CN110794144A - 用于检测诱导性免疫共刺激分子的试剂盒及其用途 - Google Patents

用于检测诱导性免疫共刺激分子的试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测诱导性免疫共刺激分子的试剂盒，本发明提供的试剂盒中的人源化单克隆抗体能够高强度、特异性与诱导性免疫共刺激分子结合，具有高效检测诱导性免疫共刺激分子表达相关疾病的辅助诊断作用。

Description

用于检测诱导性免疫共刺激分子的试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及体外检测领域，特别地涉及用于检测诱导性免疫共刺激分子的试剂盒及其用途。
背景技术
ICOS(Inducible co-stimulator)是最近发现的CD28家族的新分子，主要表达在活化的T细胞上，与表达在B细胞、巨噬细胞或树突状细胞表面的相应配体GL50分子相互作用，在机体的再次免疫阶段、炎症反应、自身免疫性疾病、肿瘤免疫和移植免疫中发挥了重要作用，展示了其潜在的应用前景。然而，ICOS-GL50在机体免疫调节中的分子机制尚待进一步阐明，更重要的是，目前对ICOS-GL50的功能研究主要集中在小鼠。
目前研究结果表明，ICOS是一种重要的共刺激分子，它在T细胞增殖和活化中，在Th1、Th2效应细胞发挥作用的过程中以及在T/B细胞协同作用、抗体产生和类型转换中，均发挥着至关重要的作用。
多种疾病的动物模型研究表明，以ICOS途径为靶点的免疫调节对包括自身免疫性疾病和移植免疫的长期耐受的形成均有着重要的临床治疗意义。ICOS是肿瘤微环境中一种新的免疫检查点抑制剂，也是肿瘤免疫治疗的新靶点，临床上急需开发针对患者生物学样品中灵敏度高，更快捷的方法以辅助诊断和预后。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供用于检测T细胞活化的V域免疫抑制因子的试剂盒。
本发明是以如下技术方案实现的：
用于检测诱导性免疫共刺激分子的试剂盒，将ICOS抗体包被板制成固相抗体，所述ICOS抗体包括：
包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列的CDR-L1，和/或
包含SEQ ID NO:02的氨基酸序列的CDR-L2，和/或
包含SEQ ID NO:03的氨基酸序列的CDR-L3，和/或
包含SEQ ID NO:04的氨基酸序列的CDR-H1，和/或
包含SEQ ID NO:05的氨基酸序列的CDR-H2，和/或
包含SEQ ID NO:06的氨基酸序列的CDR-H3。
进一步地，使用所述试剂盒的方法包括：将样品依次加入到抗体包被的微孔中，然后加入HRP标记的酶标液形成抗体-抗原-酶标记的复合物，彻底洗涤后加入TMB显色；TMB在HRP酶催化下呈蓝色，加入终止溶液后呈黄色，颜色深度与ICOS抗原含量呈正相关；测定溶液OD450nm，根据标准曲线定量计算ICOS蛋白含量。
进一步地，所述抗体选自单克隆抗体，特异性结合人ICOS的抗体片段，包含特异性结合人ICOS抗体片段的融合蛋白，鼠源抗体，人源化抗体，鼠源单克隆抗体，优选地，所述抗体为人源化单克隆抗体。
进一步地，所述抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列。
进一步地，所述抗体包含抗体轻链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列。
进一步地，所述抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
进一步地，所述抗体的生产步骤包括在培养基及合适的培养条件下培养含有表达上述抗体的核苷酸序列的宿主细胞，从所述培养基中和/或所述宿主细胞中通过常规方法回收并纯化抗体和/或抗原结合片段。
进一步地，所述试剂盒还包括酶标包被板、标品、标品缓冲剂、酶标液、样品稀释液、TMB显色剂、洗涤液、终止液。
进一步地，所述检测试剂盒辅助诊断肺癌胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤以及其他ICOS蛋白高表达的疾病类型；
优选地，所述检测试剂盒辅助诊断卵巢癌。
具体实施方式
定义
本发明术语“抗体”以最广泛的含义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体和抗体片段，只要它们表现出特定的抗原结合活性，本发明术语“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分，抗体片段包括但不限于Fv、Fab、Fab'、双特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和/或由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的类别是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本发明术语“IgG”是免疫球蛋白G(Immuno globulin G)的缩写。本发明术语“人源化”是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR对应于非人抗体的那些HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。
抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。
本发明术语“结合”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用。除非另有说明，本发明所述“结合力”是指结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示，亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量。
本发明术语“同一性”、“相似度”为比对序列并引入间隙以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。可以以本领域技术范围内的各种方式实现为了确定百分比氨基酸序列同一性的目的比对。
术语“特异性地结合”是指，抗体或其抗原结合片段“特异性地结合”另一分子的区域，具体地，是指相对于另外的表位与该表位更加频繁地、更加快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力或亲合力反应或结合。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段以至少10-7M的亲和力结合抗原，例如10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更高。优选地，抗体或其抗原结合片段在生理条件下(例如，在体内)结合。因此，特异性地结合到抗原是指该抗体或其抗原结合片段以上述特异性和/或在这样的条件下结合到抗原上的能力，适合于确定所述结合的方法是本领域已知的。
术语“结合”通常是指以对应于约10-6M或更小的KD的亲和力结合，该KD比该抗体对与除指定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原结合的亲和力低至少10倍，如低至少100倍、至少1,000倍。
