抗体的膜上可以适当变化。
所述缀合物垫还可以包含缓冲液。在这一情形中，所述缓冲液至少包含在包括在固定有缀合物的部分的上游的部分中，并且可以包含在整个缀合的垫中。
适用于缀合物垫的材料可以包括，但不限于，纸，纤维素混合物，硝基纤维素，聚酯，丙烯腈共聚物，玻璃纤维，和无纺纤维，如人造丝。优选使用玻璃纤维垫。
需要时，缀合物垫可以包含“对照试剂”，用于确保免疫色谱的可靠性，例如，不与样品成分反应的用标记物标记的抗体，或用标记物标记的高抗原性蛋白，如KLH(匙孔血蓝蛋白)。这些对照试剂是不可能存在于样品中的成分(物质)，并且可以适当选择。
(第三个垫)
在本发明中，可以布置第三个垫，用于从样品和检测剂的反应成分中去除对于检测分析物而言不需要的成分，使得反应需要的各个成分可以在固定了抗体的不溶膜上顺利展开。
例如，血细胞、不溶的血细胞碎片等优选作为对于检测而言不需要的成分而被去除。第三个垫还可以提供在抗原-抗体反应产生的聚集物中初步去除聚集物的额外的作用，所述聚集物生长成阻止在固定有抗体的膜上运动和顺利展开的尺寸。第三个垫可以包括允许液体成分和分析物成分通过的任意物质和形式。
具体的实例包括，但不限于，玻璃纤维，丙烯酸纤维，亲水性聚乙烯材料，干燥纸，纸浆，织物等。
(将抗体固定在不溶膜上)
在本发明的免疫色谱试剂中，可以通过通常公知的方法将针对分析物fFN的抗体(抗-fFN抗体)固定在不溶膜上。例如，在流通形式的情形中，以预先确定的浓度制备抗-fFN抗体，并且将给定量的其溶液以点或特定符号(如“+”)的形状涂到不溶膜上。在这一情形中，为了确保免疫色谱的可靠性，通常通过将能够结合缀合物的蛋白或化合物固定在与所述抗-fFN抗体不同的位置上而形成“对照线”。所述“对照线”可以通过将针对对照试剂的抗体固定在与所述抗-fFN抗体不同的位置上而形成。
在侧流形式的情形中，以预先确定的浓度制备抗体，并且，通过使用具有能够水平移动同时以恒定速率从喷嘴排出溶液的机制的装置，将抗体溶液以直线形状涂布到不溶膜上。在这一点上，抗体的浓度优选为0.1mg/mL至5mg/mL，并且更优选为0.5mg/mL至3mg/mL。在流通形式的情形中，通过调节滴到不溶膜上的涂布量，可以优化在不溶膜上的抗体的固定量，并且在侧流形式的情形中，通过调节从装置的喷嘴的排出速率进行优化。具体地，在侧流形式的情形中，优选0.5μL/cm至2μL/cm。在本发明中，“流通膜测定”是指其中样品液等垂直展开通过不溶膜的形式，并且“侧流式膜测定”是指其中样品液等与不溶膜平行展开移动的形式。
在本发明中，针对靶标对象的抗体在不溶膜上的涂布位置可以这样布置，以致于使检测剂通过毛细管作用从缀合物垫展开，并在侧流形式的情形中顺序通过涂布各个的抗体的直线。优选地，通过涂布针对分析物的抗体形成的直线优选位于上游，而通过涂布对照抗体形成的直线位于其下游。在这一情形中，在各条直线之间优选布置充分的距离，从而可以检测到各标记的信号。在流通形式的情形中，可以这样布置涂布针对靶标对象的抗体的位置，从而可以检测到各标记的信号。
涂布到不溶膜上的抗体溶液可以通过使用预先确定的缓冲液正常制备。缓冲液的类型可以包括常用的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，Good’s缓冲液等。缓冲液的pH优选在6.0至11的范围内，并且可以依赖于所用的抗体的性质而适当确定。例如，pH 7.2的缓冲液可用于下文所述的抗-fFN单克隆抗体。
所述缓冲液可以包含盐，如NaCl等，稳定剂，如蔗糖或防腐剂，和杀菌剂，如ProClin等。盐可以包括为调节离子强度包含的那些，诸如NaCl，以及在调节缓冲液的pH步骤添加的那些，如氢氧化钠。在将抗体固定到不溶膜上后，可以通过将固定了抗体的部分之外的部分用常用的以溶液状态或蒸汽状态存在的封闭剂包被而进行封闭。在本说明书中，如上文所述固定了抗体的不溶膜还称为“固定有抗体的膜”。
