JP2010511410A - C型肝炎ウイルスに対する組換え抗体、並びにそれを得る方法及び使用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書では「組換え抗体」又は「複数の組換え抗体」という用語は、組換え技術によって1種類以上のモノクローナル抗体の全部又は一部をコードする核酸配列を適切な発現ベクターにクローニングすること、及び続いて適切な宿主細胞中で抗体を発現することを含む1つ以上の段階によって調製された抗体を指す。したがって、この用語は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片を含めた抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体(完全又は部分ヒト化)、抗体断片から形成される多重特異性又は多価構造、及び二機能性抗体である、組換え産生された抗体を含むが、これらだけに限定されない。
本発明の免疫診断試薬は、組換えキメラ抗体を含めて、HCVタンパク質の診断関連領域に特異的に結合する1種類以上の組換え抗体を含む。したがって、一実施形態においては、本発明によって提供される免疫診断試薬は、HCVタンパク質の診断関連領域に特異的に結合可能である単一のキメラ抗体を含む。別の実施形態においては、免疫診断試薬は、HCVタンパク質の診断関連領域(例えば、同じ領域又は異なる領域)に各々特異的に結合可能である複数のキメラ抗体を含む。複数のキメラ抗体の1種類以上は、同じHCVタンパク質の診断関連領域に特異的に結合可能であり得る。或いは、複数のキメラ抗体の各々は、異なるHCVタンパク質の診断関連領域に特異的に結合し得る。
HCVは、3011個のアミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする約10,000ヌクレオチドのプラス鎖RNAゲノムを含む。ポリタンパク質は、細胞及びウイルスプロテアーゼによって成熟構造及び非構造タンパク質に同時翻訳及び翻訳後処理される。構造タンパク質としては、コアタンパク質(ポリタンパク質のアミノ酸1から192)、エンベロープ糖タンパク質E1(ポリタンパク質のアミノ酸193から384)及びE2(ポリタンパク質のアミノ酸385から747)などが挙げられる。非構造(NS)タンパク質2−5Bとしては、NS2−3自己プロテアーゼ(ポリタンパク質のアミノ酸811から1027)、NS3セリンプロテアーゼ(ポリタンパク質のアミノ酸1028から1658)、NS3のカルボキシ末端2/3中のNTPase/RNAヘリカーゼドメイン、NS4Aポリペプチド(ポリタンパク質のアミノ酸1659から1712)、NS4B及びNS5Aタンパク質(それぞれ、ポリタンパク質のアミノ酸1713から1973及びアミノ酸1974から2421)、NS5B RNA依存性RNAポリメラーゼ(ポリタンパク質のアミノ酸2422から3011)などが挙げられる。
本発明の組換え抗体は、HCV抗原タンパク質に特異的に結合可能である未変性抗体のVH及び/又はVLドメインに由来する抗原結合領域を含む。組換え抗体は、例えば、組換え産生されたモノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片から形成される多重特異性若しくは多価構造、又は二機能性抗体であり得る。
本発明の組換え抗体は、例えば、ヒト、又はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、類人猿、ニワトリなどの非ヒト動物によって産生されたモノクローナル抗体に由来する抗原結合ドメイン配列(例えば、VH及び/又はVL配列、又はその一部)を含み得る。或いは、所望の結合活性を有する抗原結合ドメインは、ラムダファージ中で発現されるコンビナトリアルライブラリーを用いて、バクテリオファージ、細菌若しくは酵母の表面で選択することができ、又は別の生物系(例えば、レトロウイルス又はポリソーム)若しくは非生物系上で標準技術を用いて表示することによってスクリーニングすることができる(例えば、Marks, J.D. et. al., J. Mol. Biol. 222: 581−597(1991); Barbas, C.F.III et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4457−4461(1992)参照)。ライブラリーは、免疫若しくは非免疫宿主から単離された未変性抗原結合ドメイン、合成若しくは半合成抗原結合ドメイン、又は改変抗原結合ドメインで構成され得る。
標的HCV抗原に特異的に結合する組換え抗体の能力は、標準免疫学的技術によって評価することができる(例えば、Current Protocols in Immunology, Coligan, J.E., et al.(ed.), J. Wiley & Sons, New York, NY参照)。例えば、放射性免疫測定法(RIA)又は酵素免疫測定法(EIA又はELISA)によって。本発明の一実施形態においては、組換え抗体は、抗原結合ドメインが由来するモノクローナル抗体と実質的に同じ特異性を示す。
(b)(例えば、実施例10に記載のように)約10.0nMから約100.0nM、場合によっては約50nM、約56nM、約62nM、約68nM又は約74nMの平衡解離定数(KD)を有するHCV NS3キメラ抗体、
(c)(例えば、実施例11に記載のように)約0.1nMから約1.0nM、場合によっては約0.3nM、約0.4nM、約0.5nM又は約0.6nMの平衡解離定数(KD)を有するHCV NS4キメラ抗体、
(d)(例えば、実施例12に記載のように)約1.0nMから約10.0nM、場合によっては約8.4nM、約8.6nM、約8.8nM又は約9.0nMの平衡解離定数(KD)を有するHCV NS5キメラ抗体。
本発明の組換え抗体は、例えば、伝統的な血しょう又は血清の代わりに、HCV抗体の検出用アッセイ又はキットにおいて、HCV検出用診断試薬として、及び/又は標準化試薬、正の対照試薬若しくは較正用物質試薬としての使用に適切である。標準化試薬は、例えば、抗体濃度の内挿のための検量線を設定するために使用することができる。正の対照は、アッセイ性能特性を設定するために、及び/又はアッセイに使用する抗原の完全性を定量及びモニターするために、使用することができる。本発明は、各組換え抗体が異なるHCV抗原に特異的に結合可能である複数の組換え抗体の標準化抗体感受性パネルとしての使用も規定する。かかる感受性パネルは、例えば、HCV抗体検出キットの品質管理のための伝統的な血しょう又は血清の代わりに、アッセイ性能特性を設定するために、及び/又はアッセイに使用する抗原の完全性を定量及びモニターするために、使用することができる。本発明は、HCV感染症の治療又は予防における組換え抗体の使用も企図する。
上述したように、本発明の組換え抗体は、診断及び/又は治療に使用することができる。したがって、本発明の一態様は、1種類以上の組換え抗体と適切な担体、希釈剤及び/又は賦形剤とを含む、診断及び薬剤組成物も規定する。適切な担体、希釈剤及び/又は賦形剤は、当分野で周知である。したがって、医薬品製造用の1種類以上の本発明の組換え抗体の使用も提供する。薬剤組成物の調製のために、担体、希釈剤及び賦形剤は薬学的に許容されるものである。必要に応じて、アジュバント又は他の活性成分を薬剤組成物に含めることができる。