如本文所用，术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数，所述值又称为koff值。
如本文所用，术语“ka”(M-1x sec-1或1/Msec)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数，所述值又称为kon值。。
如本文所用，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过kd除以ka获得。
如本文所用，术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数并且通过ka除以kd获得。
研究表明ICOS是肿瘤形成的关键因子。ICOS浓度肿瘤等疾病存在高度相关性。日前已有很多研究表明循环ICOS水平与肿瘤负荷相具有强关联性，并提示了ICOS水平为潜在的预后标志物显然，准确测量ICOS对理解其在许多生物学过程中的具有潜在的重要作用。测量内源ICOS水平的能力依赖于灵敏且特异性测定法的可获得性。针对ICOS的基于比色法、化学发光、及荧光测定的酶联免疫吸附测定法(ELISA)已有报道。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：
用6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)作为实验动物进行小鼠免疫试验。初次免疫使用50μg人ICOS蛋白(购自北京义翘神州)与完全弗氏佐剂混合形成乳剂，按1ml/只注射量注射小鼠腹腔，每隔2周用25μg人ICOS蛋白与不完全福氏佐剂充分混合形成乳液进行加强免疫，加强免疫三次，末次免疫1周后，收集小鼠静脉血并分离血清，通过ELISA方法测量抗体效价并选择具有高效价的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。
收集对数生长的骨髓瘤细胞(SP2/0)制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例混合在一起，用不完全培养液洗涤后离心8分钟弃上清，将细胞沉淀置于40℃水浴中预热，向细胞沉淀中加入预热至40℃的PEG-4000溶液1ml，出现颗粒后1min内向反应液中加入25ml预热至40℃的不完全培养基以终止反应。静置后加入2ml HAT培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮混匀，之后补充HAT培养基至离心管内的脾细胞浓度达到1.5×107/ml，将上述细胞悬浮液分装至96孔板培养并观察，待细胞表面积达到孔板面积1/2以上时，吸出上清液样品供抗体检测。
实施例2：
筛选杂交瘤培养上清液的抗人ICOS抗体。具体地，用缓冲液在96孔高吸附酶标板上包被人ICOS(购自北京义翘神州)，包被量100μL每孔，之后用缓冲液洗涤3次后；用含1％BSA的缓冲液阻断并于25℃孵育1h，阻断量280μL/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入75μL上清液样品(S1-S85)以及阳性血清(对照，CK1-5)，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL以比例1/10000稀释于含1％BSA缓冲液里的抗小鼠IgG抗体，所述抗小鼠IgG抗体被辣根过氧化物酶标记，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，30℃显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，根据OD450nm的强弱选取能够分泌人ICOS结合抗体的阳性克隆。
实施例3：
将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体DNA序列的测定。首先按照说明书使用RNA prep Pure试剂盒(Tiangen)提取细胞mRNA。之后使用Quant Script RT试剂盒(Tiangen)合成cDNA第一链。将逆转录产生的cDNA第一链用于后续PCR反应，将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中，挑取单克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。
经过PCR扩增得到抗体轻链可变区和抗体重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO:1；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2、CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的三个互补决定区CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源IgVH4-21*07、抗体重链恒定区序列鼠源IgVH2-09*01，轻链全长序列为将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接即得；重链全长序列为将抗体重链可变区和重链恒定区连接即得，将上述可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体TL10-11中(载体骨架pEGFP-N1，购自上海吉满生物)。
将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293F细胞系(购自上海纪宁生物科技)。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的表达培养基中，细胞密度为1.8×108细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为39.3μg/mL，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为30μg/mL。将上述混合物放入细胞培养箱37℃培养1小时，之后向培养液中加入新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清。
实施例4：
检测实施例1获得的抗人ICOS鼠源单抗(以下简称OM-anti-ICOS)与其抗原结合的动力学常数。利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离，简要地，将OM-anti-ICOS溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中并偶联到CM芯片上，用1M乙醇胺封闭，结合阶段将不同浓度的OM-anti-ICOS以22μL/min的速度注入3.0min，在解离阶段用PBS缓冲溶液以24μL/min的速度注入4.0min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore 3000软件进行分析计算。OM-anti-ICOS的结合动力学常数为3.51E+06(1/Ms)、解离动力学常数为4.68E-03(1/s)、解离平衡常数为1.33E-09(M)。
