WO2019189874A1 - Ｄｕｐａｎ－２抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法。 - Google Patents

Ｄｕｐａｎ－２抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法。 Download PDF

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antibody
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sugar chain
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知啓 三浦
宮崎　修
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積水メディカル株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically reacts with DUPAN-2 antigen and a method for producing the same.
  • DUPAN-2 prepared using human pancreatic cancer cell culture HPAF-1 as an immunizing antigen is known to react with a mucin-like protein produced at a higher rate than pancreatic adenocarcinoma cells.
  • Sialic acid is considered to be related (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • This antigen is called DUPAN-2 antigen and is used as a marker for digestive system cancer such as pancreatic cancer and biliary tract cancer.
  • NCC-ST-439 antigen recognized by an antibody recognizing esophageal cancer tissue is a sugar chain antigen containing sialic acid, and is known to be elevated in gastric cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, etc. (Non-patent Document) 3).
  • antibodies that recognize sugar chain antigens used as tumor markers are generally isolated as those that recognize specific cancer cells as antigens, and their antigen specificity is not sufficient. Can react with a plurality of sugar chain antigens. Detection of a tumor marker using such an antibody has a problem that detection specificity is lowered and accuracy of cancer diagnosis is lowered.
  • An object of the present invention is to provide an antibody that specifically reacts with the sugar chain of DUPAN-2 antigen used as a tumor marker and a method for producing the same.
  • the present inventors succeeded in obtaining an antibody that specifically recognizes the DUPAN-2 antigen sugar chain itself as an antigen.
  • the antibody obtained by this method recognizes DUPAN-2 antigen highly specifically among mucin antigens used as various tumor markers and does not react with other tumor marker antigens such as NCC-ST-439.
  • this invention provides the following in one aspect
  • [5] A method for producing the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [4], The method comprising the step of immunizing an animal with the polymer compound bound to the DUPAN-2 antigen.
  • [6] A method for producing a cell that produces the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [4], The method comprising the step of immunizing an animal with the polymer compound bound to the DUPAN-2 antigen.
  • [7] The method according to [5] or [6] above, wherein the polymer compound bound to the DUPAN-2 antigen does not contain a peptide portion of the DUPAN-2 antigen-binding peptide.
  • An immunoassay method comprising using the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [3].
  • An immunoassay reagent comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [3].
  • the antibody of the present invention recognizes DUPAN-2 antigen highly specifically among mucin antigens used as tumor markers and does not react with other tumor marker antigens such as NCC-ST-439. Therefore, cancer cells that express the DUPAN-2 antigen, such as pancreatic cancer cells, can be specifically detected, enabling more accurate cancer diagnosis.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a method for producing an antibody that specifically reacts with DUPAN-2 antigen.
  • FIG. 2 is a diagram showing the test results of the antigen-immobilized ELISA method.
  • FIG. 3 is a figure which shows the result of the epitope analysis of the monoclonal antibody of this invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of specificity analysis of the monoclonal antibody of the present invention.
  • FIG. 5a is a graph showing the reactivity of the monoclonal antibody of the present invention against a DUPAN-22 standard.
  • FIG. 5b is a diagram showing the correlation between the absorbance measured using the monoclonal antibody of the present invention and the value of DUPAN-2 measured with an existing ELISA kit in a test using cancer patient serum.
  • an antibody and a compound “react” can be confirmed by an antigen-immobilized ELISA method, a competitive ELISA method, a sandwich ELISA method or the like well-known to those skilled in the art, as well as surface plasmon resonance (surface plasmon resonance). It can be performed by a method using the principle of resonance (SPR method).
  • the SPR method can be performed using an apparatus, a sensor, and reagents that are commercially available under the name Biacore (registered trademark).
  • “Substantially does not react” means that, for example, in the antigen-immobilized ELISA method, the binding between the antibody and the immobilized antigen is not substantially affected by the addition of the compound. It can be confirmed that "substantially does not react” by methods and means well known to those skilled in the art other than the above-described antigen-immobilized ELISA method.
  • an antibody “reacts specifically”, or “specificity” of an antibody is the ability of the antibody to detectably react with an epitope presented on an antigen, while other antigens The detectable reactivity with is relatively small or substantially no reactivity is detected. For example, when an antibody “reacts specifically” with a particular antigen, the antibody reacts with the antigen but does not react with other antigens. In a preferred embodiment, when an antibody “reacts specifically” with a specific antigen, for example, the interaction between the antibody immobilized on the antigen-immobilized ELISA method and the antibody is inhibited by the free antigen. It is not inhibited by other free antigens.
  • IC 50 of nonspecific antigen when showing the inhibition by the antigen-immobilized ELISA method with an IC 50 of free antigen for IC 50 of the specific antigen, IC 50 of nonspecific antigen, 10-fold, 100-fold, It may be 200 times, 300 times, 400 times, 500 times, 1000 times, or 10,000 times.
  • the IC 50 of a specific antigen when the IC 50 of a specific antigen is 1 / X of that of another antigen, the reactivity of the specific antigen can be expressed as X times the reactivity with respect to the other antigen.
  • the reactivity of the other antigen is less than 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% or 1% to the specific antigen.
  • the antibody of the invention reacts with the DUPAN-2 antigen and does not react with the NCC-ST-439 antigen.
  • antibody refers to an immunoglobulin molecule comprising four polypeptide chains, two heavy chains (H) and two light chains (L) linked together by disulfide bonds.
  • Each heavy chain comprises a changeable region of the heavy chain ( "HCVR” or “VH”) and a heavy chain constant region (including CH 1, CH 2 and CH 3 domains).
  • Each light chain includes a light chain changeable region (“LCVR” or “VL”) and a light chain constant region (CL).
  • the VH and VL regions can be further divided into hypermutable regions termed complementarity determining regions (CDRs) and interspersed in many conserved regions termed frameworks (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • Each VH and VL contains 3 CDRs and 4 FRs and is arranged from the amine terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the changeable regions of the heavy and light chains contain binding domains that interact with antigens.
