TW202210525A - 針對人類免疫球蛋白g之兔類抗體 - Google Patents

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Abstract

本揭露係衍生自兔類的抗人類IgG抗體及其抗原結合部分，以及使用該等抗體與部分的方法。

Description

針對人類免疫球蛋白G之兔類抗體
本揭露係衍生自兔類的抗人類IgG抗體及其抗原結合部分，以及使用該等抗體與部分的方法。
治療性單株抗體(mAb)近年來已成為增長最為迅速的藥物類別之一，並被批准用於治療從癌症到自體免疫疾病的廣泛適應症。這些治療性單株抗體的臨床前藥物動力學特徵通常必須在非人類靈長類動物中進行，以便在臨床研究開始之前證明效力和安全性。石蟹獼猴是此類臨床前研究的首選非人類靈長類動物，因為牠通常提供與治療性抗體標靶程度足夠的交叉反應性(Iwasaki et al.,Drug Metab Pharmacokinet . (2019) 34: 55-63)。然而，石蟹獼猴的免疫球蛋白與人類的免疫球蛋白也顯示出高度序列同源性。在血清中缺乏可區分人類治療性分子與石蟹獼猴免疫球蛋白的高品質試劑抗體對於在非人類靈長類動物血清樣品中生物分析測定人類治療性抗體來說構成了一個顯著挑戰，因為IgG的蛋白質序列同源性程度高(Stubenrauch et al.,J Pharm Biomed Anal . (2009) 49:1003-8)。
目前，在臨床前研究中，評估治療性抗體藥物動力學(PK)和藥效學(PD)依賴藥物特異性抗個體基因型抗體，這會費力費時開發。每種候選藥物將需要自身的抗個體基因型抗體。在臨床前研究中，能夠偵測所有基於人類IgG的治療性抗體的通用試劑的選項非常少。因此，需要開發對人類IgG具有普遍特異性但不結合猴IgG的單株抗體，以便於臨床前研究期間在非人類靈長類動物體內精確測量治療性人類IgG衍生的mAb含量。
本揭露提供特異性結合至人類IgG的經分離單株抗體或其抗原結合部分，其中該等抗體或部分包含重鏈互補決定區(CDR) 1-3和輕鏈CDR1-3，其分別包含SEQ ID NO：27-32、SEQ ID NO：33-38、SEQ ID NO：39-44、SEQ ID NO：45-50、SEQ ID NO：51-56，或SEQ ID NO：57-62。該等抗體可以是兔類抗體或由此類分子修飾而來(包括，例如具有來自非兔類物種，諸如小鼠、大鼠或人類的Fc域的嵌合抗體)。
在一些具體例中，本抗體或部分包含重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)，其分別包含SEQ ID NO：13和19、SEQ ID NO：14和20、SEQ ID NO：15和21、SEQ ID NO：16和22、SEQ ID NO：17和23，或SEQ ID NO：18和24。該等抗體可以是兔類抗體或由此類分子修飾而來。
在一些具體例中，本抗體包含SEQ ID NO：25的重鏈恆定區胺基酸序列，及/或SEQ ID NO：26的輕鏈恆定區胺基酸序列。在進一步的具體例中，在有或沒有前導序列的情況下，抗體包含分別具有以下胺基酸序列的重鏈和輕鏈：SEQ ID NO：63和69、SEQ ID NO：64和70、SEQ ID NO：65和71、SEQ ID NO：66和72、SEQ ID NO：67和73，或SEQ ID NO：68和74。
在某些具體例中，本抗體或抗原結合部分包含可偵測標記。
本揭露還提供一種組合物或套組，其包含在水性緩衝溶液中的本單株抗體或抗原結合部分。
在其他態樣中，本揭露提供一種編碼本單株抗體或抗原結合部分之重鏈、輕鏈，或兩者的經分離核酸分子。在一些具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，及/或12。在進一步的具體例中，核酸分子包含SEQ ID NO：1和7、SEQ ID NO：2和8、SEQ ID NO：3和9、SEQ ID NO：4和10、SEQ ID NO：5和11，或SEQ ID NO：6和12。本文也提供一種包含該核酸分子的表現構建體，以及包含編碼本單株抗體或抗原結合部分之重鏈與輕鏈之核苷酸序列的宿主細胞(例如，哺乳動物細胞)。本揭露還提供一種產生抗體或其抗原結合部分的方法，其包含在允許該抗體或部分之重鏈和輕鏈表現的條件下培養該宿主細胞，以及從細胞培養物的培養細胞或上清液分離該抗體或部分。
在另一個態樣中，本揭露提供一種在樣品中偵測人類IgG或其片段的方法，其包含使樣品與本文所述的一或多個單株抗體或抗原結合部分接觸。樣品(例如，組織樣品，諸如血液、血清或血漿樣品，或生檢樣品)可以從例如已被投予包含人類IgG恆定區(例如，人類IgG1、IgG2，IgG3或IgG4恆定區)的抗體或其片段(例如，Fab或F(ab')2片段)的動物取得。動物可以是例如非人類靈長類動物，諸如石蟹獼猴或恆河猴。
本發明的其他特徵、目的和優點在下面實施方式中是明顯的。然而，應當理解，實施方式雖然指示了本發明的具體例和態樣，但是僅透過說明而非限制的方式提供。從實施方式中，習於技藝者將清楚在本發明範疇內的各種變化和修改。
本揭露提供了兔類單株抗體，其以高親和力結合至人類免疫球蛋白G及其Fab片段，但在可偵測程度下不結合至非人類靈長類動物，諸如猴(例如，石蟹獼猴或恆河猴)的IgG。在石蟹獼猴或其他非人類靈長類動物的基於人類IgG之治療性抗體的臨床前藥理學研究中，這些兔類抗體尤其適合作為偵測人類IgG或其片段的試劑。例如，這些兔類抗體可用於研究治療性抗體，即完全人類IgG抗體、人類化IgG抗體、具有人類IgG恆定區的嵌合抗體及其Fab片段。本兔類抗體還可用於臨床前免疫組織化學研究中和基於人類IgG的治療性抗體(例如，完整抗體，包括單特異性、雙特異性和三特異性抗體，以及其Fab片段)的製程開發中。
本兔類單株抗體結合至人類IgG上的三個不同表位，這些表位與商購小鼠抗hIgG抗體MCA5748G所結合的表位另有不同。兔類單株抗體提供若干更甚於傳統小鼠單株抗體的優勢。這些優勢包括結合親和力和特異性更高，以及表位辨識更為多樣化。兔子的免疫系統在演化上與囓齒動物的免疫系統不同，它使用不同的機制來產生、多樣化和優化其產生的抗體的親和力。此外，兔子的免疫系統可以辨識在小鼠體內不具免疫原性的較小尺寸表位，同時保持產生強烈免疫反應的能力。因此，本文所述的兔類抗體優於小鼠抗體。 兔類抗hIgG抗體
本揭露提供特異性結合(即，以高親和力)結合至人類IgG及其抗原結合部分(例如Fab和F(ab')2)的抗體。這些抗體在可偵測程度下不會結合至臨床前研究中常用的其他物種(例如，諸如小鼠、大鼠、兔類、非人類靈長類動物、或狗)的免疫球蛋白(諸如IgG)。
如本文所用，術語「親和力」是指抗原和抗體之間吸引力的量度。抗體對抗原的內在吸引力通常表示為特定抗體-抗原交互作用的結合親和力平衡常數(KD )。當結合親和力高，也就是KD ≦100 nM(例如，≦10 nM或≦1 nM)，則抗體被認為特異性結合至抗原。可以例如透過表面電漿共振(Biacore®)，例如使用來自Biacore的Biacore® T200，來測量KD 結合親和力常數。特定抗體-抗原交互作用的結合親和力也可以透過標準濃度-反應曲線來顯示，例如使用Gyros Protein Technologies的GyrolabTM xPlore。在一些具體例中，於Biacore分析中，本抗體以不大於2 nM的KD 結合至人類IgG和由其衍生而來的Fab片段，同時沒有能夠偵測到結合至石蟹獼猴IgG。
本文例示的抗體結合至hIgG及其Fab片段上的三個不同表位。如本文所用，術語「表位」是指抗原特異性結合至抗體或相關分子(諸如雙特異性結合分子)的一部分(決定位)。表位決定位通常由分子的化學活性表面基團組成，諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。表位可以是「線性的」或「構形性的」。在線性表位中，蛋白質(諸如抗原)和交互作用分子(諸如抗體)之間的所有交互作用點沿著蛋白質的一級胺基酸序列線性發生。在構形性表位中，交互作用點發生在蛋白質上的胺基酸殘基上，這些胺基酸殘基在一級胺基酸序列中彼此分隔。一旦確定了抗原上的所需表位，就有可使用本技藝周知的技術產生針對該表位的抗體。例如，可以產生針對線性表位的抗體，例如，藉由用具有線性表位的胺基酸殘基的肽來免疫動物。可以產生針對構形性表位的抗體，例如，藉由用含有構形性表位的相關胺基酸殘基的微型結構域來免疫動物。也可以產生針對特定表位的抗體，例如，藉由用感興趣的目標分子(例如，IgG或Fab)或其相關部分來免疫動物，然後針對與表位的結合來進行篩選。
可以透過使用技藝中已知的方法(包括但不限於競爭分析、表位分級和丙胺酸掃描)，來確定抗體是否結合至與本揭露之抗hIgG抗體相同的表位或與其競爭結合。在一些具體例中，允許本揭露之抗hIgG抗體在飽和條件下結合至hIgG，然後測量測試抗體結合至hIgG的能力。如果測試抗體能夠與參考抗IgG抗體同時結合至hIgG，則測試抗體與參考抗IgG抗體結合不同的表位。但是，如果測試抗體不能同時結合至hIgG，則測試抗體結合至與本揭露之抗IgG所結合的相同表位、重疊表位或非常接近本揭露之抗IgG所結合之表位的表位。本實驗可以使用例如ELISA、RIA、BIACORETM 、SPR、生物層干涉術或流動式細胞測量術進行。為了測試抗hIgG抗體是否與另一種抗IgG抗體交叉競爭，可以在兩個方向上使用上述競爭方法，即確定已知抗體是否阻斷測試抗體，反之亦然。可以例如使用Biacore® T200儀器進行競爭實驗。
本文揭示的抗hIgG抗體的抗原結合部分可用於代替完整抗體。術語「抗原結合部分」是指抗體的一或多個部分或片段，其保有特異性結合至抗原(例如，人類IgG或其片段)的能力。抗原結合部分的實例是，但不限於(i) Fab片段：由VL、VH、CL和CH1域組成的單價片段；(ii) F(ab')2片段：包含藉由鉸鏈區處的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii) 由VH和CH1域組成的Fd片段；(iv) 由抗體單臂的VL和VH域組成的Fv片段；(v) dAb片段，由VH域組成；以及(vi)能夠特異性結合至抗原的經分離互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH是由個別的基因所編碼，但它們可以使用重組方法透過合成連接子而連接起來，使它們能夠成為單條蛋白質鏈，其中VL和VH域配對而形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv))。還包括其他形式的單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體是二價雙特異性抗體，其中VH和VL域在單一條多肽鏈上表現，但使用的連接子太短而無法使同一條鏈上的兩個結構域之間進行配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補域配對並產生兩個抗原結合位點。抗體部分，諸如Fab和F(ab')2 片段，可以使用常規技術從完整抗體製備而來，諸如完整抗體的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，或重組DNA技術。