本発明は、さらに、1種類以上の本発明の組換え抗体を含む治療、診断及び品質管理キットを規定する。
本発明の一態様は、HCV検出用診断キットを提供する。キットは、1種類以上の本発明の組換え抗体を含む。組換え抗体は、HCV抗原の捕捉及び/又は検出に使用するために、又は抗原:抗体複合体の検出用二次抗体として使用するために、検出試薬としてキット中に用意することができる。或いは、組換え抗体は、正の対照試薬、標準化試薬、較正試薬又は感受性パネルとしてキット中に用意することができる。種々の実施形態においては、診断キットは、HCV抗原の検出用試薬、又はHCV抗体の検出用試薬を更に含み得る。一実施形態においては、本発明は、HCV抗体に特異的な1種類以上の抗原を含めた、HCV抗体の検出用試薬と、キットに含まれる1種類以上の抗原の1つに各々特異的に結合可能である1種類以上の本発明の組換え抗体を含む正の対照又は標準化試薬とを含む、診断キットを提供する。
本発明は、本発明の組換え抗体の1種類以上、又はHCV感染症の治療若しくは予防に用いられる組換え抗体の1種類以上を含む薬剤組成物を含む、治療キット又はパックを更に規定する。キットの個々の成分は、別々の容器に包装することができ、適用可能なときには、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知を添付することができ、この通知は、ヒト又は動物投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を示す。キットは、本発明の組換え抗体と併用される1種類以上の別の治療薬を更に含んでもよい。キットは、組換え抗体及び/又は追加の治療薬の使用方法又は投与計画を概説する説明書又は指示書を含んでもよい。
ハイブリドーマ細胞系の調製
ハイブリドーマ細胞系抗HCVコア201−603−195を、Galfre et al., Nature, 266: 550(1977)に記載のPEG媒介性融合技術を用いて作製した。手短に述べると、BALB/c雌性マウスを、(HCVポリタンパク質のアミノ酸1−50に対応する)pλコアとして知られる精製HCV組換えコア抗原で免疫した。動物追加免疫投薬計画はフロイントアジュバント系を利用し、抗HCV力価が確認されるまで、HCV酵素免疫測定法(EIA)で血清試料をモニターした。EIAの場合、コアアミノ酸1−150(及びNS3アミノ酸1192−1457)を含むHCV組換えコア抗原を、96ウェルEIAプレートに室温で少なくとも1時間塗布し、次いで2%BSA/PBS緩衝剤で1時間ブロックした。被覆ウェルにマウス血清試料を添加し、プレートを室温で少なくとも1時間温置した。温置後、プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIgG抗体と一緒に約1時間温置した。プレートをO−フェニレンジアミン−2HCl(OPD)を用いて現像し、492nmの光学濃度で読んだ。
上述したように得られた抗HCVコア201−603−195ハイブリドーマ細胞系をハイブリドーマ無血清培地(HSFM)中で培養して、約5×106個の細胞をmRNA精製用に得た。ポリA+mRNAを細胞から単離し、Oligotex Direct mRNA Micro Kit(QIAGEN Inc.、Valencia、CA)を製造者の指示に従って用いて精製した。
pBOSベクターは当分野で公知であり、例えば、(これらのベクター及びベクター自体の使用に関するその教示を参照により本明細書に組み入れる)米国特許出願公開第2005/0227289号に記載されている。
5’−GCTCGCGATGCGACATTGTGATGTCACAGTCT−3’[配列番号3]
を含むHCVコア抗体VL 5’末端プライマーと配列
5’−CACCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGT−3’[配列番号4]
を含むHCVコア抗体VL 3’末端プライマーを設計した。
5’−TTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCT−3’[配列番号5]
を含むHCVコア抗体VH 5’末端プライマーと配列
5’−TTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTT−3’[配列番号6]
を含むHCVコア抗体VH 3’末端プライマーを設計した。
pBOS 201−603−195−L−T9及びpBOS 201−603−195−H−T4プラスミドDNAを、Endofree plasmid Maxi−kit(QIAGEN、CA)を用いて標準技術によって調製した。次いで、こうして得られた高純度プラスミドDNAをCOS 7L細胞に電気穿孔法(Gene Pulser、BIO−RAD)によって一過性導入した。移入されたCOS 7L細胞を5%CO2恒温器中で37℃で3日間温置し、次いで遠心分離によって4000rpmで20分間回収し、上清を収集した。ろ過し、標準プロテインAアガロース(Invitrogen Corp.)親和性精製後、精製抗HCVコアキメラ抗体を酵素免疫測定法(EIA)によって評価して、HCVコア抗原との反応性を確認した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト(「GAH」)IgG抗体を検出抗体として用い、キメラ抗体濃度を変えて、EIAを上述したように実施した。EIAの結果によれば、一過性発現から得られるHCVコアキメラ抗体は、HCVコア抗原に対して反応性であった。
pBOS 201−603−195−L−T9及びpBOS 201−603−195−H−T4クローンを用いて、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。まず、それぞれのベクター中のVH及びVL配列に隣接するSrf I及びNot I制限酵素切断部位を用いて、VH及びVL配列の各々をベクターから切り出した。切り出した配列をゲル精製し、次いで(VH配列の場合)pBVベクター又は(VL配列の場合)pJVベクターにクローニングした。pJVスタッファープラスミドは、Abbott Laboratories(Abbott Bioresearch Center、Worcester、MA)から得られ、SV40プロモーター、ネズミDHFR遺伝子、CMVエンハンサー、アデノウイルス主要後期(AML)プロモーター及びラムダスタッファーを含む。(やはりAbbott Laboratories、Abbott Bioresearch Center、Worcester、MAから得られる)pBVスタッファープラスミドは、CMVエンハンサー、アデノウイルス主要後期(AML)プロモーター及びラムダスタッファーを含む。
ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣(CHO、B3.2、Abbott Laboratories、Abbott Bioresearch Center、Worcester、MA)細胞系を、以下に示す移入及び安定なキメラ抗体発現に使用した。CHO細胞を培養し、標準的リン酸カルシウム媒介性移入によってpBJ HCVコア201−603−195プラスミドを移入した。移入されたHCVコアCHO細胞を数週間培養後、BD FACSAriaフローサイトメーター選別機を用いて96ウェルプレートに単細胞クローニングした。CHOクローンが50%を超える培養密度に増殖した後、上清を抗原特異的EIAによって試験して、CHOクローンの性能をランク付けした。EIAを、種々の濃度のキメラ抗体を用いて上述したように実施した。EIAで最高シグナルを与えた16種類のCHOクローンを増殖させ、再評価した。次いで、クローンCHO 201−603−486を含めて、10種類のCHOクローンをEIAアッセイで得られた最高シグナルに基づいて選択し、CD CHO無血清組織培地に切り換えた(wean)。フローサイトメーターを用いたもう1回の単細胞サブクローニング後、キメラ抗体の産生、及び液体窒素中での長期貯蔵用の細胞バンクの開発のために、HCVコアCHOクローン201−603−486−333を増殖させた。標準プロテインA(POROS A50、Applied Biosystems)精製手順、続いてSephadex G−25 Superfine脱塩カラム精製によって、キメラ抗体をこの細胞系から精製した。
ハイブリドーマ細胞系の調製
ハイブリドーマ細胞系抗HCV NS3 17−903−127を、コア抗原の代わりにCKS−33C−BCDとして知られる精製HCV組換えNS3抗原を用いて、実施例1に記載のように作製した。CKS−33C−BCD組換え抗原は、HCVポリタンパク質のアミノ酸1192−1457+1676−1931に対応する。動物免疫化投薬計画は、フロイントアジュバント系中の1回の追加免疫200μgと2週間後の食塩水中の融合前追加免疫を利用した。
HCVコア201−603−195ハイブリドーマ細胞系に関して実施例1に記載したように、ハイブリドーマ細胞系抗HCV NS3 17−903−127並びにRT−PCRによって得られたマウスVH及びVL配列からmRNAを単離した。陽性PCR産物は、AとFの重鎖(H)プライマーセット(VH−A、VH−F)及びB、C及びGの軽鎖(L)プライマーセット(VL−B、VL−C、VL−G)から認められた。すべての陽性PCR産物をゲル精製し、pCR TOPO 2.1 TAベクターにクローニングし、E.コリに転換した。コロニーPCR反応によってクローン挿入断片を確認した。手短に述べると、M13順方向及びM13逆方向プライマー(Invitrogen Corp.)、Taq DNAポリメラーゼ、並びにテンプレートとして煮沸したE.コリコロニーを用いてPCRを実施した。PCRは、変性94℃1分間、アニーリング50℃1分間及び伸長72℃2分間、更に最終伸長72℃6分間を合計30サイクル含んだ。正しいサイズのPCR産物を産生するクローンをLBブロス中で増殖させた。各プラスミドDNAをQIAprep spin miniprep Kit(QIAGEN)によって精製し、M13順方向及び逆方向プライマーとBig Dye Terminator v3.1サイクル配列決定キット(Applied Biosystems)を用いて配列決定した。
VL−G TAクローン番号5をテンプレートとして用いて、マウスVL配列のクローンを作製するように1対のPCRプライマー、すなわち、配列
5’−CTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGCGATGTTGTGATGGCCCAAACTCCACTCTCCCC−3’[配列番号11]
を含むHCV NS3抗体VL 5’末端プライマーと配列
5’−GCGCATGCGTCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC−3’[配列番号12]
を含むHCV NS3抗体VL 3’末端プライマーを設計した。
5’−GGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTG GGGGAGGC−3’[配列番号13]
を含むHCV NS3抗体VH 5’末端プライマーと配列
5’−GCGCATGCATGCATTGTCGACGCGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCCC−3’[配列番号14]
を含むHCV NS3抗体VH 3’末端プライマーを設計した。
実施例1に記載のように、pBOS 17−903−127−L−T3及びpBOS 17−903−127−H−T2プラスミドDNAを調製し、COS 7L細胞に一過性導入した。実施例1に記載のように、移入されたCOS 7L細胞から抗HCV NS3キメラ抗体を調製し、EIAによって評価してHCV NS3抗原との反応性を確認した。実施例1に記載のように、コア抗原の代わりにCKS−33C−BCD HCV NS3抗原を用いてEIAを実施した。EIAの結果によれば、一過性発現から得られるキメラ抗体は、HCV NS3抗原に対して反応性であった。
pBOS 17−903−127−L−T3及びpBOS 17−903−127−H−T2クローンを用いて、実施例1に記載のように、配列を(VH配列の場合)pBVベクター又は(VL配列の場合)pJVベクターにまずクローニングし、続いてPac I/Asc I制限酵素消化から得られたベクター断片を連結して、VHとVLの両方の配列を含むpBJプラスミドpBJ HCV NS3 17−903−127を生成させることによって、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。pBJクローンをSrf I/Not I消化によってスクリーニングして、pBJクローンが両方の配列を含むことを確認した。HCV NS3キメラ抗体の最終pBJクローン(pBJ HCV NS3 17−903−127)のプラスミドマップを図3に示す。VH及びVL遺伝子配列を図4に示す(それぞれ、配列番号15及び配列番号16)。HCV pBJ HCV NS3 17−903−127クローンを含むE.コリDH5α細胞バンクを作製した。
実施例1に記載のように、pBJ HCV NS3 17−903−127プラスミドをリン酸カルシウム媒介性移入によって、DHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系に移入した。実施例1に記載のように、培養及び単細胞クローニングを実施した。96ウェルプレートを抗原特異的EIAによって試験し、クローン番号132を更なる発生用に選択した。EIAを上述したように実施した。HCV NS3 17−903−132 CHO細胞クローンを培養し、BD FACSAriaフローサイトメーター選別機を用いて単細胞を96ウェルプレートに選別した。CHOサブクローン番号171を選択して、CD−CHO無血清培地(Invitrogen Corp.)に切り換えた。キメラ抗体の産生、及び液体窒素中での貯蔵用の発見細胞バンク(discovery cell bank)の開発のために、最終CHO細胞系(HCV NS3 17−903−132sc171)を増殖させた。実施例1に記載のように、キメラ抗体を標準プロテインA精製手順によってこの細胞系から精製した。
ハイブリドーマ細胞系の調製
