BRPI0720154A2

BRPI0720154A2 - Anticorpos recombinantes contra vírus da hepatite c e processos de obtenção e de utilização dos mesmos

Info

Publication number: BRPI0720154A2
Application number: BRPI0720154-0A
Authority: BR
Inventors: Baillin Tu; Joan D Tyner; James W Scheffel; Michael K White; Jeffrey M Werneke; Robert N Ziemann; David J Hawksworth; Mary S Pinkus; Robin A Gutierrez
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2006-12-05
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2014-02-04
Also published as: EP2099825A4; US20110263436A1; US8734793B2; US7858752B2; CA2670423A1; US20080131912A1; EP2099825A2; WO2008070727A2; WO2008070727A3; JP2010511410A; MX2009005942A

Description

“ANTICORPOS RECOMBINANTES CONTRA VÍRUS DA HEPATITE C E PROCESSOS DE OBTENÇÃO E DE UTILIZAÇÃO DOS MESMOS”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se entre outras coisas ao campo de anticorpos recom- binantes e, em particular, a anticorpos recombinantes que incluem anticorpos quiméricos contra o vírus da hepatite C (HCV).

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

O vírus da hepatite C (HCV) é atualmente reconhecido como sendo a causa primá- ria da hepatite sem ser A sem ser B (NANB) associada com a transfusão. O HCV é um vírus de RNA de sentido positivo de filamento simples com similaridades aos flavivírus e pestivírus (Miller RH e Purcell RH. Proc Natl Acad Sei. (1991) 87, 2057; Weiner AJ e outros Virology (1990) 180, 842) e tem distribuição global. O HCV contém um genoma de RNA de filamento positivo de aproximadamente 10.000 nucleotídeos que codifica um precursor de poliproteína de aproximadamente 3000 aminoácidos. A poliproteína é processada co- e pós-tradução por proteases celulares e virais em proteínas estruturais e não estruturais maduras. As proteínas estruturais incluem a proteína do núcleo e as glicoproteínas do envelope, E1 e E2. As prote- ínas não estruturais incluem a autoprotease NS2-3, a serina protease NS3, um domínio de NTPase/RNA helicase nos dois terços carbóxi terminal de NS3, o polipeptídeo NS4A, as proteínas NS4B e NS5A e a RNA polimerase dependente do RNA de NS5B. O genoma do HCV é heterogêneo e foi classificado em seis genótipos principais (1-6), cujas seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidas variam em aproximadamente 30% em relação ao genoma inteiro (ver, Neville1 J.A. e outros, J. Clin. Microbiol., 35:3062-3070 (1997)).

A infecção com HCV é atualmente diagnosticada através da detecção direta do RNA viral por PCR ou através da detecção de anticorpos anti-HCV (geralmente para a prote- ína estrutural do núcleo do HCV ou a proteína NS3 não estrutural). Mais recentemente, fo- ram desenvolvidos ensaios com antígenos do HCV que demonstram que os antígenos da proteína do núcleo do HCV podem ser detectados em uma amostra mais cedo do que os anticorpos podem ser detectados. Estudos mostraram que o tempo médio a partir do primei- ro sangramento virêmico até o primeiro sangramento positivo em relação aos antígenos do HCV é estimado em 2,0 dias e que o tempo médio até o primeiro sangramento positivo em relação aos anticorpos para o HCV em 50,8 dias (Couroucé AM e outros Transfusion, (2000) 40, 1198-1202).

Kits para teste de HCV disponíveis atualmente que empregam anticorpos anti-HCV utilizam anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais (mAbs) têm se revelado ao longo dos últimos anos como reagentes comerciais com importância crescente (ver, Smith, K.A. e outros, J. Clin. Pathol., 57:912-917 (2004)), especialmente na área de diagnósticos e produtos terapêuticos em que o grau excepcionalmente alto de ligação direcionada exibido pelos mAbs contribuiu com o seu sucesso.

Desenvolvimentos recentes na tecnologia do DNA recombinante tornaram possível clonar as seqüências que codificam mAbs e expressar os anticorpos ou fragmentos dos an- ticorpos, na forma de proteínas recombinantes. Os anticorpos recombinantes podem ser 5 frequentemente produzidos de forma mais coerente e confiável partindo de construções re- combinantes que partindo do hibridoma original. A tecnologia do DNA recombinante também permitiu a criação de combinações das regiões variáveis de cadeias pesadas e leves de um mAb não humano desejado com regiões constantes humanas criando um anticorpo quiméri- co (ver, por exemplo, as Patentes U.S. N— 4.816.567 e 6.331.415). O anticorpo quimérico 10 mantém a especificidade e a afinidade do anticorpo monoclonal não humano original, mas causa respostas de anticorpo anti-murino humano (HAMA) inferiores quando administrado de forma terapêutica e também é capaz de reagir em formatos de ensaios de diagnóstico existentes que medem a imunoglobulina humana.

Foram descritos os anticorpos monoclonais e recombinantes para HCV. Por exem- 15 pio, as Patentes U.S. N— 5.595.868 e 7.049.060 e o Pedido de Patente U.S. 2003/0148333 descrevem anticorpos monoclonais para a proteína do núcleo do HCV; o Pe- dido de Patente U.S. 2004/0208887 descreve anticorpos monoclonais para a proteína E1 do HCV; as Patentes U.S. N— 5.308.750 e 7.091.324 descrevem anticorpos monoclonais pa- ra a proteína E2 do HCV; e a Patente U.S. Na 5.753.430 descreve anticorpos monoclonais 20 para a proteína do núcleo do HCV, para a proteína NS3 e para a proteína NS4. Os anticor- pos recombinantes humanos e especificamente fragmentos Fab derivados de anticorpos humanos, específicos para a proteína NS3 do HCV são descritos no Pedido de Patente U.S. 2004/0214994. Foram descritos os anticorpos quiméricos para a região hipervariável 1 (HVR1) do HCV (Li, C. e Allain, J-P., J. Gen. Virol., 86:1709-1716 (2005)). A HVR1 é uma

região altamente mutada de 27 resíduos no terminal N da proteína E2.

Foi descrito o uso de anticorpos quiméricos “heterólogos” como reagentes de con- trole de qualidade ou calibradores de ensaios imunológicos (Hamilton, R.G., Ann. Bioi Clin., 48:473-477 (1990); Hamilton, R.G., Ann. Biol. Clin., 49:242-248 (1991); Naess, L.M. e outros, J. of Immunol. Methods, 196:41-49; Schuurman, J. e outros, J. Allergy Clin. Immu- 30 nol., 99:545-550 (1997)). Heterólogo neste contexto indica que o anticorpo quimérico Se liga a um antígeno não relacionado com o antígeno utilizado no ensaio para a detecção de anti- corpos. O uso de anticorpos quiméricos camundongo-ser humano recombinantes e espe- cificamente anticorpos quiméricos camundongo-ser humano recombinantes contra Toxo- plasma gondii, que se ligam ao mesmo ou a um antígeno “homólogo” como calibradores ou 35 controles positivos em ensaios e kits que medem anticorpos humanos também foi descrito (Patente U.S. Na 6.015.662 e Hackett, J. Jr. e outros, J. Clin. Microbiol., 36:1277-1284).

Além disso, muitos ensaios imunológicos para o HCV utilizam amostras de sangue de pacientes infectados pelo HCV para preparar um grupo de sensibilidade ao HCV. Os re- agentes de controle de qualidade tais como os grupos de sensibilidade são plasma/soro humano verificados em relação à presença de anticorpos contra epítopos específicos. Entre- tanto, o uso de soro/plasma humano possui várias desvantagens significativas, incluindo 5 maiores preocupações reguladoras, dificuldade de aquisição de grande volume com título e especificidade altos, variabilidade de lote a lote, limitações em relação à caracterização e ao custo.

Esta informação básica é fornecida com a finalidade de tornar a informação conhe- cida acreditada pelo requerente como sendo de relevância possível para a presente inven- ção. Não é necessariamente pretendido um reconhecimento, nem deve ser interpretado, que qualquer uma das informações anteriores constitui a arte anterior contra a presente in- venção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da invenção é fornecer anticorpos recombinantes, que incluem anticor- 15 pos quiméricos, contra o vírus da hepatite C (HCV) e usos dos mesmos. De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido aqui um reagente para diagnóstico imunológico que compreende um ou mais anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos, que são capazes de se ligar especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do HCV. Opcionalmente o um ou mais anticorpos recombinantes, incluindo 20 anticorpos quiméricos, são selecionados do grupo que consiste de um anticorpo recombi- nante específico para a proteína do núcleo do HCV, um anticorpo recombinante específico para a proteína E2 do HCV, um anticorpo recombinante específico para a proteína NS3 do HCV1 um anticorpo recombinante específico para a proteína NS4 do HCV e um anticorpo recombinante específico para a proteína NS5 do HCV.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um anticorpo recombi-

nante, incluindo um anticorpo quimérico, que se liga especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do HCV em que a região relevante para diagnóstico é op- cionalmente selecionada do grupo que consiste de uma proteína do núcleo do HCV, uma proteína HS3 do HCV, uma proteína NS4 do HCV e uma proteína NS5 do HCV.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma linhagem de célu-

las capaz de expressar um anticorpo quimérico que se liga especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do HCV, em que a linhagem de células é opcio- nalmente selecionada do grupo que consiste de HCV núcleo CHO 201-603-486-333, CHO 14-153-229sc152 do núcleo do HCV, HCV NS3 CHO 17-903-132sc171, HCV NS4 CHO 35 E99H6C34sc203 e HCV NS5 CHO 48-311-271-455. É também fornecida uma linhagem de células que expressa um anticorpo monoclonal de camundongo que se liga especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do vírus da hepatite C, em que a linhagem de células é opcionalmente selecionada do grupo que consiste de 201-603-195 anti-núcleo do HCV, 14-153-462 anti-núcleo do HCV, 17-903-127 anti-NS3 do HCV, E99H6C34 anti-NS4 do HCV e 48-311-387 anti-NS5 do HCV.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de padronização de um ensaio de detecção de anticorpos para HCV que compreende o em- prego como um grupo de sensibilização de um reagente para diagnóstico imunológico que compreende opcionalmente um ou mais anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos recombinantes, que são capazes de se ligar especificamente a uma região rele- vante para diagnóstico de uma proteína do HCV. Em um tal conjunto, opcionalmente o um ou mais anticorpos recombinantes são selecionados do grupo que consiste de um anticorpo recombinante (por exemplo, um anticorpo quimérico) específico para a proteína do núcleo do HCV, um anticorpo recombinante (por exemplo, um anticorpo quimérico) específico para a proteína E2 do HCV, um anticorpo recombinante (por exemplo, um anticorpo quimérico) específico para a proteína NS3 do HCV, um anticorpo recombinante (por exemplo, um anti- corpo quimérico) específico para a proteína NS4 do HCV e um anticorpo recombinante (por exemplo, um anticorpo quimérico) específico para a proteína NS5 do HCV.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método pa- ra a detecção da presença de antígenos do HCV que compreende o contato de uma amos- tra de teste, tal como uma amostra suspeita de conter antígenos do HCV, com um reagente para diagnóstico imunológico que compreende um ou mais anticorpos recombinantes, inclu- indo anticorpos quiméricos recombinantes, que cada um é capaz de se ligar especificamente a um antígeno do HCV. Opcionalmente o contato é feito sob condições que permitem a for- mação de complexos de anticorpo recombinanteiantígeno. Ainda opcionalmente o método compreende a detecção de quaisquer complexos de anticorpo recombinante:antígeno for- mados.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método pa- ra a detecção da presença de anticorpos para HCV que compreende o contato de uma a- mostra de teste, tal como uma amostra suspeita de conter anticorpos para HCV, com um ou mais antígenos específicos para os anticorpos para HCV. Opcionalmente este contato é feito sob condições que permitem a formação de complexos de antígeno: anticorpo e ainda op- cionalmente o método compreende a detecção dos complexos de antígeno:anticorpo. Ainda adicionalmente, o método compreende opcionalmente o emprego de um reagente para di- agnóstico imunológico que compreende um ou mais anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos recombinantes, em que cada um dos anticorpos é capaz de se ligar especificamente a um dos antígenos empregados no método, por exemplo, na forma de um controle positivo ou de um reagente de padronização.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um kit para di- agnóstico para a detecção do HCV que compreende um reagente para diagnóstico imunoló- gico que compreende um ou mais anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos quiméri- cos recombinantes, que cada um é capaz de se ligar especificamente a uma região relevan- te para diagnóstico de uma proteína do HCV. Em tal kit, o um ou mais anticorpos recombi- nantes são opcionalmente selecionados do grupo que consiste de um anticorpo recombinan- te (por exemplo, um anticorpo quimérico) específico para a proteína do núcleo do HCV, um anticorpo recombinante (por exemplo, um anticorpo quimérico) específico para a proteína E2 do HCV, um anticorpo recombinante (por exemplo, um anticorpo quimérico) específico para a proteína NS3 do HCV, um anticorpo recombinante (por exemplo, um anticorpo quimérico) específico para a proteína NS4 do HCV e um anticorpo recombinante (por exemplo, um anti- corpo quimérico) específico para a proteína NS5 do HCV.

Ainda de acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um mé- todo de identificação de resíduos de aminoácidos dentro de um epítopo de proteína do HCV que estão Iitados por um anticorpo que se liga especificamente ao dito epítopo da proteína do HCV. O método compreende opcionalmente as etapas de: (a) obtenção de uma bibliote- ca de exibição de leveduras que compreende uma série de peptídeos exibidos na superfície de células hospedeiras (isto é, células de levedura), em que os peptídeos possuem seqüên- cias de aminoácidos que correspondem à seqüência de aminoácidos do epítopo em que cada aminoácido individual do epítopo foi substituído seqüencialmente por alanina; (b) con- tato da biblioteca de exibição de leveduras com o dito anticorpo que é capaz de se ligar es- pecificamente ao epítopo sob condições que permitem a ligação do anticorpo com o epítopo e (c) identificação dos peptídeos exibidos nas células de levedura que não estão ligados pelo dito anticorpo na etapa (b), em que uma ausência de ligação ao anticorpo indica que o peptídeo exibido pela levedura contém um resíduo de alanina em uma posição de aminoáci- do ligada pelo dito anticorpo no epítopo.

Estas e outras características, aspectos, objetivos e modalidades da invenção se tornarão mais evidentes na descrição detalhada a seguir na qual é feita referência às figuras em anexo que são exemplos de tais características, aspectos, objetivos e modalidades.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A FIG. 1 apresenta um mapa de plasmídeo de um plasmídeo de expressão utiliza- do na preparação de um anticorpo quimérico anti-núcleo do HCV (201-603-486-333 do nú- cleo do HCV) em uma modalidade da presente invenção.

As FIGS. 2A-D representam as seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos em uma modalidade da presente invenção das regiões variáveis leves e pesadas de um anticorpo quimérico anti-núcleo do HCV (201-603-486-333 do núcleo do HCV) com a parte sublinhada representado as respectivas regiões de determinação da complementaridade (CDRs): FIG. 2A: seqüência de ácido nucléico da Vh (SEQ ID NO: 7); FIG. 2B: seqüência de ácido nucléico da Vl (SEQ ID NO: 8); FIG. 2C: seqüência de aminoácidos da Vh (SEQ ID NO: 1); e FIG. 2D: seqüência de aminoácidos da Vl (SEQ ID NO: 2).

A FIG. 3 apresenta um mapa de plasmídeo de um plasmídeo de expressão utilizado na preparação de um anticorpo quimérico anti-NS3 do HCV (HCV NS3 CHO 17-903- 132sc171) em uma modalidade da presente invenção.

As FIGS. 4A-D representam as seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos em uma modalidade da presente invenção das regiões variáveis leves e pesadas de um anticorpo quimérico anti-NS3 do HCV (HCV NS3 CHO 17-903-132sc171) com a parte subli- nhada representando as respectivas regiões de determinação da complementaridade (C- 10 DRs): FIG. 4A: seqüência de ácido nucléico da Vh (SEQ ID NO: 15); FIG. 4B: seqüência de ácido nucléico da Vl (SEQ ID NO: 16); FIG. 4C: seqüência de aminoácidos da Vh (SEQ ID NO: 9); e FIG. 4D: seqüência de aminoácidos da Vl (SEQ ID NO: 10).

A FIG. 5 apresenta um mapa de plasmídeo de um plasmídeo de expressão utilizado na preparação de um anticorpo quimérico anti-NS4 do HCV (HCV NS4 CHO E99H6C34sc203) em uma modalidade da presente invenção.

As FIGS. 6A-D representam as seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos em uma modalidade da presente invenção das regiões variáveis leves e pesadas de um anticorpo quimérico anti-NS4 do HCV (HCV NS4 CHO E99H6C34sc203) com a parte subli- nhada representando as respectivas regiões de determinação da complementaridade (C- 20 DRs): FIG. 6A: seqüência de ácido nucléico da Vh (SEQ ID NO: 23); FIG. 6B: seqüência de ácido nucléico da Vl (SEQ ID NO: 24); FIG. 6C: seqüência de aminoácidos da Vh (SEQ ID NO: 17); e FIG. 6D: seqüência de aminoácidos da Vl (SEQ ID NO: 18).

A FIG. 7 apresenta um mapa de plasmídeo de um plasmídeo de expressão utilizado na preparação de um anticorpo quimérico anti-NS5 do HCV (HCV NS5 CHO 48-311-271- 455) em uma modalidade da presente invenção.

As FIGS. 8A-D representam as seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos em uma modalidade da presente invenção das regiões variáveis leves e pesadas de um anticorpo quimérico anti-NS5 do HCV (HCV NS5 CHO 48-311-271-455) com a parte subli- nhada representando as respectivas regiões de determinação da complementaridade (C- 30 DRs); FIG. 8A: seqüência de ácido nucléico da Vh (SEQ ID NO: 31); FIG. 8B: seqüência de ácido nucléico da Vl (SEQ ID NO: 32); FIG. 8C: seqüência de aminoácidos da Vh (SEQ ID NO: 25); e FIG. 8D: seqüência de aminoácidos da Vl (SEQ ID NO: 26).

As FIGS. 9A-D representam os epítopos ligados pelos anticorpos quiméricos para o núcleo, para a NS3, para a NS4 e para a NS5 em uma modalidade da presente invenção: FIG. 9A: mostra o epítopo (SEQ ID NO: 34) ligado pelo anticorpo quimérico anti-núcleo do HCV (201-603-486-333 do núcleo do HCV); FIG. 9B: mostra o epítopo (SEQ ID NO: 35) li- gado pelo anticorpo quimérico anti-NS3 do HCV (HCV NS3 CHO 17-903-132sc171); FIG. 9C: mostra o epítopo (SEQ ID NO: 36) ligado pelo anticorpo quimérico anti-NS4 do HCV (HCV NS4 CHO E99H6C34sc203); e FIG. 9D: mostra o epítopo (SEQ ID NO: 37) ligado pelo anticorpo quimérico anti-NS5 do HCV (HCV NS5 CHO 48-311-271-455); os resíduos especí- ficos ligados pelos respectivos anticorpos quiméricos estão sublinhados e numerados.

A FIG. 10 representa a produção média de anticorpo quimérico em uma pesquisa e uma escala de desenvolvimento típicas (isto é, as células viáveis estavem entre aproxima- damente 20-10%) que é avaliada através da análise de HPLC de culturas de 3 semanas de idade para anticorpo quimérico anti-núcleo do HCV (“Núcleo”; 201-603-486-333 do núcleo do HCV); anticorpo quimérico anti-NS3 do HCV (“NS3”; HCV NS3 CHO 17-903-132sc171); anticorpo quimérico anti-NS4 do HCV (“NS4”; HCV NS4 CHO E99H6C34sc203) e anticorpo quimérico anti-NS5 do HCV (“NS5”; HCV NS5 CHO 48-311-271-455).

As FIGS. 11A-D representam as seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos em uma modalidade da presente invenção das regiões variáveis leves e pesadas de um anticorpo quimérico anti-núcleo do HCV (14-153-229sc152 do núcleo de HCV) com a parte sublinhada representando as respectivas regiões de determinação da complementaridade (CDRs): FIG. 11 A: seqüência de ácido nucléico da Vh (SEQ ID NO: 40); FIG. 11B: seqüên- cia de ácido nucléico da Vl (SEQ ID NO: 41); FIG. 11C: seqüência de aminoácidos da Vh (SEQ ID NO: 38); e FIG. 11 D: seqüência de aminoácidos da Vl (SEQ ID NO: 39).

A FIG. 12 apresenta um mapa de plasmídeo de um plasmídeo de expressão utiliza- do na preparação de um anticorpo quimérico anti-núcleo do HCV (14-153-229sc152 do nú- cleo de HCV) em uma modalidade da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção, entre outras coisas, fornece anticorpos recombinantes, inclu- indo anticorpos quiméricos, específicos para proteínas antigênicas da hepatite C (HCV). De acordo com uma modalidade da presente invenção, os anticorpos recombinantes incluindo anticorpos quiméricos, se ligam especificamente às regiões relevantes para diagnóstico de proteínas do HCV e são assim adequados para uso, por exemplo, como reagentes para di- agnóstico para a detecção do HCV e/ou como reagentes de padronização ou reagentes de controle positivo em ensaios para a detecção do HCV.

A presente invenção fornece assim também um reagente para diagnóstico imunoló- gico que compreende um ou mais anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos quiméri- cos, em que cada anticorpo é capaz de se ligar especificamente a uma região relevante pa- ra diagnóstico de uma proteína do HCV. Os anticorpos recombinantes podem ser, por e- xemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fragmentos de anticorpos e simila- res. Em uma outra modalidade, o reagente para diagnóstico imunológico compreende dois ou mais anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos. Opcionalmente os anti- corpos empregados no reagente para diagnóstico imunológico são cada um específicos pa- ra uma proteína antigênica do HCV diferente, de forma que o reagente para diagnóstico i- munológico é capaz de detectar um grande número de antígenos do HCV. Opcionalmente, o reagente para diagnóstico imunológico compreende um ou mais ou dois ou mais, anticorpos recombinantes específicos para as proteínas do HCV selecionadas do grupo que consiste 5 de um anticorpo recombinante específico para a proteína do núcleo do HCV, um anticorpo recombinante específico para a proteína E2 do HCV, um anticorpo recombinante específico para a proteína NS3 do HCV, um anticorpo recombinante específico para a proteína NS4 do HCV e um anticorpo recombinante específico para a proteína NS5 do HCV.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece o uso do reagente para diagnós- tico imunológico como um reagente de padronização em um ensaio de detecção de HCV, por exemplo, no lugar do soro humano. Neste contexto, o reagente para diagnóstico imuno- lógico pode ser opcionalmente empregado, por exemplo, para avaliar e padronizar o de- sempenho dos ensaios de detecção dos antígenos do HCV atuais e futuros.

Em uma modalidade alternativa, a presente invenção fornece ainda o uso dos anti- corpos recombinantes no tratamento ou na prevenção de uma infecção por HCV.

Estes e modalidades, características, aspectos, ilustrações e exemplos adicionais da invenção são adicionalmente descritos nas seções a seguir. A não ser que seja definido de outra maneira aqui, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que é comumente entendido por um perito comum na arte à qual esta invenção pertence.

Definições

O termo “anticorpo recombinante” ou “anticorpos recombinantes”, como utilizado aqui, refere-se a um anticorpo preparado através de uma ou mais etapas incluindo a clona- gem das seqüências de ácidos nucléicos que codificam todo ou uma parte de um ou mais 25 anticorpos monoclonais dentro de um vetor de expressão apropriado através de técnicas recombinantes e subsequentemente a expressão do anticorpo em uma célula hospedeira apropriada. O termo inclui assim, mas não está limitado a anticorpos produzidos de forma recombinante que são anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos incluindo fragmen- tos de anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados (completa- 30 mente ou parcialmente humanizados), estruturas multiespecíficas ou multivalentes formadas partindo de fragmentos de anticorpos e anticorpos bifuncionais.

O termo “fragmento de anticorpo” ou “fragmentos de anticorpos”, como utilizado a- qui, refere-se a uma parte de um anticorpo intacto que compreende o sítio de ligação ao antígeno ou a região variável do anticorpo intacto, em que a parte está livre dos domínios de 35 cadeia pesada constantes (isto é, CH2, CH3 e CH4, dependendo do isotipo do anticorpo) da região Fc do anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos Fab-SH, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fv1 dianticorpos, moléculas de Fv de cadeia simples (scFv), polipeptídeos de cadeia simples contendo apenas um domínio variável de cadeia simples, polipeptídeos de cadeia simples contendo as três CDRs do domínio variável de cadeia simples, polipeptídeos de cadeia simples contendo apenas uma região variável de cadeia pesada e polipeptídeos de cadeia simples contendo as três CDRs da região variável de cadeia pesada.

O termo “anticorpo quimérico” (ou “cAb”) como utilizado aqui, refere-se a um poli- peptídeo que compreende toda ou uma parte das regiões variáveis de cadeias pesadas e leves de um anticorpo de uma espécie hospedeira ligada a pelo menos uma parte das regi- ões constantes do anticorpo de uma outra espécie hospedeira.

O termo “anticorpo humanizado”, como utilizado aqui, refere-se a um polipeptídeo que compreende uma região variável modificada de um anticorpo humano em que uma par- te da região variável foi substituída pela seqüência correspondente de uma espécie não hu- mana e em que a região variável modificada está ligada a pelo menos parte da região cons- tante de um anticorpo humano. Em uma modalidade, a parte da região variável é toda ou uma parte das regiões de determinação da complementaridade (CDRs). O termo inclui ainda anticorpos híbridos produzidos através do processamento de uma região variável ou uma ou mais CDRs de um anticorpo não humano com uma(ou mais) proteína(s) heteróloga(s), inde- pendente da espécie de origem, do tipo de proteína, da classe de imunoglobulina ou da de- nominação de subclasse, contanto que os anticorpos híbridos exibam a atividade biológica desejada (isto é, a capacidade de se ligar especificamente a uma proteína antigênica do HCV).

O termo “anticorpo bifuncional”, como utilizado aqui, refere-se a um anticorpo que compreende um primeiro braço que possui uma especificidade por um sítio antigênico e um segundo braço que possui uma especificidade por um sítio antigênico diferente, isto é, os anticorpos bifuncionais possuem uma especificidade dual.