本抗體結合至一個、多個、或所有人類IgG亞型hIgG1、hIgG2、hIgG3、和hIgG4。在某些具體例中，它結合所有該等亞型。應理解，本文所述的抗體還可結合至包含來自人類IgG的序列的人類化及/或嵌合抗體。
在一些具體例中，本揭露提供了抗hIgG單株抗體或其抗原結合部分，其重鏈CDR1-3和輕鏈CDR1-3分別包含SEQ ID NO：27-32、33-38、39-44、45-50，51-56或57-62。這個抗體的框架可以從兔類或另一個物種(例如，小鼠、人類，或大鼠)的抗體衍生而來。
在一些具體例中，本揭露提供抗hIgG單株抗體或其抗原結合部分，其重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)分別包含SEQ ID NO:13和19、14和20、15和21、16和22、17和23、或18和24。此抗體的恆定區可以從兔類或另一個物種(例如，小鼠、人類或大鼠)的抗體衍生而來。
在一些具體例中，本揭露提供一種抗hIgG單株抗體，其包含： a)        包含SEQ ID NO：13和25的胺基酸序列的重鏈(HC)及包含SEQ ID NO：19和26的胺基酸序列的輕鏈(LC)； b)       包含SEQ ID NO：14和25的胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：20和26的胺基酸序列的LC； c)        包含SEQ ID NO：15和25的胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：21和26的胺基酸序列的LC； d)       包含SEQ ID NO：16和25的胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：22和26的胺基酸序列的LC； e)        包含SEQ ID NO：17和25的胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：23和26的胺基酸序列的LC；或 f)        包含SEQ ID NO：18和25的胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO：24和26的胺基酸序列的LC。
在一些具體例中，抗hIgG抗體或抗原結合部分具有VH胺基酸序列，其與SEQ ID NO：13、14、15、16、17、或18的胺基酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致。
在一些具體例中，抗hIgG抗體或抗原結合部分具有VL胺基酸序列，其與SEQ ID NO：19、20、21、22、23、或24的胺基酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致。
在一些具體例中，抗hIgG抗體或抗原結合部分具有HV與VL胺基酸序列，其分別與SEQ ID NO：13和19、14和20、15和21、16和22、17和23、或18和24至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致。
在一些具體例中，抗hIgG抗體具有HC和LC，其在有或沒有前導序列的情況下分別包含SEQ ID NO：63和69、64和70、65和71、66和72、67和73、或68和74。
在一些具體例中，本揭露抗hIgG抗體或抗原結合部分包含抗體2C5、9E6、11F9、11G5、16F5、或19B1的HCDR1-3和LCDR1-3、VH和VL、或HC和LC胺基酸序列。
CDR與胺基酸編號的分配可以根據Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991))的定義。另見Zhang，同上。
本揭露之抗hIgG抗體或抗原結合部分可以衍生或連接至另一個分子(例如，另一個肽或蛋白質)。通常，抗體或其部分被衍生化，使得IgG結合不受衍生或標記的不利影響。例如，本揭露之抗體或抗體部分可以在功能上連接(藉由化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如另一個抗體或可偵測標記或標籤。實例包括，但不限於放射性同位素或放射性核素(例如3 H、14 C、15 N、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)、螢光標記(例如，FITC、玫瑰紅、鑭系磷光體、藻紅素、或Alexa Fluor®染料)、酶標記(例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光標記、生物素基團、由二級報導子辨識的預定多肽表位(例如、白胺酸拉鍊對序列、二級抗體的結合位點、金屬結合域、表位標籤)、和磁性劑(諸如釓螯合物)。在一些具體例中，標籤是經由不同長度的間隔子臂附加以減少潛在的空間位阻。
本抗hIgG抗體和本揭露之抗原結合部分可用於偵測及/或測量動物(例如，非人類靈長類動物，諸如石蟹獼猴或恆河猴)樣品中的人類IgG或Fab含量。在一些具體例中，抗體和抗原結合部分可用於偵測及/或測量人類樣品中的人類IgG或Fab含量。合適的偵測和測量方法包括免疫學方法，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析、和免疫組織學。在一些具體例中，抗體和抗原結合部分可以用於偵測及/或測量人類樣品中的人類IgG或Fab含量，供用於臨床前或臨床免疫組織化學(IHC)研究。
由於本文所述兔類抗體可結合至不同的表位，它們可以在任何宿主動物中單獨使用或成對用於偵測人類IgG，以滿足在臨床前研究中的治療性單株抗體開發的需求。例如，抗體16F5、11F9，和11G5/19B1/2C5/9E6結合至三個不同的表位，其不同於MCA5748G的表位。因此，從它們中選出結合至兩個不同表位的一對可以一起使用以例如增加分析靈敏度和特異性。例如，16F5可以與11F9一起使用；16F5或11F9可與11G5、19B1、2C5或9E6一起使用；而MCA5748G可以與16F5、11F9、11G5、19B1、2C5和9E6中的任何一者一起使用。抗體對中的抗體可能經不同標記。 抗hIgG抗體的產生
本hIgG抗體可以藉由公知的融合瘤技術來產生，其中產生感興趣抗體的兔類B細胞與永生細胞融合而形成產生抗體的融合瘤細胞株。
或者，本hIgG抗體或其抗原結合部分是藉由重組技術，使用宿主細胞來產生，該宿主細胞含有編碼抗體或部分之重鏈和輕鏈的核苷酸序列。因此，本揭露還提供編碼本文所述抗IgG抗體或其抗原結合部分的核酸分子與序列。編碼重鏈和輕鏈胺基酸序列的核苷酸序列可在兩個不同載體或在同一載體上被引入到宿主細胞內。它們可以受到單個啟動子或兩個個別啟動子的轉錄控制表現。
在一些具體例中，本核酸分子包含核苷酸序列，其與以下至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致：(i) SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12；或(ii)編碼SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26的核苷酸序列。
在胺基酸和核酸序列的上下文中，術語「序列一致性百分比」是指兩個序列中的殘基在進行最大對應比對時相同的殘基。例如，序列一致性比較的長度可以是一段至少約九個核苷酸，通常至少約18個核苷酸，更通常至少約24個核苷酸，典型至少約28個核苷酸，更典型至少約32個核苷酸，且較佳至少約36、48或更多個核苷酸。本技藝中已知有許多不同的演算法可用於測量胺基酸和核苷酸序列一致性。例如，可以使用FASTA、Gap或Bestfit來比較多核苷酸序列，它們是Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin中的程式。FASTA，其包括例如程式FASTA2和FASTA3，提供查詢和檢索序列之間最佳重疊區域的比對和序列一致性百分比(參見，例如Pearson,Methods Enzymol. (1990) 183:63-98；Pearson,Methods Mol. Biol. (2000) 132:185-219；Pearson,Methods Enzymol . (1996) 266:227-58；與Pearson,J. Mol. Biol. (1998) 276:71-84；以引用的方式併入本文)。除非另有說明，否則使用特定程式或演算法的預設參數。例如，核酸序列之間的序列一致性百分比可以使用FASTA及其預設參數(字長為6和評分矩陣的NOPAM因子)，或使用Gap及其預設參數(如GCG 6.1版中提供的，以引用的方式併入本文)來確定。
在特定具體例中，本揭露提供一種包含選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、以及12組成之群的核苷酸序列的核酸分子。在某些具體例中，該核酸分子包含SEQ ID NO：1和7、2和8、3和9、4和10、5和11、或6和12的核苷酸序列。
在上述具體例的任一者中，核酸分子可以是經分離的。在本文中稱為「經分離」或「經純化」的核酸分子是以下的核酸：(1)已經從其來源的基因體DNA或細胞RNA的核酸中分離出來；及/或(2)不會出現在自然界中。
在又一個態樣中，本揭露提供一種適合於表現如本文所述抗體或抗原結合部分之鏈中的一者或兩者的載體。術語「載體」，如本文所用，表示能夠轉運另一個其已連接之核酸的核酸分子。在一些具體例中，載體是質體，即可接合額外DNA片段的環狀雙股DNA片段。此外，某些載體能夠導引與其可操作地連接的基因的表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。