  • the term “antibody” also includes all genetically modified antibodies, eg, prokaryotic expressed antibodies, non-glycosylated antibodies.
  • an “antigen-binding fragment” of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (eg, DUPAN-2).
  • binding fragments encompassed within an “antigen-binding fragment” of an antibody are: (i) a Fab fragment that is a monovalent fragment consisting of VL, VH, CL, and CH domains; (ii) hinge region A F (ab ′) 2 fragment, which is a divalent fragment comprising two Fab fragments joined by a disulfide bridge in FIG.
  • An “antigen-binding fragment” also includes (i) a binding domain polypeptide fused to an immunoglobulin hinge region polypeptide; (ii) an immunoglobulin heavy chain CH2 constant region fused to the hinge region; and (iii) a CH2 constant.
  • a binding domain immunoglobulin fusion protein comprising an immunoglobulin heavy chain CH3 constant region fused to the region.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that can be used in the present invention may be of any animal origin including birds and mammals.
  • the antibody or fragment is human, chimpanzee, rodent (eg, mouse, rat, guinea pig or rabbit), chicken, turkey, pig, sheep, goat, camel, cow, horse, donkey, cat or dog. Is the origin.
  • the antibodies of the present invention comprise chimeric molecules in which the constant region of an antibody derived from one species is combined with an antigen binding site derived from another species.
  • the antibodies of the invention include humanized molecules that combine antigen-binding sites of antibodies derived from non-human species (eg, mouse origin) and constant and framework regions of human origin.
  • the antibody of the present invention can be obtained from a hybridoma that expresses the antibody or a host cell that expresses the antibody by genetic recombination.
  • host cells for example, CHO cells, lymphocyte cells, bacterial cells such as E. coli, and fungal cells such as yeast can be used.
  • the antibody of the present invention can be produced in a non-human animal or plant that has been gene-transferred using a gene recombination technique.
  • hybridoma S19201R a monoclonal antibody produced by hybridoma S19201R is preferable.
  • the hybridoma S19201R is deposited internationally based on the Budapest Treaty as follows. Name of depositary institution: National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganisms Depository Center, Address of depositary institution: Room 2-5-8, Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture (zip code 292-0818), Deposit number: NITE BP --02721, date of deposit: May 17, 2018.
  • alkyl or alkyl group may be any of an aliphatic hydrocarbon group composed of a straight chain, a branched chain, a ring, or a combination thereof.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group is not particularly limited, and examples thereof include 1 to 20 carbon atoms (C1 to 20), 1 to 15 carbon atoms (C1 to 15), and 1 to 10 carbon atoms (C1 to 10). obtain.
  • the alkyl group may have one or more arbitrary substituents.
  • C1-8 alkyl includes methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neo-pentyl, n-hexyl, isohexyl, n -Heptyl, n-octyl and the like are included.
  • substituents examples include an alkoxy group, a halogen atom (which may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom), an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, or Although acyl etc. can be mentioned, it is not limited to these. When the alkyl group has two or more substituents, they may be the same or different.
  • alkylene means a divalent group consisting of a linear or branched saturated hydrocarbon.
  • a functional group when a functional group is defined as “may be substituted”, the type of substituent, the substitution position, and the number of substituents are not particularly limited, and two or more substitutions are made. If they have groups, they may be the same or different.
  • the substituent group include, but are not limited to, an alkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a halogen atom, a sulfo group, an amino group, an alkoxycarbonyl group, and an oxo group. These substituents may further have a substituent. Examples of such include, but are not limited to, a halogenated alkyl group.
  • DUPAN-2 antigen has been reported to be recognized by DUPAN-2 antibody (Kawa. S. et al. Pancreas (1994), 9 (6): 692-697)) It means a sugar chain having a structure.
  • NCC-ST-439 antigen is reported to be recognized by the NCC-ST-439 antibody (Kumamoto. K. et. Al. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998), 247. (2): 514-17) Means a sugar chain having the following structure.
  • DUPAN-2 antigen-binding peptide means a peptide to which DUPAN-2 antigen is bound, which is found in tumor cells in vivo.
  • Antibodies that specifically recognize the DUPAN-2 antigen of the present invention are obtained by the method outlined in FIG. Specifically, the conventional tumor marker-reactive antibody was isolated from the tumor cell itself as an antigen (FIG. 1A), but specifically reacts with the DUPAN-2 antigen according to the present invention.
  • the method for producing an antibody FIG. 1B
  • a sugar chain constituting a DUPAN-2 antigen is supported on a polymer compound via a linker, and this is immunized to a mammal such as a mouse.
  • a hybridoma is prepared by extracting spleen cells or lymph node cells of the animal and fusing them with myeloma cells by a known method described in Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). To do. From the prepared hybridoma cell population, those producing antibodies that react specifically with cancer cells are isolated. In the conventional method, it was necessary to analyze the epitope after the antibody was finally obtained, whereas in the method of the present invention, since the immunogen and the epitope match, the antibody can be efficiently produced. An antibody that specifically reacts with a specific sugar chain antigen can be obtained. However, advanced techniques are required in sugar chain synthesis.
  • the structure of the linker is not particularly limited, and for example, a C1-C12 optionally substituted alkyl group, alkylene group, ethylene glycol, polyethylene glycol, amino acid, peptide and the like can be used.
  • the high molecular compound is not particularly limited. Proteins such as blast growth factor, transferrin, platelet-derived growth factor, poly-L-lysine, poly-L-glutamine can be used.
  • the polymer compound to which the DUPAN-2 antigen of the present invention is bound may or may not contain a part of the DUPAN-2 antigen-binding peptide. In a preferred embodiment, the polymer compound to which the DUPAN-2 antigen of the present invention is bound does not contain a DUPAN-2 antigen-binding peptide moiety.
  • the hybridoma can be produced according to a method known in the art. For example, a polyethylene glycol method, a method using Sendai virus, a method using current, and the like can be employed.
  • the obtained hybridoma can be propagated according to a known method, and a desired hybridoma can be selected while confirming the properties of the produced antibody.
  • the hybridoma can be cloned by a known method such as a limiting dilution method or a soft agar method.