ハイブリドーマ細胞系抗HCV NS4 E99H6C34を、コア抗原の代わりにCKS−C100として知られる精製HCV組換えNS4抗原を用いて、実施例1に記載のように作製した。CKS−C100組換え抗原は、HCVポリタンパク質のアミノ酸1676−1931に対応する。動物追加免疫投薬計画はフロイントアジュバント系を使用し、抗HCV力価が確認されるまでHCV EIAで血清試料をモニターした。実施例1に記載のように、コア抗原の代わりにCKS−C100 HCV NS4抗原を用いてEIAを実施した。マウスひ臓細胞をSP2/0骨髄腫と融合させ、20%ウシ胎児血清を含み、HATが補充されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(GIBCO)中で37℃で培養した。ハイブリドーマの抗HCV反応性をEIAによって10−14日後に試験した。抗HCVモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを単細胞希釈技術によってクローン化し、続いてクローンの反応性をEIAによって試験した。陽性培養物を、10%FBSを含むDMEM中で増殖させ、液体窒素中で長期貯蔵するために凍結保存剤中で凍結させた。
HCVコア201−603−195ハイブリドーマ細胞系に関して実施例1に記載したように、ハイブリドーマ細胞系抗HCV NS4 E99H6C34並びにRT−PCRによって得られたマウスVH及びVL配列からmRNAを単離した。陽性PCR産物は、Cの重鎖(H)プライマーセット(VH−C)及びB、C及びGの軽鎖(L)プライマーセット(VL−B、VL−C、VL−G)から認められた。すべての陽性PCR産物をゲル精製し、pCR TOPO 2.1 TAベクターにクローニングし、E.コリDH5αに転換した。プラスミドDNAをE.コリ細胞から抽出し、VH又はVL挿入断片をEcoR I消化によって各PCR産物について確認した。最終TAクローンを、実施例1に記載のように配列アラインメントによって選択した。配列結果によって、VL−G TAクローン番号5が正しいVL配列(配列番号18で示されるポリペプチドをコードする配列番号24)を含み、VH−C TAクローン番号16が正しいVH配列(配列番号17で示されるポリペプチドをコードする配列番号23)を含むことが確認された(図6A−Dも参照)。
VL−G TAクローン番号5をテンプレートとして用いて、マウスVL配列のクローンを作製するように1対のPCRプライマー、すなわち、配列
5’−GCTCGCGATGCGATGTTGTGATGACCCAAAC−3’[配列番号19]
を含むHCV NS4抗体VL 5’末端プライマーと配列
5’−CACCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGC−3’[配列番号20]
を含むHCV NS4抗体VL 3’末端プライマーを設計した。
5’−TACTTCGCGACAGATCCAGTTGGTGCAGTC−3’[配列番号21]
を含むHCV NS4抗体VH 5’末端プライマーと配列
5’−TGGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT−3’[配列番号22]
を含むHCV NS4抗体VH 3’末端プライマーを設計した。
実施例1に記載のように、pBOS E99H6C34−L−T4及びpBOS E99H6C34−H−T2プラスミドDNAを調製し、COS 7L細胞に一過性導入した。実施例1に記載のように、移入されたCOS 7L細胞から抗HCV NS3キメラ抗体を調製し、EIAによって評価してHCV NS4抗原(C100 Ag)との反応性を確認した。EIAを上述したように実施した。EIAの結果によれば、一過性発現から得られるキメラ抗体は、HCV NS4抗原に対して反応性であった。
pBOS E99H6C34−L−T4及びpBOS E99H6C34−H−T2クローンを用いて、実施例1に記載のように、配列を(VH配列の場合)pBVベクター又は(VL配列の場合)pJVベクターにまずクローニングし、続いてPac I/Asc I制限酵素消化から得られたベクター断片を連結して、VHとVLの両方の配列を含むpBJプラスミドpBJ HCV NS4 E99H6C34を生成させることによって、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。pBJクローンをSrf I/Not I消化によってスクリーニングして、pBJクローンが両方の配列を含むことを確認した。HCV NS4キメラ抗体の最終pBJクローン(pBJ HCV NS4 E99H6C34)のプラスミドマップを図5に示す。VH及びVL遺伝子配列を図6A−Bに示す(それぞれ、配列番号23及び配列番号24)。pBJ HCV NS4 E99H6C34クローンを含むE.コリDH5α細胞バンクを作製した。
実施例1に記載のように、pBJ HCV NS4 E99H6C34プラスミドをリン酸カルシウム媒介性移入によって、DHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系に移入した。実施例1に記載のように、培養及び単細胞クローニングを実施した。CHOクローンが50%を超える培養密度に増殖した後、上清を抗原特異的EIAによって試験して、CHOクローンの性能をランク付けした。EIAを上述したように実施した。最高シグナルを示した16種類のCHOクローンを増殖させ、抗原特異的EIAによって再評価した。6種類のCHOクローンを選択して、CD CHO無血清組織培地に切り換えた。精製キメラ抗体の産生及び液体窒素中での貯蔵用の発見細胞バンクの開発のために、HCV NS4 CHOクローン#203を増殖させた。実施例1に記載のように、キメラ抗体を標準プロテインA精製手順によってこの細胞系から精製した。
ハイブリドーマ細胞系の調製
ハイブリドーマ細胞系抗HCV NS5 48−311−387を、CKS EFとして知られるHCV組換え抗原を用いて実施例1に記載のように作製した。CKS−EF組換え抗原は、HCVポリタンパク質のアミノ酸1932−2191+2188−2481に対応する。BALB/c雌性マウスを、フロイントアジュバント系を用いた精製HCV組換え抗原(CKS−EF)200μgによって1回免疫した。3匹のマウスを3日間融合前追加免疫した後、ひ臓を採取した。
HCVコア201−603−195ハイブリドーマ細胞系に関して実施例1に記載したように、ハイブリドーマ細胞系抗HCV NS5 48−311−387並びにRT−PCRによって得られたマウスVH及びVL配列からmRNAを単離した。陽性PCR産物は、Cの重鎖(H)プライマーセット(VH−C)及びB、C及びGの軽鎖(L)プライマーセット(VL−B、VL−C、VL−G)から認められた。すべての陽性PCR産物をゲル精製し、pCR TOPO 2.1 TAベクターにクローニングし、E.コリDH5αに転換した。プラスミドDNAをE.コリ細胞から抽出し、VH又はVL挿入断片をEcoR I消化によって各PCR産物について確認した。最終TAクローンを、実施例1に記載のように配列アラインメントによって選択した。配列結果によって、VL−G TAクローン番号8が正しいVL配列(配列番号26で示されるポリペプチドをコードする配列番号32)を含み、VH−C TAクローン番号13が正しいVH配列(配列番号25で示されるポリペプチドをコードする配列番号31)を含むことが確認された(図8A−Dも参照)。
VL−G TAクローン番号8をテンプレートとして用いて、マウスVL配列のクローンを作製するように1対のPCRプライマー、すなわち、配列
5’−GCTCGCGATGCGACATTGTGATGTCACAGT−3’[配列番号27]
を含むHCV NS5抗体VL 5’末端プライマーと配列
5’−CACCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGT−3’[配列番号28]
を含むHCV NS5抗体VL 3’末端プライマーを設計した。