本揭露提供包含編碼如本文所述抗hIgG抗體或其抗原結合部分之重鏈、輕鏈、或重鏈和輕鏈的核酸分子。載體還可包含表現控制序列。
如本文所用，術語「表現控制序列」表示影響其所接合之編碼序列表現與加工所必需的多核苷酸序列。表現控制序列包括適當的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列；高效的RNA處理信號，諸如剪接和聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；提高轉譯效率的序列(即Kozak共有序列)；提高蛋白質穩定性的序列；以及在需要時，提高蛋白質分泌的序列。這種控制序列的性質因宿主生物體而異；在原核生物中，這樣的控制序列一般包括啟動子、核醣體結合位點和轉錄終止序列；在真核生物中，一般來說，這樣的控制序列包括啟動子和轉錄終止序列。術語「控制序列」旨在至少包括其存在對於表現和加工必不可少的所有組分，並且還可以包括其存在是有利的附加組分，例如前導序列和融合配偶體序列。
在一些具體例中，如本文所述的核酸分子包含核苷酸序列，其編碼如本文所述的抗IgG抗體或抗原結合部分的VH域，該核苷酸序列框內接合至編碼其他來源之重鏈恆定區的核苷酸序列。類似地，如本文所述的核酸分子可包含核苷酸序列，其編碼如本文所述的抗IgG抗體或抗原結合部分的VL域，該核苷酸序列框內接合至編碼其他來源之輕鏈恆定區的核苷酸序列。
在本揭露的又一個態樣中，編碼VH及/或VL的核酸分子可以被「轉換」成全長抗體基因。在一些具體例中，編碼VH或VL域的核酸分子藉由插入已分別編碼重鏈恆定區(CH)或輕鏈恆定區(CL)的表現載體中而被轉換成全長抗體基因，使得VH區段可操作地連接至載體內的CH區段，及/或VL區段可操作地連結至載體內的CL區段。在另一個態樣中，使用標準分子生物學技術藉由將編碼VH及/或VL域的核酸分子接合至編碼CH及/或VL域的核酸分子，將編碼VH及/或VL域的核酸分子轉換成全長抗體基因。編碼全長重鏈及/或輕鏈的核酸分子繼而可以由它們被引入其中的細胞表現並分離出抗IgG抗體。
在一些具體例中，構架區(等)被突變，使得所得構架區(等)具有對應生殖系基因的胺基酸序列。可以在框架區或恆定區中進行突變，例如以增加抗IgG抗體的半衰期。參見例如PCT公開案WO 00/09560。還可在框架區或恆定區中進行突變以改變抗體的免疫原性，及/或提供與另一分子共價或非共價結合的位點。根據本揭露，抗體可以在可變域的任何一或多個CDR或構架區中或恆定區中具有突變。
本揭露還提供了用於生產本文所述抗體組合物以及抗體與其抗原結合部分的方法。在一些具體例中，本揭露是有關一種用於生產如本文所述抗IgG抗體或抗原結合部分的方法，該方法包含提供包含編碼本文所述抗IgG抗體或抗原結合部分的重鏈或其抗原結合部分之核苷酸序列，以及編碼本文所述抗IgG抗體或抗原結合部分的輕鏈或其抗原結合部分的核苷酸序列的重組宿主細胞；在適合表現抗體或抗原結合部分的條件下培養該宿主細胞；以及分離所得抗體或抗原結合部分。藉由在此類重組宿主細胞中這樣表現所產生的抗體或抗原結合部分在本文中稱為「重組」抗體或抗原結合部分。本揭露還提供此類宿主細胞的後代細胞，以及由其產生的抗體或抗原結合部分。
術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)，如本文所用，表示重組表現載體已被引入其中的細胞。根據定義，重組宿主細胞在自然界中並不存在。本揭露提供了宿主細胞，其可包含例如本文所述的載體。本揭露還提供了宿主細胞，其包含例如編碼本文所述抗IgG抗體或其抗原結合部分之重鏈或其抗原結合部分的核苷酸序列、編碼本文所述抗IgG抗體或其抗原結合部分之輕鏈或其抗原結合部分的核苷酸序列、或兩者。應當理解，「重組宿主細胞」和「宿主細胞」不僅指特定的目標細胞，還有這種細胞的後代。由於某些修飾可能因為突變或環境影響而在後代中發生，因此此類後代實際上可能與親代細胞不同，但仍包括在本文所用術語「宿主細胞」的範圍內。
編碼抗IgG的抗體及其抗原結合部分的核酸分子和包含這些核酸分子的載體可用於轉染合適的哺乳動物、植物，細菌或酵母宿主細胞。轉形可以透過用於將多核苷酸引入宿主細胞的任何已知方法來進行。將異源多核苷酸引入哺乳動物細胞的方法是本技藝周知的，包括葡聚醣媒介的轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺媒介的轉染、原生質體融合、電穿孔、多核苷酸囊封在脂質體中和直接顯微注射DNA至細胞核內。此外，核酸分子可以藉由病毒載體被引入哺乳動物細胞中。
由不同細胞株或在轉基因動物中表現的抗體將可能具有彼此不同的糖基化模式。然而，本文提供的核酸分子所編碼的全部抗體或包含本文提供的胺基酸序列的所有抗體都是本揭露的一部分，無關乎抗體的糖基化狀態如何，且更普遍來說，與存在或不存在轉譯後修飾無關。
除非本文另有定義，否則與本揭露結合使用的科學和技術術語應具有通常由本技藝中具有通常技術者共同理解的含義。下面將說明例示性方法和材料，儘管與本文描述的那些相似或等效的方法和材料也可用於本揭露之實施與測試。如有衝突，以本說明書(包括定義)為準。大體上，與本文所述細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、分析化學、合成有機化學、醫學和醫藥化學，以及蛋白質和核酸化學與雜交的技術組合使用的命名與技術是本技藝熟知和常用的那些。酶促反應和純化技術是根據製造商的說明書來進行，如本領域中通常完成的或如本文所述。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，而複數術語應包括單數。在本說明書和具體例通篇中，詞語「具有(have)」和「包含(comprise)」，或諸如「具有(has，having)」和「包含(comprises或comprising)」的變體將被理解為暗示納入所陳述的整數或整數群，但不排除任何其他整數或整數群。本文提及的全部出版物和其它參考文獻均以全文引用的方式併入本文。儘管本文引用了許多份文件，但這樣引用並不構成承認這些文件中的任何一者構成本領域共同常識的一部分。
為了更為充分地理解本揭露，闡述以下實例。這些實例僅用於說明為目的並且不應被解釋為以任何方式限制本揭露的範疇。 實例
以下實例說明了實驗，其中使用人類IgG Fab來免疫兔子，分離脾細胞並用於分選人類IgG特異性B細胞。使用石蟹獼猴IgG作為反篩選劑，吾人獲得六個人類IgG和Fab特異性mAb選殖株。這些選殖株展現出更好的結合親和力，並靶向與唯一的商購小鼠來源抗hIgG mAb選殖株MCA5748G不同的表位。這些兔類抗hIgG mAb選殖株是藉由GyrolabTM 分析進行了評估，且發現到它們適合在石蟹獼猴血清存在下於通用藥物動力學分析中用作為捕獲試劑。用於本文所述實驗的材料和方法如下。 化學品與試劑
這些實驗中使用的治療性抗體是人類化治療性單株抗體IgG1 (hIgG1)、人類化開發候選單株抗體IgG4(hIgG4)和內部研究試劑人類Fab (hFab)。石蟹獼猴IgG (cynoIgG)是從石蟹獼猴血清中純化而來，購自Innovative Research (Novi, MI 48377)，經蛋白A親和純化。小鼠抗人類IgG單株抗體 MCA5748G (Stubenrauch et al.,J Pharm Biomed Anal. (2009) 49:1003-8)購自BioRad Laboratories (Hercules, CA)。細胞培養基和磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)購自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)。所有其他化學品均為分析級。 用於測定結合特異性的ELISA
酶聯免疫吸附分析(ELISA)用於評估抗體選殖株結合至人類免疫球蛋白(IgG)的特異性，使用cynoIgG作為對照。ELISA在室溫下於ThermoFisher Scientific的微量滴定盤(Waltham, MA)上進行，首先用含hIgG1、hIgG4或cynoIgG的PBS塗覆1小時。用磷酸鹽緩衝鹽水-聚山梨醇酯20(Tween 20)洗滌3次後，用PBS/3%牛血清白蛋白阻斷盤1小時。然後再次洗滌盤並與抗人類IgG抗體選殖株一起培育1小時。在另一個洗滌步驟之後，根據製造商的說明書，藉由來自Southern Biotech (Birmingham, AL)的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的抗兔類IgG抗體偵測結合的抗體。 用於測定結合特異性與動力學的Biacore分析
兔類抗人類IgG單株抗體的特異性在如他處所述的第二個分析系統中進行評估(Chu et al.,Sci Rep . (2015) 4:7360)。這些實驗是利用Biacore® T200儀器(Biacore, Uppsala, Sweden)，使用Biacore的鏈黴親和素或CM5感測晶片來進行。將抗體塗覆到鏈黴親和素晶片上是透過注射生物素化目標抗體來實現，該抗體使用來自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)的EZ-Link™胺-PEG11-生物素試劑按照製造商手冊進行胺偶聯。有關於CM5晶片，使用Biacore的胺偶聯套組，經由標準胺偶聯將目標抗原或抗體偶聯至晶片表面。除非另有說明，否則所有結合與動力學分析均在HBS-EP＋緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005% v/v表面活性劑P20)中於25℃下進行。使用來自Biacore的BIAevaluation軟體V4.1，用1：1朗謬擬合模型計算解離常數值(KD)。 兔子免疫以及B細胞選殖
如Wu et al.,Nat Cancer (2020) 1:86-98所述的hIgG Fab被用來免疫兩隻兔子，總共注射抗原五次。初次注射使用完全弗氏佐劑(CFA)，而四次追加注射使用不完全弗氏佐劑(IFA)。CFA和IFA均來自ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)。使用抗原蛋白藉由ELISA監測血清效價。選擇ELISA效價較高的兔子進行脾切除術。
有關於B細胞分離，從脾臟中分離出新鮮的脾細胞。大約1.2x108 個脾細胞在分選前在由Yurogen (Worcester, MA)訂製的特殊B細胞培養基中培養過夜。在Yurogen使用SMabTM平台處理脾細胞以富集辨識抗原的B細胞。將經抗原分選的B細胞接種並培養在96孔盤中，1個細胞/孔，培養歷時10-14天。