  • the obtained antibody can be obtained from the host cell by preparing a host cell that expresses the antibody by genetic recombination in addition to directly producing it from the hybridoma.
  • host cells for example, CHO cells, lymphocyte cells, bacterial cells such as E. coli, and fungal cells such as yeast can be used.
  • the method for producing the antibody is not limited to DUPAN-2 antigen, and can be used to produce an antibody specific to a sugar chain antigen of another known sugar chain protein.
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with the NCC-ST-439 antigen could be prepared by the same method.
  • the antibody of the present invention can be used in an immunoassay method for detecting DUPAN-2 antigen in a biological sample as a tumor marker.
  • various known methods for detecting mucin tumor markers in a biological sample using an antibody can be used, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), Immunofluorescence, immunoprecipitation, equilibrium dialysis, immunodiffusion, and other techniques can be used, but are not limited to these (eg, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, DM, Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston).
  • the antibody of the present invention can be used as an immobilized (solid phase) antibody immobilized on an insoluble carrier or a labeled antibody labeled with a labeling substance. Any of such immobilized antibodies and labeled antibodies are included in the scope of the present invention.
  • an immobilized antibody can be produced by physically adsorbing the antibody of the present invention to an insoluble carrier or by chemically binding it (may be via an appropriate spacer).
  • an insoluble carrier an insoluble carrier made of a polymer substrate such as polystyrene resin, an inorganic substrate such as glass, a polysaccharide substrate such as cellulose or agarose, or the like can be used.
  • the shape is not particularly limited, and any shape such as a plate shape (for example, a microplate or a membrane), a bead or fine particle shape (for example, latex particles or magnetic particles), or a tubular shape (for example, a test tube) can be selected.
  • a plate shape for example, a microplate or a membrane
  • a bead or fine particle shape for example, latex particles or magnetic particles
  • a tubular shape for example, a test tube
  • Examples of the labeling substance for producing the labeled antibody include enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, biotin, avidin, or radioisotopes, colloidal gold particles, and colored latex.
  • methods such as a glutaraldehyde method, a maleimide method, a pyridyl disulfide method, or a periodic acid method that can be used by those skilled in the art can be used.
  • an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase (hereinafter sometimes referred to as ALP) can be used as the labeling substance. .
  • the enzyme when the enzyme is a specific substrate (horseradish peroxidase (hereinafter sometimes referred to as HRP)), for example, 1,2-phenylenediamine (hereinafter sometimes referred to as OPD) or 3, 3
  • HRP horseradish peroxidase
  • OPD 1,2-phenylenediamine
  • 3 3
  • the enzyme activity can be measured using p-nitrophenyl phosphate or the like.
  • biotin is used as a labeling substance, avidin or enzyme-modified avidin is generally reacted.
  • the antibody of the present invention can be provided as an immunoassay reagent for use in the above immunoassay method.
  • the reagent may contain other components necessary for carrying out the immunoassay method, such as a buffer solution and a preservative.
  • the antibody of the present invention when it contains an enzyme as a labeling substance, it may be provided in the form of a kit together with a reagent containing the specific substrate.
  • PBST PBS containing 0.05% Tween® 20
  • BSA-PBST bovine serum albumin
  • Test Method S19201R It was confirmed by competitive ELISA described below whether the epitope of DUPAN-2 reacting with the antibody is similar to the existing DUPAN-2 antibody.
  • an ELISA plate was prepared in the same manner as the above-described antigen-immobilized ELISA method.
  • BSA-PBST as a solvent
  • the HRP-labeled existing antibody diluted 2 times, the S19201R antibody-producing hybridoma culture supernatant diluted 2-8 times, and the hybridoma culture supernatant producing a control antibody that does not react with DUPAN-2 were mixed. . These are mixed liquids.
  • Each well of the ELISA plate was washed 3 times with 400 ⁇ L of PBST, and then the above-mentioned mixed solution was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the absorbance depends on the amount of HRP-labeled existing antibody bound to the conjugate of DUPAN-2 and BSA immobilized on the plate.
  • the decrease in absorbance due to the addition of the S19201R antibody means that the S19201R antibody in the solution binds in the vicinity of the binding site between the HRP-labeled existing antibody and the conjugate and inhibits the binding between the HRP-labeled existing antibody and the conjugate. Indicates that Therefore, it was found that the S19201R antibody recognizes an epitope similar to that of the existing DUPAN-2 antibody.
  • Test Method S19201R antibody specificity was confirmed by a competitive ELISA described below.
  • an ELISA plate was prepared in the same manner as the above-described antigen-immobilized ELISA method.
  • the S19201R antibody-producing hybridoma culture supernatant diluted 8-fold using BSA-PBST as a solvent and the HRP-labeled existing antibody diluted 2-fold with NCC-ST-439 glycopeptide prepared to 0.1-10 ⁇ g / mL and BSA conjugate, DUPAN-2 sugar maleimide and BSA conjugate and purified sugar chain Sialyl Lewis X (sLex) were mixed. These are mixed liquids.
  • Each well of the ELISA plate was washed 3 times with 400 ⁇ L of PBST, and then 50 ⁇ L / well of each of the above-mentioned S19201R antibody-producing hybridoma culture supernatant and each sugar chain-related compound was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour. . To other wells, 50 ⁇ L / well of BSA-PBST was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the wells into which the S19201R antibody-producing hybridoma culture supernatant and each sugar chain-related compound mixture were dispensed were washed three times with PBST 400 ⁇ L, and then diluted HRP-labeled rat IgG (H & L) 5000 times with BSA-PBST. Were dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Of each well, 50 ⁇ L / well of BSA-PBST was dispensed at 50 ⁇ L / well, and 50 ⁇ L / well of a mixture of HRP-labeled DUPAN-2 antibody and each sugar chain-related compound was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour. did.
  • each well was washed three times with 400 ⁇ L of PBST, 50 ⁇ L of citrate buffer (pH 5.0) containing 0.2% orthophenylenediamine and 0.02% hydrogen peroxide was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 50 ⁇ L of 1.5 N sulfuric acid was added to stop the enzyme reaction, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured.