(不溶膜)
在本发明中，不溶膜(以下，还简称为膜)可以由任意材料制成。例如，所述材料可以包括，但不限于，聚乙烯，聚对苯二甲酸乙二酯，尼龙，玻璃，多糖，如纤维素和纤维素衍生物，或陶瓷。具体地，所述材料可以包括可从Merck&Co.，Inc.、Toyo Roshi kaisha，Ltd.、Whatman，Inc.等得到的玻璃纤维滤纸和纤维素滤纸。可以适当地选择不溶膜的孔径和结构，由此控制胶体金-标记的抗体和靶标对象的免疫复合物通过所述膜的流动速率。可以通过控制通过膜的流动速率，调节与固定在所述膜上的抗体结合的标记的抗体的量，并且因此，优选地考虑与本发明的免疫色谱测试条的其他组成材料的组合而优化膜的孔径和结构。
(吸收垫)
在本发明中，吸收垫是指液体吸收部分，其吸收已经在不溶膜上移动并且通过的样品从而控制样品的展开。吸收垫可以布置在侧流形式的条构型的最下游部分，并且可以布置在，例如，流通形式的固定有抗体的膜的下部。例如，吸收垫可以由滤纸制成，但不限于此。
(检测装置)
考虑到条的尺寸、样品的添加方法和位置、抗体在固定有抗体的膜上的固定位置、信号检测方法等，本发明的免疫色谱测试条可以在被封装在/封固在适当的容器(封装)中后使用，并且处于所述封装的/封固的状态的免疫色谱测试条被称为“装置”。
(其他)
在本说明书中，“不溶膜”还称为“固相”，并且允许不溶膜物理或化学支持抗原或抗体，或允许所述支持的状态可以表达为“固定”，“固定有”，“固相化的”，“敏化”或“吸附”。
(用于本发明的抗体)
用于本发明的针对分析物的抗体不以任何方式受限于制备方法，只要所述抗体与所述分析物特异性反应，并且可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以通常按照Kohler和Milstein(参见Nature，Vol.256，p.495，1975)的方法，通过用分析物作为免疫原免疫的动物的脾细胞和来自相同物种的骨髓瘤细胞之间的细胞融合来制备产生相对应的抗体的杂交瘤。
当用于通过形成所谓的夹心结构检测分析物的测量方法的抗体是单克隆抗体时，包含在缀合物中的用标记物质标记的抗体(第一抗体)与要固定在展开部中的不溶膜固定的抗体(第二抗体)之间的关系是这样的，以使第二抗体的表位与第一抗体的表位不同。优选地，第一抗体和第二抗体中的任一种是抗-fFN抗体，并且另一种抗体是与fFN结合的抗体。更优选地，第一抗体是与fFN结合的抗体，并且第二抗体是抗-fFN抗体。与fFN结合的抗体可以是任意与fFN结合的抗体和任意与血浆FN结合的抗体，所述血浆FN是与fFN相似的抗原，并且所述血浆FN可能污染样品。
在下文所述的实施例1中，提议fFN为分析物蛋白，提议血浆FN为与fFN相似的抗原。使用特异性结合fFN而不与血浆FN结合的抗-fFN单克隆抗体(以下，称为抗-fFN单克隆抗体)和与fFN和血浆FN二者都结合的抗-纤连蛋白抗体(以下，称为抗-FN抗体)。
fFN和血浆FN是具有相同氨基酸序列、仅糖链含量不同的糖蛋白。此处，在作为包含fFN的样本的孕妇阴道分泌物等的收集中，存在血液污染的可能性，并且因此，样本包含血浆FN和fFN二者。难以得到两种以上的fFN-特异性抗体，原因在于此类抗体识别糖链的差异。因此，当抗体用于夹心免疫色谱法时，可能需要构建使用两种抗体的测定系统，其中一种抗体是fFN单克隆抗体，另一种抗体是抗-FN单克隆抗体。