使用經hIgG4塗覆的直接ELISA來鑑別並確認辨識抗原的B細胞選殖株，經純化的cynoIgG用於ELISA進行計數器篩選。根據陽性/陰性ELISA信號比來對抗原特異性B細胞選殖株進行排序和選定，並藉由RT-PCR擴增它們的IgG編碼序列的重鏈和輕鏈。將重鏈和輕鏈PCR產物組合並用於直接轉染HEK293F細胞。然後透過ELISA和Biacore結合分析進一步證實瞬時表現的重組兔類IgG選殖株特異性結合至hIgG1、hIgG4和hFab。在確認特異性結合至hIgG1、hIgG4和hFab後，將來自所選陽性B細胞的PCR產物選殖到哺乳動物表現載體中，以擴大HEK293F細胞中的抗體生產。藉由HEK293F轉染生產的重組兔類mAb選殖株是使用蛋白A層析純化用於進一步評估。 GyrolabTM 分析
來自Gyros Protein Technologies (Uppsala Sweden)的GyrolabTM xPlore、Bioaffy 1000 nL CD、Rexxip A和Rexxip F緩衝液用於所有實驗(Fraley et al.,Bioanalysis (2013) 5:1765-74)。生物素化捕獲抗體在Rexxip A緩衝液中稀釋至0.1-0.2 μg/μL，並流過Bioaffy CD微結構內的鏈黴親和素珠粒管柱。藉由在含有不同量石蟹獼猴血清的Rexxip A緩衝液中指示的範圍內摻入hIgG4或hFab，製備標準曲線和品管(QC)樣品。將標準曲線樣品、QC樣品、模擬樣品和分析試劑加入PCR盤並加載到GyrolabTM 儀器上。由Gyros儀器將標準曲線、QC樣品或模擬樣品的單次重複添加到兩個CD微結構中，然後流過珠粒管柱。Alexa fluor 647標記的山羊抗人類IgG (Fc)抗體購自Southern Biotech (Birmingham, AL)，以2 μg/ml於Rexxip F緩衝液中用做偵測試劑。在每次操作之前，使含有0.01% v/v Tween-20的PBS洗滌液流過管柱，以預濕潤鏈黴親和素珠粒，並在分析的每個步驟之後沖洗掉任何未結合的試劑。樣品濃度是在1%光電倍增程度下利用數據採集確定的。GyrolabTM Evaluator Program如製造商所指示以5參數擬合和1/Y2加權用來分析結果。 實例1：分離人類IgG特異性兔類抗體選殖株
本實例描述了使用兔類B細胞選殖株技術開發辨識人類IgG和Fab，但不會辨識石蟹獼猴IgG的六個兔類抗體選殖株的實驗。
雖然融合瘤篩選和展示方法已用於兔類單株抗體開發，但它們都存在一些缺點：融合瘤技術的細胞融合效率低，而展示方法導致重鏈和輕鏈的天然同源配對喪失(Zhang et al.,Front Immunol .  (2017) 8:494)。為了克服這些問題，最近開發了一種基於單一B細胞的抗體基因選殖技術(或單一B細胞選殖) (Seeber et al.,PLoS ONE (2014) 9:e86184；Rashidian et al., “Single B Cell Cloning and Production of Rabbit Monoclonal Antibodies” in: Zielonka and Krah (eds) Genotype Phenotype Coupling. Methods in Molecular Biology, vol 2070, Humana, New York, NY, 2020)。
簡言之，單一B細胞選殖是由以下步驟組成：(i)透過基於抗原的FACS分選，從周邊血液或從淋巴組織分離特定單一B細胞；(ii)使特定單一B細胞生長並擴增持續兩週；(iii)利用抗體特異性引子執行RT-PCR，以擴增抗體基因和定序；(iv)將抗體基因選殖到表現載體中，並在哺乳動物系統(例如，HEK 293、CHO細胞)中產生重組單株抗體；以及(v)藉由ELISA和其他活體外分析純化且評估重組單株抗體。
吾人使用人類IgG1 Fab使兔子免疫，所得脾細胞是藉由生物素化hIgG1進行分選，其為一種人類化完整IgG1分子。總共530個初代B細胞被單細胞接種到96孔盤中並生長兩週。B細胞培養基，其含有單株兔類IgG抗體，藉由直接ELISA使用hIgG4，hIgG1和cynoIgG進行篩選。基於ELISA hIgG1/cynoIgG和hIgG4/cynoIgG信號值，吾人挑出17個選殖株，其hIgG1和hIgG4 OD450皆＞0.9，且CynoIgG OD 450＜0.2 (表1)，並且透過PCR擴增其抗體編碼序列。 表1. 經PCR產物轉染之細胞培養基的ELISA篩選
抗原 hIgG4/CynoIgG ELISA hIgG1/CynoIgG ELISA
hIgG4 (OD450 ＞ 0.9) Cyno IgG (OD450 ＜ 0.2) hIgG1 (OD450 ＞ 0.9) Cyno IgG (OD450 ＜ 0.2)
16F5 1.374 0.154 1.394 0.184
11G5 1.317 0.159 1.254 0.161
14G6 1.311 0.169 1.583 0.141
2C5 1.29 0.124 1.243 0.107
9E6 1.282 0.146 1.281 0.14
2G11 1.203 0.083 1.375 0.073
12C10 1.093 0.071 1.13 0.097
18C1 0.984 0.094 0.929 0.093
4E5 0.961 0.093 1.201 0.08
2D2 0.959 0.095 0.963 0.066
2G3 0.957 0.082 1.27 0.087
9H11 0.957 0.074 1.029 0.068
19B1 0.954 0.102 1.149 0.055
17E8 0.946 0.086 1.251 0.064
2A7 0.945 0.101 1.036 0.046
20D5 0.928 0.107 1.072 0.074
11F9 0.91 0.092 1.109 0.089
在這17個選殖株的11個中，吾人能夠獲得重鏈和輕鏈的PCR產物。每個選殖株的重鏈和輕鏈PCR產物以1：1的比例組合並用於直接轉染HEK293F細胞。來自經轉染HEK293F細胞的細胞培養基藉由相同的ELISA篩選分析進一步確認。表2顯示特異性結合至完整人類IgG (hIgG)與Fab，但不結合至石蟹獼猴IgG (cynoIgG)的六個兔類重組抗體選殖株的結合，如透過ELISA分析測定其結合至hIgG1或hIgG4與cynoIgG的信號比。這六個選殖株展現出良好的hIgG4/cynoIgG和hIgG1/cynoIgG ELISA信號比，範圍為4.94至14.99。 表2. 例示性兔類mAb
ELISA信號比 所選選殖株
2C5 9E6 11F9 11G5 16F5 19B1
hIgG4/CynoIgG 7.91 9.53 5.92 5.19 6.33 12.01
hIgG1/CynoIgG 7.72 10.17 6.20 4.94 5.90 14.99
藉由Biacore進一步分析這六個選殖株與hIgG1、hIgG4hFab和cynoIgG的直接結合，如圖1中所示。所有六個選殖株與hIgG1、hIgG4和hFab顯示有程度不等的結合，但不結合cynoIgG。這些數據表明，這些選殖株對人類IgG和Fab具有特異性，但對cynoIgG則無。 實例2：兔類抗hIgG抗體的序列
為了確定六個選殖株的獨特性，將重鏈和輕鏈PCR產物進行DNA定序。使用基於EMBL-EBI網路的Clustal Omega (Sievers et al.,Mol Syst Biol. (2011) 7:539)，分別比對推導出的重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列。如圖2A與2B中所示，全部六個選殖株都具有獨特的重鏈和輕鏈胺基酸序列。基於Clustal Omega來建構系統樹以顯示相對距離(圖2C)。值得注意的是，選殖株16F5在重鏈和輕鏈方面相對於其他五個選殖株都是高度歧異的，而選殖株11F9在重鏈而非輕鏈方面是其次歧異的選殖株。
表3顯示編碼抗體2C5、9E6、11F9、11G5、16F5、和19B1的核苷酸序列(SEQ：SEQ ID NO)。 表3. 例示性mAb的核苷酸序列
Ab鏈 核苷酸序列(5´至3´) SEQ
2C5 H ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCACTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGGTGGTGCGCTTACTAATACTTACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGACCCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATCTGGGTGCTGCTGGTGATGCTTATAACTTGTGGGGGCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG 1
9E6 H ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGATTCGACTTCAGTAGCAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAGACTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGGTGGTGGTCTGAGTAACACTTACTACGCGGGCTGGGCAAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGTCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATGCTGGGACTAGTGGTGATTACCTTAACTTGTGGGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG 2