  • citrate buffer pH 5.0
  • test Method It was tested whether DUPAN-2 contained in the serum sample could be measured by sandwich ELISA using S19201R antibody. Details of the sandwich ELISA are as follows. (2-1) Preparation of sandwich ELISA plate S19201R antibody-containing solution was dissolved in 20 mM phosphate buffer (pH 7.2; hereinafter referred to as PBS) containing 150 mM sodium chloride so as to be 5 ⁇ g / mL. 50 ⁇ L was dispensed into each well of a 96-well microplate and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • PBS phosphate buffer
  • PBST PBS containing 0.05% Tween® 20
  • BSA-PBST bovine serum albumin
  • Each well was washed with 400 ⁇ L of PBST three times, and then 50 ⁇ L of HRP-labeled streptavidin diluted to 0.2 ⁇ g / mL with BSA-PBST was dispensed into each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Each well was washed with 400 ⁇ L of PBST three times, 50 ⁇ L of citrate buffer (pH 5.0) containing 0.2% orthophenylenediamine and 0.02% hydrogen peroxide was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • the enzyme reaction was stopped by adding 50 ⁇ L of 5N sulfuric acid, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured.
  • the DUPAN-2 concentration was measured using the absorbance measured using a standard as a calibration curve.
  • FIGS. 5a A sandwich ELISA using the S19201R antibody confirmed the concentration-dependent increase in absorbance of the standard product (FIG. 5a). That is, this indicates that the S19201R antibody reacts with the DUPAN-2 antigen in the standard product. Furthermore, the correlation coefficient of the approximate line between the DUPAN-2 concentration in the serum of cancer patients measured with an existing ELISA kit and the DUPAN-2 concentration in the serum of cancer patients measured by sandwich ELISA using the S19201R antibody is 0.99 or more (FIG. 5b). That is, it was shown that the S19201R antibody can measure DUPAN-2 in the serum of cancer patients like the existing DUPAN-2 antibody.

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Abstract

【課題】　腫瘍マーカーとして使用される糖鎖抗原を認識する抗体の抗原特異性は十分ではなく、このような抗体を用いた腫瘍マーカーの検出では、検出特異性が低下し、癌診断の正確性が低下する問題があった。 【解決手段】　上記課題を解決するため、本発明は、腫瘍マーカーとして利用されるＤＵＰＡＮ－２抗原の糖鎖に特異的に反応する抗体およびその製造方法を提供する。

Description

ＤＵＰＡＮ－２抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法。
　本発明は、ＤＵＰＡＮ－２抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体およびその製造方法に関する。
　近年、腫瘍マーカーとして使用される糖鎖抗原に対する抗体が多数報告されている。ヒト膵癌培養細胞ＨＰＡＦ－１を免疫抗原として作製したモノクローナル抗体ＤＵＰＡＮ－２は、膵腺癌細胞より高率に産生されるムチン様タンパク質と反応することが知られており、その抗原決定基にはシアル酸が関係していると考えられている（非特許文献１、２）。当該抗原は、ＤＵＰＡＮ－２抗原と呼ばれ、特に膵癌、胆道系癌などの消化器系癌のマーカーとして用いられている。
　また、食道癌組織を認識する抗体が認識するＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原はシアル酸を含む糖鎖抗原であり、胃癌、肺癌、乳癌、膵癌などで上昇することが知られている（非特許文献３）。
　一方、これらの腫瘍マーカーとして使用される糖鎖抗原を認識する抗体は、一般的に特定の癌細胞全体を抗原として認識するものとして単離されたものであり、その抗原特異性は十分ではなく、複数の糖鎖抗原と反応し得る。このような抗体を用いた腫瘍マーカーの検出では、検出特異性が低下し、癌診断の正確性が低下する問題があった。
　したがって、腫瘍マーカーを利用した、より正確な診断を行うためには、特定の糖鎖抗原に特異的に反応する抗体を得ることが必要とされていた。
臨床病理、１９８６年，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．６，ｐｐ．７０５－７１０ 癌と化学療法、１９８６年，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１１，ｐｐ．３２０７－３２１４ ＧＡＮＮ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４年，Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．６，ｐｐ．４８５－４８８
本発明は、腫瘍マーカーとして利用されるＤＵＰＡＮ－２抗原の糖鎖に特異的に反応する抗体およびその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、ＤＵＰＡＮ－２抗原の糖鎖自体を抗原として使用し、これを特異的に認識する抗体を得ることに成功した。当該方法で得られた抗体は、各種腫瘍マーカーとして用いられるムチン抗原の中でも、ＤＵＰＡＮ－２抗原を高度に特異的に認識し、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９等の他の腫瘍マーカー抗原と反応しない。
　すなわち、本発明は一態様において以下のものを提供する。
[１]下記糖鎖構造を有するＤＵＰＡＮ－２抗原
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
と反応し、かつ
下記糖鎖構造を有するＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
と反応しない抗体およびその抗原結合フラグメント。
[２]ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原に対する反応性が、ＤＵＰＡＮ－２抗原に対する反応性の１０％未満である、[１]に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[３]ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原に対する反応性が、ＤＵＰＡＮ－２抗原に対する反応性の１％未満である、[１]に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[４]ラット抗体である、[１]～[３]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
[５]前記[１]～[４]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
　前記ＤＵＰＡＮ－２抗原を結合した高分子化合物を動物に免疫する工程を含む、前記方法。
[６]前記[１]～[４]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する細胞を製造する方法であって、
　前記ＤＵＰＡＮ－２抗原を結合した高分子化合物を動物に免疫する工程を含む、前記方法。