实施例5：
人源化形式的抗人ICOS抗体参考Molecule Immunol的制备方法制备，在Germline数据库中选取与OM-anti-ICOS非CDR区匹配最好的人源化模板，其中重链可变区的模板为人源IgVH4-28*03，轻链可变区的模板为人源IGKV1-16*02，将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换得到人源化抗体重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，替换得到人源化抗体轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。通过序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(VH)及轻链可变区氨基酸序列(VL)如表1所示。
表1.回复突变获得的氨基酸序列
VH SEQ ID NO
ORI SEQ ID NO:7
ICOS1-H SEQ ID NO:9
ICOS2-H SEQ ID NO:10
VL SEQ ID NO
ORI SEQ ID NO:8
ICOS1-L SEQ ID NO:11
ICOS2-L SEQ ID NO:12
将人源化的抗人ICOS单抗的重链可变区(SEQ ID NO：7-10)分别与人抗体IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:13)连接，分别得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人ICOS单抗的轻链可变区(SEQ ID NO：8-12)分别与人抗体Kappa轻链的恒定区(SEQ ID NO:14)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入TL10-11(载体骨架pEGFP-N1)载体中。
实施例6：
测定三种人源化ICOS单抗(ORI：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，ICOS1：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11，ICOS2：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12)与抗原ICOS蛋白的结合动力学常数，方法同实施例4，人源化ICOS单抗的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表2所示。
表2.人源化ICOS单抗与其抗原结合的动力学常数
Figure BDA0002243852150000081
由结果可见，人源化ICOS单抗与其抗原结合能力强。
实施例7：
为了确定ORI、ICOS1、ICOS2单抗的热稳定性，将ORI、ICOS1、ICOS2样品置于40℃高温条件下，在第2周、第3周分别取样进行SE-HPLC检测以观察热稳定性，测试采用色谱法，流动相为磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)，硫酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH6.7)；流速为0.6mL/min；色谱柱温度为27℃；样品池温度4℃；检测波长280nm；用缓冲液稀释样品至2mg/mL上样，体积20μL，用面积归一化法计算主峰比例处理数据，人源化ICOS单抗热稳定性测试结果如表3所示。
表3.人源化ICOS单抗热稳定性测试结果
Figure BDA0002243852150000082
热稳定性测试表明ORI单抗均显示出了优异的热稳定性。
实施例8：
ORI单抗用于制备检测试剂盒，具体方法为，将抗体包被板制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入样品，再加入HRP标记的酶标液，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在终止液作用下转化为黄色，颜色深浅与ICOS含量成正相关，利用酶标仪测定450nm波长下OD，通过标曲计算ICOS含量，本试剂盒采用新型人源化ICOS单抗，与人ICOS结合能力更强，结合速率更高，可用于快速、准确的ICOS含量检测，为辅助诊断ICOS相关疾病提供更灵敏、准确的数据，如表4所示，试剂盒具体地包括下表所述成分，保存条件为4℃。
表4.人ICOS高灵敏检测试剂盒
试剂盒组成 96孔
酶标包被板 1×96规格
TMB显色剂 5mL×2管
洗涤液 10mL×2管
终止液 5mL×2管
标品(500pg/mL) 1mL×2管
标品缓冲剂 10mL×1管
酶标液 1mL×2管
样品稀释液 10mL×1管
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 郑权
<120> 用于检测诱导性免疫共刺激分子的试剂盒及其用途
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<223> ICOS1-H
<400> 9
Asp Val Gln Lys Asn Leu Tyr Val Thr His Pro Glu Ile Val Phe Leu
1 5 10 15
Ser Glu His Trp Lys Cys Tyr Cys Glu Asn Gln Leu His Thr Tyr Gly
20 25 30
Asp Gly Met Tyr Gly Gln Glu Gly Ala Met Cys Ile Thr Thr Lys Met
35 40 45
Val Trp Lys Tyr Pro Asn His Arg Lys Pro Ser Arg Gly Thr Phe Glu
50 55 60
Asp Trp Asp Cys Thr Thr Tyr Leu Gln Lys Gly Gln His Asn Ile Thr
65 70 75 80
Pro Val Asp Ala Met Arg Ala Pro Trp Tyr Cys Lys Ala Ala Pro Arg
85 90 95
Trp Ala Phe Ala Leu Met Tyr His Cys Ile Val Gln Phe Thr
100 105 110
<210> 10
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> ICOS2-H
<400> 10
Asp Val Gln Lys Asn Leu Tyr Val Ala His Pro Glu Ile Val Phe Leu
1 5 10 15
Ser Glu His Trp Lys Asp Tyr Cys Glu Asn Gln Leu His Thr Tyr Gly
20 25 30
Asp Gly Met Tyr Gly Gln Glu Gly Ala Met Cys Ile Thr Thr Lys Met
35 40 45
Val Trp Lys Thr Pro Asn His Arg Lys Pro Ser Arg Gly Thr Phe Glu
50 55 60
Asp Trp Asp Cys Thr Thr Tyr Leu Gln Lys Gly Gln His Asn Ile Thr