11F9 H ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGCAGCAGCTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCATAGCTTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAGCCACTGGATATGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATGTCTACTAGTAGTGGTAGCACTTACGATGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATGTTGGCGGTAGTACTACTTACTTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG 3
11G5 H ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCTTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGAGGCTGGAGTGGATCGCTTGCATTTATGGTGGTGGTCTGAGTAACACTTACTACGCGGGCTGGGCAAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATGCTGGGACTAGTGGTGATTACCTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG 4
16F5 H ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGCAGCAGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGCAAAGCCTCTGGAATCGACTTCAGTAACTACTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTTGATCGCATGCATTTATACTGGTAGTAGTGGTAGCACATGGTACGCGACCTGGGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATCGTGATGTTGGTAGTCTTTATGACTCCTTAGATCTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCTCCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG 5
19B1 H ATGGAGACTGGGCTGCGGTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCTTCTGGATTCTCCTTCAGTGACAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGGTGGTACTATTACTAATACTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGTCGACCACGGTGACCCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATCTGGGTGCTGCTGGTGATGCTTATAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAG 6
2C5 L ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTCTGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAGCATTTACAGTGGTTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTTTGATGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGATCTGAGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTGATCGTAATAGTATTACTTCTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG 7
9E6 L ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCGTCGTGATGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGGAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGTAGCTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCATACGATGCTTATCGTCTCAGTAGTCCTGATAATATTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG 8
11F9 L ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGCAATGAATTATCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAGCCTCCCAAACTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAACGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTATTAGTAATGTTGATAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG 9
11G5 L ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCGTCGTGATGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGGAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTATTAGTGCTAGCGCCTTATCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCATACGATGGTTATCGTCTCAGTAGTGCTGATAATATTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG 10
16F5 L ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAATAATTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATTTACCAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACACTTTACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTGGAGTATAGACGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAGGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG  11
19B1 L ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCTCTGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAACATTTACAGCTCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTTATCGTAGTAGTAGTAGTTCTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG 12
表4顯示抗體2C5、9E6、11F9、11G5、16F5、和19B1之推導可變域胺基酸序列。互補決定區(CDR)以粗體和底線表示。 表4. 例示性抗體的可變域胺基酸序列
Ab鏈 序列(N-端至C-端) SEQ
2C5 VH QEQLVESGGD LVKPGASLTL TCTASG FSFS SGYYMC WVRQ APGKGLE WIA CIYGGALTNT YYATWA KGRF TISKTSSTTV TLQMTSLTAA DTATYFC ARD LGAAGDAYN L WGPGTLVTVS S 13
9E6 VH QSLEESGGDL VKPGASLTLT CKASG FDFSS SYYMC WVRQA PGRLE WIACI YGGGLSNTYY AGWA KGRFTI SKTSSTTVTL QMTSLTVADT ATYFC ARDAG TSGDYLN LWG PGTLVTVSS 14
11F9 VH QQQLEESGGG LVQPEGSLTL TCIASG FSFS SSHWIC WVRQ APGKGLE WIA CMSTSSGSTY DANWA KGRFT ISKTSSTTVT LQMTSLTAAD TATYFC ARDV GGSTTYFD LW GPGTLVTVSS 15
11G5 VH QSLEESGGDL VKPGASLTLT CTASG FSFSS SYYMC WVRQA PGKRLE WIAC IYGGGLSNTY YAGWA KGRFT ISKTSSTTVT LQMTSLTAAD TATYFC ARDA   TSGDYLN LWG PGTLVTVSS 16
16F5 VH QQQLEESGGG LVKPGGTLTL TCKASG IDFS NYYYMC WVRQ APGKGLE LIA CIYTGSSGST WYATWA KGRF TISKTSSTTV TLQMTSLTAA DTATYFC ARD RDVGSLYDSL D LWGQGTLVT VSP 17
19B1 VH QEQLVESGGG LVQPEGSLTL TCTASG FSFS DSYYMC WVRQ APGKGLE WIA CIYGGTITNT YYASWA KGRF TISKTSSTTV TLQMTSLTAA DTATYFC ARD LGAAGDAYN L WGPGTLVTVS S 18
2C5 VL ASDMTQTPAS VSAAVGGTVT IKCQAS ESIY SGLA WYQQKP GQPPK LLIFD ASDLAS GVPS RFKGSRSETE YTLTISDLEC ADAATYYC QC TDRNSITSYA FGGGTEVVVK 19