[７]前記ＤＵＰＡＮ－２抗原と結合した高分子化合物が、ＤＵＰＡＮ－２抗原結合ペプチドのペプチド部分を含まない、前記[５]または[６]に記載の方法。
[８]前記[１]～[３]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを用いることを特徴とする、免疫測定方法。
[９]前記[１]～[３]のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、免疫測定試薬。
　本発明の抗体は、腫瘍マーカーとして用いられるムチン抗原の中でも、ＤＵＰＡＮ－２抗原を高度に特異的に認識し、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９等の他の腫瘍マーカー抗原と反応しない。したがって、ＤＵＰＡＮ－２抗原を発現する癌細胞、例えば膵癌細胞などを特異的に検出することが可能であり、より正確ながん診断を可能とする。
　また、本発明の腫瘍マーカーとして用いられるムチン抗原を特異的に認識する抗体の作製方法を利用することにより、特定の腫瘍マーカーに高度に特異的に反応する抗体を取得することが可能となる。
図１は、ＤＵＰＡＮ－２抗原と特異的に反応する抗体の作製方法の概略を示す図である。 図２は、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の試験結果を示す図である。 図３は、本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析の結果を示す図である。 図４は、本発明のモノクローナル抗体の特異性分析の結果を示す図である。 図５ａは、本発明のモノクローナル抗体のＤＵＰＡＮ－２２標準品に対する反応性を示す図である。 図５ｂは、癌患者血清を用いた試験における、本発明のモノクローナル抗体を使用して測定した場合の吸光度と、既存ＥＬＩＳＡキットで測定したＤＵＰＡＮ－２の値の相関を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　（定義）
　特に指示がない場合、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解される意味を有する。
　本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
　本明細書において、抗体とある化合物が「反応する」、「反応性を示す」、「反応性を有する」、「結合する」、あるいは抗体がある化合物を「認識する」と表現する場合、本発明の分野で通常使用される意味を含み、いずれも同義で用いる。抗体とある化合物とが「反応する」か否かの確認は、当業者に周知の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
　本明細書において、本発明の抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明の抗体とある化合物とが実質的に反応しないことをいう。「実質的に反応しない」とは、例えば、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、当該化合物の添加によって、抗体と固相化抗原の結合が実質的に影響を受けないことを意味する。上記抗原固相化ＥＬＩＳＡ法以外の当業者に周知の方法・手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できる。
　本明細書において、抗体が「特異的に反応する」こと、または抗体の「特異性」は、抗体が検出可能に抗原上に提示されたエピトープに反応する能力であって、一方でその他の抗原との検出可能な反応性が比較的小さいか実質的に反応性が検出されないことをいう。例えば、抗体が特定の抗原に「特異的に反応する」場合、当該抗体は当該抗原に反応する一方、他の抗原には反応しない。好ましい態様において、抗体が特定の抗原に「特異的に反応する」場合、例えば抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において固定化された当該抗原と当該抗体の相互作用が遊離の当該抗原によって阻害される一方で、他の遊離抗原によっては阻害されない。例えば、上記抗原固相化ＥＬＩＳＡ法による阻害を遊離抗原のＩＣ５０で表した場合、当該特異的な抗原のＩＣ５０に対して、非特異的な抗原のＩＣ５０は、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、１００００倍であってもよい。また、特異的な抗原のＩＣ５０が他の抗原の１／Ｘである場合、当該特異的な抗原の反応性を、他の抗原に対する反応性のＸ倍であると表現することもできる。好ましくは、他の抗原の反応性は、特異的な抗原に対して２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満である。本発明の好ましい態様において、本発明の抗体は、ＤＵＰＡＮ－２抗原に反応し、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原に反応しない。
　本明細書において、「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合で相互に連結された２つの重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）を含む免疫グロブリン分子を意味する。各重鎖は、重鎖の変更可能領域（「ＨＣＶＲ」又は「ＶＨ」）及び重鎖の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）を含む。各軽鎖は、軽鎖の変更可能領域（「ＬＣＶＲ」又は「ＶＬ」）及び軽鎖の定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名される超変異性の領域に分割され、フレームワーク（ＦＲ）と命名される多く保存できる領域に散在され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、アミン末端からカルボキシ末端に次の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の変更可能領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。用語「抗体」は、また、抗体の全ての遺伝子組替え体、例えば、原核生物で発現する抗体、グリコシル化されていない抗体を含む。
　また、Ｐａｄｌａｎ（１９９５　ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　９：１３３－１３９）、Ｖａｊｄｏｓ　ｅｔ　ａｌ．　２００２　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　３２０：４１５－４２８に示されるように、実際にはＣＤＲ残基の一部のみが抗原に接触することが知られており、抗原に接触しないＣＤＲ残基は、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側に存在するＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデリングにより、または経験的に特定できる。ＣＤＲ又はその一つ又は複数の残基が除去される場合、それは、普通は、別のヒト抗体配列又はそのような配列のコンセンサスにおいて対応する位置を占めるアミノ酸で置換される。ＣＤＲ及びアミノ酸内で置換する位置は、また、経験的に選択できる。経験的置換は保存的又は非保存的置換であってもよい。
　本明細書において、抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原（例えば、ＤＵＰＡＮ－２）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを意味する。抗体の「抗原結合フラグメント」内に包含される結合フラグメントの非限定的な例は：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインより成る１価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨドメインより成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインより成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインより成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：　５４４－５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｖｉｉ）合成リンカーで、場合により、結合されてもよい２つ又はそれ以上の単離されたＣＤＲの組合せ；を含む。また、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られるように、遺伝子組み換え法を用いて、合成リンカーによりＶＬ及びＶＨ領域を対に形成する単一タンパク質鎖として作ることもできる（Ｂｉｒｄ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２：　４２３－４２６；　ａｎｄ　Ｈｕｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８８）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８５：　５８７９－５８８３）。また、「抗原結合フラグメント」は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド；（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域；を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であってもよい。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られる。