O termo “relevante para diagnóstico” como utilizado aqui com referência a uma re- gião de uma proteína do HCV refere-se a uma região da proteína cuja detecção, isolada- mente ou em combinação com outras regiões relevantes para diagnóstico do HCV, permite a detecção de pelo menos três dos seis genótipos de HCV principais (ver, por exemplo, Ne- ville e outros, ibid.). Os exemplos de regiões relevantes para diagnóstico incluem regiões imunodominantes conhecidas na arte e regiões tais como as descritas aqui.

Como utilizado aqui, o termo “epítopo”, “epítopos” ou “epítopos de interesse” refere- se a um(ou mais) sítio(s) em qualquer molécula que é(são) reconhecido(s) e é(são) ca- paz(es) de se ligar a um(ou mais) sítio(s) complementar(es) em seu parceiro de ligação es- pecífica. A molécula e o parceiro de ligação específica fazem parte de um par de ligação específica. Por exemplo, um epítopo pode ser um polipeptídeo, uma proteína, um hapteno, um antígeno de carboidrato (tal como, mas não limitado a glicolipídeos, glicoproteínas ou lipopolissacarídeos) ou polissacarídeo e seu parceiro de ligação específica, pode ser, mas não está limitado a um anticorpo. Tipicamente, um epítopo está contido dentro de um frag- mento antigênico maior (isto é, uma região ou um fragmento capaz de se ligar a um anticor- po) e refere-se aos resíduos precisos conhecidos por entrarem em contato com o parceiro de ligação específica. É possível que um fragmento antigênico contenha mais de um epíto- po.

Como utilizado aqui, “específica” ou “especificidade” no contexto de uma interação entre membros de um par de ligação específica (por exemplo, um antígeno e um anticorpo) refere-se à reatividade seletiva da interação. A expressão “se liga especificamente a” e ter- mos análogos da mesma referem-se à capacidade dos anticorpos de se ligarem especifica- mente a uma proteína do HCV e não se ligarem especificamente a outras entidades. Os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína do HCV podem ser identificados, por exemplo, através de ensaios imunológicos de diagnóstico (por exemplo, ensaios imunológicos radioativos (“RIA”) e ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (“ELISAs”) (Ver, por exemplo, Paul, ed., Fundamental Immunology, 2- ed., Raven Press, Nova York, páginas 332-336 (1989)), BIAcore® (análise de interação biomolecular, instrumento disponível na BIAcore International AB, Uppsala, Suécia), KinExA® (Kinetic Ex- clusion Assay (Ensaio de Exclusão Cinética), disponível na Sapidyne Instruments (Boise, Idaho)) ou outras técnicas conhecidas pelos peritos na arte.

Como utilizado aqui, o termo “constante de dissociação em equilíbrio” ou “KD” que é utilizada de forma intercambiável, refere-se ao valor obtido através da divisão da constante da taxa de dissociação (koff) pela constante da taxa de associação (kon). A constante da taxa de associação, a constante da taxa de dissociação e a constante de dissociação em equilí- brio são utilizadas para representar a afinidade de ligação de um anticorpo com um antíge- no. Os métodos para a determinação destas constantes são bem conhecidos na arte. Por exemplo, pode ser utilizado um ensaio Biacore® ou KinExA®.

Como descrito aqui, os ensaios imunológicos incorporam “reagentes de controle de qualidade” que incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, calibradores, controles e grupos de sensibilidade. Um “calibrador” ou “padrão” tipicamente é utilizado (por exemplo, um ou mais ou um grande número) com a finalidade de estabelecer curvas de calibração (padrão) para a interpolação da concentração de anticorpo. Opcionalmente, um único cali- brador pode ser utilizado próximo ao limite positivo/negativo. Vários calibradores (isto é, mais de um calibrador ou uma quantidade variável de calibrador(es)) podem ser utilizados em conjunto de forma a compreender um “grupo de sensibilidade”. Um “controle positivo” é utilizado para estabelecer as características de desempenho do ensaio e é um indicador útil da integridade dos reagentes (por exemplo, antígenos).

O termo “substancialmente idêntica”, como utilizado aqui em relação a uma se- quência de ácido nucléico ou de aminoácidos indica que, quando alinhada de forma ótima, por exemplo, utilizando os métodos descritos a seguir, a seqüência de ácido nucléico ou de aminoácidos compartilha pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos 5 aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98% ou pelo me- nos aproximadamente 99% de identidade de seqüência com uma segunda seqüência de ácido nucléico ou de aminoácidos definida (ou uma “seqüência de referência”). “Identidade substancial” pode ser utilizada para se referir a vários tipos e comprimentos de seqüência, 10 tal como seqüência de comprimento completo, epítopos ou peptídeos imunogênicos, domí- nios funcionais, seqüências codificadoras e/ou reguladoras, éxons, íntrons, promotores e seqüências genômicas. A porcentagem de identidade entre duas seqüências de aminoáci- dos ou de ácidos nucléicos pode ser determinada de várias maneiras que estão dentro da perícia de um perito na arte, por exemplo, utilizando software de computador disponível ao 15 público tal como Smith Waterman Alignment (Smith, T. F. e M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7); “BestFit” (Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)) que é incorporado no GeneMatcher Plus™, Schwarz e Diahof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Diahof, M. O., Ed pp 353-358; programa BLAST (Basic Local A- Iignment Search Tool (Altschul, S. F., W. Gish e outros (1990) J Mol Biol 215: 403-10) e vari- 20 ações do mesmo incluindo os softwares BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU- BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL e Megalign (DNASTAR). Em adição, os peritos na arte podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo algorit- mos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo do comprimento das se- qüências que serão comparadas. Em geral, para as seqüências de aminoácidos, o compri- 25 mento das seqüências de comparação será de pelo menos aproximadamente 10 aminoáci- dos. Um perito na arte entenderá que o comprimento real dependerá do comprimento total das seqüências que serão comparadas e pode ser de pelo menos aproximadamente 20, pelo menos aproximadamente 30, pelo menos aproximadamente 40, pelo menos aproxima- damente 50, pelo menos aproximadamente 60, pelo menos aproximadamente 70, pelo me- 30 nos aproximadamente 80, pelo menos aproximadamente 90, pelo menos aproximadamente 100, pelo menos aproximadamente 110, pelo menos aproximadamente 120, pelo menos aproximadamente 130, pelo menos aproximadamente 140, pelo menos aproximadamente 150, pelo menos aproximadamente 200, pelo menos aproximadamente 250, pelo menos aproximadamente 300 ou pelo menos aproximadamente 350 aminoácidos ou pode ser o 35 comprimento completo da seqüência de aminoácidos. Para os ácidos nucléicos, o compri- mento das seqüências de comparação será geralmente de pelo menos aproximadamente 25 nucleotídeos, mas pode ser de pelo menos aproximadamente 50, pelo menos aproximada- mente 100, pelo menos aproximadamente 125, pelo menos aproximadamente 150, pelo menos aproximadamente 200, pelo menos aproximadamente 250, pelo menos aproxima- damente 300, pelo menos aproximadamente 350, pelo menos aproximadamente 400, pelo menos aproximadamente 450, pelo menos aproximadamente 500, pelo menos aproxima- damente 550, pelo menos aproximadamente 600, pelo menos aproximadamente 650, pelo menos aproximadamente 700, pelo menos aproximadamente 800, pelo menos aproxima- damente 900 ou pelo menos aproximadamente 1000 nucleotídeos ou pode ser o compri- mento completo da seqüência de ácido nucléico.

Os termos “que corresponde a” ou “corresponde a” indicam que uma seqüência de ácido nucléico é idêntica a toda ou a uma parte de uma seqüência de ácido nucléico de refe- rência. O termo “complementar a” é utilizado aqui para indicar que a seqüência de ácido nucléico é idêntica a toda ou a uma parte do filamento complementar de uma seqüência de ácido nucléico de referência. Para ilustração, a seqüência de ácido nucléico “TATAC” cor- responde a uma seqüência de referência “TATAC” e é complementar a uma seqüência de referência “GTATA”.

A não ser que seja especificado aqui de outra maneira, todas as seqüências de áci- dos nucléicos são escritas em uma direção 5’ para 3’ e todas as seqüências de aminoácidos são escritas em uma direção de terminal amino para carbóxi.

Como utilizado aqui, o termo “aproximadamente” refere-se a uma variação de apro- ximadamente +/-10% do valor determinado. Deve ser entendido que tal variação está sem- pre incluída em qualquer certo valor fornecido aqui, seja este ou não referido especificamen- te.

1. REAGENTE PARA DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO

O reagente para diagnóstico imunológico da presente invenção compreende um ou mais anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos recombinantes, que se li- gam especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do HCV. Em uma modalidade, portanto, o reagente para diagnóstico imunológico fornecido pela presente invenção compreende um único anticorpo quimérico capaz de se ligar especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do HCV. Em outras modalidades, o reagente para diagnóstico imunológico compreende um grande número de anticorpos qui- méricos, cada um capaz de se ligar especificamente a uma região relevante para diagnósti- co de uma proteína do HCV (por exemplo, à mesma região ou a uma região diferente). Um ou mais do grande número de anticorpos quiméricos podem ser capazes de se ligar especi- ficamente a uma região relevante para diagnóstico da mesma proteína do HCV. Alternativa- mente, cada um do grande número de anticorpos quiméricos pode se ligar especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína diferente do HCV.

Em uma modalidade da presente invenção, o reagente para diagnóstico imunológi- co é capaz de detectar um grande número de antígenos do HCV e opcionalmente compre- ende dois ou mais anticorpos recombinantes, cada um capaz de se ligar especificamente a uma proteína antigênica diferente do HCV. Em uma modalidade adicional, o reagente para diagnóstico imunológico compreende opcionalmente três ou mais anticorpos recombinantes, 5 cada um capaz de se ligar especificamente a uma proteína antigênica diferente do HCV. Em uma outra modalidade, o reagente para diagnóstico imunológico compreende opcionalmente quatro ou mais anticorpos recombinantes, cada um capaz de se ligar especificamente a uma proteína antigênica diferente do HCV.

Os anticorpos recombinantes compreendidos pelo reagente para diagnóstico imu- nológico podem ser opcionalmente modificados, por exemplo, para as finalidades de detec- ção, para imobilização sobre um suporte sólido, para aumentar a estabilidade e/ou para au- mentar as propriedades farmacocinéticas ou através de outros meios tais como são conhe- cidos na arte.

2. ANTÍGENOS DO HCV E REGIÕES RELEVANTES PARA DIAGNÓSTICO DOS MESMOS

O HCV contém um genoma de RNA de filamento positivo de aproximadamente 10.000 nucleotídeos que codifica um precursor de poliproteína de 3011 aminoácidos. A poli- proteína é processada co- e pós-tradução por proteases celulares e virais nas proteínas es- truturais e não estruturais maduras. As proteínas estruturais incluem a proteína do núcleo 20 (aminoácidos 1 até 192 da poliproteína) e as glicoproteínas do envelope, E1 (do aminoácido 193 até 384 da poliproteína) e E2 (do aminoácido 385 até 747 da poliproteína). As proteínas não estruturais (NS) 2-5B incluem a autoprotease NS2-3 (do aminoácido 811 até 1027 da poliproteína), a serina protease NS3 (do aminoácido 1028 até 1658 da poliproteína), um domínio de NTPase/RNA helicase nos dois terços carbóxi terminal da NS3, o polipeptídeo 25 NS4A (do aminoácido 1659 até 1712 da poliproteína), as proteínas NS4B e NS5A (do ami- noácido 1713 até 1973 e do aminoácido 1974 até 2421 da poliproteína, respectivamente) e a RNA polimerase dependente do RNA de NS5B (do aminoácido 2422 até 3011 da polipro- teína).

As regiões relevantes para diagnóstico de muitas destas proteínas foram determi- 30 nadas. Para a proteína do núcleo, a região definida, por exemplo, pelos aminoácidos 1-150 e subregiões da mesma tais como os aminoácidos 2 até 120, os aminoácidos 10 até 53 e aminoácidos 1 até 50, foram determinadas como sendo relevantes para diagnóstico. Para a proteína NS3, a região definida, por exemplo, pelos aminoácidos 1192 até 1457 foi determi- nada como sendo relevante para diagnóstico. Para a proteína NS4, as regiões definidas, por 35 exemplo, pelos aminoácidos 1920 até 1935 e pelos aminoácidos 1676 até 1931 e subregi- ões das mesmas tais como os aminoácidos 1696-1931 e os aminoácidos 1694 até 1735, foram determinadas como sendo relevantes para diagnóstico. Para NS5, a região definida, por exemplo, pelos aminoácidos 2054 até 2995 e subregiões da mesma tais como os ami- noácidos 2188 até 2481 e os aminoácidos 2212 até 2313 (ver Dou, X-G. e outros, J. Clin. Microbioi (2002) 40:61-67), foram determinadas como sendo relevantes para diagnóstico. Para E1 e E2 as regiões definidas pelos aminoácidos 303-320 e pelos aminoácidos 405- 444, respectivamente, foram determinadas como sendo relevantes para diagnóstico. Outros exemplos incluem, mas não estão limitados à região definida pelos aminoácidos 1192 até 1931 (abrangendo NS3 e NS4), à região definida pelos aminoácidos 1569 até 1931 (abran- gendo NS3 e NS4) e à região definida pelos aminoácidos 1932 até 2191 (abrangendo NS4 e NS5).

3. ANTICORPOS RECOMBINANTES

Os anticorpos recombinantes da presente invenção compreendem regiões de liga- ção ao antígeno derivadas dos domínios Vh e/ou Vl de um anticorpo nativo capaz de se ligar especificamente a uma proteína antigênica do HCV. O anticorpo recombinante pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal produzido de forma recombinante, um fragmento de um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, uma estrutura multiespecífica ou multivalente formada partindo de um fragmento de anticorpo ou de um anticorpo bifuncional.

Em uma modalidade, opcionalmente o anticorpo recombinante é um anticorpo qui- mérico que mantém especificidade e afinidade de anticorpo monoclonal de camundongo e reage em um formato de ensaio imunológico que mede a imunoglobulina humana. Opcio- nalmente o anticorpo quimérico camundongo-humano é direcionado contra o antígeno do Núcleo, da NS3, da NS4 e/ou da NS5 do HCV. Opcionalmente tal anticorpo quimérico reage em um formato de ensaio imunológico existente que inclui, mas não é limitado ao ensaio de HVC para EIA do Abbott Laboratories (Bead), às plataformas AxSYM®, ARCHITECT® e PRISM®.

A região de ligação ao antígeno compreendida pelo anticorpo recombinante pode incluir a seqüência de Vh e/ou Vl inteira do anticorpo nativo ou pode compreender uma ou mais partes da mesma, tais como as CDRs, junto com seqüências derivadas de um ou mais outros anticorpos. Em uma modalidade, o anticorpo recombinante compreende as seqüên- cias de Vh e Vl de comprimento completo do anticorpo nativo.

O anticorpo nativo do qual as regiões de ligação ao antígeno são derivadas é ge- ralmente um anticorpo de vertebrado. Por exemplo, o anticorpo nativo pode ser um anticorpo de roedor (por exemplo, camundongo, hamster, rato), um anticorpo de frango, um anticorpo de coelho, um anticorpo canino, um anticorpo felino, um anticorpo bovino, um anticorpo e- quino, um anticorpo suíno, um anticorpo de macaco (por exemplo, chimpanzé) ou um anti- corpo humano. A fonte do anticorpo se baseia primariamente na conveniência. Em uma mo- dalidade, o anticorpo nativo é um anticorpo não humano. O anticorpo recombinante também pode incluir uma ou mais regiões constantes, por exemplo, as regiões CL, CH1, de “dobradiça”, CH2, CH3 e/ou CH4, derivadas do mesmo anticorpo nativo ou de um anticorpo diferente. A(s) região(ões) constante(s) podem ser deri- vada(s) de um anticorpo de um de um número de espécies de vertebrados, incluindo mas 5 não limitadas às listadas anteriormente. Em uma modalidade da presente invenção, o anti- corpo recombinante compreende pelo menos uma região constante. Em uma outra modali- dade, o anticorpo recombinante compreende uma ou mais regiões constantes que são deri- vadas de um anticorpo humano. Em uma modalidade específica da presente invenção, o anticorpo recombinante compreende a região variável de um anticorpo não humano ligada à 10 região constante de um anticorpo humano.

A(s) região(ões) constante(s) compreendida(s) pelo anticorpo recombinante po- de(m) ser derivada(s) de uma ou mais classes ou isotipos de imunoglobulina, por exemplo, para as regiões constantes derivadas das imunoglobulinas humanas, a região constante pode ser derivada de uma ou mais de uma região constante de IgM, IgD, IgGI, lgG2, lgG3, 15 lgG4, IgAI, lgA2 ou IgE. Quando a região constante compreende uma região derivada de uma cadeia leve de IgG, esta pode ser derivada de uma cadeia kappa ou de uma cadeia lambda. O anticorpo recombinante pode compreender seqüências de mais de uma classe ou isotipo. A seleção de domínios constantes particulares para otimizar a função desejada do anticorpo recombinante está dentro da perícia comum na arte. Em uma modalidade da 20 presente invenção, o anticorpo recombinante compreende um ou mais domínios constantes derivados de uma IgG. Em uma outra modalidade, o anticorpo recombinante compreende regiões das cadeias tanto pesadas quanto leves de um domínio constante de IgG.

Em uma modalidade da presente invenção, as regiões de ligação ao antígeno são derivadas de um anticorpo nativo que se liga especificamente a um epítopo dentro de uma região relevante para diagnóstico de uma proteína antigênica do HCV. Os exemplos não Iimitantes de regiões relevantes para diagnóstico de proteínas do HCV são fornecidos aci- ma. Em uma outra modalidade, as regiões de ligação ao antígeno são derivadas de um anti- corpo nativo que se liga especificamente a um epítopo dentro da região definida pelos ami- noácidos 1-150 da proteína do núcleo, da região definida pelos aminoácidos 1192 até 1457 da proteína NS3, das regiões definidas pelos aminoácidos 1920 até 1935 ou pelos aminoá- cidos 1676 até 1931 da proteína NS4 ou da região definida pelos aminoácidos 2054 até 2995 da proteína NS5. Em uma modalidade adicional, as regiões de ligação ao antígeno são derivadas de um anticorpo nativo que se liga especificamente a um epítopo dentro da região da proteína do núcleo definida pelos aminoácidos 1-50 da poliproteína do HCV, dentro da região da proteína NS3 definida pelos aminoácidos 1192-1457 da poliproteína do HCV, den- tro da região da proteína NS4 definida pelos aminoácidos 1676-1931 da poliproteína do HCV ou dentro da região da proteína NS5 definida pelos aminoácidos 1932-2191 ou pelos aminoácidos 2188-2481 da poliproteína do HCV. Em uma outra modalidade, as regiões de ligação ao antígeno são derivadas de um anticorpo nativo que se liga especificamente a uma região da proteína do núcleo que é apresentada na SEQ ID NO: 33 (GGVYL) ou na SEQ ID NO: 34 (GGQIVGGVYLLPR), uma região da proteína NS3 que é apresentada na 5 SEQ ID NO: 35 (AKAVDFVPVESLETTMRSPVFTDNSSP), uma região da proteína NS4 que é apresentada na SEQ ID NO: 36 (PAIIPDREVLYREFDEMEECSQ) ou uma região da prote- ína NS5 que é apresentada na SEQ ID NO: 37 (AESYSSMPPLEGEPGDPDLSDGSWSTV).

Em uma modalidade específica da presente invenção, as regiões de ligação ao an- tígeno do anticorpo recombinante compreendem uma seqüência de aminoácidos substanci- almente idêntica a toda ou a uma parte da seqüência Vh ou Vl que é apresentada em qual- quer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 10, 17, 18, 25, 26, 38 e 39 (ver a Tabela 1). Em uma outra modalidade, as regiões de ligação ao antígeno do anticorpo recombinante compreen- dem as regiões de determinação da complementaridade (CDRs; isto é, CDR1, CDR2 e CDR3) de uma seqüência Vh ou Vl. Em uma modalidade específica, as regiões de ligação ao antígeno do anticorpo recombinante compreendem uma seqüência de aminoácidos subs- tancialmente idêntica a uma ou mais das CDRs (ver a Tabela 1): que é apresentada nas SEQ ID NOs: 42, 43 e 44; que é apresentada nas SEQ ID NOs: 45, 46 e 47; que é apresen- tada nas SEQ ID NOs: 48, 49 e 50; que é apresentada nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53; que é apresentada nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56; que é apresentada nas SEQ ID NOs: 57, 58 e 59; que é apresentada nas SEQ ID NOs: 60, 43 e 61; que é apresentada nas SEQ ID NOs: 62, 58 e 63; que é apresentada nas SEQ ID NOs: 64, 65 e 66; ou que é apresentada nas SEQ ID NOs: 67, 46 e 68.

Tabela 1: Exemplos de Seqüências Vh e Vl

SEQ Seqüência Vh ou Vl Especifi¬ ID cidade à NO Proteína do HCV 1 QIQLVQSGPELQKPGKTVKISCKTSGYT FTDYP Vh Núcleo M H W VKQ APG KG LKWMG WINTETG E PTRVD D FKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKDEDTATYFC ARGGGVRRQVMDYWGQGTSVTVSS 2 DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSR Vl Núcleo TRKNYLVWYQQKPGQSPKLLIYWASTRDSGVP DRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSY NLYTFGGGTKLEIKR 38 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYT FTNYG Vh Núcleo SEQ Seqüência Vh ou Vl Especifi¬ ID cidade à NO Proteína do HCV MNWVKQAPGKGLKWMGWINTNTGEPTYAEE FKGRFAFSLETSAITAYLQINNLKNEDTATYFC ARAGGDYYDSSYDYAMDYWGQGTSVTVSS 39 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDG Vl Núcleo DSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPAR FSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNED PWTFGGGTKLEIKR 9 EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYY Vh NS3 MYWVRQTPEKRLEWAAYISNGAGSTYYPDTV KGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYC ARGLWDGLDYWGQGTTLTVSS DWMAQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSN Vl NS3 GNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTH VPYTFGGGTKLEIKR 17 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYT FTDYS Vh NS4 MHWVNQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADD FKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC TRGGT GYWGQGTTLTVSS 18 DWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVYSN Vl NS4 GNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTH VPWTFGGGTKLEIKR EVQLQQSG AELVKPGASVKLSCTASG FNIKDT Vh NS5 YMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPK FQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYC ARSREFAYWGQGTLVTVSA 26 DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSS Vl NS5 NQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVP DRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLA VYYCQQ YY SYPLTFGAGTKLELKR Tabela 1: Exemplo de Seqüências Vh e Vl (continuação)

SEQ Seqüência Vh ou Vl Especifi¬ ID cidade à NO Proteína do HCV 42 GYT FTDYP CDR1 Vh Núcleo 43 INTETGEP CDR2 Vh Núcleo 44 ARGGGVRRQVMDY CDR3 Vh Núcleo 45 QSLLNSRTRKNY CDR1 Vl Núcleo 46 WAS CDR2 Vl Núcleo 47 KQSYN LYT CDR3 Vl Núcleo 48 GYTFTNYG CDR1 Vh Núcleo 49 INTNTGEP CDR2 Vh Núcleo 50 ARAGG DYYDSSYDYAM DY CDR3 Vh Núcleo 51 QSVDYDGDSY CDR1 Vl Núcleo 52 AAS CDR2 Vl Núcleo 53 QQSNEDPWT CDR3 Vl Núcleo 54 GFTFSDYY CDR1 Vh NS3 55 ISNGAGST CDR2 Vh NS3 56 ARGLWDGLDY CDR3 Vh NS3 57 QSLVHSNGNTY CDR1 Vl NS3 58 KVS CDR2 Vl NS3 59 SQSTHVPYT CDR3 Vl NS3 60 GYTFTDYS CDR1 Vh NS4 43 INTETGEP CDR2 Vh NS4 61 TRGGTGY CDR3 Vh NS4 62 QSLVYSNGNTY CDR1 Vl NS4 58 KVS CDR2 Vl NS4 63 SQSTHVPWT CDR3 Vl NS4 64 G FNIKDTY CDR1 Vh NS5 65 IDPANGNT CDR2 Vh NS5 66 ARSREFAY CDR3 Vh NS5 67 QSLLYSSNQKNY CDR1 Vl NS5 46 WAS CDR2 Vl NS5 68 QQYYSYPLT CDR3 Vl NS5 Em uma modalidade da presente invenção, as regiões de ligação ao antígeno do anticorpo recombinante compreendem uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica a toda ou uma parte da seqüência de aminoácidos codificada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 8, 15, 16, 23, 24, 31, 32, 40 ou 41 (ver a Tabela 2). Em uma outra modali- dade, as regiões de ligação ao antígeno do anticorpo recombinante compreendem uma se- 5 quência de ácido nucléico que codifica as regiões de determinação da complementaridade (CDRs; isto é, CDR1, CDR2 e CDR3) de uma seqüência Vh ou Vl. Em uma modalidade es- pecífica, as regiões de ligação ao antígeno do anticorpo recombinante compreendem CDRs que possuem uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica às seqüências de aminoácidos codificadas por uma ou mais das SEQ ID NOs: 69, 70 e 71; uma ou mais das 10 SEQ ID NOs: 72, 73 e 74; uma ou mais das SEQ ID NOs: 75, 76 e 77; uma ou mais das SEQ ID NOs: 78, 79 e 80; uma ou mais das SEQ ID NOs: 81, 82 e 83; uma ou mais das SEQ ID NOs: 84, 85 e 86; uma ou mais das SEQ ID NOs: 87, 70 e 88; uma ou mais das SEQ ID NOs: 89, 85 e 90; uma ou mais das SEQ ID NOs: 91, 92 e 93; ou uma ou mais das SEQ ID NOs: 94, 73 e 95 (ver a Tabela 2).