用于本发明的抗-fFN单克隆抗体是单克隆抗体，其通过下述得到：合成包含fFN特有的糖链结合位点的糖蛋白，通过碳二亚胺法使所述糖蛋白与转铁蛋白或OVA结合，并且使用得到的产物作为免疫原进行足垫免疫和皮下免疫，并且所述抗体特异性与fFN反应。此外，用于本发明的抗-FN单克隆抗体是单克隆抗体，其通过用血浆FN的全长蛋白作为免疫原类似地进行免疫而得到，并且所述抗体与fFN和血浆FN中的任一种反应。
本发明不限于此，并且还可以使用商购的抗-FN单克隆抗体和抗-fFN单克隆抗体。商购的抗-FN单克隆抗体的实例可以包括抗-人纤连蛋白，单克隆(克隆FN12-8)，抗-人纤连蛋白，单克隆(克隆FN30-8)(由Takara Bio，Inc.制备)(注意：为便利起见，单克隆抗体可以由产生各种抗体的杂交瘤的克隆名称表示。在下文中使用所述名称)。
当检测fFN时，第一抗体和第二抗体中的任一种优选是抗-fFN单克隆抗体，并且另一种优选是抗-FN单克隆抗体，并且更优选地，第一抗体是抗-FN单克隆抗体，第二抗体是抗-fFN单克隆抗体。
(抗-fFN单克隆抗体和抗-FN单克隆抗体的制备实施例)
按照本领域技术人员通常进行的制备单克隆抗体的方法(Kohler和Milstein的方法，(Nature，Vol.256，p.495，1975))，通过用fFN肽片段-结合的OVA或fFN肽片段-结合的转铁蛋白免疫小鼠得到用于下述检测的抗-fFN单克隆抗体(克隆#90204)，通过用血浆纤连蛋白的全长蛋白免疫小鼠得到抗-FN单克隆抗体(克隆#90412)。
(测量)
定量来源于胶体金的信号的方法可以按照已知方法进行，并且可以测量吸光度或反射的光强度。备选地，可以将吸光度或反射光强度的变化外推到具有已知浓度的样品的校正曲线，从而测量靶标对象的浓度。
(试剂盒)
样本提取液与使用说明手册中任一种或多种和免疫色谱测试条的组合可以用作试剂盒。在该情形中，本发明的表面活性剂可以包含在样本提取液、样本稀释液、展开液中的任一种或多种中。
(使用免疫色谱的检测方法)
本发明使用免疫色谱的检测方法是至少包括下述步骤(A)至(C)的方法，并且下文将描述使用fFN作为分析物和血浆FN作为相似的抗原的典型检测方法：
(A)将本发明的表面活性剂和包含样品的样本提取液提供到测试条的样品供给部，所述测试条包括由多孔体组成的膜，所述多孔体至少具备样品供给部、展开部和检测部，其中胶体金标记的抗-FN抗体(缀合物)以可溶方式保留在所述展开部的一部分上，并且其中固定了抗-fFN抗体的检测部提供在所述展开部的相对于保留缀合物的部分的下游侧的一部分上；
(B)使所述样品(样本)与所述缀合物接触；并且
(C)在固定了抗-fFN抗体的检测部中，检测步骤(B)中得到的样品中的fFN与胶体金标记的抗-FN抗体(缀合物)的复合物。
[实施例]
[试验例1]制作本发明的免疫色谱测试条
1.制备胶体金标记的抗-FN抗体溶液
通过下述步骤进行制备。
(i)将50-nm胶体金储液用纯净水稀释至1.0OD，并用0.2M碳酸钾水溶液调节至pH8.5。
(ii)抗-血浆FN小鼠单克隆抗体(克隆#90412)用5mM硼酸稀释至80μg/mL。
(iii)将BSA溶解在纯净水中得到10％的溶液。
(iv)在搅拌下，将1mL(ii)添加到20mL(i)中，然后搅拌10分钟。
(v)在搅拌下，将2mL(iii)添加到(iv)中，然后搅拌5分钟。
(vi)将(v)在10℃以10,000rpm离心45分钟，吸出上清，并且将沉淀物混悬在1mL缀合物稀释液(缓冲液缀合物稀释液(Buffer Conjugate Dilution)，SCRIPPS)中，从而得到胶体金标记的抗-FN抗体溶液(抗-FN抗体缀合物)。
(vii)将(vi)在45℃加热18小时。
2.制作缀合物垫