5’−TACTTCGCGAGAGGTTCAGCTGCAGCAGT−3’[配列番号29]
を含むHCV NS5抗体VH 5’末端プライマーと配列
5’−TGGTCGACGCTGCAGAGACAGTGACCAG−3’[配列番号30]
を含むHCV NS5抗体VH 3’末端プライマーを設計した。
実施例1に記載のように、pBOS 48−311−387−L−T4及びpBOS 48−311−387−H−T2プラスミドDNAを調製し、COS 7L細胞に一過性導入した。実施例1に記載のように、移入されたCOS 7L細胞から抗HCV NS5キメラ抗体を調製し、EIAによって評価してHCV NS5抗原(SOD−NS5;Chiron Corporation)との反応性を確認した。実施例1に記載のように、コア抗原の代わりにCKS EF HCV NS5抗原を用いてEIAを実施した。EIAの結果によれば、一過性発現から得られるキメラ抗体は、HCV NS5抗原に対して反応性であった。
pBOS 48−311−387−L−T4及びpBOS 48−311−387−H−T2クローンを用いて、実施例1に記載のように、配列を(VH配列の場合)pBVベクター又は(VL配列の場合)pJVベクターにまずクローニングし、続いてPac I/Asc I制限酵素消化から得られたベクター断片を連結して、VHとVLの両方の配列を含むpBJプラスミドpBJ HCV NS5 48−311−387を生成させることによって、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。pBJクローンをSrf I/Not I消化によってスクリーニングして、pBJクローンが両方の配列を含むことを確認した。HCV NS5キメラ抗体の最終pBJクローン(pBJ HCV NS5 48−311−387)のプラスミドマップを図7に示す。VH及びVL遺伝子配列を図8A−Bに示す(それぞれ配列番号31及び32)。pBJ HCV NS5 48−311−387クローンを含むE.コリDH5α細胞バンクを作製した。
実施例1に記載のように、pBJ HCV NS5 48−311−387プラスミドをリン酸カルシウム媒介性移入によって、DHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系に移入した。実施例1に記載のように、培養及び単細胞クローニングを実施した。CHOクローンが50%を超える培養密度に増殖した後、上清を抗原特異的EIAによって試験して、CHOクローンの性能をランク付けした。EIAを上述したように実施した。最高シグナルを示した6種類のCHOクローンを増殖させ、抗原特異的EIAによって再評価した。4種類のCHOクローンをBD FACSAriaフロー選別機を用いて単細胞クローニング用に選択した。コンフルエントな成長が明白になった後、培養物をEIAによってスクリーニングして、CHO 48−311−271と命名されたクローンを含めて、無血清培地に切り換える5種類のクローンを選択した。1回の最終サブクローニングによって、細胞バンク目的でHCV NS5 CHOクローン48−311−271−455を選択した。キメラ抗体の産生及び液体窒素中での貯蔵用の発見細胞バンクの開発のために、細胞系を増殖させた。実施例1に記載のように、キメラ抗体を標準プロテインA精製手順によってこの細胞系から精製した。
実施例1に記載の抗HCVコアマウスモノクローナル抗体の結合部位を、アミノ酸32−36(GGVYL、配列番号33)を含むHCVコアタンパク質領域に合成ペプチドを用いて位置づけた。手短に述べると、合成短鎖ペプチドを用いてEIAプレートのウェルを被覆し、2%BSA/PBS緩衝剤でブロックした。抗HCVコアマウスモノクローナル抗体をEIAプレートに添加し、少なくとも1時間温置した。次いで、EIAプレートを洗浄し、ヤギ抗マウス(「GAM」)HRP標識抗体と一緒に更に1時間温置した。プレートを洗浄し、O−フェニレンジアミン−2HCl(OPD)を用いて現像し、492nmの光学濃度で読んだ。
ハイブリドーマ細胞系抗HCV NS3 17−903−127によって産生されるHCV NS3マウスモノクローナル抗体は、アミノ酸1192−1457(265aa)にわたるHCV NS3抗原の領域に対して産生された。NS3キメラ抗体がこの領域内で結合するエピトープを位置づけるために、12対のDNAオリゴヌクレオチドを構築することによって265aa領域を12個の重複断片に分解した。具体的には、これらのオリゴヌクレオチドは、以下の断片であった:1190−1216、1212−1239、1235−1257、1251−1272、1273−1301、1297−1323、1321−1347、1341−1367、1364−1387、1388−1414、1411−1438及び1434−1459。DNAオリゴヌクレオチド対をアニールし、酵母ディスプレイベクター(pYD41)のNco I及びNot I制限酵素部位にクローニングした。HCV NS3ベクターの各々をE.コリに転換し、プラスミドDNAを抽出し、配列決定した。最終クローンの選択は、配列決定に基づいた。選択したクローンをEBY100サッカロミセス セレビシエ細胞に転換した。個々の酵母クローンを培養し、HCV NS3ペプチド発現を誘導した。誘導した酵母細胞をHCV NS3キメラ抗体及び二次抗体(Alexa Fluor 633ヤギ抗ヒトIgG)と一緒に温置し、蛍光活性化細胞選別装置(FACS Calibur)によって分析して、キメラ抗体に対して正の結合を示す、したがってエピトープの位置を示す、断片を決定した。データによれば、HCV NS3断片1190−1216(AKAVDFVPVESLETTMRSPVFTDNSSP、配列番号35)のみが正の結合を示した。
実施例5及び6に概説したように、HCV NS4 CHO E99H6C34sc203細胞系によって産生されたHCV NS4キメラモノクローナル抗体を、合成DNAオリゴヌクレオチド及び標準酵母ディスプレイ技術を用いて、アミノ酸1692−1713(PAIIPDREVLYREFDEMEECSQ、配列番号36)で表されるHCV NS4抗原の領域に位置づけた。次いで、アラニンスキャンニング及び酵母ディスプレイ技術を精密エピトープマッピングに使用した。コア抗原に対して実施例5に概説したように、1692−1713領域であるアラニン変異体のライブラリーを、1組の合成DNAオリゴヌクレオチドを用いて構築した。野生型NS4 1692−1713断片を対照として用いた。酵母ディスプレイを実施例5に記載のように実施し、誘導した酵母細胞をHCV NS4キメラ抗体及び二次抗体(Alexa Fluor 633ヤギ抗ヒトIgG)と一緒に温置し、蛍光活性化細胞選別装置(FACS Calibur)によって分析して、抗体結合活性の低下したアラニン変異体を求めた。データによれば、(図9Cに示すように)HCV NS4抗原位置1701(Leu)、1702(Tyr)、1704(Gly)、1705(Phe)、1706(Asp)がHCV NS4キメラ抗体の結合部位である。