9E6 VL AVVMTQTASP VSGAVGGTVT INCQAS QSIS SSYLS WYQQK PGQPPK LLIY GASTLAS GVP SRFKGSGSGT QFTLTISGVQ CDDAATYYC A YDAYRLSSPD NI FGGGTEVV VK 20
11F9 VL AYDMTQTPAS VSEPVGGTVT IKCQAS QSIS NELS WYQQKP GQPPK LLIYR ASTLAS GVPS RFKGSGSGTQ FTLTINGVEC ADAATYYC QQ GYSISNVDNT FGGGTEVVVK 21
11G5 VL AVVMTQTASP VSGAVGGTVT INCQAS QSIS ASALS WYQQK PGQPPK LLIY AASTLES GVP SRFKGSGSGT QFTLTISGVQ CDDAATYYC A YDGYRLSSAD NI FGGGTEVV VK 22
16F5 VL AYDMTQTPAS VEAAVGGTVT INCQAS QSIN NWLS WYQQKP GQRPK LLIYQ ASTLAS GVSS RFKGSGSGTH FTLTISDLEC ADAATYYC QQ GWSIDDIDNA FGGGTEVVVK 23
19B1 VL ASDMTQTPAS VSEPVGGTVT IKCQAS ENIY SSLA WYQQKP GQPPK LLIYD ASNLAS GVPS RFSGSGSGTE FTLTISDLEC ADAATYYC QC TYRSSSSSYA FGGGTEVVVK 24
表5顯示六個抗體2C5、9E6、11F9、11G5、16F5、和19B1的重鏈與輕鏈恆定區胺基酸序列(分別為CH與CL)。 表5. 例示性抗體的恆定區胺基酸序列
Ab鏈 序列(N-端至C-端) SEQ
CH GQPKAPSVFP LAPCCGDTPS STVTLGCLVK GYLPEPVTVT WNSGTLTNGV RTFPSVRQSS GLYSLSSVVS VTSSSQPVTC NVAHPATNTK VDKTVAPSTC SKPMCPPPEL PGGPSVFIFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQDDPEVQ FTWYINNEQV RTARPPLREQ QFNSTIRVVS TLPIAHQDWL RGKEFKCKVH NKALPAPIEK TISKARGQPL EPKVYTMGPP REELSSRSVS LTCMINGFYP SDISVEWEKN GKAEDNYKTT PTVLDSDGSY FLYSKLSVPT SEWQRGDVFT CSVMHEALHN HYTQKSISRS PGK 25
CL GDPVAPTVLI FPPAADQVAT GTVTIVCVAN KYFPDVTVTW EVDGTTQTTG IENSKTPQNS ADCTYNLSST LTLTSTQYNS HKEYTCKVTQ GTTSVVQSFN RGDC 26
表6顯示抗體2C5、9E6、11F9、11G5、16F5、和19B1的重鏈CDR(HCDR)與輕鏈CDR(LCDR)胺基酸序列，其中該等CDR是依據Kabat編號系統來界定。序列的SEQ ID NO顯示於括號中。 表6. 例示性抗體的CDR胺基酸序列
Ab 胺基酸序列(N-端至C-端)
HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
2C5 FSFSSGYYMC (27) WIACIYGGALTNTYYATWA (28) ARDLGAAGDAYN (29) ESIYSGLA (30) LLIFDASDLAS (31) QCTDRNSITSYA (32)
9E6 FDFSSSYYMC (33) WIACIYGGGLSNTYYAGWA (34) ARDAGTSGDYLN (35) QSISSSYLS (36) LLIYGASTLAS (37) AYDAYRLSSPDNI (38)
11F9 FSFSSSHWIC (39) WIACMSTSSGSTYDANWA (40) ARDVGGSTTYFD (41) QSISNELS (42) LLIYRASTLAS (43) QQGYSISNVDNT (44)
11G5 FSFSSSYYMC (45) WIACIYGGGLSNTYYAGWA (46) ARDAGTSGDYLN (47) QSISASALS (48) LLIYAASTLES (49) AYDGYRLSSADNI (50)
16F5 IDFSNYYYMC (51) LIACIYTGSSGSTWYATWA (52) ARDRDVGSLYDSLD (53) QSINNWLS (54) LLIYQASTLAS (55) QQGWSIDDIDNA (56)
19B1 FSFSDSYYMC (57) WIACIYGGTITNTYYASWA (58) ARDLGAAGDAYN (59) ENIYSSLA (60) LLIYDASNLAS (61) QCTYRSSSSSYA (62)
表7顯示抗體2C5、9E6、11F9、11G5、16F5、和19B1的SEQ ID NO資訊。除了以「nt」(核苷酸)表示以外，表格中的所有序列為胺基酸序列。 表7.  2C5、9E6、11F9、11G5，16F5和19B1的SEQ ID NO
選殖株 HC (nt.) LC (nt.) VH VL CH CL HC LC HCDR LCDR
1 2 3 1 2 3
2C5 1 7 13 19 25 26 63 69 27 28 29 30 31 32
9E6 2 8 14 20 25 26 64 70 33 34 35 36 37 38
11F9 3 9 15 21 25 26 65 71 39 40 41 42 43 44
11G5 4 10 16 22 25 26 66 72 45 46 47 48 49 50
16F5 5 11 17 23 25 26 67 73 51 52 53 54 55 56
19B1 6 12 18 24 25 26 68 74 57 58 59 60 61 62
實例3：兔類抗hIgG抗體的結合親和力以及表位
將含有重鏈和輕鏈抗體編碼序列的經擴增PCR產物選殖到表現載體中，並用於瞬時轉染和抗體純化。使用胺偶聯，將小鼠抗兔類mAb直接固定在CM5晶片上(Chu et al.,Sci Rep . (2015) 4:7360)。然後注射經純化的兔類mAb選殖株，接著流過1：2連續稀釋的hFab、hIgG1、hIgG4和cynoIgG，範圍為80-0 nM。
如表8中所示，所有選殖株對hIgG1、hIgG4和hFab表現出大於亞奈莫耳的結合親和力(KD)，但對cynoIgG則無。然而，在相同條件下，對照商業選殖株MCA5748G (Bio-Rad, Hercules, CA)能夠結合至hIgG1和hIgG4，但不能結合至hFab和cynoIgG。 表8. 兔類mAb選殖株結合至不同抗體類型的Biacore動力學
樣品 抗原 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
11F9 hFab 2.97E+07 3.34E-02 1.12E-09
hIgG4 1.45E+05 4.06E-05 2.79E-10
hIgG1 1.49E+05 9.21E-05 6.19E-10
cynoIgG 無結合
11G5 hFab 8.99E+05 5.31E-04 5.91E-10
hIgG4 1.35E+05 5.80E-06 4.29E-11
hIgG1 1.35E+05 2.52E-05 1.87E-10
cynoIgG 無結合
16F5 hFab 3.02E+06 5.84E-03 1.93E-09
hIgG4 1.57E+05 8.09E-05 5.14E-10
hIgG1 1.73E+05 2.21E-05 1.27E-10
cynoIgG 無結合
19B1 hFab 1.22E+06 6.58E-04 5.40E-10
hIgG4 1.36E+05 9.14E-06 6.70E-11
hIgG1 1.37E+05 3.28E-05 2.39E-10
cynoIgG 無結合
2C5 hFab 2.65E+06 1.46E-03 5.50E-10
hIgG4 1.35E+05 1.36E-05 1.00E-10
hIgG1 1.37E+05 3.80E-05 2.77E-10
cynoIgG 無結合
9E6 hFab 1.16E+07 6.03E-03 5.18E-10
hIgG4 1.37E+05 2.68E-05 1.96E-10
hIgG1 1.43E+05 6.10E-05 4.26E-10
cynoIgG 無結合
MCA 5748G hFab 無結合
hIgG4 1.34E+05 2.36E-04 1.57E-09
hIgG1 1.47E+05 2.81E-04 1.82E-09
cynoIgG 無結合
為了確定六個兔類抗hIgG選殖株是否具有與唯一可商購的選殖株MCA5748G不同的表位，將MCA5748G、19B1和11F9選殖株以及小鼠抗hIgG mAb (作為分析對照)予以生物素化。然後將這些生物素化抗體注射到鏈黴親和素晶片的不同流量槽(flow cell)中(達到500-600 RU之間的範圍)，接著在240 nm不同兔類mAb選殖株作為競爭物的情況下，流過1：2連續稀釋的hIgG1抗體(範圍為80-0 nM)。如圖3A與3B中所示，當MCA5748G用作晶片表面上的捕獲抗體，只看到與選殖株MAC5748G本身有競爭，表明該商業小鼠抗hIgG選殖株MAC5748G具有一個與本文揭示之六個兔類抗hIgG選殖株不同的表位。
當兔類抗hIgG選殖株19B1用作晶片表面上的捕獲抗體，與選殖株11G5、19B1、2C5和9E6看到有競爭。因此，這四個選殖株的表位是相同的，但與選殖株11F9和16F5不同。此外，當選殖株11F9被捕獲在晶片表面上時，只看到與選殖株11F9本身有競爭，既沒有與選殖株16F5有競爭，也沒有與共享相同表位的其他四個選殖株中的任何一者有競爭。因此，選殖株16F5也具有與選殖株11F9不同的表位。這些結果表明，選殖株16F5和11F9各自具有獨特的表位，而選殖株11G5、19B1、2C5和9E6共享相同的表位。在CDR的互補位確定抗體結合表位和重鏈扮演主導作用，六個兔類抗hIgG選殖株的表位分類與系統樹的相關性充分相關(圖2C)。