　本発明に使用可能な抗体又はその抗原結合フラグメントは、鳥、哺乳類を含むいかなる動物起源であってもよい。好ましくは、抗体又はフラグメントは、ヒト、チンパンジ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、又はウサギ）、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ起源である。本発明の抗体は、ある種から誘導された抗体の定常領域が、他種から誘導された抗原結合サイトと組み合わされたキメラ分子を含む。更に、本発明の抗体は、非ヒト種（例えば、マウス起源）から誘導された抗体の抗原結合サイトと、ヒト起源の定常領域とフレームワーク領域を組合せたヒト化分子を含む。
　本発明の抗体は、当該抗体を発現するハイブリドーマ、または、遺伝子組み換えにより当該抗体を発現するホスト細胞から得ることができる。ホスト細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞、大腸菌などの細菌細胞、及び酵母などの真菌細胞を用いることができる。
　また、本発明の抗体は、遺伝子組み換え技術を用いて遺伝子導入された非ヒト動物又は植物において製造することができる。
　本発明における抗体として、例えばハイブリドーマＳ１９２０１Ｒが産生するモノクローナル抗体が好ましい。上記ハイブリドーマＳ１９２０１Ｒは下記のようにブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
　寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター、寄託機関の住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室（郵便番号２９２－０８１８）、受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７２１、寄託日：２０１８年５月１７日。
　本明細書において、「アルキル又はアルキル基」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１～２０個（Ｃ１～２０）、炭素数１～１５個（Ｃ１～１５）、炭素数１～１０個（Ｃ１～１０）であり得る。
　アルキル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。例えば、Ｃ１～８アルキルには、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル等が含まれる。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
　本明細書中において、「アルキレン」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素からなる二価の基を意味する。
　本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
　本明細書において、「ＤＵＰＡＮ－２抗原」は、ＤＵＰＡＮ－２抗体が認識すると報告されている（Ｋａｗａ．　Ｓ．　ｅｔ．ａｌ．　Ｐａｎｃｒｅａｓ（１９９４），　９（６）：　６９２－６９７））下記の構造を有する糖鎖を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　本明細書において、「ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原」は、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗体が認識すると報告されている（Ｋｕｍａｍｏｔｏ．　Ｋ．　ｅｔ．ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　（１９９８），　２４７（２）：　５１４－１７）下記の構造を有する糖鎖を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　本明細書において、「ＤＵＰＡＮ－２抗原結合ペプチド」とは、生体内の腫瘍細胞などで発見される、ＤＵＰＡＮ－２抗原が結合したペプチドを意味する
（ＤＵＰＡＮ－２抗原と特異的に反応する抗体の作製方法）
　本発明のＤＵＰＡＮ－２抗原を特異的に認識する抗体は、図１に概要を示す方法で取得される。具体的には、従来の腫瘍マーカー反応性抗体が、腫瘍細胞自体を抗原として単離されたものであったのに対して（図１Ａ）、本発明によるＤＵＰＡＮ－２抗原と特異的に反応する抗体を作製する方法では（図１Ｂ）、ＤＵＰＡＮ－２抗原を構成する糖鎖を、リンカーを介して高分子化合物に担持させ、これをマウス等の哺乳動物に免疫する。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））などに記載される既知の方法により、当該動物の脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、ミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを作製する。作製したハイブリドーマ細胞集団から、癌細胞と特異的に反応する抗体を産生するものを単離する。
　従来の方法では、最終的に抗体が取得されてからエピトープを解析する必要があったのに対して、本件発明の方法では免疫原とエピトープが一致しているため効率的に抗体作製可能であり、特定の糖鎖抗原と特異的に反応する抗体を取得することができる。但し、糖鎖合成において高度な技術を必要とする。
　リンカーの構造は特に限定されないが、例えば、Ｃ１～Ｃ１２の置換されてもよいアルキル基、アルキレン基、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチドなどを用いることができる。
　高分子化合物は特に限定されないが、例えば、アルブミン、オボアルブミン、緑膿菌外毒素、破傷風毒素、リシン毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素、易熱性エンテロトキシン、キーホールリンペットヘモシアニン、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、血小板由来増殖因子、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－グルタミンなどのタンパク質を用いることができる。
　本発明のＤＵＰＡＮ－２抗原が結合した高分子化合物は、ＤＵＰＡＮ－２抗原結合ペプチドの一部を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。好ましい態様において、本発明のＤＵＰＡＮ－２抗原が結合した高分子化合物は、ＤＵＰＡＮ－２抗原結合ペプチド部分を含まない。
　ハイブリドーマの作製は、当該分野で公知の方法に従って行うことができ、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは、公知の方法に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの公知の方法により行うことが可能である。
　得られた抗体は、上記ハイブリドーマから直接産生する以外に、遺伝子組み換えにより当該抗体を発現するホスト細胞を調製し、当該ホスト細胞から得ることができる。ホスト細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞、リンパ球細胞、大腸菌などの細菌細胞、及び酵母などの真菌細胞を用いることができる。
　なお、上記抗体の作製方法は、ＤＵＰＡＮ－２抗原に限定されず、他の公知の糖鎖タンパク質の糖鎖抗原に対して特異的な抗体を作製するために用いることができる。例えば、同様の方法により、上記ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を作製することができた。
（本発明の抗体の用途）
　本発明の抗体は、腫瘍マーカーの検出として、生体試料中のＤＵＰＡＮ－２抗原を検出するための免疫測定方法に用いることができる。具体的には、抗体を用いて生体試料中のムチン腫瘍マーカーを検出するための様々な公知の方法を利用することができ、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法、免疫沈降法、平衡透析、免疫拡散法およびその他の技法をもちいることができるが、これらに限定されない（例えばＨａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ参照）。一つの態様において、本発明の抗体は、不溶性担体上に固定された固定（固相）化抗体や、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体はいずれも本発明の範囲に包含される。例えば、不溶性担体に本発明の抗体を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合（適当なスペーサーを介してもよい）させることにより固定化抗体を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることがでる。その形状は特に限定されず、板状（例えば、マイクロプレートやメンブレン）、ビーズあるいは微粒子状（例えば、ラテックス粒子や磁性粒子）、筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。