ハイブリドーマ細胞系抗HCV NS5 48−311−387によって産生されるHCV NS5マウスモノクローナル抗体は、アミノ酸2054−2481(428aa)領域にわたるHCV NS5抗原の領域に対して産生された。NS5キメラ抗体がこの領域内で結合するエピトープを位置づけるために、18対のDNAオリゴヌクレオチドを構築することによって428aa領域を18個の重複断片に分解した。具体的には、これらのオリゴヌクレオチドは以下の断片であった:2048−2076、2075−2101、2098−2124、2120−2146、2144−2177、2169−2196、2193−2221、2220−2247、2245−2272、2271−2296、2292−2318、2313−2339、2336−2363、2360−2386、2382−2408、2408−2436、2435−2462及び2457−2486。これらの18対のオリゴヌクレオチド及びHCV NS5キメラ抗体を利用したエピトープマッピングを実施例6に記載のように実施した。データによれば、HCV NS5断片2382−2408(2382−AESYSSMPPLEGEPGDPDLSDGSWSTV−2408、配列番号37)のみが正の結合を示した。
実施例5から得られる野生型HCV 27−39コア断片を含む酵母細胞を培養し、細胞表面のエピトープの発現を誘導した。誘導した酵母細胞を種々の濃度のHCVコアキメラ抗体(100nM、33nM、11nM、3.7nM、1.2nM、0.4nM、0.14nM及び0nM)と一緒に温置した。次いで、結合したHCVコアキメラ抗体を、Alexa 633蛍光団と複合化されたヤギ抗ヒトIgGを用いて標準フローサイトメトリー分析によって検出した。HCVコアキメラ抗体の各濃度における平均蛍光強度(MFI)を、蛍光団の励起後に、適切なレーザー及び検出光学を備えたフローサイトメーターによって測定した。
HCV NS3キメラ抗体の平衡解離定数(KD)を、(実施例6から得られる)野生型HCV 1190−1216 NS3断片を含む酵母細胞及び種々の濃度のHCV NS3キメラ抗体(33nM、11nM、3.7nM、1.2nM、0.4nM、0.14nM及び0nM)を用いて、実施例9に記載のように測定した。その結果、HCV NS3キメラ抗体のKDは約68nMであった。
HCV NS4キメラ抗体の平衡解離定数(KD)を、(実施例7から得られる)野生型HCV 1692−1713 NS4断片を含む酵母細胞及び種々の濃度のHCV NS4キメラ抗体(100nM、33nM、11nM、3.7nM、1.2nM、0.4nM、0.14nM及び0nM)を用いて、実施例9に記載のように測定した。その結果、HCV NS4キメラ抗体のKDは約0.5nMであった。
HCV NS5キメラ抗体の平衡解離定数(KD)を、(実施例8から得られる)野生型HCV 2382−2408 NS5断片を含む酵母細胞及び種々の濃度のHCV NS5キメラ抗体(100nM、33nM、11nM、3.7nM、1.2nM、0.4nM、0.14nM及び0nM)を用いて、実施例9に記載のように測定した。その結果、HCV NS5キメラ抗体のKDは約8.8nMであった。
実施例1−4で調製したHCVコアCHO 201−603−486−333、HCV NS3 CHO 17−903−132sc171、HCV NS4 CHO E99H6C34sc203及びHCV NS5 CHOクローン48−311−271−455細胞系を、細胞の生存、安定な抗体産生による細胞系の安定性、及びマイコプラズマ試験による外来性媒介物(adventitious agent)のないことを含めて、製造性について分析した。細胞系の単クローン性についても試験した。キメラ抗体を等電点電気泳動(IEF)、SDS−PAGE及びゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって特徴づけた。
実施例1−4に記載のように調製した4種類のキメラ抗体(HCVコア、NS3、NS4及びNS5)を、Prism、AxSYM、ARCHITECT及びEIA(Bead)プラットホームのAbbott HCV血液スクリーニングアッセイによって試験した。Prismプラットホームアッセイは、抗体検出にNS3、NS4、NS5及びコア抗原を使用するのに対して、AxSYM、ARCHITECT及びEIA(Bead)プラットホームアッセイは抗体検出にNS3、NS4及びコア抗原を使用する。すべてのプラットホームで、抗原は、現在、ヒトドナーから提供されるエピトープ反応性血しょう/血清試料を用いて適格とされる。
第2の抗コアキメラ抗体HCVコアCHO 14−153−229sc152をハイブリドーマ14−153−462から調製した。(「HCV 14−153−462」としても知られる)ネズミハイブリドーママウスひ臓細胞系抗HCVコア14−153−462をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)、10801 University Boulevard、Manassas、VAに2006年11月21日にPatent Deposit Designation PTA−8028のもとに寄託した。
ハイブリドーマ細胞系抗HCVコア14−153−462を、コアCKS−33C−BCD抗原の代わりにpL−コアとして知られる精製HCV組換えコア抗原を用いて、実施例1に記載のように作製した。pL−コア組換え抗原は、HCVポリタンパク質のアミノ酸1−150に対応する。動物免疫化投薬計画は、フロイントアジュバント系中の1回の追加免疫200μgと2週間後の食塩水中の融合前追加免疫を利用した。
HCVコア201−603−195ハイブリドーマ細胞系に関して実施例1に記載したように、ハイブリドーマ細胞系抗HCVコア14−153−462並びにRT−PCRによって得られたマウスVH及びVL配列からmRNAを単離した。陽性PCR産物は、Cの重鎖(H)プライマーセット(VH−C)及びB及びCの軽鎖(L)プライマーセット(VL−B、VL−C)から認められた。すべての陽性PCR産物をゲル精製し、pCR TOPO 2.1 TAベクターにクローニングし、E.コリに転換した。コロニーPCR反応によってクローン挿入断片を確認した。手短に述べると、M13順方向及びM13逆方向プライマー(Invitrogen Corp.)、Taq DNAポリメラーゼ、並びにテンプレートとして煮沸したE.コリコロニーを用いてPCRを実施した。PCRは、変性94℃1分間、アニーリング50℃1分間及び伸長72℃2分間、更に最終伸長72℃6分間を合計30サイクル含んだ。正しいサイズのPCR産物を産生するクローンをLBブロス中で増殖させた。各プラスミドDNAをQIAprep spin miniprep Kit(QIAGEN)によって精製し、M13順方向及び逆方向プライマーとBig Dye Terminator v3.1サイクル配列決定キット(Applied Biosystems)を用いて配列決定した。
VL−B TAクローン番号5をテンプレートとして用いて、マウスVL配列のクローンを作製するように1対のPCRプライマー、すなわち、HCVコア抗体VL 5’末端プライマー
5’−AAATTTTCGCGATGCGACATTGTGCTGACCCAATCTC−3’[配列番号96]
とHCVコア抗体VL 3’末端プライマー
5’−ACTACTCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCT−3’[配列番号97]
を設計した。
5’−AAATTTTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGG−3’[配列番号98]
とHCVコア抗体VH 3’末端プライマー
5’−TCCTTTGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTT−3’[配列番号99].