65 70 75 80
Pro Val Asp Ala Met Arg Ala Pro Trp Tyr Cys Lys Asp Ala Pro Arg
85 90 95
Trp Ala Phe Ala Leu Met Tyr His Cys Ile Glu Gln Phe Thr
100 105 110
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> ICOS1-L
<400> 11
Phe Gly Thr Asp Gly Asp Phe Lys His Thr Met Ser Arg Asp Gly Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Ala Gln Lys Pro Asp Cys Met Ser Arg Asp Thr Pro Asn
20 25 30
Thr Glu His Met His Asp Met Ser Arg Trp Leu His Arg Met Ile His
35 40 45
Val Trp Ile Glu Ile Gly Ala Tyr Asn Gly Trp Pro Cys Ser Asn His
50 55 60
Val Gly Leu Ile Gln Gly Cys Thr Glu His Met His Val Trp Gln Pro
65 70 75 80
His Arg Asp Tyr Gly Ile Pro Gly Met Thr Lys Met Leu Lys Leu Asp
85 90 95
Glu Pro His Arg Met Ile His Gln Ile Glu Ile Ile
100 105
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> ICOS2-L
<400> 12
Ser Gly Thr Asp Gly Asp Phe Lys His Ala Met Ser Arg Asp Gly Ala
1 5 10 15
Tyr Leu Asn Ala Gln Lys Pro Asp Cys Met Ser Arg Asp Thr Pro Asn
20 25 30
Thr Glu His Met His Arg Met Ser Arg Leu Leu His Arg Met Ile His
35 40 45
Val Trp Ile Glu Ile Gly Ala Tyr Asn Gly Trp Pro Cys Ser Asn His
50 55 60
Val Gly Leu Ile Gln Gly Cys Thr Glu His Met His Val Trp Gln Pro
65 70 75 80
His Arg Asp Tyr Gly Ile Pro Gly Met Thr Arg Met Leu Lys Leu Asp
85 90 95
Glu Pro His Arg Met Ile His Asp Ile Glu Ile Gly
100 105
<210> 13
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CH
<400> 13
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> CL
<400> 14
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
20 25 30
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
35 40 45
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
50 55 60
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
85 90 95
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 110

Claims (9)

1.用于检测诱导性免疫共刺激分子的试剂盒，其特征在于，将ICOS抗体包被板制成固相抗体，所述ICOS抗体包括：
包含SEQ ID NO:01的氨基酸序列的CDR-L1，和/或
包含SEQ ID NO:02的氨基酸序列的CDR-L2，和/或
包含SEQ ID NO:03的氨基酸序列的CDR-L3，和/或
包含SEQ ID NO:04的氨基酸序列的CDR-H1，和/或
包含SEQ ID NO:05的氨基酸序列的CDR-H2，和/或
包含SEQ ID NO:06的氨基酸序列的CDR-H3。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，使用所述试剂盒的方法包括：将样品依次加入到抗体包被的微孔中，然后加入HRP标记的酶标液形成抗体-抗原-酶标记的复合物，彻底洗涤后加入TMB显色；TMB在HRP酶催化下呈蓝色，加入终止溶液后呈黄色，颜色深度与ICOS抗原含量呈正相关；测定溶液OD450nm，根据标准曲线定量计算ICOS蛋白含量。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体选自单克隆抗体，特异性结合人ICOS的抗体片段，包含特异性结合人ICOS抗体片段的融合蛋白，鼠源抗体，人源化抗体，鼠源单克隆抗体，优选地，所述抗体为人源化单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体包含抗体重链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VH序列。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体包含抗体轻链可变区氨基酸序列包括如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有至少99％序列同一性的VL序列。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体重链恒定区氨基酸序列如SEQID NO:7所示，所述抗体轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
7.根据权利要求1-6所述任一试剂盒，其特征在于，所述抗体的生产步骤包括在培养基及合适的培养条件下培养含有表达权利要求1-6所述抗体的核苷酸序列的宿主细胞，从所述培养基中和/或所述宿主细胞中通过常规方法回收并纯化抗体和/或抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标包被板、标品、标品缓冲剂、酶标液、样品稀释液、TMB显色剂、洗涤液、终止液。
9.根据权利要求1-8所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒辅助诊断肺癌胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤以及其他ICOS蛋白高表达的疾病类型；
优选地，所述检测试剂盒辅助诊断卵巢癌。
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