Em uma outra modalidade específica da presente invenção, as regiões de ligação

ao antígeno do anticorpo recombinante compreendem uma seqüência de aminoácidos codi- ficada por uma seqüência de ácido nucléico substancialmente idêntica a toda ou uma parte da seqüência que é apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 8, 15, 16, 23, 24, 31, 32, 40 ou 41. Em uma modalidade específica adicional, as regiões de ligação ao antíge- 20 no do anticorpo recombinante compreendem CDRs codificadas por seqüências de ácidos nucléicos substancialmente idênticas às seqüências que são apresentadas nas SEQ ID NOs: 69, 70 e 71; que são apresentadas nas SEQ ID NOs: 72, 73 e 74; que são apresenta- das nas SEQ ID NOs: 75, 76 e 77; que são apresentadas nas SEQ ID NOs: 78, 79 e 80; que são apresentadas nas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83; que são apresentadas nas SEQ ID NOs: 25 84, 85 e 86; que são apresentadas nas SEQ ID NOs: 87, 70 e 88; que são apresentadas nas SEQ ID NOs: 89, 85 e 90; que são apresentadas nas SEQ ID NOs: 91, 92 e 93; ou que são apresentadas nas SEQ ID NOs: 94, 73 e 95.

Tabela 2: Exemplos de Seqüências de Ácidos Nucléicos Que Codificam Seqüên- cias Vh e Vl

SEQ Seqüência Que codi¬ Especifi¬ ID ficam Vh cidade à NO ou Vl Proteína do HCV 7 CAGAT CCAGTT GGT GCAGT CTGG ACCT G AGCTGCAG Vh Núcleo AAGCCTG G AAAG ACAGT CAAGAT CTCCTG CAAGACT TCTG GTT ATACCTT CACAG ACT AT CCAAT G CACT GGG SEQ Seqüência Que codi¬ Especifi¬ ID ficam Vh cidade à NO ou Vl Proteína do HCV TGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGG GCTGGATAAACACT GAG ACTGGT G AGCCAACACGT G TAGAT GACTT CAAGG G ACGTTTT G CCTT CT CTTT G GA AACCT CTGCCAGCACT G CCTATTT G CAGAT CAACAAC CT CAAAGAT GAG GACACG G CCACATATTT CTG CG CT AGAGGGGGTGGGGTCCGACGCCAGGTTATGGACTAC TG GGGT CAAG GAACCT CAGT CACCGT CT CCT CA 8 GACATT GTGATGT CACAGT CT CCAT CCTCCCTG G CTG Vl Núcleo TGT CAGCAGGAGAGAAGGT CACT AT GAGCTGCAAAT CCAGT CAGAGT CTGCT CAATAGT AGAACCCG AAAG A ACT ACTT G GTTT GGT ACCAG CAG AAACCAG G G CAGT CT CCTAAACTGCT GAT CT ACTGGGCATCCACTAGGGA TT CT GGGGT CCCT GAT CGCTT CACAGGCAGTGGAT CT G GG ACAG ATTT CACT CT CACCAT CAG CAGT GTG CAG GCT G AAG ACCT G G CAGTTT ATT ACT G CAAG CAAT CTT ATAATCTGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGG AAATAAAAC 40 CAG ATCCAGTTGGT GCAGT CTGG ACCT GAGCT GAAG Vh Núcleo AAG CCTG G AG AG ACAGT CAAGAT CTCCTG CAAG G CT TCTGGGTATACCTT CACAAACTATGG AAT GAACT GG GTG AAG CAAG CTCCAG G AAAG G GTTTAAAGTG G ATG G G CTGGATAAACACCAACACT GGAGAG CCAACATAT GCTGAAGAGTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGG AAACCT CT G CCAT CACT G CCTATTT G CAGAT CAACAA CCT CAAAAAT GAGGACACGGCT ACAT ATTTCT GTGC AAGAGCGGGGGGAGATTACT ACGAT AGT AGCT ACGA CTATG CT ATG G ACT ACT GGGGT CAAG GAACCT CAGT CACCGT CT CCT CA 41 GACATT GTG CT G ACCCAAT CCCCAG CTT CTTT G G CTG Vl Núcleo T GT CT CTAGGGCAGAGGGCCACCAT CT CCTGCAAGG CCAGCCAAAGT GTT GATTAT GATGGT GAT AGTTATAT G AACTGGTACCAACAG AAACCAG GACAG CCACCCAA ACT CCT CAT CTATG CTG CATCCAAT CT AGAAT CTG GG SEQ Seqüência Que codi¬ Especifi¬ ID ficam Vh cidade à NO ou Vl Proteína do HCV AT CCCAG CCAG GTTTAGT G G CAGT G GGTCT GG G ACA GACTT CACCCT CAACAT CCAT CCTGTG GAG GAG GAG GAT G CT GCAACCTATTACT GT CAG CAAAGTAAT GAG GAT CCGT GGACGTTCGGT GG AGGCACCAAGCT GGAA ATCAAACGT Tabela 2: Exemplos de Seqüências de Ácidos Nucléicos Que Codificam Seqüên- cias Vh e Vl (continuação)

SEQ Seqüência Que codi¬ Especifi¬ ID ficam Vh cidade à NO ou Vl Proteína do HCV GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTG Vh NS3 CAG CCTG GAG G GTCCCT GAAACT CT CCTGTG CAACCT CT GGATT CACTTT CAGT GACT ATT ATAT GTATTGGGT TCG CCAGACT CCAG AG AAG AGG CTGG AGTGG G CCGC ATACATT AGTAAT GGTGCT GGTAG CACCTATTAT CCA GACACT GT AAAGG G CCGATT CACCAT CT CCAG AG AC AAT G CCAAG AACACCCT GTACCT G CAAAT GAG CCGT CT GAAGT CT G AGG ACACAG CCAT GTATT ACT GTG CA AGAGGCCTCTGGGACGGCCTTGACTACTGGGGCCAA G G CACCACT CT CACAGT ctcctcg 16 GATGTT GT G ATGG CCCAAACT CCACT CTCCCTG CCTG Vl NS3 T CAGT CTTGGAGAT CAAGCCTCCAT CT CTTGCAGAT C TAGT CAG AGCCTT GTACACAGTAAT GGAAACACCTA TTTACATT GGTACCTGCAG AGGCCAGGCCAGT CT CCA AAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGAI I I ICTG GGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGA CAGATTT CACACT CAAGAT CAG CAGAGT G GAG G CTG AGGAT CTG G GAGTTT ATTT CT G CT CT CAAAGTACACA TGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGA AATAAAACGT 23 CAGAT CCAGTT GGT GCAGT CTGGACCT GAGCT GAAG Vh NS4 SEQ Seqüência Que codi¬ Especifi¬ ID ficam Vh cidade à NO ou Vl Proteína do HCV AAG CCTG G AG AG ACAGT CAAGAT CTCCTG CAAG G CT TCTG GTTATACCTT CACAG ACTATT CAAT G CACT GGG TGAACCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGG GCT GGATAAACACT GAGACT GGT G AGCCAACAT AT G CAGAT GACTT CAAGGG ACGGTTT GCCTT CT CTTTGGA AACCT CT G CCAG CACT G CCT ATTT G CAGAT CAACAAC CT CAAAAAT G AGG ACACG G CT ACATATTT CTGTACT A GGGGAGGCACGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACT CT CACAGT CT CCT CA 24 GAT GTTGT GAT G ACCCAAACT CCACT CTCCCTG CCTG Vl NS4 T CAGT CTTGGAG AT CAAGCCT CCAT CT CTTGCAGAT C T AGT CAGAG CCTT GTATACAGT AAT G G AAACACCTA TTT ACATTGGT ACCTGCAGAAGCCAGGCCAGT CT CCA AAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGAI I I ICTG GGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGA CAGATTT CACACT CAAGAT CAG CAGAGT G GAG G CTG AG G ATCT G GG AGTTT ATTT CT GCT CT CAAAGTACACA T GTTCCGTGGACGTT CGGT GGAGGCACCAAGCT GGA AATCAAACGG Tabela 2: Exemplos de Seqüências de Ácidos Nucléicos Que Codificam Seqüên-

cias Vh e Vl (continuação)

SEQ Seqüência Que codi¬ Especifi¬ ID ficam Vh cidade à NO ou Vl Proteína do HCV 31 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTG Vh NS5 AAG CCAG G GG CCT CAGT CAAGTT GT CCTG CACAGCT TCTGGCTT CAACATT aaagacacctat atgcactggg T GAAG CAG AGG CCT G AACAGG G CCT G GAGT G GATT G G AAGG ATT GAT CCT GCGAAT GGTAAT ACTAAAT AT G ACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAG ACACAT CCT CCAACAC AG CCT ACCT G CAG CT CAG CA SEQ Seqüência Que codi¬ Especifi¬ ID ficam Vh cidade à NO ou Vl Proteína do HCV GCCT GACAT CT GAG GACACT G CCGTCTATTACT GTG C TAGATCGCGGGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGAC TCTGGTCACTGTCTCTGCA 32 GACATT GTGATGT CACAGT CT CCAT CCTCCCTAG CT G Vl NS5 T GT CAGTT GG AGAG AAGGTT ACTAT GAGCT GCAAGT CCAGTCAGAGCCI I I IATATAGTAGCAATCAAAAGA ACTACTTGGCCT GGT ACCAGCAGAAACCAGGGCAGT CTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGA ATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCT GGG ACAG ATTT CACT CT CACCAT CAGCAGT GT GAAG G CT G AAG ACCT G GCAGTTT ATTACT GTCAG CAAT ATT ATAG CTATCCG CT CACGTT CGGTG CT G GG ACCAAGCT GGAGCTGAAACGG 69 G GTTAT ACCTT CACAG ACT AT CCA CDR1 Vh Núcleo 70 AT AAACACT GAGACT GGT GAGCCA CDR2 Vh Núcleo 71 GCTAGAGGGGGTGGGGTCCGACGCCAGGTTATGGAC CDR3 Vh Núcleo TAC 72 CAGAGT CT G CT CAAT AGT AG AACCCG AAAG AACT AC CDR1 Vl Núcleo 73 TGGGCATCC CDR2 Vl Núcleo 74 AAG CAAT CTT AT AAT CT GTACACG CDR3 Vl Núcleo 75 GGGTATACCTTCACAAACTATGGA CDR1 Vh Núcleo 76 ATAAACACCAACACT GGAGAG CCA CDR2 Vh Núcleo 77 G CAAGAG CGG GGG G AG ATT ACT ACGATAGTAG CTAC CDR3 Vh Núcleo GACTATG CTATGG ACTAC 78 CAAAGT GTT GATTAT GAT G GTG ATAGTTAT CDR1 Vl Núcleo 79 GCTGCATCC CDR2 Vl Núcleo 80 CAGCAAAGT AAT GAGGAT CCGTGG ACG CDR3 Vl Núcleo 81 G GATT CACTTT CAGT GACTATTAT CDR1 Vh NS3 82 ATTAGT AAT GGT GCTGGT AGCACC CDR2 Vh NS3 83 GCAAGAGGCCTCTGGGACGGCCTTGACTAC CDR3 Vh NS3 84 CAGAG CCTT GT ACACAGT AAT G G AAACACCTAT CDR1 Vl NS3 85 AAAGTTTCC CDR2 Vl NS3 86 T CT CAAAGT ACACAT GTT CCGT ACACG CDR3 Vl NS3 SEQ Seqüência Que codi¬ Especifi¬ ID ficam Vh cidade à NO ou Vl Proteína do HCV 87 GGTT ATACCTT CACAGACTATT CA CDR1 Vh NS4 70 ATAAACACT GAGACT GGT GAG CCA CDR2 Vh NS4 88 ACTAGGGGAGGCACGGGCTAC CDR3 Vh NS4 cias Vh Tabela 2: Exemplos de Seqüências de Ácidos Nucléicos Que Codificam Sequên- e Vl (continuação) SEQ Seqüência Que codi¬ Especifi¬ ID ficam Vh cidade à NO ou Vl Proteína do HCV 89 CAGAG CCTT GTAT ACAGTAATGG AAACACCT AT CDR1 Vl NS4 85 AAAGTTTCC CDR2 Vl NS4 90 T CT CAAAGT ACACAT GTT CCGT GGACG CDR3 Vl NS4 91 G G CTT CAACATTAAAG ACACCT AT CDR1 Vh NS5 92 ATT GAT CCT GCGAAT GGTAATACT CDR2 Vh NS5 93 GCTAGATCGCGGGAGTTTGCTTAC CDR3 Vh NS5 94 CAGAG CCTTTT ATAT AGTAG CAAT CAAAAG AACTAC CDR1 Vl NS5 73 TGGGCATCC CDR2 Vl NS5 95 CAG CAATATTATAG CTATCCG CTCACG CDR3 Vl NS5 A seqüência de aminoácidos do anticorpo recombinante não precisa corresponder precisamente às seqüências originais, isto é, pode ser uma “seqüência variante”. Por exem- pio, dependendo dos domínios compreendidos pelo anticorpo recombinante, um ou mais dos VL, Vh, Cl, Ch1, “dobradiça”, CH2, CH3 e CH4, quando aplicável, podem sofrer mutagê- nese através da substituição, da inserção ou da deleção de um ou mais resíduos de amino- ácidos de forma que o resíduo em tal sítio não corresponda a qualquer uma das seqüências originais (ou de referência). Um perito na arte considerará, entretanto, que tais mutações não serão extensivas e não afetarão drasticamente a ligação do anticorpo recombinante com sua proteína do HCV alvo. De acordo com a presente invenção, quando um anticorpo recombinante compreende uma seqüência variante, a seqüência variante é pelo menos a- proximadamente 70% idêntica à seqüência de referência. Em uma modalidade, a seqüência variante é pelo menos aproximadamente 75% idêntica à seqüência de referência. Em outras modalidades, a seqüência variante é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos apro- ximadamente 85% ou pelo menos aproximadamente 90% idêntica à seqüência de referên- cia. Em uma modalidade específica, a seqüência de referência corresponde a uma seqüên- cia que é apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 10, 17, 18, 25, 26, 38 e 39. Em uma outra modalidade, a seqüência de referência corresponde a uma seqüência que é apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 e 68.

Geralmente, quando o anticorpo recombinante compreende uma seqüência varian- te que contém uma ou mais substituições de aminoácidos, estas são substituições “conser- vativas”. Uma substituição conservativa envolve a substituição de um resíduo de aminoácido por um outro resíduo que possui propriedades de cadeia lateral similares. Como é conheci- do na arte, os vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente podem ser agrupados de acordo com as propriedades fisicoquímicas de suas cadeias laterais. Os grupos adequados incluem alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina, fenilalanina e triptofano (cadeias late- rais hidrofóbicas); glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina (cadeias laterais não carregadas polares); ácido aspártico e ácido glutâmico (cadeias laterais ácidas) e lisina, arginina e histidina (cadeias laterais básicas). Um outro grupo de aminoácidos é fenilalanina, triptofano e tirosina (cadeias laterais aromáticas). Uma substituição conservati- va envolve a substituição de um aminoácido por um outro aminoácido do mesmo grupo.

Assim, a presente invenção em outras modalidades fornece ainda polipeptídeos iso- lados que correspondem a novas seqüências de anticorpos recombinantes divulgadas aqui. Opcionalmente o polipeptídeo isolado compreende uma parte de um anticorpo recombinante (por exemplo, quimérico) que se liga especificamente a uma região relevante para diagnósti- co de uma proteína do HCV selecionada do grupo que consiste da proteína do núcleo do HCV, da proteína NS3 do HCV, da proteína NS4 do HCV e da proteína NS5 do HCV. Em uma modalidade o polipeptídeo compreende uma região Vh selecionada do grupo que con- siste de uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência que é apresentada em qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 1, 9,

17, 25 e 38. Em uma outra modalidade o polipeptídeo compreende uma região Vh que com- preende seqüências de regiões de determinação da complementaridade que são substanci- almente idênticas a: uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 42, 43 e 44; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 48, 49 e 50; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 60, 43 e 61; e/ou a uma ou mais das seqüências apresen- tadas nas SEQ ID NOs: 64, 65 e 66. Em uma outra modalidade o polipeptídeo compreende uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos que é substancialmente idêntica à seqüência que é apresentada em qualquer uma ou mais das SEQ ID NOS: 2, 10,

18, 26 e 39. Ainda em uma outra modalidade o polipeptídeo compreende uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade que são subs- tancialmente idênticas a: uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 45, 46 e 47; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 57, 58 e 59; uma ou mais das se- 5 quências apresentadas nas SEQ ID NOs: 62, 58 e 63; e/ou uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 67, 46 e 68.

Ainda em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende uma região Vh sele- cionada do grupo que consiste de uma região Vh que compreende uma seqüência de ami- noácidos substancialmente idêntica à seqüência codificada por qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 7, 15, 23, 31 e 40. Ainda em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreen- de uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complemen- taridade que são substancialmente idênticas a: uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 69, 70 e 71; uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 75, 76 e 77; uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83; uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 87, 70 e 88; e/ou uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 91, 92 e 93. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência codificada por qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 8, 16, 24, 32 e 41. Ainda em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais de: as seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 89, 85 e 90; as seqüências codifica- das pelas SEQ ID NOs: 84, 85 e 86; as seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 72, 73 e 74; as seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 78, 79 e 80; e/ou as seqüências codifica- das pelas SEQ ID NOs: 94, 73 e 95.

Similarmente, a seqüência de ácido nucléico que codifica a(s) região(ões) variá- vel(eis) não precisa corresponder precisamente à seqüência de referência original, mas po- de variar em virtude da degeneração do código genético e/ou de forma que codifique uma seqüência variante de aminoácidos como descrito anteriormente. Em uma modalidade da 30 presente invenção, portanto, a seqüência de ácido nucléico que codifica uma região variável do anticorpo recombinante é pelo menos aproximadamente 70% idêntica à seqüência de referência. Em uma outra modalidade, a seqüência de ácido nucléico que codifica uma regi- ão variável do anticorpo recombinante é pelo menos aproximadamente 75% idêntica à se- qüência de referência. Em outras modalidades, a seqüência de ácido nucléico que codifica 35 uma região variável do anticorpo recombinante é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85% ou pelo menos aproximadamente 90% idêntica à seqüência de referência. Em uma modalidade específica, a seqüência de referência corresponde a uma seqüência que é apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 8, 15, 16, 23, 24, 31, 32, 40 ou 41. Em uma outra modalidade, a seqüência de referência corresponde a uma seqüência que é apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 e 95.

Assim, a presente invenção em outras modalidades fornece ainda polinucleotídeos

isolados que codificam novas seqüências de anticorpos recombinantes (incluindo seqüên- cias de anticorpos quiméricos) divulgadas aqui. Opcionalmente, o polinucleotídeo isolado codifica uma parte de um anticorpo recombinante (por exemplo, quimérico) que se liga es- pecificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do HCV seleciona- 10 da do grupo que consiste da proteína do núcleo do HCV, da proteína NS3 do HCV, da prote- ína NS4 do HCV e da proteína NS5 do HCV. Em uma modalidade o polinucleotídeo codifica uma região Vh selecionada do grupo que consiste de uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência que é apresentada em qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 1,9, 17, 25 e 38. Em uma outra modalidade o poli- 15 nucleotídeo codifica uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determina- ção da complementaridade que são substancialmente idênticas a: uma ou mais das se- qüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 42, 43 e 44; uma ou mais das seqüências apre- sentadas nas SEQ ID NOs: 48, 49 e 50; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 60, 20 43 e 61; e/ou a uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 64, 65 e 66. Em uma outra modalidade o polinucleotídeo codifica uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos que é substancialmente idêntica à seqüência que é apresentada em qualquer uma ou mais das SEQ ID NOS: 2, 10, 18, 26 e 39. Ainda em uma outra modali- dade o polinucleotídeo codifica uma região Vl que compreende seqüências de regiões de 25 determinação da complementaridade que são substancialmente idênticas a: uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 45, 46 e 47; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 57, 58 e 59; uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 62, 58 e 63; e/ou uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 67, 46 e 68.

Ainda em uma outra modalidade, o polinucleotídeo codifica uma região Vh selecio-

nada do grupo que consiste de uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoá- cidos substancialmente idêntica à seqüência codificada por qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 7, 15, 23, 31 e 40. Ainda em uma outra modalidade, o polinucleotídeo codifica uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade 35 que são substancialmente idênticas a: uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 69, 70 e 71; uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 75, 76 e 77; uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83; uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 87, 70 e 88; e/ou uma ou mais das seqüên- cias codificadas pelas SEQ ID NOs: 91, 92 e 93. Em uma outra modalidade, o polinucleotí- deo codifica uma região Vl selecionada do grupo que consiste de uma região Vl que com- preende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência codificada por qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 8, 16, 24, 32 e 41. Ainda em uma outra modali- dade, o polinucleotídeo codifica uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais de: as se- qüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 89, 85 e 90; as seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 84, 85 e 86; as seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 72, 73 e 74; as sequên- cias codificadas pelas SEQ ID NOs: 78, 79 e 80; e/ou uma ou mais das seqüências codifica- das pelas SEQ ID NOs: 94, 73 e 95.

Em uma modalidade, os anticorpos podem ainda ser modificados para reduzir a i- munogenicidade a um ser humano em relação ao anticorpo nativo através da mutação de um ou mais aminoácidos na parte não humana do anticorpo que são epítopos potenciais para células T humanas com a finalidade de eliminar ou reduzir a imunogenicidade do anti- corpo quando exposto ao sistema imunológico humano. As mutações adequadas incluem, por exemplo, substituições, deleções e inserções de um ou mais aminoácidos.

Em uma modalidade, os anticorpos recombinantes da presente invenção podem a- inda ser modificados para imobilização sobre uma fase sólida adequada. A imobilização po- de ser conseguida através da ligação covalente ou não covalente (por exemplo, iônica, hi- drofóbica ou similar) à fase sólida. As modificações adequadas são conhecidas na arte e incluem a adição de um grupo funcional ou de um grupamento químico ao terminal C ou ao terminal N de uma das seqüências de aminoácidos compreendidas pelo anticorpo recombi- nante para facilitar a reticulação ou a ligação do anticorpo recombinante ao suporte sólido. Os exemplos de modificações incluem a adição de grupos funcionais tal como o anidrido S- acetilmercaptossuccínico (SAMSA) ou o tioacetato de S-acetila (SATA) ou a adição de um ou mais resíduos de cisteína ao terminal N ou C da seqüência de aminoácidos. Outros rea- gentes de reticulação são conhecidos na arte e muitos estão disponíveis comercialmente (ver, por exemplo, catálogos da Pierce Chemical Co. e da Sigma-AIdrich). Os exemplos in- cluem, mas não estão limitados às diamines, tal como 1,6-diaminohexano; aos dialdeídos, tal como glutaraldeído; aos ésteres de bis-N-hidroxissuccinimida, tais como etileno glicol- bis(éster de N-hidroxissuccinimida do ácido succínico), glutarato de dissuccinimidila, subera- to de dissuccinimidila e etileno glicol-bis(succinimidilsuccinato); aos diisocianatos, tal como hexametilenodiisocianato; aos bis oxiranos, tal como o éter 1,4 butanediil diglicidílico; aos ácidos dicarboxílicos, tal como succiniidissalicilato; ao éster de N-hidroxisuccinimida do áci- do 3-maleimidopropiônico e similares.

Outras modificações incluem a adição de um ou mais aminoácidos no terminal N ou C1 tais como resíduos de histidina para permitir a ligação a superfícies derivatizadas como Ni2+ ou resíduos de cisteína para permitir a formação de pontes dissulfeto ou a ligação à agarose Sulfolink™. Alternativamente, o anticorpo pode ser modificado para incluir um ou mais espaçadores químicos no terminal N ou no terminal C com a finalidade de distanciar o anticorpo recombinante de forma ótima do suporte sólido. Os espaçadores que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados ao ácido 6-aminohexanóico; ao 1,3-diamino pro- pano; ao 1,3-diamino etano; e a seqüências curtas de aminoácidos, tais como seqüências de poliglicina, de 1 até 5 aminoácidos.

Em uma modalidade alternativa, os anticorpos recombinantes podem ser opcional- mente conjugados a uma proteína carreadora, tal como albumina de soro bovino (BSA)1 ca- seína ou tiroglobulina, com a finalidade de imobilizá-los sobre uma fase sólida.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece a modificação dos anticor- pos recombinantes para incorporar uma marcação detectável. As marcações detectáveis de acordo com a invenção são preferencialmente moléculas ou grupamentos que podem ser detectados diretamente ou indiretamente e são escolhidos de forma que a conjugação da marcação detectável ao anticorpo recombinante preferencialmente não interfira com a liga- ção específica do anticorpo com sua proteína alvo do HCV. Os métodos de marcação de anticorpos são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, o uso de agentes de reticu- lação bifuncionais, tal como SAMSA (anidrido S-acetilmercaptossuccínico), para ligar o anti- corpo recombinante à marcação detectável. Outros reagentes de reticulação tais como são conhecidos na arte ou que são similares aos descritos anteriormente podem ser emprega- dos da mesma maneira,

As marcações detectáveis para uso com os anticorpos recombinantes da presente invenção incluem, por exemplo, aquelas que podem ser detectadas diretamente tais como radioisótopos, fluoróforos, quimioluminóforos, enzimas, partículas coloidais, micropartículas fluorescentes e similares. A marcação detectável é por si só detectável ou pode ser reagida com um ou mais compostos adicionais para gerar um produto detectável. Assim, um perito na arte entenderá que as marcações que podem ser diretamente detectadas da invenção podem requerer componentes adicionais, tais como substratos, reagentes de ativação, luz e similares para possibilitar a detecção da marcação. Os exemplos de marcações detectáveis incluem, mas não estão limitados a cromogênios, radioisótopos (tais como, por exemplo, 125I, 131I1 32P, 3H, 35S e 14C), compostos fluorescentes (tais como fluoresceína, rodamina, tris bipiridil rutênio e derivados de quelatos de lantanídeos), compostos quimioluminescentes (tais como, por exemplo, acridínio e luminol), partículas visíveis ou fluorescentes, ácidos nucléicos, agentes complexantes ou catalisadores tais como enzimas (tais como, por exem- plo, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, peroxidase de raiz forte, /?-galactosidase, β- lactamase, luciferase). No caso de uso de enzimas, a adição de, por exemplo, um substrato cromo, fluoro ou luminogênico resulta preferencialmente na produção de um sinal detectá- vel. Outros sistemas de detecção tais como a fluorescência resolvida em relação ao tempo, a fluorescência de reflexão interna e a espectroscopia de Raman são também opcionalmen- te úteis.