を設計した。
実施例1に記載のように、pBOS 14−153−462−L−T0及びpBOS 14−153−462−H−T0プラスミドDNAを調製し、COS 7L細胞に一過性導入した。実施例1に記載のように、移入されたCOS 7L細胞から抗HCVコアキメラ抗体を調製し、EIAによって評価してHCVコア抗原との反応性を確認した。EIAを実施例1に記載のように実施した。EIAの結果によれば、一過性発現から得られるキメラ抗体は、HCVコア抗原に対して反応性であった。
pBOS 14−153−462−L−T0及びpBOS 14−153−462−H−T0クローンを用いて、実施例1に記載のように、配列を(VH配列の場合)pBVベクター又は(VL配列の場合)pJVベクターにまずクローニングし、続いてPac I/Asc I制限酵素消化から得られたベクター断片を連結して、VHとVLの両方の配列を含むpBJプラスミドpBJ HCVコア14−153−462を生成させることによって、安定な細胞系移入用のプラスミドクローンを構築した。pBJクローンをSrf I/Not I消化によってスクリーニングして、pBJクローンが両方の配列を含むことを確認した。HCVコアキメラ抗体の最終pBJクローン(pBJ HCVコア14−153−462)のプラスミドマップを図12に示す。VH及びVL遺伝子配列を図11A−Bに示す(それぞれ、配列番号40及び配列番号41)。pBJ 14−153−462−T4クローンを含むE.コリDH5α細胞バンクを作製した。
実施例1に記載のように、pBJ 14−153−462−T4プラスミドをリン酸カルシウム媒介性移入によって、DHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞系に移入した。実施例1に記載のように、培養及び単細胞クローニングを実施した。96ウェルプレートを抗原特異的EIAによって試験し、クローン番号229を更なる発生用に選択した。EIAを上述したように実施した。HCVコア14−153−462 CHO細胞クローンを培養し、BD FACSAriaフローサイトメーター選別機を用いて単細胞を96ウェルプレートに選別した。CHOサブクローン番号152を選択して、CD−CHO無血清培地(Invitrogen Corp.)に切り換えた。キメラ抗体の産生、及び液体窒素中での貯蔵用の発見細胞バンクの開発のために、最終CHO細胞系(HCVコア14−153−229sc152)を増殖させた。実施例1に記載のように、キメラ抗体を標準プロテインA精製手順によってこの細胞系から精製した。
Claims (93)
- C型肝炎ウイルス(HCV)タンパク質の診断関連領域に特異的に結合する1種類以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬であって、前記1種類以上の組換え抗体がHCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、HCV E2タンパク質に特異的なキメラ抗体、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、及びHCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体からなる群から選択される、免疫診断試薬。
- 前記免疫診断試薬が、
(a)HCVポリタンパク質のアミノ酸1−150によって規定されたHCVコアタンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)アミノ酸1192から1457 HCVポリタンパク質によって規定されたHCV NS3タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(c)アミノ酸1920から1935又はアミノ酸1676から1931 HCVポリタンパク質によって規定されたHCV NS4タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(d)HCVポリタンパク質のアミノ酸2054から2995によって規定されたHCV NS5タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項1に記載の免疫診断試薬。 - 前記免疫診断試薬が、
(a)配列番号34で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号35で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(c)配列番号36で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(d)配列番号37で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記免疫診断試薬が、
(a)配列番号100で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号101で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(c)配列番号102で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記免疫診断試薬が、
(a)配列番号103で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号104で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(c)配列番号105で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記免疫診断試薬が、
(a)配列番号106で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号107で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(c)配列番号108で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記免疫診断試薬が、
(a)配列番号109で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号110で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(c)配列番号111で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号1で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(b)配列番号38で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(c)配列番号42、43及び44で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域、並びに
(d)配列番号48、49及び50で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号2で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(b)配列番号39で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(c)配列番号45、46及び47で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域、並びに
(d)配列番号51、52及び53で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号9で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号54、55及び56で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号10で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号57、58及び59で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号17で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号60、43及び61で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号18で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号62、58及び63で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号25で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号64、65及び66で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
配列番号26で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
配列番号67、46及び68で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号7によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(b)配列番号40によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(c)配列番号69、70及び71によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域、並びに
(d)配列番号75、76及び77によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号8によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(b)配列番号41によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(c)配列番号72、73及び74によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域、並びに
(d)配列番号78、79及び80によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号15によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号81、82及び83によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号16によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号84、85及び86によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号23によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号87、70及び88によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号24によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号89、85及び90によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号31によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号91、92及び93によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記キメラ抗体が、
配列番号32によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
配列番号94、73及び95によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項2に記載の免疫診断試薬。 - 前記免疫診断試薬が前記組換え抗体の2種類以上を含む、請求項1から23のいずれかに記載の免疫診断試薬。
- 前記免疫診断試薬が、検出試薬、標準化試薬及び正の対照試薬からなる群から選択される試薬である、請求項24に記載の免疫診断試薬。
- HCVコアタンパク質、HCV NS3タンパク質、HCV NS4タンパク質及びHCV NS5タンパク質からなる群から選択されるHCVタンパク質の診断関連領域に特異的に結合する、キメラ抗体。
- 前記キメラ抗体が、
(a)HCVポリタンパク質のアミノ酸1−150によって規定されたHCVコアタンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)アミノ酸1192から1457 HCVポリタンパク質によって規定されたHCV NS3タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(c)アミノ酸1920から1935又はアミノ酸1676から1931 HCVポリタンパク質によって規定されたHCV NS4タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(d)HCVポリタンパク質のアミノ酸2054から2995によって規定されたHCV NS5タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項26に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号34で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号35で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(c)配列番号36で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(d)配列番号37で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項26に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号100で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号101で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(c)配列番号102で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項26に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号103で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号104で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(c)配列番号105で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項26に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号106で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号107で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(c)配列番号108で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項26に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号109で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)配列番号110で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(c)配列番号111で表されるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項26に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号1で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(b)配列番号38で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(c)配列番号42、43及び44で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域、並びに
(d)配列番号48、49及び50で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号2で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(b)配列番号39で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(c)配列番号45、46及び47で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域、並びに
(d)配列番号51、52及び53で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号9で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号54、55及び56で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域。
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号10で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号57、58及び59で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号17で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号60、43及び61で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号18で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号62、58及び63で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号25で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号64、65及び66で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号26で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号67、46及び68で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号7によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(b)配列番号40によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(c)配列番号69、70及び71によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域、並びに
(d)配列番号75、76及び77によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号8によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(b)配列番号41によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(c)配列番号72、73及び74によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域、並びに