額外的Biacore實驗已經證明，所有六個兔類抗hIgG選殖株能夠結合至10個不同人類IgG中的每一者，以及2個測試的Fab。這十個抗體包括那些具有人類IgG1和IgG4的抗體。因為Fab用作免疫原以產生這些兔類抗hIgG mAb選殖株，它們全都應該在IgG的Fab區內結合。由於不同的人類IgG亞型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是根據它們的Fc序列(不屬於Fab區的一部分)進行分類的，所以全部六個兔類抗hIgG抗體選殖株都應該能夠辨識人類IgG的所有亞型。在臨床前研究及/或製程開發中，當這些兔類抗hIgG mAb被用來偵測不同亞型的治療性人類IgG (例如IgG1、IgG2和IgG4)分子時，這會是一個明顯的優勢。
歸納來說，胺基酸序列比對證明，本文獲得的全部六個選殖株都是獨特且多樣化的。它們結合至三個不同的表位群(16F5；11F9；和11G5/19B1/2C5/9E6)，並顯示結合親和力更好，並靶向與唯一可商購小鼠源抗hIgG抗體選殖株MCA5748G不同的表位。具有不同結合表位的選殖株可用於開發成對人類IgG偵測分析，諸如「夾心」ELISA和GyrolabTM 分析。 實例4：藉由兔類抗體在GyrolabTM 分析中特異性偵測人類抗體
為了要測試兔類抗hIgG mAb能否可以在猴血清存在下偵測到人類IgG分子，經生物素化的選殖株16F6首次被用作捕獲試劑。來自Gyros Protein Technologies (Uppsala Sweden)的GyrolabTM xPlore、Bioaffy 1000 nL CD、Rexxip A和Rexxip F緩衝液用於所有實驗。經生物素化的捕獲抗體在Rexxip A緩衝液中稀釋至0.1-0.2 μg/μL，並流過Bioaffy CD微結構內的鏈黴親和素珠粒管柱。標準曲線和品管(QC)樣品是藉由與0、4%、10%和25%石蟹獼猴血清混合的GyrolabTM Rexxip A緩衝液中所示的範圍內摻入hIgG4或hFab來製備。人類IgG4抗體hIgG4用於製備標準曲線，該曲線是在分析基質中範圍1200-0.3 ng/ml的1：4稀釋液。
如圖4A中所示，在1200-0.3 ng/ml的範圍下，0和4%之間的石蟹獼猴血清濃度下沒有觀察到基質效應。當分析基質含有10%和25%石蟹獼猴血清時，標準曲線的下半部觀察到一些較小的背景信號。因此，使用相同的標準曲線，用三個QC (750、40和0.6 ng/ml的hIgG4)進一步測試了含有4%石蟹獼猴血清的分析基質。如圖4B與4C中所示，獲得一個例示性標準曲線，且三個QC中有兩者滿足＜20%偏差和＜20% CV，而高QC剛好未達到偏差截止值差0.9% (20.9%)和它的CV是例示性的(4.56%)。
吾人進一步測試其他兔類抗hIgG選殖株在GyrolabTM 分析中用作捕獲試劑的適用性。所有六個兔類抗hIgG選殖株，連同商業小鼠抗hIgG mAb MCA5748G選殖株，都被生物素化並以類似濃度用於GyrolabTM 分析。GyrolabTM 通用PK分析捕獲試劑用作對照。如圖5A與5B中所示，當完整抗體分子hIgG4用作為標準品(相同範圍1200-0.3 ng/ml)時，所有捕獲試劑產生濃度依賴性曲線，商業選殖株MCA5748G看到的背景最高。然而，當Fab抗體分子hFab用作為標準品(相同範圍1200-0.3 ng/ml)時，所有六個兔類抗hIgG捕獲試劑也產生濃度依賴性曲線。相比之下，商業小鼠抗hIgG選殖株MAC5748G和對照GyrolabTM 捕獲試劑均未能產生濃度依賴性曲線。 實例5：兔類mAb選殖株在GyrolabTM 分析中的動力學範圍
GyrolabTM 分析的一個優勢在於，與基於表面的分析平台(諸如ELISA與MSD)相比，它提供明顯更大的動力學範圍(Fraley et al.,Bioanalysis (2015) 5:1765-74)。人類完整抗體hIgG4再次被用來製備分析標準品，這是一個線性的6點1：5稀釋液，範圍為5000-0.32 ng/ml，如表9中所示。 表9. 依據GyrolabTM 分析，不同捕獲試劑的效能
捕獲 Exp. Conc Av. Resp. Calc Conc Av. 偏差 S/B 捕獲 Exp. Conc Av. Resp. Calc Conc Av. 偏差 S/B
GyrolabTM  捕獲 0 4.5 NaN NaN 1.0 2C5 0 2.1 NaN NaN 1.0
0.32 4.6 0.4 20.1 1.0 0.32 2.1 0.3 -10.36 1.0
1.6 5.3 1.4 -9.4 1.2 1.6 3.0 1.7 6.36 1.4
8 9.3 8.3 3.1 2.1 8 6.6 7.8 -1.95 3.2
40 26.1 39.5 -1.3 5.7 40 23.4 40.1 0.18 11.1
200 94.1 201.2 0.6 20.8 200 87.7 200.9 0.46 41.7
1000 267.3 997.3 -0.3 59.0 1000 232.2 996.0 -0.40 110.4
5000 467.6 5005.7 0.1 103.2 5000 316.8 5043.1 0.86 150.6
MCA 5748G 0 11.8 NaN NaN 1.0 19B1 0 1.7 NaN NaN 1.0
0.32 13.6 0.4 37.0 1.2 0.32 1.8 0.3 -6.63 1.1
1.6 14.2 1.3 -17.1 1.2 1.6 2.7 1.7 4.82 1.6
8 18.4 8.2 2.6 1.6 8 6.2 7.8 -2.32 3.6
40 33.8 40.4 1.0 2.9 40 22.8 40.5 1.20 13.3
200 86.7 196.8 -1.6 7.4 200 82.9 199.2 -0.39 48.3
1000 213.5 1021.5 2.2 18.1 1000 202.9 1001.9 0.19 118.2
5000 282.9 4454.3 -10.9 24.0 5000 246.3 4936.0 -1.28 143.6
16F5 0 3.9 NaN NaN 1.0 11G5 0 7.4 NaN NaN 1.0
0.32 4.4 0.3 2.2 1.1 0.32 7.5 0.4 10.6 1.0
1.6 7.0 1.6 -1.6 1.8 1.6 9.8 1.5 -5.3 1.3
8 18.5 8.0 -0.1 4.7 8 20.3 8.0 0.6 2.7
40 64.2 40.6 1.5 16.4 40 60.9 40.6 1.6 8.2
200 197.2 196.0 -2.0 50.5 200 183.7 196.0 -2.0 24.8
1000 368.7 1072.2 7.2 94.4 1000 393.7 1025.2 2.5 53.1
5000 385.2 2171.9 -56.6 98.6 5000 468.5 4581.7 -8.4 63.3
9E6 0 2.9 NaN NaN 1.0 11F9 0 3.0 NaN NaN 1.0
0.32 3.0 0.3 -3.26 1.1 0.32 3.1 0.3 -4.19 1.0
1.6 4.1 1.6 1.65 1.4 1.6 5.0 1.7 3.47 1.7
8 8.6 8.0 -0.32 3.0 8 12.8 7.9 -1.27 4.3
40 28.4 39.9 -0.16 9.8 40 45.1 39.8 -0.47 15.2
200 102.9 200.5 0.26 35.5 200 148.5 202.9 1.45 50.2
1000 255.8 997.7 -0.23 88.2 1000 289.3 972.7 -2.73 97.8
5000 326.9 5041.0 0.82 112.7 5000 329.5 8125.0 62.50 111.4
Exp.：預期。Av.：平均。Resp.：反應。Conc：濃度。
進行了類似的GyrolabTM 分析程序，然後取得並比較數據。在上限(5000 ng/ml)處，GyrolabTM 捕獲和兔類mAb選殖株9E6、2C5和19B1均具有可接受的偏差(＜20)和大於100的信噪比。三種兔類抗hIgG選殖株顯示出比GyrolabTM 捕獲更好的信噪比。在5000 ng/ml的高上限處，儘管選殖株11G5具有可接受的平均偏差，但其信噪比是低的(63.3%)，這是由相對高的空白信號水準(7.4)所致。出於同樣的原因，商業mAb選殖株MCA5748在上限的信噪比也很差(24.0)。
數據表明，與GyrolabTM 捕獲試劑相比時，選殖株9E6，2C5和19B1提供類似的動力學範圍，具有更好的信噪比。選殖株9E6，2C5和19B1的偵測動力學範圍是顯著優於商業小鼠抗hIgG選殖株MCA5748G。選殖株16F5和11F9在0-1000 ng/ml範圍內表現良好，平均偏差＜20%，而在5000 ng/ml數據點則否。這可能是因為這兩個選殖株與其他四個選殖株具有不同的結合表位。
因此，在最初的GyrolabTM 分析中，當使用選殖株16F5作為捕獲試劑進行實驗時，利用含有高達25%石蟹獼猴血清的分析基質產生濃度依賴性分析曲線。該分析在0.30-1200 ng/ml範圍內使用含有4%石蟹獼猴血清的分析基質表現良好。在擴大GyrolabTM 評估分析中，所有六個兔類mAb選殖株都顯示它們能夠作為捕獲試劑用於偵測完整人類IgG和Fab分子。然而，兩種對照捕獲試劑Gyros捕獲試劑和商業選殖株MCA5748G只能偵測到完整人類IgG，而不能偵測到Fab分子。
如表10中所歸納，我們開發出6個兔類抗人類IgG mAb選殖株，它們皆可結合至完整人類IgG分子和Fab分子，而不結合至石蟹獼猴IgG。這六個選殖株屬於三個不同的表位群，與商業選殖株MCA5748G不同。這些選殖株中的每一者都經過測試用於在GyrolabTM 分析中偵測人類IgG和Fab，其中三個展現出更大的動力學範圍和信噪比。 表10. 六個兔類抗hIgG選殖株的摘要
抗體選殖株 hIgG hFab cynoIgG 表位 VH 系統數
Gyros捕獲 是 否 否 未知 N/A
MCA5748G 是 否 微量 未知 N/A
16F5 是 是 否 A群 A群
11F9 是 是 否 B群 B群
9E6 是 是 否 C群 C群
2C5 是 是 否 C群 C群
19B1 是 是 否 C群 C群
11G5 是 是 否 C群 C群
實例6：兔類抗人類IgG單株抗體選殖株作為通用陽性對照以供PandA分析的用途