A presente invenção também fornece o uso de marcações que são detectadas indi-

retamente. As marcações detectáveis indiretamente envolvem tipicamente o uso de um "par de afinidade", isto é, duas moléculas diferentes, em que um primeiro membro do par é aco- plado ao anticorpo recombinante da presente invenção e o secundo membro do par se liga especificamente ao primeiro membro. A ligação entre os dois membros do par tem tipica- mente natureza química ou física. Os exemplos de tais pares de ligação incluem, mas não estão limitados a: antígenos e anticorpos; avidina/estreptavidina e biotina; haptenos e anti- corpos específicos para haptenos; seqüências de nucleotídeos complementares; co-fatores de enzimas / substratos e enzimas; e similares.

4. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS RECOMBINANTES Os anticorpos recombinantes da presente invenção podem compreender seqüên-

cias de domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, as seqüências Vh e/ou Vl ou uma parte das mesmas) derivadas, por exemplo, de um anticorpo monoclonal produzido por um ser humano ou um animal não humano, tal como um roedor, um coelho, um canino, um feli- no, um bovino, um eqüino, um suíno, um macaco ou um frango. Alternativamente, os domí- nios de ligação ao antígeno com a atividade de ligação desejada podem ser selecionados através do uso de bibliotecas combinatórias expressos em fago lambda, na superfície de bacteriófago, bactérias ou leveduras ou verificados através da exibição em outros sistemas biológicos (por exemplo, retrovírus ou polissomo) ou não biológicos utilizando técnicas pa- dronizadas (ver, por exemplo, Marks, J. D. e outros, J. Mol. BioL 222:581-597 (1991); Bar- bas, C. F. Ill e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4457-4461 (1992)). As bibliotecas po- dem ser compostas de domínios de ligação ao antígeno nativos isolados de um hospedeiro imunizado ou não imunizado, domínios de ligação ao antígeno sintéticos ou semissintéticos ou domínios de ligação ao antígeno modificados.

Em uma modalidade da presente invenção, os anticorpos recombinantes compre- endem domínios de ligação ao antígeno derivados de anticorpos monoclonais que se ligam à proteína do HCV de interesse. Os métodos de produção de anticorpos monoclonais contra um antígeno desejado são bem conhecidos na arte. Por exemplo, os anticorpos monoclo- nais podem ser produzidos utilizando o método de hibridoma descrito primeiro por Kohler e outros, Nature, 256:495 (1975). Em geral, no método de hibridoma, um camundongo ou ou- tro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster ou um macaco, é imunizado através de várias injeções subeutâneas ou intraperitoneais de antígeno e um carreador e/ou um ad- juvante em vários sítios. Duas semanas depois, os animais recebem reforço e aproximada- mente 7 até 14 dias depois os animais têm seu sangue tirado e o soro é analisado em rela- ção ao título anti-antígeno. Os animais podem receber reforço até que o título estabilize.

Os esplenócitos dos camundongos são extraídos e fundidos com células de mielo- ma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (ver, por exemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Prac- tice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986); Galfre e outros, Nature, 266:550 (1977)). As linha- gens de células de mieloma adequadas são conhecidas na arte e incluem, mas não estão limitadas às linhagens de células de mieloma murino, tais como as derivadas dos tumores de camundongos MOP-21 e MC-11 (disponíveis no Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA), assim como as células SP-2, SP2/0 e X63-Ag8-653 (disponíveis na Ameri- can Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA). As linhagens de células de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-ser humano também foram descritas para a produção de anticorpos humanos monoclonais (ver, por exemplo, Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur e outros, Monoclonal Antibodies Production Teehniques and Ap- plieations, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)). As células de hibridoma prepa- radas dessa maneira podem ser semeadas e crescidas em um meio de cultura adequado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a so- brevivência de células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuírem a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes em relação à HGPRT.

As células de hibridoma obtidas através de tal seleção são então analisadas para identificar clones que secretam anticorpos capazes de se ligar ao antígeno do HCV utilizado na imunização inicial, por exemplo, por imunoprecipitação ou através de um ensaio de liga- ção in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou imunoensaio enzimático (EIA ou ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser opcionalmente determinada, por e- xemplo, através da análise de Scatchard de Munson e outros, Anal. Bioehem., 107:220 (1980).

Após serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos da es-

pecificidade desejada, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de dilui- ção limitante, por exemplo, através do procedimento descrito por Wands e outros (Gastroen- terology 80:225-232 (1981)) e crescidos através de métodos padronizados (ver, por exem- plo, Goding, ibid.). Os meios de cultura adequados para esta finalidade incluem, por exem- pio, meio D-MEM1 IMDM ou RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo na forma de tumores de ascitos em um animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser opcionalmente isolados do meio de cultura, do fluido de ascitos ou do soro através de procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tal como, por exemplo, cromatografia em prote- ína A, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afini- dade.

Em uma modalidade da presente invenção, os anticorpos recombinantes são deri-

vados de anticorpos monoclonais produzidos para um antígeno do HCV derivado de uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do HCV. Em uma outra modalidade, os anticorpos recombinantes são derivados de anticorpos monoclonais produzidos para um antígeno do HCV derivado de uma região relevante para diagnóstico da proteína do núcleo, E2, NS3, NS4 ou NS5 do HCV. Em uma modalidade adicional, os anticorpos recombinantes são derivados de anticorpos monoclonais produzidos para um antígeno do HCV que com- preende toda ou um fragmento de: (a) a região da proteína do núcleo definida pelos amino- ácidos 1-150 da poliproteína do HCV, (b) a região da proteína NS3 definida pelos aminoáci- dos 1192 até 1457 da poliproteína do HCV, (c) as regiões da proteína NS4 definida pelos aminoácidos 1920 até 1935 ou aminoácidos 1676 até 1931 da poliproteína do HCV ou (d) a região da proteína NS5 definida pelos aminoácidos 2054 até 2995 da poliproteína do HCV. Em uma outra modalidade, os anticorpos recombinantes são derivados de anticorpos mono- clonais produzidos para um antígeno do HCV que compreende toda ou um fragmento (por exemplo, um fragmento que compreende um ou mais epítopos) de: (a) a região da proteína do núcleo definida pelos aminoácidos 1-50 da poliproteína do HCV, (b) a região da proteína NS3 definida pelos aminoácidos 1192-1457 da poliproteína do HCV, (c) a região da proteína NS4 definida pelos aminoácidos 1696-1931 da poliproteína do HCV e/ou (d) a região da pro- teína NS5 definida pelos aminoácidos 1932 até 2191 ou aminoácidos 2188 até 2481. Em uma modalidade adicional, os anticorpos recombinantes são derivados de anticorpos mono- clonais produzidos para um antígeno do HCV que compreende uma seqüência substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 33, 34, 35, 36 ou 37.

Ainda em uma modalidade adicional, o anticorpo recombinante é derivado de anti- corpos monoclonais produzidos para um epítopo da proteína do núcleo do HCV selecionado do grupo que consiste de: (a) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 100; (b) um epítopo compreendido pela seqüência de amino- ácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 101; e (c) um epítopo compreendido pela se- qüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 102. Ainda em uma outra moda- lidade, o anticorpo recombinante é derivado de anticorpos monoclonais produzidos para um epítopo da proteína NS3 do HCV selecionado do grupo que consiste de: (a) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 103; (b) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 104; e (c) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 105. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo recombinante é derivado de anticorpos monoclonais produzidos para um epítopo da proteína NS4 do HCV seleciona- do do grupo que consiste de: (a) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 106; (b) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 107; e (c) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 108. E em uma outra modali- dade, o anticorpo recombinante é derivado de anticorpos monoclonais produzidos para um epítopo da proteína NS5 do HCV selecionado do grupo que consiste de: (a) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 109; (b) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 110; e (c) um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 111.

Opcionalmente o anticorpo monoclonal é expresso por uma linhagem de células se- lecionada do grupo que consiste de 201-603-195 anti-núcleo do HCV1 14-153-462 anti- núcleo do HCV1 17-903-127 anti-NS3 do HCV1 E99H6C34 anti-NS4 do HCV e 48-311-387 anti-NS5 do HCV.

Uma vez que um anticorpo monoclonal foi preparado, o DNA que codifica o anticor- po monoclonal ou as regiões variáveis do mesmo podem ser facilmente isoladas através de técnicas padronizadas, por exemplo, através da utilização de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves ou as regiões variáveis do anticorpo monoclonal ou através de RT-PCR do mRNA que codifica o anticorpo monoclonal utilizando iniciadores para as regiões conservadas (por exemplo, os conjuntos de iniciadores para igG disponíveis na Novagen (EMD Biosciences, Inc.), San Diego, CA).

Uma vez isolado, o DNA pode ser, por exemplo, clonado em um vetor de expressão apropriado e introduzido em uma célula hospedeira adequada, tal como células de E. coli, células de levedura, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO), células renais embrionárias humanas (HEK) (por exemplo, HEK 293) ou células de mieloma que não produzem de outra maneira proteína de imunoglobulina, com a finalidade de produ- zir anticorpos monoclonais recombinantes. Opcionalmente, em uma modalidade, os anticor- pos quiméricos de camundongo-ser humano anti-HCV da invenção são produzidos em li- nhagens de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), o que é vantajoso pelo fato de que podem ser produzidos em quantidades suficientes para uso comercial. Preferencialmen- te, as células hospedeiras de mamífero são linhagens de células CHO e linhagens de célu- las HEK 293. Uma outra célula hospedeira preferida é a linhagem de células B3.2 (por e- xemplo, Abbott Laboratories, Abbott Bioresearch Center, Worcester, MA) ou uma outra Ii- nhagem de células CHO deficiente em relação à dihidrofolato redutase (DHFR-) (por exem- plo, disponível na Invitrogen Corp., Carlsbad, CA).

Alternativamente, o DNA que codifica o anticorpo monoclonal ou as regiões variá- veis do mesmo pode ser utilizado para produzir anticorpos quiméricos, anticorpos humani- zados e fragmentos de anticorpos através de métodos padronizados conhecidos na arte.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais quiméricos podem ser produzidos através da clonagem do DNA que codifica as regiões variáveis do anticorpo monoclonal em ve- tores) de expressão de mamífero contendo genes das regiões constantes de cadeias pesa- das e leves derivados de uma espécie hospedeira diferente. Muitos vetores de expressão de anticorpos eucarióticos que são integrados de forma estável ou existem na forma de ele- mentos extracromossômicos foram descritos e são conhecidos pelos peritos comuns na ar- te. Em geral, os vetores de expressão de anticorpos são plasmídeos que compreendem o gene que codifica a região constante de cadeia pesada e/ou o gene que codifica a região constante de cadeia leve, um elemento intensificador a montante e um promotor adequado. Por exemplo, para as regiões constantes humanas, o vetor pode compreender os genes da IgGI humana (Cyl humana) e da região constante kappa humana (Ck humana) e o elemen- to intensificador de cadeia da imunoglobulina Η. O vetor também pode conter uma origem de replicação bacteriana e um marcador de seleção. A inclusão opcional de um marcador de seleção, que é conhecida na arte, permite a seleção e a amplificação sob condições de crescimento definidas, por exemplo, o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) possibilita a seleção e a amplificação em células de mamífero com metotrexato. A construção de um apropriado para a expressão de anticorpo partindo de um vetor de expressão de mamífero comercial, pode ser facilmente conseguida pelo perito na arte. Os exemplos representativos de vetores de expressão de anticorpos recombinantes são fornecidos nas Figuras 1, 3, 5, 7 e 12.

A introdução da(s) construção(ões) de expressão em células hospedeiras apropria- das resulta na produção de anticorpos quiméricos completos de uma especificidade definida (ver, por exemplo, Morrison, S. L. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855 (1984)). As seqüências que codificam as cadeias pesadas e leves podem ser introduzidas na célula hospedeira individualmente em plasmídeos separados ou juntas no mesmo vetor.

Dependendo do sistema de vetor utilizado, muitas linhagens de células imortaliza- das podem servir como hospedeiros adequados, estas incluem, mas não estão limitadas a mieloma (por exemplo, X63-Ag8.653), hibridoma (por exemplo, Sp2/0-Ag14), linfoma, célu- las de insetos (por exemplo, células sf9), células renais embrionárias humanas (por exem- pio, HEK 293) e células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). As construções de expressão podem ser introduzidas nas células hospedeiras utilizando uma variedade de técnicas co- nhecidas na arte, incluindo, mas não limitadas à precipitação com fosfato de cálcio, à fusão de protoplastos, à lipofecção, a vetores "shuttle" (de ida e volta) derivados de retrovírus e à eletroporação.

Os anticorpos quiméricos e os fragmentos de anticorpos também podem ser produ- zidos em outros sistemas de expressão que incluem, mas não estão limitados a baculovírus, levedura, bactérias (tal como E. coli) e in vitro em sistemas isentos de células tal como o Iisado de reticulócitos de coelho.

O anticorpo recombinante pode ser isolado das células hospedeiras através de pro- cedimentos de purificação de imunoglobulina padronizados tal como, por exemplo, filtração com fluxo cruzado, precipitação com sulfato de amônio, cromatografia em proteína A, cro- matografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, cromatografia por afinidade ou combinações das mesmas.

Alternativamente, os fragmentos de anticorpos podem ser gerados partindo de uma preparação de anticorpos purificados através de métodos enzimáticos convencionais, por exemplo, fragmentos F(ab')2 podem ser produzidos através da clivagem com pepsina do anticorpo intacto e fragmentos Fab podem ser produzidos através da digestão por curto pe- ríodo de tempo do anticorpo intacto com papaína.

Os fragmentos de anticorpos biespecíficos e heteroconjugados recombinantes que possuem especificidades por pelo menos dois antígenos diferentes podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento completo ou na forma de fragmentos de anticorpos (tais como fragmentos de anticorpos biespecíficos F(ab')2). Os fragmentos de anticorpos que possuem mais de duas valências (por exemplo, fragmentos de anticorpos trivalentes ou de valência superior) também são considerados. Os anticorpos biespecíficos, os anticorpos heteroconjugados e os anticorpos multivalentes podem ser preparados através de métodos padronizados conhecidos pelos peritos na arte. 5. TESTE DE ANTICORPOS RECOMBINANTES

A capacidade do anticorpo recombinante de se ligar especificamente ao antígeno alvo do HCV pode ser avaliada através de técnicas imunológicas padronizadas (ver, por exemplo, Current Protocols in Immunology, Coligan, J.E. e outros (ed.), J. Wiley & Sons, Nova York, NY). Por exemplo, através de radioimunoensaio (RIA) ou imunoensaio enzimáti- co (EIA ou ELISA). Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo recombinante demonstra substancialmente a mesma especificidade que a do anticorpo monoclonal do qual os domínios de ligação ao antígeno são derivados.

Os anticorpos recombinantes também podem ser opcionalmente testados em rela- ção a sua afinidade de ligação ao antígeno alvo do HCV através da medida da constante de dissociação em equilíbrio (Kd) através de técnicas padronizadas. Em uma modalidade da presente invenção, os anticorpos recombinantes (por exemplo, anticorpos quiméricos) pos- suem uma Kd menor que aproximadamente 1 μΜ. Em uma outra modalidade, os anticorpos recombinantes (por exemplo, anticorpos quiméricos) possuem uma K0 menor que aproxi- madamente 100 nM. Ainda em uma outra modalidade, opcionalmente o anticorpo recombi- nante é um anticorpo quimérico que se liga especificamente a um epítopo da proteína do HCV, em que o dito anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico para o núcleo do HCV que possui uma constante de

dissociação em equilíbrio (Kd) de aproximadamente 0,1 nM até aproximadamente 1,0 nM, opcionalmente de aproximadamente 0,4 nM, aproximadamente 0,5, nM, aproximadamente 0,6 nM, aproximadamente 0,7 nM ou aproximadamente 0,8 nM (por exemplo, como descrito no Exemplo 9);

(b) um anticorpo quimérico para a NS3 do HCV que possui uma constante de dis-

sociação em equilíbrio (K0) de aproximadamente 10,0 nM até aproximadamente 100,0 nM, opcionalmente de aproximadamente 50 nM, aproximadamente 56 nM, aproximadamente 62 nM, aproximadamente 68 nM ou aproximadamente 74 nM (por exemplo, como descrito no Exemplo 10);

(c) um anticorpo quimérico para a NS4 do HCV que possui uma constante de dis-

sociação em equilíbrio (Kd) de aproximadamente 0,1 nM até aproximadamente 1,0 nM, op- cionalmente de aproximadamente 0,3 nM, aproximadamente 0,4 nM, aproximadamente 0,5 nM ou aproximadamente 0,6 nM (por exemplo, como descrito no Exemplo 11); e

(d) um anticorpo quimérico para a NS5 do HCV que possui uma constante de dis- sociação em equilíbrio (K0) de aproximadamente 1,0 nM até aproximadamente 10,0 nM, opcionalmente de aproximadamente 8,4 nM, aproximadamente 8,6 nM, aproximadamente 8,8 nM ou aproximadamente 9,0 nM (por exemplo, como descrito no Exemplo 12).

Outros testes padronizados também podem ser realizados nos anticorpos, por e- xemplo, o valor de Pl dos anticorpos pode ser obtido, tal como para os anticorpos quiméri- cos como descrito no Exemplo 13. Em uma modalidade, os anticorpos quiméricos de acordo com a invenção que se ligam especificamente a um epítopo de uma proteína do HCV com- preendem cada um opcionalmente um valor de Pl que varia de aproximadamente 7,8 até aproximadamente 9,0. Em uma outra modalidade, o anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico para o núcleo do HCV que possui um valor de pl de aproximadamente 8,8 até aproximadamente 9,2, opcionalmente aproximada- mente 9,0; (b) um anticorpo para a NS3 do HCV que possui um valor de pl entre aproxima- damente 8,5 e aproximadamente 9,0; (c) um anticorpo quimérico para a NS4 do HCV que possui um valor de pl entre aproximadamente 7,8 e aproximadamente 8,7 e (d) um anticorpo quimérico para a NS5 do HCV que possui um valor de pl entre aproximadamente 8,0 e a- proximadamente 8,9.

Opcionalmente, os anticorpos recombinantes (por exemplo, anticorpos quiméricos) são submetidos a procedimentos de mapeamento de epítopos para a identificação de uma região do antígeno alvo à qual se ligam. É conhecida na arte uma variedade de métodos de mapeamento de epítopos (ver, por exemplo, Current Protocols in Immunology, Coligan, J.E. e outros (ed.), J. Wiley & Sons, Nova York, NY) e estes incluem, por exemplo, métodos de exibição em fagos e leveduras. Os métodos de exibição em fagos e leveduras podem tam- bém ser combinados com técnicas de mutagênese aleatória com a finalidade de mapear de forma mais precisa os resíduos do antígeno envolvidos na ligação do anticorpo (ver, por exemplo, Chão, G. e outros, J. Moi Biol., 10:539-50 (2004)).

Em uma modalidade da presente invenção, os resíduos do antígeno alvo aos quais os anticorpos recombinantes se ligam são identificados através de uma técnica que combina a mutagênese de varredura com alanina com exibição de leveduras. Os exemplos não Iimi- tantes deste procedimento são fornecidos na seção de Exemplos a seguir. A técnica envolve geralmente a preparação de uma série de oligonucleotídeos que codificam peptídeos cada um representando a região alvo do antígeno e em que cada aminoácido individual nesta região foi substituído seqüencialmente por alanina. A região alvo do antígeno é determinada partindo do antígeno utilizado na imunização inicial para preparar o anticorpo monoclonal original ou partindo de uma verificação "de resolução baixa" preliminar utilizando exibição de leveduras ou fagos. Uma versão do tipo selvagem do antígeno é utilizada como um controle. Cada oligonucleotídeo é clonado em um vetor de exibição em levedura apropriado e cada mutante de alanina é transformado em um hospedeiro adequado, tal como E. coli. O DNA plasmideal é extraído e sequenciado e os clones são selecionados com base no sequenci- amento. Os vetores de exibição de leveduras são conhecidos na arte e estão disponíveis comercialmente (por exemplo, pYD1 disponível na Invitrogen Corp., Carlsbad1 CA).

Os clones selecionados são então transformados em células de Saccharomyces cerevesiae, por exemplo, células EBY100 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e os clones de levedura individuais são cultivados e induzidos para a expressão de peptídeo. As células de levedura induzidas expressando os mutantes de alanina na superfície da célula são incuba- das com o anticorpo recombinante e o anticorpo ligado é detectado através de métodos convencionais, por exemplo, utilizando um anticorpo secundário marcado. Os resíduos im- portantes na região antigênica alvo podem então ser determinados com base na identifica- ção de mutantes de alanina incapazes de se ligar ao anticorpo recombinante. Uma perda de atividade de ligação ao anticorpo indica que o mutante inclui um resíduo de alanina em uma posição que faz parte do epítopo para o anticorpo recombinante.

6. USOS DOS ANTICORPOS RECOMBINANTES

Os anticorpos recombinantes da presente invenção são adequados para uso, por exemplo, como reagentes para diagnóstico para a detecção de HCV e/ou como reagentes de padronização, reagentes de controle positivo ou reagentes de calibração em ensaios ou kits para a detecção de anticorpos para HCV no lugar de plasma ou soro tradicional. Os rea- gentes de padronização podem ser empregados, por exemplo, para estabelecer curvas pa- drões para a interpolação da concentração de anticorpo. Os controles positivos podem ser empregados para estabelecer características de desempenho do ensaio e/ou quantificar e monitorar a integridade do(s) antígeno(s) utilizado(s) no ensaio. A presente invenção fornece ainda o uso de um grande número dos anticorpos recombinantes, cada anticorpo recombi- nante capaz de se ligar especificamente a um antígeno do HCV diferente, na forma de gru- pos de sensibilidade de anticorpos padronizados. Tais grupos de sensibilidade podem ser empregados, por exemplo, no lugar do plasma ou do soro tradicional para o controle de qua- lidade de kits de detecção de anticorpos para o HCV, para estabelecer características de desempenho do ensaio e/ou para quantificar e para monitorar a integridade do(s) antíge- no(s) utilizado(s) no ensaio. A presente invenção considera ainda o uso dos anticorpos re- combinantes no tratamento ou na prevenção de uma infecção causada pelo HCV.

Uma modalidade da presente invenção fornece assim um reagente para diagnósti- co imunológico que compreende um ou mais anticorpos recombinantes, cada um capaz de se ligar especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do HCV.

Em uma modalidade da presente invenção, o reagente para diagnóstico imunológi- co compreende um grande número de (por exemplo, dois ou mais) anticorpos recombinan- tes cada um capaz de detectar um antígeno diferente do HCV.

O reagente para diagnóstico imunológico pode ser adaptado para um uso final es- pecífico através da seleção apropriada dos anticorpos recombinantes que compreende, tor- nando assim o reagente para diagnóstico imunológico compatível com um número de forma- tos e kits para ensaio de detecção de HCV existentes. A adaptação do reagente para diag- nóstico imunológico desta maneira também permite que o reagente seja otimizado para a detecção de certos estágios da infecção pelo HCV. Por exemplo, um reagente para diagnós- tico imunológico que compreende anticorpos recombinantes para as proteínas do núcleo e NS3 do HCV e opcionalmente para a proteína E2 do HCV, permitirá a detecção de infecções pelo HCV no estágio inicial, que pode ter importância particular, por exemplo, na verificação de produtos do sangue. Uma modalidade da presente invenção fornece assim um reagente para diagnóstico imunológico que compreende um anticorpo recombinante específico para a proteína do núcleo do HCV, um anticorpo recombinante específico para a proteína NS3 do HCV e opcionalmente um ou mais de: um anticorpo recombinante específico para a proteína E2, um anticorpo recombinante específico para a proteína NS4 do HCV e um anticorpo re- combinante específico para a proteína NS5 do HCV, que é adequado para a detecção da infecção pelo HCV em estágio inicial e/ou para a padronização de kits e ensaios para a in- fecção pelo HCV em estágio inicial.

Em uma modalidade da presente invenção, cada anticorpo incluído no reagente pa- ra diagnóstico imunológico mostra uma reatividade em relação ao seu antígeno alvo que é maior ou igual àquela do controle de origem no soro humano sob condições de ensaio subs- tancialmente idênticas.

A presente invenção fornece ainda um método de padronização de ensaios de de- tecção de anticorpos para o HCV utilizando um reagente para diagnóstico imunológico que compreende um grande número de anticorpos recombinantes, cada um capaz de se ligar especificamente a uma proteína antigênica diferente do HCV1 na forma de um grupo de sen- sibilidade.

A presente invenção fornece adicionalmente um método para a detecção da pre- sença de antígenos do HCV que compreende o contato de uma amostra de teste suspeita de conter os antígenos do HCV com um reagente para diagnóstico imunológico que com- preende um ou mais anticorpos recombinantes, cada um capaz de se ligar especificamente a um antígeno do HCV, sob condições que permitem a formação de complexos de anticorpo recombinante: antígeno e a detecção de quaisquer complexos de anticorpo recombinante: antígeno formados.

A presente invenção abrange ainda um método para a detecção da presença de

anticorpos para HCV que compreende o contato de uma amostra de teste suspeita de con- ter anticorpos para HCV com um ou mais antígenos específicos para os anticorpos para HCV, sob condições que permitem a formação de complexos de antígeno/anticorpo, a de- tecção dos complexos de antígeno: anticorpo e o emprego de um reagente para diagnóstico imunológico que compreende um ou mais anticorpos recombinantes, cada um capaz de se ligar especificamente a um dos antígenos empregados no método, como um controle positi- vo ou um reagente de padronização.

Os reagentes para diagnóstico imunológico da presente invenção são adequados para uso com ensaios e kits que monitoram as respostas do HCV no ser humano assim co- mo em outras espécies de vertebrados susceptíveis à infecção pelo HCV e capazes de ge- rar uma resposta de anticorpo para a mesma. Os reagentes para diagnóstico imunológico possuem assim aplicações na medicina humana assim como na veterinária.

Um outro aspecto da presente invenção fornece as seqüências de aminoácidos e de ácidos nucléicos correspondentes das regiões variáveis de anticorpos específicos para as proteínas do núcleo, NS3, NS4 e NS5 do HCV, respectivamente. Estas seqüências pos- suem utilidade na produção de outros anticorpos recombinantes como é conhecido na arte, assim como para a identificação de regiões variáveis significativamente homólogas de anti- corpos humanos ou humanizados, tais como as contidas em uma biblioteca ou um banco de tais anticorpos.