　標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックスなどが挙げられる。標識物質と抗体との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができる。固定化抗体や標識抗体の種類、及びそれらの製造方法は特に限定されることはなく、例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰということがある）などの酵素を標識物質として用いることができる。この場合、当該酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰということがある）の場合には、例えば１，２－フェニレンジアミン（以下、ＯＰＤということがある）あるいは３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＡＬＰの場合には、ｐ－ニトロフェニルホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができる。ビオチンを標識物質として用いる場合にはアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。
　本発明の抗体は、上記免疫測定方法に用いるための免疫測定試薬として提供され得る。当該試薬は、本発明の抗体に加えて、当該免疫測定方法の実施に必要な他の構成要素、例えば、緩衝液、保存剤等を含んでもよい。
　一態様において、例えば本発明の抗体が酵素を標識物質として含む場合には、その特異的基質を含む試薬と共に、キットの形態で提供されてもよい。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
〔試験例１〕ＤＵＰＡＮ－２抗原特異的なモノクローナル抗体の製造
１．材料
（１）ＤＵＰＡＮ－２修飾マレイミド、各種糖鎖関連化合物
（２）フロインド完全アジュバント：和光純薬工業社製，０１４－０９５４１
（３）ミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）
（４）ＲＰＭＩ１６４０，　ＧｌｕｔａＭＡＸ：ＧＩＢＣＯ社製，６１８７０－０３６
（５）Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　（ＦＢＳ）：ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ社製，０４－００１－１Ａ
（６）ＨＡＴ　培地：コスモバイオ社製，１６２１３００８
（７）９６穴プレート：ＮＵＮＣ，１６７００８
（８）ＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製，３０５０－０５
（９）「デタミナー（登録商標）ＤＵＰＡＮ－２」（既存ＥＬＩＳＡキット；協和メデックス社製）：構成試薬としてＨＲＰ標識ＤＵＰＡＮ－２抗体（ＨＲＰ標識既存抗体）およびＤＵＰＡＮ－２標準品を含む。
２．免疫原用ＤＵＰＡＮ－２修飾マレイミド架橋タンパク質の調製
　糖鎖修飾マレイミドの架橋は、ヒトトランスフェリンを還元し、還元されたヒトトランスフェリンと糖鎖マレイミドとを重量比４：１にてＰＢＳ中で混合し、室温で２時間反応させ、４℃で一晩放置した。その後、透析によりバッファーをＰＢＳに置換し、免疫用コンジュゲート液とした。
３．抗ＤＵＰＡＮ－２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
（３－１）動物への免疫
　前記免疫用コンジュゲート液（０．２～２ｍｇ／ｍｌ）とフロインド完全アジュバンドを等量ずつ混合して調製したエマルジョンを用い、Ｆ３４４ラットに１匹あたり１０～４０μｇを注射した。さらに、１週間の間隔で７～８回、該エマルジョンの注射を繰り返した。尾部静脈より採血して得た抗血清中の抗体価を、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（３－２）１次スクリーニング（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）
　前記免疫動物抗血清中の抗ＤＵＰＡＮ－２抗体の存在を、免疫用コンジュゲート液と同様の方法で作製した、ＤＵＰＡＮ－２とＢＳＡとのコンジュゲート液を固相化したＥＬＩＳＡ法（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）で確認した。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を以下の通り行った
（３－２－１）抗原固相化ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
　ＤＵＰＡＮ－２とＢＳＡとのコンジュゲート液を１μｇ／ｍＬになるよう、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解し、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウエルに分注して、室温で２時間又は４℃で一晩静置した。
　前記各ウエルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳＴという）１００μＬを加え、室温で１時間又は４℃で一晩ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。
（３－２－２）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
　前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで１５００倍から１３５００倍に希釈した免疫動物抗血清及び非免疫動物血清５０μＬを前記各ウエルに添加し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識ラットＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）を５０μＬ前記各ウエルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
（３－２－３）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の試験結果
　結果を図２に示す。非免疫動物血清と比較して免疫動物抗血清は何れも希釈倍率が低いほど、高い吸光度を示した。この測定系では、吸光度は動物の血清中に含まれるＤＵＰＡＮ－２に対する抗体濃度に依存する。つまり、前述の結果は、免疫動物抗血清には非免疫動物の血清と比較して、より高い濃度のＤＵＰＡＮ－２に対する抗体を含み、抗体価が高いということを示している。測定の結果、抗体価の高かったラットから、脾臓もしくはリンパ節を摘出して、脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞を調製し、細胞融合に用いた。
（３－３）細胞融合
　前記脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞のいずれかとミエローマ細胞を細胞数で１対１の割合で混合し、電気融合した。該融合させた細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ２にて８日間培養して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。
（３－４）ハイブリドーマの選別（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）
　上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、免疫動物抗血清の代わりに融合細胞の培養上清を用いた以外は、同様の方法を行った。測定の結果、吸光度の高いウエルを抗ＤＵＰＡＮ－２抗体産生ハイブリドーマの存在するウエル（陽性ウエル）として選択した。
（３－５）クローニング
　上述の１次スクリーニング及び２次スクリーニングで選択された抗ＤＵＰＡＮ－２抗体産生株ハイブリドーマを用いて、ハイブリドーマの単クローン化とモノクローナル抗体の精製を行った。
　単クローン化は定法（限界希釈法）で行い、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法で陽性ウエルを選別し、最終的に１種の抗ＤＵＰＡＮ－２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。当該ハイブリドーマＳ１９２０１Ｒが産生するモノクローナル抗体を、Ｓ１９２０１Ｒ抗体と呼ぶ。
〔試験例２〕本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析
１．試験方法
　Ｓ１９２０１Ｒ抗体と反応するＤＵＰＡＮ－２のエピトープが、既存のＤＵＰＡＮ－２抗体と近似であるかについて、以下に記述する競合ＥＬＩＳＡにより確認した。先ず、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法でＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。また、ＢＳＡ－ＰＢＳＴを溶媒として、２倍希釈したＨＲＰ標識既存抗体と２－８倍希釈したＳ１９２０１Ｒ抗体産生ハイブリドーマ培養上清及びＤＵＰＡＮ－２に反応しないコントロール抗体を産生するハイブリドーマ培養上清を混合した。これらを混合液とする。ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、上述の混合液をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　次いで、前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間静置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