兔類多株抗藥物抗體(pAb)通常用作抗藥物抗體(ADA)偵測的性能對照。但pAb的生成非常耗時，並且需要重複使用實驗動物。此外，作為對照，pAb通常表現出低靈敏度。這個實例描述了一個研究，比較兩個經重組產生的兔類抗人類IgG mAb 2C5和11G5，和在PandA分析中作為陽性對照的商業小鼠抗Fc mAb (JDC-10; Southern Biotech Cat# 9040-01)。
2C5和11G5，以及JDC-10，分別以5 μg/ml、1 μg/ml、0.75 μg/ml、0.5 µg/ml、與0 µg/ml稀釋於猴血漿池中。
含有經稀釋抗體的血漿樣品最初在含有過量藥物(人類IgG4同型的單株抗體；10-50 μg/mL)的分析緩衝液(300 mM乙酸，2% BSA)中以1：5稀釋，並在聚丙烯盤中以450 rpm、37℃培育歷時一小時，以允許藥物和所添加的抗體在樣品中形成複合物。隨後向每個樣品添加含3% PEG的硼酸鹽(pH為8.0)，且在2-8℃下培育過夜。每個樣品中的PEG緩衝液最終濃度為1.5%。
次日，將盤以4,000 rpm離心20分鐘，將複合物沉澱為丸粒。將丸粒用含1.5% PEG的硼酸鹽(pH為8.0)再次懸浮，並再次以4,000 rpm離心20分鐘。重複洗滌循環三遍。最後一次離心後，將各樣品懸浮在100 μΙ的300 mM乙酸中，並進一步稀釋1：10 (20 μl樣品＋180 μl乙酸)為1：50的最終樣品稀釋。以二重複的方式將經稀釋樣品以每孔25 μl添加至MSD High Bind盤的各孔，並在24℃、450 rpm搖動培育一小時。
培育後，用1x盤洗滌緩衝液來洗滌盤，並用含3%牛奶的PBS在24℃下搖動阻斷一小時。然後洗滌盤，並將100 ng/ml磺基-TAG-藥物加入到樣品且在24℃下搖動培育一小時。最終一次培育後，用含0.05% Tween的PBS洗滌盤。然後添加讀取緩衝液T 2x，並在Sector PR2400上讀取盤。電化學發光(ECL)信號與每個樣品中的抗藥物抗體呈正比。
如圖6A與表11中所示，相較於商業抗Fc mAb選殖株JDC-10，有兩個兔類抗hIgG選殖株2C5和11G5證明一個更大的動力學範圍和靈敏度。 表11：不同抗體在PandA中作為陽性對照的比較
PC (μg/ml) ECL 信號
抗 -Fc mAb JDC-10 抗 -hFab mAb 2C5 抗 -hFab mAb 11G5
5 755.5 2,180 1,551
1 182.5 426 319.5
0.75 148.5 323 257
0.5 130.5 187.5 171
NC 95 94.5 95
S/N 1.37 1.98 1.80
*PC：陽性對照。S/N：信噪比。NC：陰性對照。
選殖株2C5和11G5也作為性能對照，並在人類、大鼠、猴、與小鼠血漿和血清基質中進行試驗。數據顯示，2C5(圖6B)和11G5(圖6C)可以區分人類、猴、小鼠、和大鼠血清，其中2C5比11G5更為靈敏(表12)。在人類基質中，一如預期，兩個選殖株的背景都增加。 表12. PandA分析中的靈敏度
PC (μg/ml) S/N ( 猴 )
2C5 11G5
5 15.70 9.76
1 3.39 2.40
0.75 2.51 1.92
0.5 1.93 1.58
以上結果證實，經重組產生的兔類抗人類IgG mAb是臨床前分析的一個極佳通用陽性對照，特別是對於PandA形式來說(例如，對於猴，大鼠和小鼠基質)。這些抗體在血漿和血清基質中均表現良好。兔類IgG mAb具有增進的動力學範圍和分析靈敏度。
圖1是一組Biacore傳感圖，顯示六個兔類重組抗體選殖株與完整人類IgG1 (hIgG1)、完整人類IgG4 (hIgG4)、人類Fab (hFab)，和石蟹獼猴IgG (cynoIgG)的結合。
圖2A和圖2B分別顯示使用Clustal Omega和Kabat編號系統，六個兔類重組抗體選殖株的重鏈(圖2A)和輕鏈(圖2B)胺基酸序列的比對。CDR (另參見Zhang and Ho,MABS (2017) 9(3):419-29)劃底線且呈粗體。前導序列、可變域的開始和恆定區的開始被標記為如所示。
圖2C顯示六個兔類抗體選殖株的VH和VL序列的系統樹。
圖3A和3B顯示依據Biacore競爭分析(圖3A)和Biacore動力學分析傳感圖(圖3B)，六個兔類抗hIgG選殖株的表位測定。抗體MCA5748G (Bio-Rad)、19B1、11F9和小鼠抗hIgG mAb (Southern Biotech Cat # 9042-01)首先被生物素化並以500-600 RU被捕獲於Biacore SA晶片上，且經1：2連續稀釋8次(80-0 nM)的hIgG1抗體(伊沙妥昔單抗(isatuximab)；「isa」)與各個競爭抗體(240 nM)預混合。當預混合的競爭抗體與晶片表面上所捕獲的抗體在相同位點處結合至hIgG1，它會阻止hIgG1與捕獲抗體結合。
圖4A-4C顯示使用選殖株16F5作為捕獲試劑的GyrolabTM 免疫分析，以及hIgG4在含有0%、4%、10%和25%石蟹獼猴血清的分析基質中的疊加圖(圖4A)；hIgG4在含有4%石蟹獼猴血清的分析基質中的標準曲線圖(圖4B)；以及在含有4%石蟹獼猴血清的相同分析基質中的品管(圖4C)。選殖株16F5被生物素化並用作為捕獲試劑。充當分析標準品的人類IgG4抗體(hIgG4)在1200-0.30 ng/ml範圍內1比4稀釋。Alexa Fluor647偶聯的山羊抗人類IgG用於偵測。
圖5和5B顯示不同選殖株用作為偵測hIgG4和hFab的捕獲試劑的比較。圖5A顯示所有六個兔類抗hIgG mAb選殖株，加上GyrolabTM 和MCA5748G捕獲試劑用於偵測hIgG4的標準曲線。圖5B顯示用於偵測hIgG Fab的同一組捕獲試劑。要注意的是，GyrolabTM 捕獲試劑或MCA5748G捕獲試劑無法偵測到hFab。
圖6A顯示沉澱和酸解離(PandA)分析中所使用的四種抗體的比較。將兩個兔類抗人類IgG選殖株(2C5和11G5)的動力學範圍和靈敏度與商業小鼠抗Fc mAb (選殖株JDC-10) (Southern Biotech, Cat. No. 9040-01)進行比較。pAb：兔類多株抗藥物抗體(藥物：具有人類IgG4恆定區的單株抗體)。ECL：電化學發光。
圖6B和圖6C分別顯示於PandA分析中，選殖株2C5和11G5在人類、大鼠，猴和小鼠血清基質中的性能。Pos ctrl：陽性對照。
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Claims (20)

  1. 一種特異性結合至人類IgG的經分離單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或部分包含重鏈互補決定區(CDR)1-3和輕鏈CDR1-3，其分別包含： SEQ ID NO：27-32、 SEQ ID NO：33-38、 SEQ ID NO：39-44、 SEQ ID NO：45-50、 SEQ ID NO：51-56、或 SEQ ID NO：57-62。
  2. 如請求項1之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或部分包含重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)，其分別包含： SEQ ID NO：13和19、 SEQ ID NO：14和20、 SEQ ID NO：15和21、 SEQ ID NO：16和22、 SEQ ID NO：17和23、或 SEQ ID NO：18和24。
  3. 如請求項1或2之單株抗體，其中該抗體為兔類IgG抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項之單株抗體，其包含SEQ ID NO：25的重鏈恆定區胺基酸序列，及/或SEQ ID NO：26的輕鏈恆定區胺基酸序列。
  5. 如請求項1之單株抗體，其在有或沒有前導序列的情況下，包含分別具有以下胺基酸序列的重鏈和輕鏈： SEQ ID NO：63和69、 SEQ ID NO：64和70、 SEQ ID NO：65和71、 SEQ ID NO：66和72、 SEQ ID NO：67和73、或 SEQ ID NO：68和74。
  6. 如請求項1至5中任一項之單株抗體或抗原結合部分，其進一步包含可偵測標記。
  7. 一種組成物或套組，其包含在水性緩衝溶液中的如請求項1至6中任一項之單株抗體或抗原結合部分。
  8. 一種經分離核酸分子，其編碼如請求項1至6中任一項之單株抗體或抗原結合部分之重鏈、輕鏈、或兩者。
  9. 如請求項8之核酸分子，其包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、及/或12。
  10. 如請求項9之核酸分子，其包含： SEQ ID NO：1和7、 SEQ ID NO：2和8、 SEQ ID NO：3和9、 SEQ ID NO：4和10、 SEQ ID NO：5和11、或 SEQ ID NO：6和12。
  11. 一種表現構築體，其包含如請求項8至10中任一項之核酸分子。
  12. 一種宿主細胞，其包含編碼如請求項1至6中任一項之單株抗體或抗原結合部分之重鏈與輕鏈的核苷酸序列。
  13. 如請求項12之宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
  14. 一種產生抗體或其抗原結合部分的方法，其包含： 在允許該抗體或部分之重鏈和輕鏈表現的條件下培養如請求項13之宿主細胞，以及 從細胞培養物的培養細胞或上清液分離該抗體或部分。
  15. 一種在樣品中偵測人類IgG或其片段的方法，其包含使樣品與如請求項1至6中任一項之一或多個單株抗體或抗原結合部分接觸。
  16. 如請求項15之方法，其中該樣品從已被投予包含人類IgG恆定區的抗體或其片段的動物取得。
  17. 如請求項15或16之方法，其中該人類IgG恆定區是人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4恆定區。
  18. 如請求項15或16之方法，其中該動物已被投予包含人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4恆定區的抗體的Fab或F(ab')2片段。
  19. 如請求項15至18中任一項之方法，其中該樣品是組織樣品，視情況為血液、血清、或血漿樣品。
  20. 如請求項15至19中任一項之方法，其中該動物為非人類靈長類動物，視情況為石蟹獼猴或恆河猴。
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