A presente invenção abrange ainda o uso dos anticorpos recombinantes e das regi-

ões variáveis descritas aqui em tecnologias de evolução molecular direcionada tais como tecnologias de exibição em fagos e tecnologias de exibição na superfície de células bacteri- anas e de leveduras, com a finalidade de produzir novos anticorpos recombinantes in vitro (ver, por exemplo, Johnson e outros, Current Opinion in Structural Biology 3:564 (1993) e Clackson e outros, Nature 352:624 (1991)).

Opcionalmente o reagente para diagnóstico imunológico da invenção, por exemplo, os anticorpos quiméricos, podem ser utilizados em ensaios imunológicos de plataformas comerciais, por exemplo, como descrito no Exemplo 14. Por exemplo, os quatro anticorpos quiméricos (núcleo, NS3, NS4 e NS5 do HCV) preparados como descrito aqui podem ser utilizados em uma variedade de ensaios de verificação de sangue em relação ao HCV da Abbott Laboratories nas plataformas Prism®, AxSYM®, ARCHITECT® e EIA (Bead), assim como em outros ensaios de diagnóstico comerciais e/ou in vitro como reagentes de controle de qualidade (por exemplo, grupos de sensibilidade, calibradores e controles positivos). 7. COMPOSIÇÕES QUE COMPREENDEM ANTICORPOS RECOMBINANTES Como citado anteriormente, os anticorpos recombinantes da presente invenção po- dem ser utilizados como diagnóstico e/ou de forma terapêutica. Um aspecto da presente invenção fornece assim ainda composições para diagnóstico e farmacêuticas que compre- endem um ou mais anticorpos recombinantes e um carreador, um diluente e/ou um excipien- te adequado. Os carreadores, os diluentes e/ou os excipientes adequados são bem conhe- cidos na arte. Consequentemente, é também fornecido o uso de um ou mais anticorpos re- combinantes da invenção para a produção de um medicamento. Para a preparação de com- posições farmacêuticas, os carreadores, os diluentes e os excipientes serão farmaceutica- mente aceitáveis. Se desejado, um adjuvante ou outro ingrediente ativo pode ser incluído nas composições farmacêuticas.

Para a administração a um animal, as composições farmacêuticas podem ser for- muladas para a administração através de uma variedade de rotas. Por exemplo, as compo- sições podem ser formuladas para administração oral, tópica, retal ou parenteral ou para a administração por inalação ou spray. O termo parenteral como utilizado aqui inclui injeções subcutâneas, injeção intravenosa, intramuscular, intratecal, intraesternal ou técnicas de infu- são. Como indicado anteriormente, tais composições farmacêuticas são utilizadas no trata- mento de vários estados de saúde em animais, incluindo seres humanos. As composições farmacêuticas compreendem preferencialmente uma quantidade

terapeuticamente eficiente do anticorpo recombinante da invenção. O termo "quantidade terapeuticamente eficiente" como utilizado aqui refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessária para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou um estado de saú- de alvo ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para um anticorpo, a quantidade terapeuticamente eficiente pode ser estimada inicialmente, por exemplo, em en- saios de cultura de células ou em modelos de animais, geralmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo de animal também pode ser utilizado para determinar a faixa de concentração apropriada e a rota de administração. Tal informação pode então ser utilizada para determinar doses e rotas úteis para a administração no animal que será trata- do, incluindo seres humanos.

Várias composições para diagnóstico e composições farmacêuticas adequadas pa- ra rotas de administração diferentes e métodos de preparação de composições farmacêuti- cas são conhecidas na arte e são descritas, por exemplo, em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (anteriormente "Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott1 Williams & Wilkins1 Philadelphia, PA (2000).

8. KITS QUE COMPREENDEM ANTICORPOS RECOMBINANTES A presente invenção fornece ainda kits terapêuticos, para diagnóstico e para contro-

le de qualidade que compreendem um ou mais anticorpos recombinantes da invenção.

a. Kits para Diagnóstico e para Controle de Qualidade

Um aspecto da presente invenção fornece kits para diagnóstico para a detecção do HCV. Os kits compreendem um ou mais anticorpos recombinantes da presente invenção. Os anticorpos recombinantes podem ser fornecidos no kit na forma de reagentes de detecção, para uso para capturar e/ou para detectar antígenos do HCV ou para uso como anticorpos secundários para a detecção de complexos de antígeno: anticorpo. Alternativamente, os anticorpos recombinantes podem ser fornecidos no kit como um reagente de controle positi- vo, um reagente de padronização, um reagente de calibração ou um grupo de sensibilidade. Em várias modalidades, o kit para diagnóstico pode compreender ainda reagentes para a detecção de antígenos do HCV ou reagentes para a detecção de anticorpos para HCV. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um kit para diagnóstico que compreende rea- gentes para a detecção de anticorpos para HCV, incluindo um ou mais antígenos específi- cos para os anticorpos para HCV e um controle positivo ou um reagente de padronização que compreende um ou mais anticorpos recombinantes da invenção, cada um capaz de se ligar especificamente a um do um ou mais antígenos incluídos no kit.

Como discutido anteriormente, opcionalmente o reagente para diagnóstico imuno- lógico da invenção, por exemplo, os anticorpos quiméricos, assim como os ensaios, os kits e os próprios componentes dos kits são otimizados para uso em plataformas comerciais (por exemplo, ensaios imunológicos tais como ensaios de verificação de sangue em relação ao HCV para uso nas plataformas Prism®, AxSYM®, ARCHITECT® e EIA (Bead) da Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, assim como outros ensaios de diagnóstico comerciais e/ou in vitro). Adicionalmente, os ensaios, os kits e os componentes dos kits podem ser emprega- dos em outros formatos, por exemplo, em sistemas de ensaio eletroquímicos ou outros por- táteis ou "point-of-care" (ao lado do leito). A presente invenção é, por exemplo, aplicável ao sistema de ensaio imunológico eletroquímico Point of Care comercial da Abbott (i-STAT®, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) que realiza ensaios imunológicos em sanduíche para vários marcadores cardíacos, incluindo Tnl1 CKMB e BNP. Sensores imunológicos e méto- dos de operação dos mesmos em dispositivos de teste de um único uso são descritos, por exemplo, nos Pedidos de Patentes US 20030170881, 20040018577, 20050054078 e 20060160164 que são incorporados aqui como referência. O fundamento adicional da pro- dução de sensores imunológicos eletroquímicos e de outros tipos é encontrado na Patente US 5.063.081 que é também incorporada como referência por seus ensinamentos em rela- ção ao mesmo.

Os reagentes para diagnóstico imunológico e outros componentes do kit também podem ser opcionalmente empregados como reagentes de controle de qualidade (por e- xemplo, grupos de sensibilidade, calibradores e controles positivos). A preparação de rea- gentes de controle de qualidade é bem conhecida na arte e é descrita, por exemplo, em uma variedade de folhetos de instruções de produtos para diagnóstico imunológico. Os membros do grupo de sensibilidade do HCV podem ser opcionalmente preparados em quantidades variáveis contendo quantidades conhecidas do anticorpo para o HCV variando de "baixa" até "alta", por exemplo, adicionando quantidades conhecidas de anticorpos quiméricos de acor- do com a invenção em um tampão de ensaio apropriado (por exemplo, um tampão fosfato. Estes membros do grupo de sensibilidade são opcionalmente utilizados para estabelecer as características de desempenho do ensaio e são ainda opcionalmente indicadores úteis da integridade dos reagentes do kit de ensaio imunológico e da padronização dos ensaios. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um kit de controle de qua-

lidade que compreende um ou mais anticorpos recombinantes da presente invenção para uso como um grupo de sensibilidade para avaliar as características de desempenho do en- saio e/ou quantificar e monitorar a integridade do(s) antígeno(s) utilizado(s) no ensaio.

Os anticorpos recombinantes fornecidos no kit podem incorporar uma marcação de- tectável, tal como um fluoróforo, um grupamento radioativo, uma enzima, uma marcação de biotina/avidina, um cromóforo, uma marcação quimioluminescente ou similar ou o kit pode incluir reagentes para a marcação dos anticorpos recombinantes ou reagentes para a detec- ção dos anticorpos recombinantes. Os anticorpos recombinantes podem ser fornecidos em recipientes separados ou pré-distribuídos em um formato de ensaio apropriado, por exem- pio, em placas para microtitulação.

Os kits podem incluir opcionalmente outros reagentes necessários para realizar um ensaio diagnóstico ou facilitar avaliações de controle de qualidade, tais como tampões, sais, enzimas, co-fatores de enzimas, substratos, reagentes de detecção e similares. Outros componentes, tais como tampões e soluções para o isolamento e/ou o tratamento de uma amostra de teste, podem também ser incluídos no kit. O kit pode incluir adicionalmente um ou mais controles. Um ou mais dos componentes do kit podem ser Iiofilizados e o kit pode compreender ainda reagentes adequados para a reconstituição dos componentes Iiofiliza- dos.

Os vários componentes do kit são fornecidos em recipientes adequados. Como in- dicado anteriormente, um ou mais dos recipientes pode ser uma placa para microtitulação. Quando apropriado, o kit também pode opcionalmente conter recipientes de reação, recipi- entes de mistura e outros componentes que facilitam a preparação de reagentes ou da a- mostra de teste. O kit também pode incluir um ou mais instrumentos para auxiliar a obtenção de uma amostra de teste, tal como uma seringa, uma pipeta, um fórceps, uma colher para medida ou similar.

O kit pode opcionalmente incluir instruções para uso, que podem ser fornecidas na forma de papel ou na forma que pode ser lida em computador, tal como um disco, um CD, um DVD ou similar.

b.Kits Terapêuticos

A presente invenção fornece adicionalmente kits terapêuticos ou embalagens que contêm um ou mais dos anticorpos recombinantes da invenção ou uma composição farma- cêutica que compreende um ou mais dos anticorpos recombinantes para uso no tratamento ou na prevenção de uma infecção causada pelo HCV. Os componentes individuais do kit podem ser embalados em recipientes separados, associados com os quais, quando aplicá- vel, pode estar uma instrução na forma prescrita por um órgão governamental que regula- menta a produção, o uso ou a venda dos produtos farmacêuticos ou dos produtos biológi- cos, cuja instrução reflete a aprovação pelo órgão de produção, uso ou venda para adminis- tração humana ou a animais. O kit pode opcionalmente conter ainda um ou mais outros a - gentes terapêuticos para uso em combinação com os anticorpos recombinantes da inven- ção. O kit pode conter opcionalmente instruções ou orientações que descrevem o método de uso ou o regime de dosagem para os anticorpos recombinantes e/ou os agentes terapêuti- cos adicionais.

Quando um ou mais componentes do kit são fornecidos na forma de soluções, por exemplo, uma solução aquosa ou uma solução aquosa esterilizada, os meios de recipientes podem por si só ser um inalante, uma seringa, uma pipeta, um conta gotas ou outro tal apa- rato similar, partindo do qual a solução pode ser administrada a um indivíduo ou aplicada e misturada com os outros componentes do kit.

Os componentes do kit também podem ser fornecidos na forma seca ou Iiofilizada e o kit pode conter adicionalmente um solvente adequado para a reconstituição dos compo- nentes liofilizados. Independente do número ou do tipo de recipientes, os kits da invenção também podem compreender um instrumento para auxiliar a administração da composição a um paciente. Tal instrumento pode ser um inalante, uma seringa, uma pipeta, um fórceps, uma colher para medida, um conta gotas ou um veículo para fornecimento aprovado na me- dicina similar. Para adquirir um melhor entendimento da invenção descrita aqui, são apresentados os exemplos a seguir. Será entendido que estes exemplos são pretendidos para descrever modalidades ilustrativas da invenção e não é pretendido que limitem o âmbito da invenção de forma alguma.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE UM ANTICORPO QUIMÉRICO DE SER HUMANO-CAMUNDONGO ESPECÍFICO PARA A PROTEÍNA DO NÚCLEO #1 DO VÍRUS DA HEPATITE C

Preparação de uma linhagem de células de hibridoma A linhagem de células de hibridoma 201-603-195 anti-núcleo do HCV foi desenvol-

vida utilizando a técnica de fusão mediada por PEG descrita em Galfre e outros, Nature, 266:550 (1977). Sucintamente, fêmeas de camundongos BALB/c foram imunizadas com o antígeno do núcleo do HCV purificado conhecido como núcleo ρλ (que corresponde aos a- minoácidos 1-50 da poliproteína do HCV). O regime de reforço dos animais utilizava o Sis- tema de Adjuvante de Freund e as amostras de soro foram monitoradas em um imunoensaio enzimático (EIA) do HCV até que um título anti-HCV fosse identificado. Para o EIA1 um antí- geno do núcleo recombinante do HCV que compreende os aminoácidos 1-150 do núcleo (assim como os aminoácidos de NS3 1192-1457) foi coberto sobre placas de EIA de 96 po- ços durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente e então foi bloqueado com 2% de BSA/tampão PBS durante 1 hora. As amostras de soro dos camundongos foram adiciona- das nos poços revestidos e as placas foram incubadas durante pelo menos 1 hora à tempe- ratura ambiente. Após a incubação, as placas foram lavadas e incubadas com anticorpo IgG anti camundongo de cabra marcado com peroxidase de raiz forte (HRP) durante aproxima- damente 1 hora. As placas foram reveladas utilizando 0-Fenilenodiamina-2HCI (OPD) e lidas em uma densidade óptica de 492 nm.

As células de baço dos camundongos foram então fundidas com o mieloma SP2/0 e cultivadas a 37°C em Meio de Dulbecoo Modificado por Iscove suplementado com HAT (IMDM) contendo 10% de soro fetal bovino (GIBCO). Os hibridomas foram testados 10-14 dias depois em relação à reatividade anti-HCV através do EIA. Os hibridomas secretando anticorpos monoclonais anti-HCV foram clonados através de técnicas de diluição de células isoladas padronizadas e os clones subsequentes foram testados em relação à reatividade através do EIA. As culturas positivas foram expandidas em IMDM contendo 10% de FBS e então congeladas novamente em um agente de criopreservação para armazenamento em longo prazo em nitrogênio líquido. A linhagem de células de baço de camundongos de hibridoma murino 201-603-195

anti-núcleo do HCV (também conhecida como "HCV 201-603-195") foi depositada na Ameri- can Type Culture Collection (ATCC) at 10801 University Boulevard, Manassas, VA em 21 de novembro de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-8027.

Isolamento de mRNA e identificação de seqüências Vh e Vl de camundongo A linhagem de células de hibridoma 201-603-195 anti-núcleo do HCV obtida como descrito anteriormente foi cultivada no Hybridoma Serum-Free Médium (HSFM) para a ob- tenção de ~ 5 χ 106 células para a purificação do mRNA. O mRNA poli A+ foi isolado das células e purificado utilizando Oligotex Direct mRNA Micro Kit (QIAGEN Inc., Valencia1 CA) seguindo as instruções do fabricante.

O mRNA purificado foi então utilizado como um molde em uma reação de RT-PCR utilizando o conjunto Mouse Ig-Primer® (EMD Biosciences Inc. (Novagen), San Diego1 CA). Cada Mu Ig Vh 5'-A Primer1 Mu Ig Vh 5'-B Primer1 Mu Ig Vh 5'-C Primer1 Mu Ig Vh 5'-D Pri- mer, Mu Ig Vh 5'-E Primer e Mu Ig Vh 5-F Primer foi pareado individualmente com o Mu IgG Vh 3-2 Primer para a reação de RT-PCR de VH. Cada Mu Ig kappa Vl 5'-A Primer, Mu Ig kappa Vl 5'-B Primer1 Mu Ig kappa Vl 5'-C Primer1 Mu Ig kappa Vl 5'-D Primer1 Mu Ig kappa Vl 5'-E Primer, Mu Ig kappa Vl 5-F Primer e Mu Ig kappa Vl 5'-G Primer foi individualmente pareado com Mu Ig kappa Vl 3-1 Primer para a reação de RT-PCR de VL. Cada reação de RT-PCR foi executada em Tampão de reação 2 X (dNTP), cada par de iniciadores a 5' e a 3' e 2,5 unidades de RT-PIatinum Taq HiFi Mix (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). A síntese do cDNA e a pré-desnaturação foram realizadas em 1 ciclo de 50°C durante 30 minutos e 1 ciclo de 94°C durante 2 minutos, seguidos pela reação da PCR que compreende a desnatu- ração durante 1 minuto a 94°C; o anelamento 1 minuto a 50°C e a extensão 2 minutos a 68°C, com uma extensão final de 6 minutos a 72°C. Foi realizado um total de 45 ciclos.

Os produtos positivos da PCR foram observados partindo dos conjuntos de inicia- dores da cadeia pesada (H) de B e C (VH-B, VH-C) e partindo dos conjuntos de iniciadores da cadeia leve (L) de A, Β, E, F, G (VL-A, VL-B, VL-E1 VL-F1 VL-G). Todos os produtos posi- tivos da PCR foram purificados em gel e clonados no vetor pCR TOPO 2.1 TA (Invitrogen Corp., Carlsbad1 CA) e transformados em E. coli DH5a. O DNA plasmideal foi extraído das células de E. coli utilizando o QIAprep spin miniprep Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA) se- guindo as instruções do fabricante e o inserto de Vh ou de Vl foi confirmado através da di- gestão com EcoR I para cada produto da PCR. O clone TA final para cada um dos insertos de Vh ou de Vl foi selecionado através do alinhamento das seqüências para a cadeia variá- vel leve ou para a cadeia variável pesada utilizando o software Vector NTI Advance™ (Invi- trogen Corp., Carlsbad1 CA). Sucintamente, cada clone TA foi crescido em meio LB durante a noite com agitação a 37°C. O DNA plasmideal de cada clone foi purificado utilizando o QIAprep spin miniprep kit (QIAGEN) e sequenciado utilizando os iniciadores para frente e para trás de M13 e o kit de sequenciamento Big Dye Terminator v3.1 cycle (Applied Biosys- tems, Foster City, CA). As seqüências foram inseridas no software Vector NTI Advance e alinhadas. As seqüências que se alinhavam completamente, isto é, não tinham mutações, inserções ou deleções, foram considerados clones corretos e foram selecionadas para de- senvolvimento adicional. Os resultados de seqüências identificaram o clone de VL-G TA número 1 como contendo a seqüência de Vl correta (SEQ ID NO: 8, que codifica o polipep- tídeo mostrado na SEQ ID NO: 2) da linhagem de células de hibridoma e o clone VH-C TA número 1 como contendo a seqüência de Vh correta (SEQ ID NO: 7, que codifica o polipep- tídeo mostrado na SEQ ID NO: 1) (ver as Figuras 2A-D). Clonagem dos genes Vh e Vl nos vetores pBOS

Os vetores pBOS são conhecidos na arte e são descritos, por exemplo, na US 2005/0227289 (incorporada como referência por seus ensinamentos em relação ao uso des- tes vetores e aos próprios vetores).

Utilizando o clone VL-G TA número 1 como o molde, um par de iniciadores da PCR foi planejado para clonar a seqüência Vl de camundongo, ou seja, um iniciador da extremi- dade a 5' de Vl do Anticorpo do Núcleo do HCV que compreende a seqüência 5'-GCTCGCGATGCGACATTGTGATGTCACAGTCT-3' [SEQ ID NO: 3], e um iniciador da extremidade a 3' de Vl do Anticorpo do Núcleo do HCV que com-

preende the seqüência

5'-CACCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGT-3' [SEQ ID NO: 4], O iniciador da extremidade a 5' (SEQ ID NO: 3) continha uma seqüência sinal Kap- pa parcial e um sítio de restrição de Nru I e o iniciador da extremidade a 3' (SEQ ID NO: 4) continha um sítio de restrição de BsiW I. Em adição, utilizando o clone VH-C TA número 1 como o molde, um par de iniciadores foi planejado para clonar a seqüência Vh de camun- dongo, ou seja, um iniciador da extremidade a 5' de Vh do Anticorpo do Núcleo do HCVque compreende a seqüência

5'-TTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCCAGATCCAGTTGGTGC AGTCTGGACCT-3' [SEQ ID NO:5],

e um um iniciador da extremidade a 3' de Vh do Anticorpo do Núcleo do HCV que compreende a seqüência

5'-TTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTT -3' [SEQ ID NO:6], Para este par de iniciadores, o iniciador da extremidade a 5' (SEQ ID NO: 5) conti- nha uma seqüência sinal de cadeia pesada parcial e um sítio de restrição de Nru I e o inicia- dor da extremidade a 3' (SEQ ID NO: 6) continha um sítio de restrição de Sal I.

A PCR foi realizada em tampão de amplificação 2 X Pfx utilizando 15 pmoles de cada um dos iniciadores da extremidade a 5' e da extremidade a 3', 1,25 unidade de Pfx DNA polimerase (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e 100 ng do DNA plasmideal do clone de TA. A PCR foi realizada durante 30 ciclos de 15 segundos a 94°C seguidos por 1 minuto a 68°C.

As seqüências VLeVH foram independentemente amplificadas através da PCR utili- zando os pares de iniciadores anteriores e o clone VL-G TA número 1 e o clone VH-C TA número 1, respectivamente, como os moldes. Os produtos da PCR de Vl e Vh foram corta- dos com enzimas de restrição através da digestão com Nru I /BsiW I e Nru I/ Sal I, respecti- vamente e então clonados no vetor pBOS-hck (para a seqüência VL) ou no vetor pBOS-hcg (para a seqüência VH) e transformados em E. coli DH5a. O vetor pBOS-hck compreende o gene de resistência à ampicilina, a origem de pUC, a origem de SV40, o promotor EF-1a, o peptídeo sinal kappa e o gene kappa humano (hck). O vetor pBOS-hcg compreende o gene de resistência à ampicilina, a origem de pUC, a origem de SV40, o promotor EF-1a, o peptí- deo sinal de cadeia pesada e o gene de IgG constante humano (hcg1,2,non-a). Os clones de E. coli transformados foram crescidos em meio LB durante a noite

com agitação a 37°C. O DNA plasmideal foi purificado partindo de cada clone individual com o QIAprep spin miniprep kit (QIAGEN) seguido pelo seqüenciamento utilizando o kit de se- quenciamento Bigdye Terminator v3.1 cycle (Applied Biosystems). Os plasmídeos pBOS 201-603-195-L-T9 (contendo a seqüência VL) e pBOS 201-603-195-H-T4 (contendo a se- quência VH) foram selecionados através do seqüenciamento. Uma vez que os respectivos clones de pBOS foram identificados, bancos de células E. coli DH5a separados contendo o plasmídeo pBOS 201-603-195-L-T9 ou o plasmídeo pBOS 201-603-195-H-T4 foram produ- zidos para preservar os clones de pBOS.

Teste do anticorpo quimérico funcional O DNA plasmideal de pBOS 201-603-195-L-T9 e de pBOS 201-603-195-H-T4 foi

preparado utilizando o Endofree plasmid Maxi-kit (QIAGEN, CA) através de técnicas padro- nizadas. O DNA plasmideal de pureza alta obtido dessa maneira foi então transfectado de forma transitória em células COS 7L por eletroporação (Gene Pulser, BIO-RAD). As células COS 7L transfectadas foram incubadas a 37°C em uma incubadora com 5% de CO2 durante três dias, então coletadas por centrifugação a 4000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadan- te foi coletado. Após a filtração e a purificação por afinidade em agarose com proteína a pa- dronizada (Invitrogen Corp.), o anticorpo quimérico purificado anti-núcleo do HCV foi anali- sado através de imunoensaio enzimático (EIA) para confirmar a reatividade com o antígeno do núcleo do HCV. O EIA foi realizado como descrito anteriormente utilizando anticorpo IgG anti-humano de cabra ("GAH") marcado com peroxidase de raiz forte como o anticorpo de detecção e variando as concentrações do anticorpo quimérico. Os resultados do EIA de- monstraram que o anticorpo quimérico para o núcleo do HCV proveniente da expressão transitória era reativo ao antígeno do núcleo do HCV.

Clonagem das seqüências Vh e Vl em um vetor de expressão estável Os clones pBOS 201-603-195-L-T9 e pBOS 201-603-195-H-T4 foram utilizados pa-

ra a construção de um clone de plasmídeo para a transfecção estável de linhagens de célu- las. Em primeiro lugar, os sítios de restrição de Srf I e Not I que flanqueiam as seqüências Vh e Vl nos respectivos vetores foram empregados para cortar cada uma das seqüências Vh e Vl dos vetores. As seqüências cortadas foram purificadas em gel e então clonadas no ve- tor pBV (para a seqüência VH) o no vetor pJV (para a seqüência VL). O plasmídeo "stuffer" pJV foi obtidos na Abbott Laboratories (Abbott Bioresearch Center, Worcester, MA) e com- preende um promotor do SV40, um gene da DHFR murino, um intensificador do CMV1 um promotor tardio principal de adenovírus (AML) e um "stuffer" lambda. O plasmídeo "stuffer" pBV (também obtido na Abbott Laboratories, Abbott Bioresearch Center, Worcester, MA) compreende um intensificador do CMV, um promotor tardio principal de adenovírus (AML) e um "stuffer" lambda.

Os clones de pBV e pJV foram verificados através da digestão com as enzimas de

restrição Srf l/Not I para a identificação dos clones que contêm o inserto correto. Uma vez que os clones de pBV e pJV corretos foram identificados, o gene da cadeia pesada (do pBV) e o gene da cadeia leve (do pJV) foram clonados em um plasmídeo, através da digestão de cada plasmídeo com Asc I e Pac I. Para o plasmídeo do gene da cadeia leve (pJV), a diges- tão com Pac I/ Asc I produziu duas bandas distintas em 4,8 Kb e 1,5 kb. Para o plasmídeo do gene da cadeia pesada (pBV), a digestão com Pae I/ Asc I produziu duas bandas distin- tas em 4,6 kb e 1,2 kb. O fragmento de DNA de 4,8 kb do plasmídeo pJV e o fragmento de DNA de 4,6 kb do pBV foram purificados em gel e ligados para formar um plasmídeo pBJ que continha ambas as seqüências Vh e Vl . Após a transformação, o clone final de 201-603- 195 do núcleo do HCV em pBJ foi selecionado com base na verificação através da digestão com Srf l/Not I para confirmar que este continha ambas as seqüências Vh e VL. O mapa do plasmídeo para o clone de pBJ final (201-603-195 do núcleo do HVC em pBJ) para o anti- corpo quimérico para o núcleo do HCV obtido dessa maneira é mostrado na Figura 1. As seqüências gênicas de Vh e Vl são mostradas nas Figuras 2A-B (SEQ ID NOs: 7 e 8, res- pectivamente). Foram produzidos bancos de células de E. coli contendo o clone de 201-603- 195 do núcleo do HVC em pBJ.