将在1中制备的胶体金标记的抗-FN抗体溶液与包含2.0％BSA和2.4％乳糖溶液的20mM磷酸二氢钠水溶液混合至3.75OD/mL，以制得缀合物溶液(pH 7)。将缀合物溶液以66.93μL/cm2的速率浸渍在胚板(cookie sheet)上的玻璃纤维垫，并且在干燥炉中在70℃干燥45分钟，并将该垫用作缀合物垫。
3.制作样品垫
将20mM磷酸二氢钠水溶液(pH 7)以62.99μL/cm2的速率浸渍在胚板上的玻璃纤维垫，并在干燥炉中在70℃干燥45分钟，将该垫用作样品垫。
4.制备抗-fFN抗体和抗-小鼠IgG抗体膜涂布溶液
(i)制备抗-fFN抗体膜涂布溶液
将抗-fFN小鼠单克隆抗体(克隆#90204)用包含2.5％蔗糖的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)稀释，以致抗体浓度变为2.0mg/mL，将该溶液用作抗-fFN抗体膜涂布溶液。
(ii)制备抗-小鼠IgG抗体膜涂布溶液
如(i)，将抗-小鼠IgG山羊多克隆抗体(Jackson Immuno ResearchLaboratories)用包含2.5％蔗糖的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)稀释，以致抗体浓度变为0.5mg/mL，并将该溶液用作抗-小鼠IgG山羊多克隆抗体膜涂布溶液。
5.制作固定有抗体的膜
使用免疫色谱分配器XYZ3000(BIO DOT)以1.0μL/cm将抗-fFN抗体膜涂布液和抗-小鼠IgG抗体膜涂布液分别涂到距硝基纤维素膜(Hi-Flow Plus HF180(MerckMillipore))下端11mm和15mm的位置，并且在干燥炉中在70℃干燥45分钟，以产生固定有抗体的膜。
6.制作检测装置
将固定有抗体的膜(d)粘贴在塑料粘合板(g)上，以下述次序布置涂布抗体的位置：在展开的上游侧为抗-fFN抗体(e)，然后是作为对照试剂的抗-小鼠IgG抗体(j)，并且封固第三个垫(c)。然后，放置并封固上述制作的缀合物垫(b)，并且放置并封固上述制作的样品垫(a)，从而与该缀合物垫重叠，同时将吸收垫(f)放置并封固在另一侧的末端。将透明的塑料薄膜(h)放置在固定有抗体的膜和吸收垫的表面上，并通过切割上述具有彼此重叠的组成元件的结构而制成免疫色谱测试条。
将测试条封装/封固在具有加样口和检测口的专用塑料罩(DKVIN(Syncorporation)(图6中未显示))中，其在测定时采用免疫色谱测试装置的形式。图6显示了所述免疫色谱测试条的示意结构。
[实施例1]添加到样本提取液中的表面活性剂的种类与FN交叉反应性之间的关系
通过使用上述制作的检测装置改变添加到样本提取液中的表面活性剂的种类，并且证实其对血浆FN的交叉反应性的影响。除非另外指明，对于非离子表面活性剂的浓度，％表示％(w/v)。
1.试验方法
(1)样本制备
将正常人的血浆汇合物用下述fFN样本提取液稀释，以制备0.3％血浆的样本。
<fFN样本提取液的组成>
如表1所示，10mM PBS，1％BSA，1mM EDTA-2Na，非离子表面活性剂(0.1％，0.5％)。
[表1]
非离子表面活性剂
1 TritonX-114(现有技术)
2 TritonX-100
3 正庚基-β-D-硫代葡糖苷
4 正辛基-β-D-葡糖苷
5 吐温20
6 Brij35(Brij是商标)
(2)测量
将120μL的每种样本滴到检测装置上，并且10分钟后，用RAPIDPIA((注册商标)Sekisui Medical Co.，Ltd.)和软件(C10066)测量测试线和对照线的反射吸光度。
2.检测结果
结果显示在图1中。在该图中，在加入0.1％Triton X-114时与血浆FN的交叉反应性的结果由虚线表示。