(d)配列番号78、79及び80によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号15によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号81、82及び83によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号16によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号84、85及び86によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号23によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号87、70及び88によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号24によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号89、85及び90によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号31によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号91、92及び93によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、
(a)配列番号32によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号94、73及び95によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項27に記載のキメラ抗体。 - 前記キメラ抗体が、HCVコアCHO 201−603−486−333、HCVコアCHO 14−153−229sc152、HCV NS3 CHO 17−903−132sc171、HCV NS4 CHO E99H6C34sc203及びHCV NS5 CHO 48−311−271−455からなる群から選択される細胞系によって発現されるキメラ抗体と実質的に同一である、請求項26から48のいずれかに記載のキメラ抗体。
- 抗HCVコア201−603−195、抗HCVコア14−153−462、抗HCV NS3 17−903−127、抗HCV NS4 E99H6C34及び抗HCV NS5 48−311−387からなる群から選択される細胞系によって発現される、マウスモノクローナル抗体。
- C型肝炎ウイルスタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するキメラ抗体を発現する細胞系であって、HCVコアCHO 201−603−486−333、HCVコアCHO 14−153−229sc152、HCV NS3 CHO 17−903−132sc171、HCV NS4 CHO E99H6C34sc203及びHCV NS5 CHO 48−311−271−455からなる群から選択される、前記細胞系。
- C型肝炎ウイルスタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を発現する細胞系であって、抗HCVコア201−603−195、抗HCVコア14−153−462、抗HCV NS3 17−903−127、抗HCV NS4 E99H6C34及び抗HCV NS5 48−311−387からなる群から選択される、前記細胞系。
- 請求項1から25のいずれかに記載の免疫診断試薬を感受性パネルとして使用することを含む、HCV抗体検出アッセイを標準化する方法。
- HCV抗原の存在を検出する方法であって、
(a)試験試料を得る段階、
(b)前記試験試料を請求項1から25のいずれかに記載の免疫診断試薬と、キメラ抗体:抗原複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、及び
(b)前記HCV抗原の存在を示すものとして、形成されたキメラ抗体:抗原複合体を検出する段階
を含む、方法。 - HCV抗体の存在を検出する方法であって、
(a)試験試料を得る段階、
(b)前記試験試料をHCV抗体に特異的な1種類以上のHCV抗原と、抗原:抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させる段階、及び
(c)前記HCV抗原の存在を示すものとして、形成された抗原:抗体複合体を検出する段階
を含み、改善が、請求項1から25のいずれかに記載の免疫診断試薬が前記方法において正の対照又は標準化試薬として用いられることを含む、方法。 - 請求項1から25のいずれかの免疫診断試薬を含む、C型肝炎ウイルス検出用診断キット。
- HCVタンパク質エピトープに特異的に結合する抗体によって結合される、HCVタンパク質エピトープ内のアミノ酸残基を特定する方法であって、
(a)宿主細胞(すなわち、酵母細胞)の表面に提示された一連のペプチドを含む酵母ディスプレイライブラリーを得る段階であって、酵母によって提示された前記一連のペプチドが、前記エピトープのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含み、前記エピトープの個々のアミノ酸はアラニンで順次置換されている段階、
(b)前記酵母ディスプレイライブラリーを、前記エピトープに特異的に結合する抗体と、前記抗体と前記エピトープの結合を可能にする条件下で接触させる段階、及び
(c)段階(b)において前記抗体によって結合されない、酵母細胞上に提示されたペプチドを特定する段階
を含み、抗体結合の欠如によって、酵母によって提示されたペプチドが、エピトープ中の前記抗体によって結合されるアミノ酸位置にアラニン残基を含むことが示される、方法。 - HCVコアタンパク質、HCV NS3タンパク質、HCV NS4タンパク質及びHCV NS5タンパク質からなる群から選択されるHCVタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部を含む、単離ポリペプチド。
- 前記キメラ抗体が、
(a)HCVポリタンパク質のアミノ酸1−150によって規定されたHCVコアタンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)アミノ酸1192から1457 HCVポリタンパク質によって規定されたHCV NS3タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(c)アミノ酸1920から1935又はアミノ酸1676から1931 HCVポリタンパク質によって規定されたHCV NS4タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(d)HCVポリタンパク質のアミノ酸2054から2995によって規定されたHCV NS5タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項58に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号1で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(b)配列番号38で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(c)配列番号42、43及び44で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域、並びに
(d)配列番号48、49及び50で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号2で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(b)配列番号39で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(c)配列番号45、46及び47で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域、並びに
(d)配列番号51、52及び53で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号9で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号54、55及び56で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号10で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号57、58及び59で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号17で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号60、43及び61で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号18で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号62、58及び63で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号25で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号64、65及び66で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号26で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号67、46及び68で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号7によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(b)配列番号40によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(c)配列番号69、70及び71によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域、並びに
(d)配列番号75、76及び77によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号8によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(b)配列番号41によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(c)配列番号72、73及び74によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域、並びに
(d)配列番号78、79及び80によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号15によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号81、82及び83によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号16によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号84、85及び86によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号23によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号87、70及び88によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号24によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号89、85及び90によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号31によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号91、92及び93によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、
(a)配列番号32によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号94、73及び95によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域を含む、請求項59に記載の単離ポリペプチド。 - HCVコアタンパク質、HCV NS3タンパク質、HCV NS4タンパク質及びHCV NS5タンパク質からなる群から選択されるHCVタンパク質の診断関連領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部をコードする、単離ポリヌクレオチド。
- 前記キメラ抗体が、
(a)HCVポリタンパク質のアミノ酸1−150によって規定されたHCVコアタンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCVコアタンパク質に特異的なキメラ抗体、
(b)アミノ酸1192から1457 HCVポリタンパク質によって規定されたHCV NS3タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS3タンパク質に特異的なキメラ抗体、
(c)アミノ酸1920から1935又はアミノ酸1676から1931 HCVポリタンパク質によって規定されたHCV NS4タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS4タンパク質に特異的なキメラ抗体、及び
(d)HCVポリタンパク質のアミノ酸2054から2995によって規定されたHCV NS5タンパク質の領域に含まれるエピトープに特異的に結合する、HCV NS5タンパク質に特異的なキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項76に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号1で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(b)配列番号38で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(c)配列番号42、43及び44で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域、並びに
(d)配列番号48、49及び50で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号2で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(b)配列番号39で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(c)配列番号45、46及び47で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域、並びに
(d)配列番号51、52及び53で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号9で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号54、55及び56で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号10で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号57、58及び59で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号17で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号60、43及び61で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号18で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号62、58及び63で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号25で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号64、65及び66で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号26で表される配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号67、46及び68で表される配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号7によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(b)配列番号40によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、
(c)配列番号69、70及び71によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域、並びに
(d)配列番号75、76及び77によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号8によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(b)配列番号41によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、
(c)配列番号72、73及び74によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域、並びに
(d)配列番号78、79及び80によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号15によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号81、82及び83によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号16によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号84、85及び86によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号23によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号87、70及び88によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号24によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号89、85及び90によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号31によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVH領域、並びに
(b)配列番号91、92及び93によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVH領域
からなる群から選択されるVH領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号32によってコードされる配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むVL領域、並びに
(b)配列番号94、73及び95によってコードされる配列の1個以上と実質的に同一である相補性決定領域配列を含むVL領域
からなる群から選択されるVL領域をコードする、請求項77に記載の単離ポリヌクレオチド。
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