Estabelecimento de uma linhagem de células CHO estável e expressão do anticor- po quimérico para o núcleo do HCV

Uma linhagem de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO, B3.2, Abbott Labo- ratories, Abbott Bioresearch Center, Worcester, MA) que não possui o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) foi utilizada para a transfecção e a expressão estável do anticorpo quimé- rico como descrito a seguir. As células CHO foram cultivadas e transfectadas através da transfecção mediada por fosfato de cálcio padronizada com plasmídeo pBJ 201-603-195 do núcleo do HVC. As células CHO transfectadas com o núcleo do HCV foram cultivadas du- rante várias semanas antes da clonagem em uma célula isolada em placas de 96 poços utilizando o separador com citômetro de fluxo BD FACSAria. Uma vez que os clones de CHO foram crescidos até mais de 50% de confluência, o sobrenadante foi testado em um EIA específico ao anticorpo para determinar o desempenho dos clones de CHO. O EIA foi realizado como descrito anteriormente utilizando concentrações variáveis do anticorpo qui- mérico. Os 16 clones de CHO que forneceram o maior sinal no EIA foram expandidos e ana- lisados novamente. Dez clones de CHO foram então selecionados com base no sinal mais alto fornecido no ensaio de EIA para privação no meio de cultura de tecido isento de soro CD CHO1 incluindo o clone CHO 201-603-486. Após mais uma subclonagem de célula isola- da utilizando o citômetro de fluxo, o 201-603-486-333 do clone de CHO do núcleo do HCV foi expandido para a produção de anticorpo quimérico e para o desenvolvimento de bancos de células para armazenamento em longo prazo em nitrogênio líquido. O anticorpo quiméri- co foi purificado partindo desta linhagem de células utilizando procedimentos de purificação em Proteína A padronizados (POROS A50, Applied Biosystems) seguidos pela purificação em colunas de dessalinização Sephadex G-25 Superfine.

A linhagem de células 201-603-486-333 CHO do núcleo do HCV foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) at 10801 University Boulevard, Manassas1 VA em 2 de maio de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-7570.

EXEMPLO 2: Preparação de um Anticorpo Quimérico de Ser Humano- Camundongo Específico para a Proteína NS3 do Vírus da Hepatite C

Preparação de uma linhagem de células de hibridoma

A linhagem de células de hibridoma 17-903-127 anti-NS3 do HCV foi desenvolvida como descrito no Exemplo 1 utilizando o antígeno NS3 recombinante do HCV purificado conhecido como CKS-33C-BCD no lugar do antígeno do núcleo. O antígeno recombinante CKS-33C-BCD corresponde aos aminoácidos 1192-1457 + 1676-1931 da poliproteína do HCV. O regime de imunização de animais utilizava um reforço de 200 pg no Sistema de Ad- juvante de Freund, com um reforço pré-fusão em solução salina 2 semanas depois. A linhagem de células de baço de camundongo de hibridoma murino 17-903-127

anti-NS3 do HCV (também conhecida como "HCV 17-903-127") foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) at 10801 University Boulevard, Manassas, VA em 21 de novembro de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-8023.

Isolamento de mRNA e identificação de seqüências Vh e Vl de camundongo O mRNA foi isolado da linhagem de células de hibridoma 17-903-127 anti-NS3 do

HCV e as seqüências Vh e Vl de camundongo foram obtidas através da RT-PCR como des- crito no Exemplo 1 em relação à linhagem de células de hibridoma 201-603-195 do Núcleo do HCV. Os produtos positivos da PCR foram observados partindo dos conjuntos de inicia- dores de cadeia pesada (H) de A e F (VH-A, VH-F) e dos conjuntos de iniciadores de cadeia leve (L) de B, C e G (VL-B, VL-C, VL-G). Todos os produtos positivos da PCR foram purifi- cados em gel, clonados no vetor pCR TOPO 2.1 TA e transformados em E. coli. As reações da PCR em colônias foram utilizadas para confirmar o inserto do clone. Sucintamente, a PCR foi realizada utilizando o iniciador para frente de M13 e para trás de M13 (Invitrogen Corp.), Taq DNA polimerase e colônia de E. coli fervida como o molde. A PCR compreendia a desnaturação 1 minuto a 94°C; o anelamento 1 minuto a 50°C e a extensão 2 minutos a 72°C, com uma extensão final de 6 minutos a 72°C durante um total de 30 ciclos. Os clones que forneceram o tamanho correto para os produtos da PCR foram crescidos em meio LB. Cada DNA plasmideal foi purificado utilizando o QIAprep spin miniprep Kit (QIAGEN) e se- quenciado utilizando os Iniciadores para frente e para trás de M13 com o kit de sequencia- mento Big Dye Terminator v3.1 cycle (Applied Biosystems);

O clone TA final foi selecionado através do alinhamento das seqüências como des- crito no Exemplo 1. Os resultados das seqüências confirmaram que o clone VL-G continha a seqüência Vl correta (SEQ ID NO: 16 que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 10), enquanto que os clones VH-A e F continham a seqüência Vh correta (SEQ ID NO: 15 que codifica o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 9) (ver também as Figuras 4A-D). Clonagem dos genes Vh e Vl nos vetores pBOS Utilizando o clone VL-G TA número 5 como o molde, um par de iniciadores da PCR

foi planejado para clonar a seqüência Vl de camundongo, ou seja, um iniciador da extremi- dade a 5' da Vl do anticorpo para NS3 do HCV que compreende a seqüência

5'-CTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGCGATGTTGTGATGGCCCAAAC TCCACTCTCCCC-3' [SEQ ID NO: 11] e um iniciador da extremidade a 3' da Vl do anticorpo para NS3 do HCV que compreende a seqüência

5'-GCGCATGCGTCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-3' [SEQ ID NO:

12].

O iniciador da extremidade a 5' continha uma seqüência sinal Kappa parcial e um sítio de restrição de Nru I e o iniciador da extremidade a 3' continha um sítio de restrição de BsiW I. Em adição, utilizando o clone VH TA número 2 como o molde, um par de iniciadores foi planejado para clonar a seqüência Vh de camundongo, ou seja, um iniciador da extremi- dade a 5' da Vh do anticorpo para a NS3 do HCV que compreende a seqüência 5-GGC Illll CTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCGAAGTG AAGCTGGTGGAGTCTG GGGGAGGC-3' [SEQ ID NO: 13] e um iniciador da ex- tremidade a 3' da Vh do anticorpo para a NS3 do HCV que compreende a seqüência 5'-GCG CATG CATG CATTGTCG ACG CGAG G AG ACTGTG AG AGTG GT GCCTTGGCCC -3' [SEQ ID NO: 14].

Para este par de iniciadores, o iniciador da extremidade a 5' continha uma seqüên- cia sinal de cadeia pesada parcial e um sítio de restrição de Nru I e o iniciador da extremida- de a 3' continha um sítio de restrição de Sal I.

As seqüências Vl e Vh foram independentemente amplificadas através da PCR uti- lizando os pares de iniciadores anteriores e o clone VL-G TA número 5 e o clone VH TA nú- mero 2, respectivamente, como os moldes. A PCR foi realizada em Tampão de amplificação 1 X PCR utilizando 20 pmoles de cada um dos iniciadores da extremidade a 5' e da extremi- dade a 3', 1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen Corp.) e 2 μΙ_ de colônia bacteriana como o molde. A PCR foi realizada empregando 30 ciclos de 30 segundos a 94°C e 30 se- gundos a 55°C seguidos por 1 minuto a 72°C.

Os produtos da PCR de Vl e Vh foram cortados com enzimas de restrição através da digestão com Nru I /BsiW I e Nru I/ Sal I, respectivamente e então clonados no vetor pBOS-hck (para a seqüência VL) ou no vetor pBOS-hcg (para a seqüência VH), como descri- to no Exemplo 1. Os plasmídeos pBOS 17-903-127-L (contendo a seqüência VL) e pBOS 17- 903-127-H (contendo a seqüência VH) foram selecionados através do sequenciamento como descrito no Exemplo 1. Uma vez que os respectivos clones de pBOS identificados, bancos de células E. coli DH5a separados contendo o plasmídeo pBOS 17-903-127-L-T3 ou o plasmídeo pBOS 17-903-127-H-T2 foram produzidos para preservar os clones de pBOS.

Teste do anticorpo quimérico funcional O DNA plasmideal de pBOS 17-903-127-L-T3 e de pBOS 17-903-127-H-T2 foi pre-

parado e transfectado de forma transitória em células COS 7L como descrito no Exemplo 1. O anticorpo quimérico anti-NS3 do HCV foi preparado partindo das células COS 7L transfec- tadas como descrito no Exemplo 1 e analisados através do EIA para confirmar a reatividade com o antígeno NS3 do HCV. O EIA foi realizado como descrito no Exemplo 1 utilizando o antígeno NS3 do HCV CKS-33C-BCD no lugar do antígeno do núcleo. Os resultados do EIA demonstraram que o anticorpo quimérico proveniente da expressão transitória era reativo ao antígeno NS3 do HCV.

Clonagem das seqüências Vh e Vl em um vetor de expressão estável

Os clones pBOS 17-903-127-L-T3 e pBOS 17-903-127-H-T2 foram utilizados para a construção de um clone de plasmídeo para a transfecção estável de linhagens de células clonando primeiramente as seqüências no vetor pBV (para a seqüência VH) ou no vetor pJV (para a seqüência VL) e subseqüentemente ligando os fragmentos dos vetores obtidos pro- venientes da digestão com as enzimas de restrição Pac I /Asc I como descrito no Exemplo 1 para fornecer o pBJ 17-903-127 da NS3 do HCV no plasmídeo pBJ que contém ambas as seqüências Vh e VL. O clone de pBJ foi verificado através da digestão com Srf l/Not I para confirmar que este contém ambas as seqüências. O mapa do plasmídeo para o clone de pBJ final (pBJ 17-903-127 da NS3 do HCV) para o anticorpo quimérico para a NS3 do HCV é mostrado na Figura 3. As seqüências gênicas de Vh e Vl são mostradas na Figura 4 (SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente). Foram feitos bancos de células de E. coli DH5a contendo o clone pBJ 17-903-127 da NS3 do HCV.

Estabelecimento de uma linhagem de células CHO estável e expressão do anticor- po quimérico para o HCV O plasmídeo pBJ 17-903-127 da NS3 do HCV foi transfectado através da transfec- ção mediada por fosfato de cálcio em linhagens de células de Ovário de Hamster Chinês deficientes em relação à DHFR como descrito no Exemplo 1. A cultura e a clonagem de cé- lulas isoladas foram realizadas como descrito no Exemplo 1. As placas de 96 poços foram testadas através de EIA específico ao antígeno e o clone número 132 foi selecionado para desenvolvimento adicional. O EIA foi realizado como descrito anteriormente. O clone de cé- lulas CHO 17-903-132 da NS3 do HCV foi cultivado e a célula isolada foi separada em pla- cas de 96 poços utilizando o separador com citômetro de fluxo BD FACSAria. o subclone de CHO número 171 foi selecionado para privação em meio isento de soro CD-CHO (Invitrogen Corp.). A linhagem de células CHO final (HCV NS3 17-903-132sc171) foi expandida para a produção do anticorpo quimérico e para o desenvolvimento de um banco de células de pu- blicação para armazenamento em nitrogênio líquido. O anticorpo quimérico foi purificado partindo desta linhagem de células utilizando procedimentos de purificação em Proteína A padronizados como descrito no Exemplo 1. A linhagem de células HCV NS3 CHO 17-903-132sc171 foi depositada na American

Type Culture Collection (ATCC) at 10801 University Boulevard1 Manassas, VA em 2 de maio de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-7573.

EXEMPLO 3: Preparação de um Anticorpo Quimérico de Ser Humano- Camundongo Específico para a Proteína NS4 do Vírus da Hepatite C Preparação de uma linhagem de células de hibridoma

A linhagem de células de hibridoma E99H6C34 anti-NS4 do HCV foi desenvolvida como descrito no Exemplo 1 utilizando o antígeno NS4 recombinante do HCV purificado conhecido como CKS-C100 no lugar do antígeno do núcleo. O antígeno recombinante CKS- C100 corresponde aos aminoácidos 1676-1931 da poliproteína do HCV. O regime de reforço do animal utilizava o Sistema de Adjuvantes de Freund e as amostras de soro foram monito- radas em um EIA para o HCV até que um título anti-HCV fosse identificado. O EIA foi reali- zado como descrito no Exemplo 1 utilizando o antígeno NS4 do HCV CKS-C100 no lugar do antígeno do núcleo. As células de baço de camundongo foram fundidas com o mieloma SP2/0 e cultivadas a 37°C em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementa- do com HAT contendo 20% de soro fetal bovino (GIBCO). Os hibridomas foram testados ΙΟ- Ι 4 dias depois em relação à reatividade anti-HCV em um EIA. Os hibridomas secretando anticorpos monoclonais anti-HCV foram clonados através de técnicas de diluição de células isoladas e os clones subsequentes foram testados em relação à reatividade em um EIA. As culturas positivas foram expandidas em DMEM contendo 10% de FBS e congeladas nova- mente em um agente de criopreservação para um armazenamento em longo prazo em ni- trogênio líquido.

A linhagem de células de baço de camundongo de hibridoma murino E99H6C34 anti-NS4 do HCV (também conhecida como "HCV E99H6C34") foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) at 10801 University Boulevard1 Manassas1 VA em 21 de novembro de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-8021.

Isolamento de mRNA e identificação de seqüências Vh e Vl de camundongo O mRNA foi isolado da linhagem de células de hibridoma E99H6C34 anti-NS4 do

HCV e as seqüências Vh e Vl de camundongo foram obtidas através da RT-PCR como des- crito no Exemplo 1 em relação à linhagem de células de hibridoma 201-603-195 do Núcleo do HCV. Os produtos positivos da PCR foram observados partindo do conjunto de iniciado- res de cadeia pesada (H) de C (VH-C) e partindo dos conjuntos de iniciadores de cadeia leve (L) de B1 C e G (VL-B, VL-C1 VL-G). Todos os produtos positivos da PCR foram purifi- cados em gel, clonados em um vetor PCR TOPO 2.1 TA e transformados em E. coli DH5a. O DNA plasmideal foi extraído das células de E. coli e o inserto de Vh ou de Vl foi confirma- do através da digestão com EcoR I para cada produto da PCR. O clone TA final foi selecio- nado através do alinhamento das seqüências como descrito no Exemplo 1. Os resultados das seqüências confirmaram que o clone VL-G TA número 5 continha a seqüência Vl corre- ta (SEQ ID NO: 24 que codifica um polipeptídeo que é mostrado na SEQ ID NO: 18), en- quanto que o clone VH-C TA número 16 continha a seqüência Vh correta (SEQ ID NO: 23 que codifica um polipeptídeo que é mostrado na SEQ ID NO: 17) (ver também as Figuras 6A-D).

Clonagem das seqüências Vh e Vl nos vetores pBOS

Utilizando o clone VL-G TA número 5 como o molde, um par de iniciadores da PCR foi planejado para clonar a seqüência Vl de camundongo, ou seja, um iniciador da extremi- dade a 5' da Vl do Anticorpo da NS4 do HCVque compreende a seqüência

5'-GCTCGCGATGCGATGTTGTGATGACCCAAAC-3' [SEQ ID NO: 19] e um inicia- dor da extremidade a 3' da Vl do Anticorpo da NS4 do HCV que compreende a seqüência 5'-CACCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGC -3' [SEQ ID NO: 20], O iniciador da extremidade a 5' continha uma seqüência sinal Kappa parcial e um sítio de restrição de Nru I e o iniciador da extremidade a 3' continha um sítio de restrição de BsiW I. Em adição, utilizando o clone VH-C TA número 16 como o molde, um par de inicia- dores foi planejado para clonar a seqüência VH de camundongo, ou seja, um iniciador da extremidade a 5' da Vh do Anticorpo da NS4 do HCVque compreende a seqüência

5'-TACTTCGCGACAGATCCAGTTGGTGCAGTC-3' [SEQ ID NO: 21] e um iniciador da extremidade a 3' da Vh do Anticorpo da NS4 do HCV que compreende a seqüência 5'-TGGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT -3' [SEQ ID NO: 22], Para este par de iniciadores, o iniciador da extremidade a 5' continha uma seqüên-

cia sinal de cadeia pesada parcial e um sítio de restrição de Nru I e o iniciador da extremida- de a 3' continha um sítio de restrição de Sal I. As seqüências Vl e Vh foram independentemente amplificadas através da PCR uti- lizando os pares de iniciadores anteriores e o clone VL-G TA número 5 e o clone VH-C TA número 16, respectivamente, como os moldes. A PCR foi realizada em tampão de amplifica- ção 2 X Pfx utilizando 15 pmoles de cada um dos iniciadores da extremidade a 5' e da ex- tremidade a 3', 1,25 unidade de Pfx DNA polimerase (Invitrogen Corp.) e 100 ng de DNA plasmideal do clone de TA como o molde. A PCR foi realizada utilizando 30 ciclos de 15 segundos a 94°C seguidos por 1 minuto a 68°C.

Os produtos da PCR de Vl e VH foram cortados com enzimas de restrição através da digestão com Nru I /BsiW I e Nru I/ Sal I, respectivamente e então clonados no vetor pBOS-hck (para a seqüência VL) ou no vetor pBOS-hcg (para a seqüência VH), como descri- to no Exemplo 1. Os plasmídeos pBOS E99H6C34-L-T4 (contendo a seqüência VL) e pBOS E99H6C34-H-T2 (contendo a seqüência VH) foram selecionados através do seqüenciamen- to. Uma vez que os respectivos clones de pBOS foram identificados, bancos de células de E coli DH5ct separados contendo o plasmídeo pBOS E99H6C34-L-T4 ou o plasmídeo pBOS E99H6C34-H-T2 foram preparados para preservar os clones de pBOS.

Teste do anticorpo quimérico funcional

O DNA plasmideal de pBOS E99H6C34-L-T4 e de pBOS E99H6C34-H-T2 foi pre- parado e transfectado de forma transitória em células COS 7L como descrito no Exemplo 1. O anticorpo quimérico anti-NS3 do HCV foi preparado partindo das células COS 7L transfec- tadas como descrito no Exemplo 1 e analisado através do EIA para confirmar a reatividade com o antígeno NS4 do HCV (C100 Ag). O EIA foi realizado como descrito anteriormente. Os resultados do EIA demonstraram que o anticorpo quimérico proveniente da expressão transitória era reativo ao antígeno NS4 do HCV.

Clonagem das seqüências Vh e Vl em um vetor de expressão estável Os clones pBOS E99H6C34-L-T4 e pBOS E99H6C34-H-T2 foram utilizados para a

construção de um clone de plasmídeo para a transfecção estável de linhagens de células primeiramente através da clonagem das seqüências no vetor pBV (para a seqüência VH) ou no vetor pJV (para a seqüência VL) e subseqüentemente ligando os fragmentos dos vetores obtidos partindo da digestão com as enzimas de restrição Pac l/Asc I como descrito no E- xemplo 1 para fornecer o pBJ E99H6C34 da NS4 do HCV no plasmídeo pBJ que contém ambas as seqüências Vh e VL. O clone de pBJ foi verificado através da digestão com Srf l/Not I para confirmar que este contém ambas as seqüências. O mapa do plasmídeo para o clone de pBJ final (pBJ E99H6C34 da NS4 do HCV) para o anticorpo quimérico para a NS4 do HCV é mostrado na Figura 5. As seqüências gênicas de Vh e Vl são mostradas nas Figu- ras 6A-B (SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, respectivamente). Foram produzidos bancos de células E coli DH5a contendo o clone E99H6C34 da NS4 do HCV em pBJ.

Estabelecimento de uma linhagem de células CHO estável e expressão do anticor- po quimérico para o HCV

O plasmídeo pBJ E99H6C34 da NS4 do HCV foi transfectado através da transfec- ção mediada por fosfato de cálcio em linhagens de células de Ovário de Hamster Chinês deficientes em relação à DHFR como descrito no Exemplo 1. A cultura e a clonagem de cé- lulas isoladas foram realizadas como descrito no Exemplo 1. Quando os clones de CHO tinham crescido até mais de 50% de confluência, o sobrenadante foi testado em um EIA específico ao antígeno para determinar o desempenho dos clones de CHO. O EIA foi reali- zado como descrito anteriormente. Os 16 clones de CHO que exibiam o sinal mais alto fo- ram expandidos e analisados novamente através de um EIA específico ao antígeno. Seis clones de CHO foram selecionados para a privação em meio de cultura de tecido isento de soro CD CHO. O clone #203 de CHO da NS4 do HCV foi expandido para produzir anticorpo quimérico purificado e para o desenvolvimento de um banco de células de publicação para armazenamento em nitrogênio líquido. O anticorpo quimérico foi purificado partindo desta linhagem de células utilizando procedimentos de purificação em Proteína A padronizados como descrito no Exemplo 1.

A linhagem de células HCV NS4 CHO E99H6C34sc203 foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) at 10801 University Boulevard, Manassas1 VA em 2 de maio de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-7569.

EXEMPLO 4: Preparação de um Anticorpo Quimérico de Ser Humano- Camundongo Específico para a Proteína NS5 do Vírus da Hepatite C Preparação de uma linhagem de células de hibridoma

A linhagem de células de hibridoma 48-311-387 anti-NS5 do HCV foi desenvolvida como descrito no Exemplo 1 utilizando o antígeno recombinante do HCV conhecido como CKS EF. O antígeno recombinante CKS-EF corresponde aos aminoácidos 1932-2191+2188- 2481 da poliproteína do HCV. Fêmeas de camundongos BALB/c foram imunizadas uma vez com 200 μg de antígeno recombinante de HCV purificado (CKS-EF) utilizando o Sistema de Adjuvantes de Freund. Três camundongo receberam uma administração de reforço pré- fusão 3 dias antes da colheta dos baços.

A linhagem de células de baço de camundongo de hibridoma murino 48-311-387 anti-NS5 do HCV (também conhecida como "HCV 48-311-387") foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) at 10801 University Boulevard, Manassas, VA em 21 de novembro de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-8022.

Isolamento de mRNA e identificação of seqüências Vh e Vl de camundongo O mRNA foi isolado partindo de uma linhagem de células de hibridoma 48-311-387 anti-NS5 do HCV e as seqüências Vh e Vl de camundongo foram obtidas através da RT- PCR como descrito no Exemplo 1 em relação à linhagem de células de hibridoma 201-603- 195 do Núcleo do HCV. Os produtos positivos da PCR foram observados partindo do con- junto de iniciadores de cadeia pesada (H) de C (VH-C) e partindo dos conjuntos de iniciado- res de cadeia leve (L) de B, C e G (VL-B, VL-C1 VL-G). Todos os produtos positivos da PCR foram purificados em gel, clonados em um vetor PCR TOPO 2.1 TA e transformados em E. coli DH5a. O DNA plasmideal foi extraído das células de E coli e o inserto de Vh ou de Vl foi confirmado através da digestão com EcoR I para cada produto da PCR. Os clones TA finais foram selecionados através do alinhamento das seqüências como descrito no Exemplo 1. Os resultados das seqüências confirmaram que o clone VL-G TA número 8 continha a se- qüência Vl correta (SEQ ID NO: 32 que codifica um polipeptídeo que é mostrado na SEQ ID NO: 26), enquanto que o clone VH-C TA número 13 continha a seqüência Vh correta (SEQ ID NO: 31 que codifica um polipeptídeo que é mostrado na SEQ ID NO: 25) (ver também as Figuras 8A-D).

Clonagem das seqüências VH e VL nos vetores pBOS

Utilizando o clone VL-G TA número 8 como o molde, um par de iniciadores da PCR foi planejado para clonar a seqüência Vl de camundongo, ou seja, um iniciador da extremi- dade a 5' da Vl do Anticorpo da NS5 do HCVque compreende a seqüência

5'-GCTCGCGATGCGACATTGTGATGTCACAGT -3' [SEQ ID NO: 27] e um inicia- dor da extremidade a 3' da Vl do Anticorpo da NS5 do HCV que compreende a seqüência 5'-CACCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGT -3' [SEQ ID NO: 28], O iniciador da extremidade a 5' continha uma seqüência sinal Kappa parcial e um sítio de restrição de Nru I e o iniciador da extremidade a 3' continha um sítio de restrição de BsiW I. Em adição, utilizando o clone VH-C TA número 13 como o molde, um par de inicia- dores foi planejado para clonar a seqüência VH de camundongo, ou seja, um iniciador da extremidade a 5' da Vh do Anticorpo da NS5 do HCVque compreende a seqüência

5'-TACTTCGCGAGAGGTTCAGCTGCAGCAGT -3' [SEQ ID NO: 29] e um iniciador da extremidade a 3' da Vh do Anticorpo da NS5 do HCV que compreende a seqüência 5-TGGTCGACGCTGCAGAGACAGTGACCAG -3' [SEQ ID NO: 30], Para este par de iniciadores, o iniciador da extremidade a 5' continha uma seqüên- cia sinal de cadeia pesada parcial e um sítio de restrição de Nru I e o iniciador da extremida- de a 3' continha um sítio de restrição de Sal I. As seqüências Vl e Vh foram independentemente amplificadas através da PCR uti-

lizando os pares de iniciadores anteriores e o clone VL-G TA número 5 e o clone VH-C TA número 16, respectivamente, como os moldes. A PCR foi realizada em tampão de amplifica- ção 2 X Pfx utilizando 15 pmoles de cada um dos iniciadores da extremidade a 5' e da ex- tremidade a 3', 1,25 unidade de Pfx DNA polimerase (Invitrogen Corp.) e 100 ng de DNA plasmideal do clone de TA como molde. A PCR compreendia 30 ciclos de 15 segundos a 94°C seguidos por 1 minuto a 68°C.