２．試験結果
　結果を図３に示す。コントロール抗体とＨＲＰ標識既存抗体を混合した場合には、吸光度の減少が観察されなかった。一方、Ｓ１９２０１Ｒ抗体とＨＲＰ標識既存抗体を混合した場合には、吸光度の減少が観察された。この測定系では、吸光度は、プレートに固相化したＤＵＰＡＮ－２とＢＳＡとのコンジュゲートに結合したＨＲＰ標識既存抗体の量に依存する。つまり、Ｓ１９２０１Ｒ抗体の添加により吸光度が減少するということは、溶液中のＳ１９２０１Ｒ抗体が、ＨＲＰ標識既存抗体とコンジュゲートとの結合部位近傍に結合し、ＨＲＰ標識既存抗体とコンジュゲートとの結合を阻害していることを示す。従って、Ｓ１９２０１Ｒ抗体は、既存のＤＵＰＡＮ－２抗体と近似のエピトープを認識することがわかった。
〔試験例３〕本発明のモノクローナル抗体の特異性分析
１．試験方法
　Ｓ１９２０１Ｒ抗体の特異性を、以下に記述する競合ＥＬＩＳＡにより確認した。先ず、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法でＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。また、ＢＳＡ－ＰＢＳＴを溶媒として、８倍希釈したＳ１９２０１Ｒ抗体産生ハイブリドーマ培養上清及び２倍希釈したＨＲＰ標識既存抗体を、０．１－１０μｇ／ｍＬに調製したＮＣＣ－ＳＴ－４３９の糖ペプチドとＢＳＡのコンジュゲート、ＤＵＰＡＮ－２の糖マレイミドとＢＳＡのコンジュゲート及び精製糖鎖Ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅｗｉｓ　Ｘ（ｓＬｅｘ）と混合した。これらを混合液とする。ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、上述、Ｓ１９２０１Ｒ抗体産生ハイブリドーマ培養上清と各糖鎖関連化合物の混合液をそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。その他のウエルにはＢＳＡ－ＰＢＳＴを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルのうちＳ１９２０１Ｒ抗体産生ハイブリドーマ培養上清と各糖鎖関連化合物の混合液を分注したウエルはＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識ラットＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルのうち、ＢＳＡ－ＰＢＳＴを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注したウエルにはＨＲＰ標識ＤＵＰＡＮ－２抗体と各糖鎖関連化合物の混合液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
　次いで、前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間静置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
２．試験結果
　結果を図４に示す。ＮＣＣ－ＳＴ－４３９及びＤＵＰＡＮ－２のコンジュゲートを混合し、Ｓ１９２０１Ｒ抗体を用いた場合には、ＤＵＰＡＮ－２のみで吸光度の減少が観察された（図４）。この測定系では、吸光度は、プレートに固相化したＤＵＰＡＮ－２とＢＳＡとのコンジュゲートに結合した抗体の量に依存する。つまり、各糖鎖関連化合物の添加により吸光度が減少するということは、溶液中の遊離の糖鎖関連化合物が、溶液中の抗体と反応し、抗体と固相化したコンジュゲートとの結合を阻害することを示している。
〔試験例４〕検体及び標準品に対する反応性
１．材料
１．ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製、２１１２６）　
２．試験方法
　Ｓ１９２０１Ｒ抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡにより、血清検体中に含まれるＤＵＰＡＮ－２を測定できるか試験した。サンドウィッチＥＬＩＳＡの詳細は以下である。
（２－１）サンドウィッチＥＬＩＳＡ用プレートの作製
　Ｓ１９２０１Ｒ抗体含有液を５μｇ／ｍＬになるよう、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解し、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウエルに分注して、室温で２時間静置した。
　前記各ウエルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳＴという）１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。
　（２－２）サンドウィッチＥＬＩＳＡ法
　前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで６倍または１２倍に希釈した１２例の癌患者血清５０μＬ及びＢＳＡ－ＰＢＳＴで段階希釈したＤＵＰＡＮ－２標準品を前記各ウエルに添加し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで２μｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識したＳ１９２０１Ｒを５０μＬ前記各ウエルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジンを５０μＬ前記各ウエルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウエルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、１．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。癌患者血清を用いた場合には、標準品を用いて測定した吸光度を検量線として、ＤＵＰＡＮ－２濃度を測定した。
３．試験結果
　結果を図５ａ，ｂに示す。Ｓ１９２０１Ｒ抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡにより、標準品の濃度依存的な吸光度の増大が確認された（図５ａ）。つまりこのことは、Ｓ１９２０１Ｒ抗体が標準品内のＤＵＰＡＮ－２抗原と反応していることを示す。更に、既存のＥＬＩＳＡキットで測定した癌患者血清中のＤＵＰＡＮ－２濃度とＳ１９２０１Ｒ抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡで測定した癌患者血清中のＤＵＰＡＮ－２濃度の近似直線の相関係数は０．９９以上であった（図５ｂ）。つまり、Ｓ１９２０１Ｒ抗体は既存のＤＵＰＡＮ－２抗体同様に癌患者血清中のＤＵＰＡＮ－２を測定できることが示された。
　以上具体例を用いて本発明を説明したが、本発明の範囲は上記具体例に限定されるものではない。当業者は本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることを理解する。

Claims (9)

  1. 　下記糖鎖構造を有するＤＵＰＡＮ－２抗原
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    と反応し、かつ
    下記構造を有するＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    と反応しない抗体およびその抗原結合フラグメント。
  2. 　ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原に対する反応性が、ＤＵＰＡＮ－２抗原に対する反応性の１０％未満である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 　ＮＣＣ－ＳＴ－４３９抗原に対する反応性が、ＤＵＰＡＮ－２抗原に対する反応性の１％未満である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 　ラット抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、
    　前記ＤＵＰＡＮ－２抗原を結合した高分子化合物を動物に免疫する工程を含む、前記方法。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する細胞を製造する方法であって、
    　前記ＤＵＰＡＮ－２抗原を結合した高分子化合物を動物に免疫する工程を含む、前記方法。
  7. 　前記ＤＵＰＡＮ－２抗原と結合した高分子化合物が、ＤＵＰＡＮ－２抗原結合ペプチドのペプチド部分を含まない、請求項５または６に記載の方法。
  8. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを用いることを特徴とする、免疫測定方法。
  9. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、免疫測定試薬。
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