在添加到样本提取液中的非离子表面活性剂中，Brij 35在以0.1％和0.5％加入时最大地抑制与血浆FN的交叉反应性。因此，在后续检测中，改变Brij 35的添加浓度，并且研究其对交叉反应性的抑制作用。
[实施例2]Brij 35的添加浓度与FN交叉反应性之间的关系
1.试验方法
以与实施例1相同的方式进行检测，不同之处在于，将正常人的血浆汇合物(pool)用含有0.2％、0.4％、0.5％、0.6％或0.8％Brij 35作为非离子表面活性剂的fFN样本提取液稀释，以将血浆的浓度调节为0.2％和0.5％。作为比较例，也检测添加Triton X-114的fFN样本提取液(现有技术)。
2.检测结果
结果显示在图2中。
与现有技术中添加0.1％Triton X-114相比，当Brij 35以0.4％至0.8％的浓度范围添加时，抑制与血浆FN的交叉反应性。
[实施例3]Brij链长与FN交叉反应性之间的关系
1.试验方法
以与实施例1相同的方式进行检测，不同之处在于，将正常人的血浆汇合物用含有0.1％或0.5％的表2所示的非离子表面活性剂的fFN样本提取液稀释，以将血浆的浓度调节为0.2％和0.3％。作为比较例，也检测添加0.1％或0.5％的Triton X-114的fFN样本提取液(现有技术)。
[表2]
2.检测结果
结果显示在图3中。
与相同浓度的Triton X-114相比，两个浓度的Brij 35(m＝23)和Brij O20(m＝20)都抑制与血浆纤连蛋白的交叉反应性，从而表现出高抑制作用。相反，与相同浓度的Triton X-114相比，0.5％Brij S100(m＝100)和Brij 93(m＝2)不能抑制与血浆纤连蛋白的交叉反应性，从而表现出低抑制作用。
[实施例4]EMULGEN链长与FN交叉反应性之间的关系
1.试验方法
以与实施例3相同的方式进行检测，不同之处在于，将正常人的血浆汇合物用包含表3所示的非离子表面活性剂的fFN样本稀释液稀释，以将血浆浓度调节为0.3％。
[表3]
2.检测结果
结果显示在图4中。
与相同浓度的Triton X-114相比，两个浓度的EMULGEN 108(m＝6)、EMULGEN 120(m＝12)、EMULGEN 123P(m＝23)、EMULGEN 420(m＝20)和EMULGEN 430(m＝30)都抑制与血浆纤连蛋白的交叉反应性，从而表现出高抑制作用。相反，与相同浓度的Triton X-114相比，0.5％EMULGEN 150(m＝47)抑制与血浆纤连蛋白的交叉反应性。
工业适用性
按照本发明，在利用免疫色谱检测癌胚纤连蛋白(fFN)的方法中，即使当fFN被血液污染时，也几乎不发生测量误差或假阳性反应，并且可以准确检测fFN。因此，可以提供POCT中常用的利用免疫色谱的针对先兆早产的检测试剂。
符号说明
(a)样品垫
(b)缀合物垫
(c)第三个垫
(d)固定有抗体的膜
(e)抗-fFN抗体
(f)吸收垫
(g)塑料粘合板
(h)塑料薄膜
(j)对照抗体

Claims (12)

1.一种利用免疫色谱检测癌胚纤连蛋白的检测方法，所述方法包括步骤(A)至(C)：
(A)向下述测试条的样品供给部提供样品和液体组合物，所述样品可能包含癌胚纤连蛋白和除癌胚纤连蛋白之外的纤连蛋白，所述液体组合物包含式(1)所示的非离子表面活性剂；
所述测试条包括由多孔体组成的膜，所述多孔体至少具备所述样品供给部、展开部和检测部，其中包含用标记物质标记的第一抗体的缀合物以可溶方式保留在所述展开部的一部分上，并且其中固定了第二抗体的所述检测部提供在所述展开部的相对于保留所述缀合物的部分的下游侧的一部分上，并且其中所述第一抗体和所述第二抗体中的任一种是抗-癌胚纤连蛋白抗体，并且另一种是结合癌胚纤连蛋白的抗体；
(B)使所述样品与所述缀合物接触；并且