Os produtos da PCR de Vl e Vh foram cortados com enzimas de restrição através da digestão com Nru I /BsiW I e Nru I/ Sal I1 respectivamente e então clonados no vetor pBOS-hck (para a seqüência VL) ou no vetor pBOS-hcg (para a seqüência VH), como descri- to no Exemplo 1. Os plasmídeos pBOS 48-311-387-L-T4 (contendo a seqüência VL) e pBOS 48-311-387-H-T2 (contendo a seqüência VH) foram selecionados através do seqüenciamen- to. Uma vez que os respectivos clones de pBOS foram identificados, bancos de células de E. coli separados contendo o plasmídeo pBOS 48-311-387-L-T4 ou o plasmídeo pBOS 48- 311-387-H-T2 foram produzidos para preservar os clones de pBOS. Teste do anticorpo quimérico funcional

O DNA plasmideal do pBOS 48-311-387-L-T4 e do pBOS 48-311-387-H-T2 foi pre- parado e transfectado de forma transitória em células COS 7L como descrito no Exemplo 1. O anticorpo quimérico anti-NS5 do HCV foi preparado partindo das células COS 7L transfec- tadas como descrito no Exemplo 1 e analisado através do EIA para confirmar a reatividade com o antígeno NS5 do HCV (SOD-NS5; Chiron Corporation). O EIA foi realizado como descrito no Exemplo 1 utilizando o antígeno NS5 do HCV CKS EF no lugar do antígeno do núcleo. Os resultados do EIA demonstraram que o anticorpo quimérico proveniente da ex- pressão transitória era reativo ao antígeno NS5 do HCV.

Clonagem das seqüências Vh e Vl em um vetor de expressão estável Os clones pBOS 48-311-387-L-T4 e pBOS 48-311-387-H-T2 foram utilizados para a construção de um clone de plasmídeo para a transfecção estável de linhagens de células primeiramente através da clonagem das seqüências no vetor pBV (para a seqüência VH) ou no vetor pJV (para a seqüência VL) e subseqüentemente ligando os fragmentos dos vetores obtidos partindo da digestão com as enzimas de restrição Pac l/Asc I como descrito no E- xemplo 1 para fornecer o pBJ 48-311-387 da NS5 do HCV no plasmídeo pBJ que contém ambas as seqüências Vh e VL. O clone de pBJ foi verificado através da digestão com Srf l/Not I para confirmar que este contém ambas as seqüências. O mapa do plasmídeo para o clone de pBJ final (pBJ 48-311-387 da NS5 do HCV) para o anticorpo quimérico para a NS5 do HCV é mostrado na Figura 7. As seqüências gênicas de Vh e Vl são mostradas nas Figu- ras 8A-B (SEQ ID NO: 31 e 32, respectivamente). Foram feitos bancos de células de E. coli DH5a contendo o clone de pBJ 48-311-387 da NS5 do HCV. Estabelecimento de uma linhagem de células CHO estável e expressão do anticor-

po quimérico para o HCV

O plasmídeo pBJ 48-311-387 da NS5 do HCVfoi transfectado através da transfec- ção mediada por fosfato de cálcio em linhagens de células de Ovário de Hamster Chinês deficientes em relação à DHFR como descrito no Exemplo 1. A cultura e a clonagem de cé- lulas isoladas foram realizadas como descrito no Exemplo 1. Quando os clones de CHO tinham crescido até mais de 50% de confluência, o sobrenadante foi testado em um EIA específico ao antígeno para determinar o desempenho dos clones de CHO. O EIA foi reali- zado como descrito anteriormente. Os 6 clones de CHO que exibiam o sinal mais alto foram expandidos e analisados novamente através de um EIA específico ao antígeno. 4 clones de CHO foram selecionados para a clonagem de célula isolada utilizando o separador de fluxo BD FACSAria. Quando o crescimento confluente era evidente, as culturas foram verificadas em um EIA que resultou na seleção de 5 clones que sofreriam privação em um meio isento de soro, incluindo o clone denominado CHO 48-311-271. Uma subclonagem final resultou na seleção do clone 48-311-271-455 de CHO da NS5 do HCV com a finalidade de obtenção de banco de células. A linhagem de células foi expandida para a produção de anticorpos quiméricos e para o desenvolvimento de um banco de células de publicação para armaze- namento em nitrogênio líquido. O anticorpo quimérico foi purificado partindo desta linhagem de células utilizando procedimentos de purificação em Proteína A padronizados como des- crito no Exemplo 1.

A linhagem de células HCV NS5 CHO 48-311-271-455 foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) at 10801 University Boulevard1 Manassas, VA em 2 de maio de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-7572.

EXEMPLO 5: Mapeamento de Epítopos do Anticorpo Monoclonal Quimérico para o Núcleo do HCV

O sítio de ligação do anticorpo monoclonal de camundongo anti-núcleo do HCV descrito no Exemplo 1 foi mapeado na região da proteína do núcleo do HCV que compreen- de os aminoácidos 32-36 (GGVYL; SEQ ID NO: 33) utilizando peptídeos sintéticos. Sucin- tamente, peptídeos curtos sintetizados foram utilizados para cobrir os poços de uma placa para EIA e foram bloqueados com 2% de BSA/tampão PBS. O anticorpo monoclonal de ca- mundongo anti-núcleo do HCV foi adicionado nas placas para EIA e incubados durante pelo menos 1 hora. As placas para EIA foram então lavadas e incubadas com anticorpo marcado com HRP anticamundongo de cabra ("GAM") durante mais 1 hora. As placas foram lavadas e reveladas utilizando 0-Fenilenodiamina-2HCI (OPD) e lidas em uma densidade óptica de 492 nm.

Uma combinação de varredura de alanina e tecnologia de exibição de leveduras foi subseqüentemente utilizada para o mapeamento fino dos epítopos. Sucintamente, foi cons- truída uma biblioteca de mutantes de alanina utilizando um conjunto de oligonucleotídeos de DNA sintéticos que codificavam peptídeos cada um representando a região 27-39 (GGQIVGGVYLLPR; SEQ ID NO: 34) do antígeno do núcleo e em que cada aminoácido individual nesta região foi seqüencialmente substituído por alanina. Um fragmento de 27-39 do núcleo do tipo selvagem foi utilizado como controle. Os oligonucleotídeos de DNA foram clonados no vetor de exibição de leveduras (pYD41; baseado no vetor pYD1 disponível na Invitrogen Corp.) nos sítios das enzimas de restrição Nco I e Not I. Cada mutante de alanina do núcleo do HCV foi então transformado em E. coli e o DNA plasmideal foi extraído e se- quenciado. A seleção final dos clones se baseava no sequenciamento. Os clones seleciona- dos foram transformados em células de Saccharomyces cerevesiae EBY100 (Invitrogen Corp.). Os clones de levedura individuais foram cultivados e induzidos a expressarem o pep- tídeo do núcleo do HCV. As células de levedura induzidas foram incubadas com o anticorpo quimérico para o núcleo do HCV e um anticorpo secundário (Alexa Fluor 633 IgG anti huma- no de cabra; Invitrogen Corp.) e analisadas por Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS Calibur) para determinar quais mutantes de alanina tinham perdido a atividade de ligação ao anticorpo. Uma perda da atividade de ligação ao anticorpo indicava que o mutante tinha in- cluído uma alanina em uma posição que fazia parte do epítopo para o anticorpo quimérico. Os dados mostraram que as posições no antígeno do núcleo do HCV 29 (Gln), 31 (Vai), 32 (Gly), 33 (GIy)1 36 (Leu) (como mostrado na Figura 9A) são sítios de ligação para o anticorpo quimérico para o núcleo do HCV.

Estes resultados confirmam que esta região apresentada na seqüência QIVGGVYL (SEQ ID NO: 100) compreende um epítopo para a ligação ao anticorpo quimérico para o núcleo do HCV. Os resultados confirmam que para a ligação ao anticorpo quimérico para o núcleo do HCV, estes resíduos antigênicos têm que permanecer invariáveis enquanto que outros podem ser alterados, como na seqüência QXVGGXXL, em que X é qualquer aminoá- cido (SEQ ID NO: 101) ou em que X é Ala ou Gly (SEQ ID NO: 102).

EXEMPLO 6: Mapeamento de Epítopos do Anticorpo Monoclonal Quimérico para a NS3 do HCV

O anticorpo monoclonal quimérico de camundongo para NS3 do HCV produzido pe- la linhagem de células de hibridoma 17-903-127 anti-NS3 do HCV foi produzido contra a região do antígeno NS3 do HCV que abrange os aminoácidos 1192-1457 (265aa). Com a finalidade de mapear o epítopo ao qual o anticorpo quimérico para NS3 se liga dentro desta região, a região de 265aa foi quebrada em doze fragmentos sobrepostos através da cons- trução de doze pares de oligonucleotídeos de DNA. Especificamente, estes oligonucleotí- deos representavam os fragmentos a seguir: 1190-1216; 1212-1239; 1235-1257; 1251-1272; 1273-1301; 1297-1323; 1321-1347; 1341-1367; 1364-1387; 1388-1414; 1411-1438 e 1434- 1459. Os pares de oligonucleotídeos de DNA foram anelados e clonados no vetor de exibi- ção de levedura (pYD41) nos sítios das enzimas de restrição Nco I e Not I. Cada um dos vetores de NS3 do HCV foi transformado em E. coli e o DNA plasmideal foi extraído e se- quenciado. A seleção final dos clones se baseava no sequenciamento. Os clones seleciona- dos foram transformados em células de Saccharomyces cerevesiae EBY100. Os clones de levedura individuais foram cultivados e induzidos a expressarem o peptídeo NS3 do HCV. As células de levedura induzidas foram incubadas com o anticorpo quimérico para a NS3 do HCV e o anticorpo secundário (Alexa Fluor 633 IgG anti humano de cabra) e analisadas por Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS Calibur) para determinar qual fragmento demons- trava ligação positiva ao anticorpo quimérico, indicando assim a localização do epítopo. Os dados mostraram que apenas o fragmento 1190-1216 da NS3 do HCV (AKAVDFVPVESLETTMRSPVFTDNSSP; SEQ ID NO: 35) demonstrava ligação positiva.

A varredura de alanina e a tecnologia de exibição de leveduras foram então utiliza- das para o mapeamento fino dos epítopos. Uma biblioteca de mutantes de alanina represen- tando a região 1190-1216 foi construída utilizando um conjunto de oligonucleotídeos de DNA sintéticos que são descritos de forma geral no Exemplo 5 para o antígeno do núcleo. O fragmento 1190-1216 da NS3 do tipo selvagem foi utilizado como controle. A exibição de leveduras foi realizada como descrito no Exemplo 5 e as células de levedura induzidas fo- ram incubadas com o anticorpo quimérico para a NS3 do HCV e um anticorpo secundário (Alexa Fluor 633 IgG anti humano de cabra) e analisadas por Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS Calibur) para determinar quais mutantes de alanina tinham perdido a atividade de ligação ao anticorpo. Os dados mostraram que as posições do antígeno NS3 do HCV 1194 (Asp)1 1195 (Phe), 1196 (Vai), 1197 (Pro), 1199 (GIu)l 1201 (Leu), 1202 (GIu) e 1205 (Met) (como mostrado na Figura 9B) são sítios de ligação para o anticorpo quimérico para a NS3 do H CV.

Estes resultados confirmam que esta região apresentada na seqüência DFVPVESLETTM (SEQ ID NO: 103) compreende um epítopo para ligação ao anticorpo quimérico para a NS3 do HCV. Os resultados confirmam que para a ligação ao anticorpo quimérico para a NS3 do HCV, estes resíduos antigênicos têm que permanecer invariáveis enquanto outros podem ser alterados, como na seqüência DFVPXEXLEXXM, em que X é qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 104) ou em que X é Ala ou Gly (SEQ ID NO: 105).

EXEMPLO 7: Mapeamento de Epítopos do Anticorpo Monoclonal Quimérico para a NS4 do HCV

O anticorpo monoclonal quimérico para a NS4 do HCV produzido pela linhagem de

células HCV NS4 CHO E99H6C34sc203 foi mapeado na região do antígeno NS4 do HCV representada pelos aminoácidos 1692-1713 (PAIIPDREVLYREFDEMEECSQ; SEQ ID NO: 36) utilizando oligonucleotídeos de DNA sintéticos e a tecnologia de exibição de leveduras padronizada, como descrito de forma geral nos Exemplos 5 e 6. A varredura de alanina e a tecnologia de exibição de leveduras foram então utilizadas para o mapeamento fino dos epí- topos. Uma biblioteca de mutantes de alanina representando a região 1692-1713 foi constru- ída utilizando um conjunto de oligonucleotídeos de DNA sintéticos que é descrita de forma geral no Exemplo 5 para o antígeno do núcleo. O fragmento 1692-1713 da NS4 do tipo sel- vagem foi utilizado como controle. A exibição de leveduras foi realizada como descrito no Exemplo 5 e as células de levedura induzidas foram incubadas com o anticorpo quimérico para a NS4 do HCV e um anticorpo secundário (Alexa Fluor 633 IgG anti humano de cabra) e analisadas por Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS Calibur) para determinar quais mutantes de alanina tinham perdido a atividade de ligação ao anticorpo. Os dados mostra- ram que as posições do antígeno NS4 do HCV 1701 (Leu), 1702 (Tyr)1 1704 (GIy)1 1705 (Phe)1 1706 (Asp) (como mostrado na Figura 9C) são sítios de ligação para o anticorpo qui- mérico para a NS4 do HCV.

Estes resultados confirmam que esta região apresentada na seqüência LYREFD

(SEQ ID NO: 106) compreende um epítopo para ligação ao anticorpo quimérico para a NS4 do HCV. Os resultados confirmam que para a ligação ao anticorpo quimérico para a NS4 do HCV1 estes resíduos antigênicos têm que permanecer invariáveis enquanto outros podem ser alterados, como na seqüência LYXEFD1 em que X é qualquer aminoácido (SEQ ID NO: 107) ou em que X é Ala ou Gly (SEQ ID NO: 108).

EXEMPLO 8: Mapeamento de Epítopos do Anticorpo Monoclonal Quimérico para a NS5 do HCV

O anticorpo monoclonal quimérico para a NS5 do HCV de camundongo produzido pela linhagem de células de hibridoma 48-311-387 anti-NS5 do HCV foi produzido contra a região do antígeno NS5 do HCV que abrange a região dos aminoácidos 2054-2481 (428aa). Com a finalidade de mapear o epítopo ao qual o anticorpo quimérico para a NS5 se liga den- tro desta região, a região de 428aa foi quebrada em dezoito fragmentos sobrepostos através da construção de dezoito pares de oligonucleotídeos de DNA. Especificamente, estes oligo- nucleotídeos representavam os fragmentos a seguir: 2048-2076; 2075-2101; 2098-2124; 2120-2146; 2144-2177; 2169-2196; 2193-2221; 2220-2247; 2245-2272; 2271-2296; 2292- 2318; 2313-2339; 2336-2363; 2360-2386; 2382-2408; 2408-2436; 2435-2462 e 2457-2486. O mapeamento de epítopos utilizando estes dezoito pares de oligonucleotídeos e o anticor- po quimérico para a NS5 do HCV foi realizado como descrito no Exemplo 6. Os dados mos- traram que somente o fragmento 2382-2408 da NS5 do HCV (2382- AESYSSMPPLEGEPGDPDLSDGSWSTV-2408; SEQ ID NO: 37) demonstrava ligação posi- tiva.

A varredura de alanina e a tecnologia de exibição de leveduras foram então utiliza- das para o mapeamento fino dos epítopos. Uma biblioteca de mutantes de alanina represen- tando a região 2382-2408 foi construída utilizando um conjunto de oligonucleotídeos de DNA sintéticos que é descrita de forma geral no Exemplo 5 para o antígeno do núcleo. O frag- mento 2382-2408 da NS5 do tipo selvagem foi utilizado como controle. A exibição de leve- duras foi realizada como descrito no Exemplo 5 e as células de levedura induzidas foram incubadas com o anticorpo quimérico para a NS5 do HCV e um anticorpo secundário (Alexa Fluor 633 IgG anti humano de cabra) e analisadas por Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS Calibur) para determinar quais mutantes de alanina tinham perdido a atividade de ligação ao anticorpo. Os dados mostraram que as posições do antígeno NS5 do HCV 2390 (Pro), 2391 (Leu), 2392 (Glu), 2393 (GIy)1 2394 (GIu)1 2395 (Pro), 2397 (Asp)1 2398 (Pro) e 2400 (Leu) (como mostrado na Figura 9D) são sítios de ligação para o anticorpo quimérico para a NS5 do HCV.

Estes resultados confirmam que esta região apresentada na seqüência PLEGEPGDPDL (SEQ ID NO: 109) compreende um epítopo para ligação ao anticorpo qui- mérico para a NS5 do HCV. Os resultados confirmam que para a ligação ao anticorpo qui- mérico para a NS5 do HCV, estes resíduos antigênicos têm que permanecer invariáveis en- quanto outros podem ser alterados, como na seqüência PLEGEPXDPXL, em que X é qual- quer aminoácido (SEQ ID NO: 110) ou em que X é Ala ou Gly (SEQ ID NO: 111).

EXEMPLO 9: Determinação da Constante de Dissociação em Equilíbrio (K0) para o Anticorpo Monoclonal Quimérico para o Núcleo do HCV

As células de levedura contendo o fragmento do núcleo 27-39 do HCV do tipo sel- vagem do Exemplo 5 foram cultivadas e induzidas para expressarem o epítopo na superfície das células. As células de levedura induzidas foram incubadas com concentrações variáveis do anticorpo quimérico para o núcleo do HCV (100 nM, 33 nM, 11 nM, 3,7 nM, 1,2 nM, 0,4 nM, 0,14 nM e zero nM). O anticorpo quimérico para o núcleo do HCV ligado foi então detec- tado com IgG anti humano de cabra conjugado com o fluoróforo Alexa 633 utilizando análise citométrica de fluxo padronizada. A intensidade de fluorescência média (MFI) em cada con- centração do anticorpo quimérico para o núcleo do HCV foi determinada após a excitação do fluoróforo utilizando um citômetro de fluxo equipado com laseres apropriados e aparatos ópticos de detecção.

A constante de dissociação em equilíbrio aparente (K0) foi calculada através da re- presentação gráfica de MFI vs. [Ag] e da determinação de uma curva de melhor ajuste, em que é sabido que a curva é definida pela fórmula: Fbkg + Fsat * [Antígeno]/(KD + [Antígeno]), em que Fbkg: sinal de fundo e Fsat: sinal máximo, permitindo assim a determinação da KD. Os resultados indicaram que a Kd para o anticorpo quimérico para o núcleo do HCV é de aproximadamente 0,7 nM.

EXEMPLO 10: Determinação da Constante de Dissociação em Equilíbrio (K0) para o Anticorpo Monoclonal Quimérico para a NS3 do HCV

A constante de dissociação em equilíbrio (K0) para o anticorpo quimérico para a NS3 do HCV foi determinada como descrito no Exemplo 9 utilizando células de levedura contendo o fragmento da NS3 1190-1216 do HCV do tipo selvagem (do Exemplo 6) e con- centrações variáveis do anticorpo quimérico para a NS3 do HCV (33 nM, 11 nM, 3,7 nM, 1,2 nM, 0,4 nM, 0,14 nM e zero nM). Os resultados indicaram que a Kd para o anticorpo quimé- rico para a NS3 do HCV é de aproximadamente 68 nM. EXEMPLO 11: Determinação da Constante de Dissociação em Equilíbrio (Kd) para

o Anticorpo Monoclonal Quimérico para a NS4 do HCV

A constante de dissociação em equilíbrio (K0) para o anticorpo quimérico para a NS4 do HCV foi determinada como descrito no Exemplo 9 utilizando células de levedura contendo o fragmento da NS4 the wildtype HCV 1692-1713 NS4 fragmento (from Exemplo 7) e concentrações variáveis do anticorpo quimérico para a NS4 do HCV (100 nM, 33 nM, 11 nM, 3.7 nM, 1,2 nM, 0,4 nM, 0,14 nM e zero nM). Os resultados indicaram que a K0 para o anticorpo quimérico para a NS4 do HCV é de aproximadamente 0,5 nM.

EXEMPLO 12: Determinação da constante de dissociação em equilíbrio (K0) for an- ticorpo monoclonal quimérico para a NS5 do HCV

A constante de dissociação em equilíbrio (K0) para o anticorpo quimérico para a NS5 do HCV foi determinada como descrito no Exemplo 9 utilizando células de levedura contendo o fragmento da NS5 2382-2408 do HCV do tipo selvagem (do Exemplo 8) e con- centração variável do anticorpo quimérico para a NS5 do HCV (100 nM, 33 nM, 11 nM, 3,7 nM, 1,2 nM, 0,4 nM, 0,14 nM e zero nM). Os resultados indicaram que a K0 para o anticorpo quimérico para a NS5 do HCV é de aproximadamente 8,8 nM.

EXEMPLO 13: Caracterização de Anticorpos Quiméricos para HCV e Linhagens CHO que Secretam os Mesmos

As linhagens de células HCV núcleo CHO 201-603-486-333, HCV NS3 CHO 17- 903-132sc171, HCV NS4 CHO E99H6C34sc203 e clone 48-311-271-455 de CHO da NS5 do HCV preparados nos Exemplos 1-4 foram analisadas em relação à capacidade de produ- ção, incluindo a viabilidade celular, a estabilidade da linhagem de células através da produ- ção de anticorpos estáveis e a ausência de agentes adventícios através do teste de mico- plasma. As linhagens de células também foram testadas em relação à característica mono- clonal. Os anticorpos quiméricos foram caracterizados por focalização isoelétrica (IEF), SDS-PAGE e cromatografia por permeação em gel (GPC).

Os resultados indicaram que todas as linhagens de células eram >90% clonais e i- sentas de agentes adventícios. A análise da produção de anticorpos quiméricos ao longo de um período de tempo > 3 semanas indicou que todas as linhagens de células possuem uma produção de anticorpos quiméricos estável ou crescente em cultura. A produção média de anticorpos quiméricos em uma escala R & D terminal (isto é, as células viáveis estavam en- tre 20-10%) que foi avaliada através da análise de HPLC de culturas de 3 semanas de idade é mostrada na Figura 10.

A eletroforese em gel de SDS-PAGE foi realizada em todos os anticorpos quiméri- cos para HCV sob condição redutora. Aproximadamente 3 pg de cada anticorpo quimérico foram misturados com o tampão de carga com agentes redutores, fervidos durante 10 minu- tos, então carregados em um gel de SDS-PAGE a 12% e corridos a 80 Volts durante 1,5 hora. A cadeia pesada deveria migrar entre 66,2 kD e 45 kD e a cadeia leve deveria migrar entre 31 kD e 21,5 kD. Todos os anticorpos quiméricos para HCV exibiam duas bandas que podiam ser distinguidas por SDS-PAGE que correspondiam às cadeias pesadas e leves do anticorpo.

Com a finalidade de caracterizar adicionalmente os anticorpos quiméricos para HCV1 a eletroforese em gel com focalização isoelétrica (IEF) foi realizada em todos os qua- tro anticorpos quiméricos para HCV. A IEF é uma técnica que separa proteínas de acordo com sua carga líquida. Em um certo pH, a carga líquida de uma proteína dependerá de se número relativo de cargas positivas e negativas. O pH no qual as cargas positivas em uma proteína se igualam com as cargas negativas define o ponto isoelétrico (pl) de tal proteína. Os perfis de IEF dos quatro anticorpos quiméricos para HCV indicaram que estes possuem valores de Pl variando de 7,8 até 9,0. Especificamente, o pl do anticorpo quimérico para o núcleo do HCV era de aproximadamente 9,0, o pl do anticorpo para a NS3 do HCV estava entre 8,5 e 9,0, o pl do anticorpo quimérico para a NS4 do HCV estava entre 7,8 e 8,7 e o pl do anticorpo quimérico para a NS5 do HCV estava entre 8,0 e 8,9.

Os anticorpos quiméricos para o núcleo do HCV também foram analisados através da cromatografia líquida de alto desempenho com permeação em gel (GPC-HPLC) em um sistema Waters system com uma coluna Tosohaas 3000. A GPC-HPLC é uma técnica pa- dronizada utilizada para determinar a pureza de uma proteína ou de um polipeptídeo assim como seu estado de agregação através da separação cromatográfica com base no tamanho e no formato. Com base em três injeções de 10 pg de cada um de albumina, anticorpo qui- mérico e padrão de filtração de gel, a pureza média final para cada lote de anticorpo quimé- rico foi calculada. A pureza do lote de HCV NS3 CHO 17-903-132sc171 era de 97%. A pure- za do lote de HCV NS4 CHO E99H6C34sc203 era de 58%. A pureza do lote de HCV NS5 CHO 48-311-271-455 era de 90% e a pureza do lote de HCV núcleo CHO 201-603-486-333 era de 88%.

EXEMPLO 14: Reatividade ao Antígeno dos Anticorpos Quiméricos para HCV em Ensaios de Detecção de HCV Padronizados

Os quatro anticorpos quiméricos (núcleo, NS3, NS4 e NS5 do HCV) preparados como descrito nos Exemplos 1-4 foram testados utilizando os ensaios de verificação de san- gue de HCV da Abbott nas plataformas Prism, AxSYM, ARCHITECT e EIA (Bead). O ensaio com a plataforma Prism emprega os antígenos NS3, NS4, NS5 e do núcleo para a detecção de anticorpos, enquanto que os ensaios com as plataformas AxSYM, ARCHITECT e EIA (Bead) empregam os antígenos NS3, NS4 e do núcleo para a detecção de anticorpos. Para todas as plataformas, os antígenos são atualmente qualificados utilizando amostras de plas- ma/soro reativas ao epítopo obtidas de doadores humanos.

O Abbott HCV EIA é um imunoensaio enzimático in vitro para a detecção qualitativa de anticorpo para a Hepatite C (anti-HCV) em soro, plasma ou soro cadavérico humano. A amostra humana é diluída em um diluente de espécimes e incubada com uma esfera de poliestireno revestida com antígenos recombinantes do HCV. Se o anticorpo estiver presen- te na amostra, as imunoglobulinas na amostra do paciente se ligam aos antígenos revesti- dos sobre a esfera. Após a remoção dos materiais não ligados através da lavagem da esfe- ra, as imunoglobulinas humanas que permanecem ligadas na esfera são detectadas através da incubação do complexo esfera-antígeno-anticorpo com uma solução contendo anticorpos de cabra marcados com peroxidase de raiz forte direcionados contra imunoglobulinas hu- manas utilizando 0-fenilenodiamina-2HCI (OPD) e da leitura da intensidade da coloração desenvolvida em 492 nm. É calculada a Amostra/limite (S/Co) final. O limite é calculado co- mo a seguir:

Valor de limite = NCx + (0,25)PCx, em que NCx (Absorbância média Negativa) = Absorbância total/número de repetições e PCx (Cálculo da média positiva) = Absorbância total/número de repetições.