(C)在所述检测部中检测所述样品中的癌胚纤连蛋白与所述缀合物的复合物：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
2.权利要求1的检测方法，其中所述液体组合物中所述表面活性剂的浓度在大于0.2％(W/V)并且小于1.0％(W/V)的范围内。
3.在利用免疫色谱测试条检测样品中的癌胚纤连蛋白的方法中减少交叉反应的方法，所述交叉反应是在癌胚纤连蛋白与除癌胚纤连蛋白之外的纤连蛋白之间的交叉反应，所述减少交叉反应的方法包括下述步骤：
(A)向下述测试条的样品供给部提供样品和液体组合物，所述样品可能包含癌胚纤连蛋白和除癌胚纤连蛋白之外的纤连蛋白，所述液体组合物包含式(1)所示的非离子表面活性剂；
所述测试条包括由多孔体组成的膜，所述多孔体至少具备所述样品供给部、展开部和检测部，其中包含用标记物质标记的第一抗体的缀合物以可溶方式保留在所述展开部的一部分上，并且其中固定了第二抗体的所述检测部提供在所述展开部的相对于保留所述缀合物的部分的下游侧的一部分上，并且其中所述第一抗体和所述第二抗体中的任一种是抗-癌胚纤连蛋白抗体，并且另一种是结合癌胚纤连蛋白的抗体；
(B)使所述样品与所述缀合物接触；并且
(C)在所述检测部中检测所述样品中的癌胚纤连蛋白与所述缀合物的复合物：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
4.权利要求3的减少交叉反应的方法，其中所述液体组合物中所述表面活性剂的浓度在大于0.2％(W/V)并且小于1.0％(W/V)的范围内。
5.用于癌胚纤连蛋白的免疫色谱检测试剂盒，其包括下述组件(1)和(2)：
(1)免疫色谱测试条，所述测试条包括由多孔体组成的膜，所述多孔体至少具备样品供给部、展开部和检测部，其中包含用标记物质标记的第一抗体的缀合物以可溶方式保留在所述展开部的一部分上，并且其中固定了第二抗体的所述检测部提供在所述展开部的相对于保留所述缀合物的部分的下游侧的一部分上，并且其中所述第一抗体和所述第二抗体中的任一种是抗-癌胚纤连蛋白抗体，并且另一种是结合癌胚纤连蛋白的抗体；和
(2)包含下式(1)所示的非离子表面活性剂的液体组合物：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
6.权利要求5的检测试剂盒，其中(2)所述的液体组合物用作展开液或样本提取液。
7.权利要求5或6的检测试剂盒，其中所述液体组合物中所述表面活性剂的浓度在大于0.2％(W/V)并且小于1.0％(W/V)的范围内。
8.用于利用免疫色谱检测癌胚纤连蛋白的液体组合物，所述液体组合物包含下式(1)所示的非离子表面活性剂：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
9.权利要求8的液体组合物，其中所述液体组合物用作展开液或样本提取液。
10.权利要求8或9的液体组合物，其中所述液体组合物中所述表面活性剂的浓度在大于0.2％(W/V)并且小于1.0％(W/V)的范围内。
11.用于检测癌胚纤连蛋白的样本提取液，其包含下式(1)所示的非离子表面活性剂：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
12.利用免疫色谱检测癌胚纤连蛋白的方法，所述方法包括使可能包含癌胚纤连蛋白和除癌胚纤连蛋白之外的纤连蛋白的样品与抗-癌胚纤连蛋白抗体在下式(1)所示的非离子表面活性剂的存在下接触：
R-O-(CH2CH2O)mH (1)
其中m是4至30，并且R表示烷基。
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