As amostras com valores de absorbância maiores que ou iguais a 0,005, mas me- nores que o limite são consideradas negativas. As amostras com valores de absorbância maiores que ou iguais ao valor de limite são consideradas inicialmente reativas. Após este procedimento utilizando o kit de ensaio Abbott HCV EIA 2.0, os anticorpos quiméricos anti- núcleo, NS3 e NS4 do HCV eram todos reativos como mostrado na Tabela 3. O anticorpo quimérico anti-NS5 do HCV é negativo uma vez que nenhum antígeno recombinante NS5 do HCV foi incluído no ensaio.

O ensaio Abbott AXSYM Anti-HCV ensaio é um ensaio imunológico de micropartí- cuias (MEIA) para a detecção qualitativa de IgG anti-HCV para proteínas recombinantes do HCV no soro ou no plasma humano. O sistema AxSYM utilizado para realizar os ensaios calcula a taxa de limite partindo da taxa média de duas repetições do índice Calibrador e armazena os resultados. A taxa de limite (CO) é determinada pela multiplicação da taxa mé- dia do índice Calibrador do AxSYM anti-HCV por 0,12. As amostras são consideradas reativas se os valores de S/CO forem maiores que

ou iguais a 1,21. As amostras com valores de S/CO entre 0,8 e 1,20 são consideradas como sendo amostras da "zona cinzenta" e as amostras com valores de S/CO menores que 0,79 são consideradas como não reativas. Seguindo o protocolo descrito nas instruções da em- balagem do ensaio Abbott HCV AxSYM Anti-HCV, os anticorpos quiméricos anti-núcleo do HCV, NS3 e NS4 eram reativos como mostrado na Tabela 3. Novamente, o anticorpo quimé- rico anti-NS5 do HCV era negativo uma vez que o antígeno recombinante NS5 do HCV não foi incluído no ensaio.

O ensaio Abbott ARCHITECT Anti-HCV é um ensaio imunológico de micropartícu- Ias quimioluminescente (CMIA) para a detecção qualitativa de anticorpos anti-HCV no soro e no plasma humanos. O ensaio ARCHITECT Anti-HCV utiliza antígenos recombinantes do HCV revestidos sobre uma superfície de micropartícula para ligar os anticorpos em uma amostra. Na reação final do ARCHITECT Anti-HCV, os conjugados acridinilados ligados são utilizados para gerar um sinal quimioluminescente. O ARCHITECT /' System utilizado para realizar os ensaios calcula o RLU limite partindo do sinal quimioluminescente médio de três repetições do Anti-HCV Calibrator 1 e armazena o resultado. O RLU limite é determinado através da multiplicação do RLU médio do Anti-HCV Calibrator 1 por 0,074. O ARCHITECT /' System então calcula um resultado com base na proporção de RLU da amostra em relação ao RLU limite (S/CO) para cada espécime e para o controle.

As amostras são consideradas reativas se os valores de S/CO forem maiores que ou iguais a 1,00. As amostras com valores de S/CO entre 0,8 e 0,99 são consideradas como sendo amostras da "zona cinzenta" e as amostras com valores de S/CO menores que 0,79 são consideradas não reativas. Seguindo o protocolo fornecido nas instruções da embala- gem do ensaio Abbott ARCHITECT Anti-HCV, os anticorpos quiméricos anti-núcleo do HCV, NS3 e NS4 são reativos como mostrado na Tabela 3. O anticorpo quimérico anti-NS5 do HCV era negativo uma vez que o antígeno recombinante NS5 do HCV não foi incluído no ensaio.

O ensaio Abbott Prism HCV é um ensaio imunológico de micropartículas quimiolu-

minescente para a detecção qualitativa de anticorpos anti-HCV no soro e no plasma huma- nos. O valor de limite é calculado como a seguir:

Valor de limite = Média das contagens líquidas do calibrador negativo + 0,55 χ Mé- dia das contagens líquidas do calibrador positivo. As amostras são consideradas inicialmente reativas se os valores de S/CO forem

maiores que ou iguais ao valor de limite. Seguindo o protocolo fornecido nas instruções da embalagem do ensaio Abbott Prism HCV, os anticorpos quiméricos anti-núcleo do HCV, NS3, NS4 e NS5 eram todos reativos como mostrado na Tabela 3.

Tabela 3: Reatividade do Anticorpo Quimérico para Núcleo, NS3, NS4 e NS5 em Vários Ensaios Abbott HCVt

Amostra Antígeno Reativi- dade Concentra- ção (mg/mL) Valores de Amostra/Limite (S/CO) EIA (Bead) AxSYM Prism ARCHITECT Controle negativo 0,2 0,21 0,12 0,05 Controle positivo11 3.21 4,99 1,60 3.63 NS4:1 NS4 1,41 12,72 31,11 2,58 8,59 NS4:2 1,90 15,03 26,69 2,77 5,88 NS4:3 2,20 14,30 28,10 2,43 5,41 Amostra Antígeno Concentra¬ Valores de Amostra/Limite (S/CO) EIA (Bead) AxSYM Prism ARCHITECT NS4:4 1,50 14,00 29,68 2,94 8,89 NS4:5 0,70 13,20 31,35 2,32 7,75 NS4:6 1,50 13,15 33,61 2,67 8,10 NS4:7 1,19 13,24 33,29 2,66 6,34 Núcleo: 1 Núcleo 1,13 9,04 50,89 2,14 11,81 Núcleo:2 1,00 8,91 47,00 2,14 12,29 Núcleo:3 0,83 9,09 46,37 2,12 14,49 Núcleo:4 1,80 9,27 46,74 2,08 12,20 Núcleo:5 2,46 9,25 48,67 2,13 12,70 Núcleo:6 2,50 9,45 44,70 2,16 12,36 Núcleo:7 1,90 8,13 40,41 1,64 11,17 Núcleo:8* 0,15 9,04 45,70 1,99 11,31 Núcleo:9 2,14 8,85 44,76 1,92 12,03 Núcleo: 10 0,01 7,80 4,77 1,24 8,85 * NS5:1 NS5 0,70 0,06 0,16 2,60 0,05 NS5:2 1,60 0,03 0,14 2,04 0,06 NS5:3 1,30 0,04 0,14 2,38 0,05 NS5:4 0,87 0,02 0,13 2,59 0,05 NS5:5 0,58 0,02 0,10 2,55 0,05 Tabela 3: Reatividade do Anticorpo Quimérico para Núcleo, NS3, NS4 e NS5 em Vários Ensaios Abbott HCVi (continuação)

Amostra Antígeno Concentra¬ Valores de Amostra/Limite (S/CO) EIA (Bead) AxSYM Prism ARCHITECT NS3:1 NS3 3,08 7,44 40,58 3,94 8,75 NS3:2 2,40 7,58 40,34 4,39 9,50 NS3:3 3,70 7,88 38,88 4,41 10,57 NS3:4 1,90 7,51 37,54 3,89 9,69 NS3:5 2,10 7,71 37,68 4,65 10,38 Amostra Antígeno Concentra¬ Valores de Amostra/Limite (S/CO) EIA (Bead) AxSYM Prism ARCHITECT NS3:6# 1,80 6,77 36,31 4,37 8,70 1,80 7,99 39,64 4,58 9,59 0,33 7,30 40,26 4,15 9,52 0,34 8,00 39,42 4,30 9,61 t Os anticorpos quiméricos foram testados em uma concentração de 500 ng/mL em todas as plataformas Abbott, com a exceção do anticorpo quimérico para a NS5 do HCV em Abbott Prism, que foi testado em uma concentração de 10 /yg/mL.

110 controle positivo consistia de amostras de plasma de pacientes positivos em re- lação ao HCV que foram qualificadas e direcionadas a uma taxa específica ou RLU.

* Amostras coletadas, isto é, sobrenadante de culturas de células diretas.

# Amostras pré-diálise, isto é, material purificado do sobrenadante de cultura de cé- lulas através da purificação com Proteína A.

Os resultados mostram que nas plataformas Abbott AxSYM, EIA1 Prism e ARCHITECT os anticorpos quiméricos para HCV demonstram reatividade aos antígenos que é igual ou maior que a do controle de origem humana. Na Tabela 3, o anticorpo quimérico anti-NS5 não reage nos ensaios EIA, AxSYM e ARCHITECT simplesmente porque não há antígeno NS5 revestido sobre a esfera/micropartícula.

EXEMPLO 15: Preparação de um Anticorpo Quimérico de Ser Humano- Camundongo Específico para a Proteína do Núcleo #2 do Vírus da Hepatite C

Um segundo anticorpo quimérico anti-núcleo, HCV Núcleo CHO 14-153-229sc152, foi preparado partindo do hibridoma 14-153-462. A linhagem de células de baço de camun- dongo de hibridoma murino 14-153-462 anti-núcleo do HCV (também conhecida como “HCV 14-153-462”) foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC) at 10801 Univer- 20 sity Boulevard, Manassas, VA em 21 de novembro de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-8028.

Preparação de uma linhagem de células de hibridoma

A linhagem de células de hibridoma 14-153-462 anti-núcleo do HCV foi desenvolvi- da como descrito no Exemplo 1 utilizando o antígeno do núcleo recombinante do HCV purifi- 25 cado conhecido como pL-Core no lugar do antígeno CKS-33C-BCD do núcleo. O antígeno recombinante pL-Core corresponde aos aminoácidos 1-150 da poliproteína do HCV. O regi- me de imunização dos animais utilizava um reforço de 200 //g no Sistema de Adjuvantes de Freund, com um reforço pré-fusão em solução salina 2 semanas depois.

Isolamento de mRNA e identificação de seqüências Vh e Vl de camundongo O mRNAfoi isolado da linhagem de células de hibridoma 14-153-462 anti-núcleo do HCV e as seqüências Vh e Vl de camundongo foram obtidas através da RT-PCR como des- crito no Exemplo 1 em relação à linhagem de células de hibridoma 201-603-195 do Núcleo do HCV. Os produtos positivos da PCR foram observados partindo dos conjuntos de inicia- 5 dores de cadeia pesada (H) de C (VH-C) e dos conjuntos de iniciadores de cadeia leve (L) de B e C (VL-B, VL-C). Todos os produtos positivos da PCR foram purificados em gel, clo- nados em um vetor PCR TOPO 2.1 TA e transformados em E. coli. As reações da PCR em colônias foram utilizadas para confirmar o inserto do clone. Sucintamente, a PCR foi realiza- da utilizando os iniciadores para frente de M13 e para trás de M13 (Invitrogen Corp.), Taq 10 DNA polimerase e a colônia de E. coli fervida como o molde. A PCR compreendia a desna- turação 1 minuto a 94°C; o anelamento 1 minuto a 50°C e a extensão 2 minutos a 72°C, com uma extensão final de 6 minutos a 72°C durante um total de 30 ciclos. Os clones forne- cendo o tamanho correto para os produtos da PCR foram crescidos em meio LB. Cada DNA plasmideal foi purificado utilizando o QIAprep spin miniprep Kit (QIAGEN) e sequenciado 15 utilizando iniciadores para frente e para trás de M13 com o kit de sequenciamento Big Dye Terminator v3.1 cycle (Applied Biosystems).

O clone TA final foi selecionado através do alinhamento das seqüências como des- crito no Exemplo 1. Os resultados das seqüências confirmaram que o clone VL-B continha a seqüência Vl correta (SEQ ID NO: 41 que codifica um polipeptídeo que é mostrado na SEQ 20 ID NO: 39), enquanto que os clones VH-C continham a seqüência Vh correta (SEQ ID NO: 40 que codifica um polipeptídeo que é mostrado na SEQ ID NO: 38) (ver também as Figuras 11A-D).

Clonagem dos genes Vh e Vl nos vetores pBOS

Utilizando o clone VL-B TA número 5 como o molde, um par de iniciadores da PCR foi planejado para clonar a seqüência Vl de camundongo, ou seja, um iniciador da extremi- dade a 5’ de Vl do Anticorpo do núcleo do HCV

5’-AAATTTTCGCGATGCGACATTGTGCTGACCCAATCTC-3’ [SEQ ID NO: 96] e um iniciador da extremidade a 3’ de Vl do Anticorpo do núcleo do HCV

5’-ACTACTCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCT-3’ [SEQ ID NO: 97],

O iniciador da extremidade a 5’ continha uma seqüência sinal Kappa parcial e um

sítio de restrição de Nru I e o iniciador da extremidade a 3’ continha um sítio de restrição de BsiW I. Em adição, utilizando o clone VH TA número 1 como o molde, um par de iniciadores foi planejado para clonar a seqüência Vh de camundongo, ou seja, um iniciador da extremi- dade a 5’ de Vh do Anticorpo do núcleo do HCV 5’-AAATTTT CGCG ATTTTAAAAGGT GT CCAGT GT CAGAT CCA

GTTGGTGCAGTCTGG -3’ [SEQ ID NO: 98] e a um iniciador da extremidade a 3’ de Vh do Anticorpo do núcleo do HCV 5’-TCCTTTGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTT-3’ [SEQ ID NO: 99],

Para este par de iniciadores, o iniciador da extremidade a 5’ continha uma seqüên- cia sinal de cadeia pesada parcial e um sítio de restrição de Nru I e o iniciador da extremida- de a 3’ continha um sítio de restrição de Sal I.

As seqüências Vl e Vh foram independentemente amplificadas através da PCR uti-

lizando os pares de iniciadores anteriores e o clone VL-B TA número 5 e clone VH-C TA número 1, respectivamente, como os moldes. A PCR foi realizada em Tampão de amplifica- ção 1 X PCR utilizando 20 pmoles de cada um dos iniciadores da extremidade a 5’ e da ex- tremidade a 3’, 1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen Corp.) e 2 ywL de colônia bac- 10 teriana como o molde. A PCR foi realizada empregando 30 ciclos de 30 segundos a 94°C e 30 segundos a 55°C seguidos por 1 minuto a 72°C.

Os produtos da PCR de Vl e Vh foram cortados com enzimas de restrição através da digestão com Nru I /BsiW I e Nru I/ Sal I, respectivamente e então clonados no vetor pBOS-hck (para a seqüência VL) ou no vetor pBOS-hcg (para a seqüência VH), como descri- 15 to no Exemplo 1. Os plasmídeos pBOS 14-153-462-L (contendo a seqüência VL) e pBOS 14- 153-462-H (contendo a seqüência VH) foram selecionados através do sequenciamento como descrito no Exemplo 1. Uma vez que os respectivos clones de pBOS foram identificados, foram feitos bancos de células de E. coli DH5a separados contendo o plasmídeo pBOS 14- 153-462-L-TO ou o plasmídeo pBOS 14-153-462-H-T0 para preservar os clones de pBOS.

Teste do anticorpo quimérico funcional

O DNA plasmideal de pBOS 14-153-462-L-T0 e de pBOS 14-153-462-H-T0 foi pre- parado e transfectado de forma transitória em células COS 7L como descrito no Exemplo 1.

O anticorpo quimérico anti-núcleo do HCV foi preparado partindo das células COS 7L trans- fectadas como descrito no Exemplo 1 e analisado através do EIA para confirmar a reativida- de com antígeno do núcleo do HCV. O EIA foi realizado como descrito no Exemplo 1. Os resultados do EIA demonstraram que o anticorpo quimérico proveniente da expressão transi- tória era reativo com o antígeno do núcleo do HCV.

Clonagem das seqüências Vh e Vl em um vetor de expressão estável Os clones pBOS 14-153-462-L-T0 e pBOS 14-153-462-H-T0 clones foram utilizados para a construção de um clone de plasmídeo para a transfecção estável de linhagens de células primeiramente através da clonagem das seqüências no vetor pBV (para a seqüência VH) ou no vetor pJV (para a seqüência VL) e subsequentemente ligando os fragmentos dos vetores obtidos partindo da digestão com as enzimas de restrição Pac l/Asc I como descrito no Exemplo 1 para fornecer o pBJ HCV núcleo 14-153-462 no plasmídeo pBJ que contém ambas as seqüências Vh e VL. O clone de pBJ foi verificado através da digestão com Srf l/Not I para confirmar que este contém ambas as seqüências. O mapa do plasmídeo para o clone de pBJ final (pBJ HCV núcleo 14-153-462) para o anticorpo quimérico para o núcleo do HCV é mostrado na Figura 12. As seqüências gênicas de Vh e Vl são mostradas nas Figuras 11A-B (SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41, respectivamente). Foram feitos bancos de células de E. coli DH5a contendo o clone pBJ 14-153-462-T4.

O plasmídeo pBJ 14-153-462-T4 foi transfectado através da transfecção mediada por fosfato de cálcio em linhagens de células de Ovário de Hamster Chinês deficientes em relação à DHFR como descrito no Exemplo 1. A cultura e a clonagem de células isoladas foram realizadas como descrito no Exemplo 1. As placas de 96 poços foram testadas atra- 10 vés de EIA específico ao antígeno e o clone número 229 foi selecionado para desenvolvi- mento adicional. O EIA foi realizado como descrito anteriormente. O clone de célula CHO 14-153-462 do núcleo do HCV foi cultivado e a célula isolada foi selecionada em placas de 96 poços utilizando o separador com citômetro de fluxo BD FACSAria. O subclone de CHO número 152 foi selecionado para privação em meio isento de soro CD-CHO (Invitrogen 15 Corp.). A linhagem de células CHO final (14-153-229sc152 do núcleo de HCV) foi expandida para a produção do anticorpo quimérico e para o desenvolvimento de um banco de células de publicação para armazenamento em nitrogênio líquido. O anticorpo quimérico foi purifi- cado partindo desta linhagem de células utilizando procedimentos de purificação em Proteí- na A padronizados como descrito no Exemplo 1.

A linhagem de células CHO 14-153-229sc152 do núcleo do HCV foi depositada na

American Type Culture Collection (ATCC) at 10801 University Boulevard, Manassas, VA em 2 de maio de 2006 sob a Designação de Depósito de Patente PTA-7571.

A divulgação de todas as patentes, publicações, incluindo pedidos de patentes pu- blicados e entradas em bancos de dados referidos neste relatório descritivo são especifica- mente incorporados como referência em sua totalidade até a mesma extensão como se ca- da tal patente, publicação e entrada em bancos de dados individuais fossem especificamen- te e individualmente indicadas como sendo incorporadas como referência.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência a certas modalidades espe- cíficas, várias modificações das mesmas serão evidentes aos peritos na arte sem sair do espírito e do âmbito da invenção. É pretendido que todas as tais modificações que seriam evidentes a um perito na arte estejam incluídas dentro do âmbito das reivindicações a se- guir. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> Abbott Laboratories Tu, Bailin

Tyner, Joan Ziemann, Robert N.

Hawksworth, David Scheffel, James White, Michael

Wernecke, Jeffrey M.

Pinkus, Mary S.

Gutierrez, Robin

<120> “ANTICORPOS RECOMBINANTES CONTRA VÍRUS DA HEPATITE C E PROCESSOS DE OBTENÇÃO E DE UTILIZAÇÃO DOS MESMOS”

<130> 8339W001

<150 US/633.810 <151 >05-12-2006

<160> 111

<170> FastSEQ for Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 120 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Região VH do anticorpo 201-603 do núcleo do HCV <400> 1

Gln He Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Gln Lys Pro Gly Lys 10 15

Thr Val Lys Ne Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Pro Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp He Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro ThrArg Val Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Ne Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Val Arg Arg Gln Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 2 <211> 113 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Região VL do anticorpo 201-603 do núcleo do HCV <400>2

Asp Ne Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ne Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ne Lys 100 105 110

Arg <210> 3 <211 >32 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VL do anticorpo 201-603 do núcleo do HCV <400>3

gctcgcgatg cgacattgtg atgtcacagt ct 32

<210> 4 <211 >27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 3’ de VL do anticorpo 201-603 do núcleo do HCV <400>4

caccgtacgt tttatttcca gcttggt 27

<210> 5 <211 >56 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VH do anticorpo 201-603 do núcleo do HCV <400>5

ttgtcgcgat tttaaaaggt gtccagtgcc agatccagtt ggtgcagtct ggacct 56

<210> 6 <211 >33 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220

<223> Iniciador a 3’ de VH do anticorpo 201-603 do núcleo do HCV <400 6

ttggtcgacg ctgaggagac ggtgactgag gtt 33

<210> 7 <211 >360 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região do anticorpo 201-603 do núcleo do HCV Região

<400>7

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgcagaagc ctggaaagac agtcaagatc 60 tcctgcaaga cttctggtta taccttcaca gactatccaa tgcactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacacgt 180 gtagatgact tcaagggacg ttttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa agatgaggac acggccacat atttctgcgc tagagggggt 300 ggggtccgac gccaggttat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

<210> 8 <211 >337 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região VL do anticorpo 201-603 do núcleo do HCV Região

<400>8

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aatagtagaa cccgaaagaa ctacttggtt 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gattctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaac 337

<210> 9 <211> 117 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Região VH do anticorpo para NS3 do HCV <400>9

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Ala 35 40 45

Ala Tyr Ne Ser Asn Gly Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ne Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Leu Trp Asp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 10 <211> 113 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Região VL do anticorpo para NS3 do HCV <400> 10

Asp Val Val Met Ala Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 10 15

Asp Gln Ala Ser Ne Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110

Arg

<210> 11 <211 >56 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VL do anticorpo para NS3 do HCV <400> 11

ctgtggttcc ccggctcgcg atgcgatgtt gtgatggccc aaactccact ctcccc 56

<210> 12 <211 >40 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Iniciador a 3’ de VL do anticorpo para NS3 do HCV <400> 12

gcgcatgcgt cgtacgtttt atttccagct tggtcccccc 40

<210> 13 <211 >68 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VH do anticorpo para NS3 do HCV <400> 13

ggctttttct tgtcgcgatt ttaaaaggtg tccagtgcga agtgaagctg gtggagtctg 60 ggggaggc 68

<210> 14 <211> 53 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 3’ de VH do anticorpo para NS3 do HCV <400> 14

gcgcatgcat gcattgtcga cgcgaggaga ctgtgagagt ggtgccttgg ccc 53

<210> 15 <211> 351 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região VH do anticorpo para NS3 do HCV

<400> 15 gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcaa cctctggatt cactttcagt gactattata tgtattgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggccgcatac attagtaatg gtgctggtag cacctattat 180 ccagacactg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gccgtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagaggcctc 300 tgggacggcc ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc g 351

<210> 16 <211 >339 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região VL do anticorpo para NS3 do HCV

<400> 16

gatgttgtga tggcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga ggccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc o CM agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgt 339 <210> 17 <211> 114 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Região VH do anticorpo para NS4 do HCV <400> 17

Gln He Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 10 15

Thr Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp He Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln He Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Thr Arg Gly Gly Thr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110

Ser Ser

<210> 18 <211> 113 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Região VL do anticorpo para NS4 do HCV <400> 18

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 10 15

Asp Gln Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 * 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110

Arg <210> 19 <211 >31 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VL do anticorpo para NS4 do HCV <400> 19

gctcgcgatg cgatgttgtg atgacccaaa c 31

<210> 20 <211 >29 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 3’ de VL do anticorpo para NS4 do HCV <400> 20

caccgtacgt ttgatttcca gcttggtgc 29

<210> 21 <211 >30 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VH do anticorpo para NS4 do HCV <400> 21

tacttcgcga cagatccagt tggtgcagtc 30

<210> 22 <211 >31 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 3’ de VH do anticorpo para NS4 do HCV <400> 22

tggtcgacgc tgaggagact gtgagagtgg t 31

<210> 23 <211 >342 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região VH do anticorpo para NS4 do HCV <400> 23

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaaccaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtac taggggaggc 300 acgggctact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342

<210> 24 <211 >339 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região VL do anticorpo para NS4 do HCV <400> 24

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta tacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339 <210> 25 <211> 115 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Região VH do anticorpo para NS5 do HCV <400> 25

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn He Lys Asp Thr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Arg He Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Arg Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110

Val Ser Ala 115

<210> 26 <211> 114 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Região VL do anticorpo para NS5 do HCV <400> 26

Asp Ne Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ne Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ne Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110

Lys Arg

<210> 27 <211 >30 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VL do anticorpo para NS5 do HCV <400> 27

gctcgcgatg cgacattgtg atgtcacagt 30

<210> 28 <211 >27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 3’ de VL do anticorpo para NS5 do HCV

<400> 28

caccgtacgt ttcagctcca gcttggt

27 <210> 29 <211 >29 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VH do anticorpo para NS5 do HCV <400> 29

tacttcgcga gaggttcagc tgcagcagt 29

<210> 30 <211 >28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 3’ de VH do anticorpo para NS5 do HCV <400> 30

tggtcgacgc tgcagagaca gtgaccag 28

<210> 31 <211 >345 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região VH do anticorpo para NS5 do HCV <400> 31

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180 gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagatcgcgg 300 gagtttgctt actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345 <210> 32 <211> 342 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região VL do anticorpo para NS5 do HCV <400> 32

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gg 342

<210 33 <211>5 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico do núcleo do HCV <400 33

Gly Gly Val Tyr Leu 1 5

<210> 34 <211> 13 <212> PRT

<213> Artificial Sequence <220

<223> Fragmento antigênico do núcleo do HCV

<400> 34 Gly Gly Gln He Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg 1 5 10

<210> 35 <211 >27 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS3 do HCV <400> 35

Ala Lys Ala Val Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Leu Glu Thr Thr Met 10 15

Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro 20 25

<210> 36 <211 >22 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS4 do HCV <400> 36

Pro Ala Ne He Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu 10 15

Met Glu Glu Cys Ser Gln 20

<210> 37 <211 >27 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Fragmento antigênico da NS5 do HCV <400> 37

Ala Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp 10 15

Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val 20 25

<210> 38 <211> 125 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Região VH do anticorpo 14-153 do núcleo do HCV <400> 38

Gln He Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 10 15

Thr Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp He Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ne Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln He Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Gly Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Tyr Asp Tyr Ala Met 100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 39 <211> 112 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Região VL do anticorpo 14-153 do núcleo do HCV <400> 39

Asp Ne Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15

Gln Arg Ala Thr He Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ne Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly He Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn He His 65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ne Lys Arg 100 105 110

<210> 40 <211 >375 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região VH do anticorpo 14-153 do núcleo do HCV Região

<400 40

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaagct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaacatat 180 gctgaagagt tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccat cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagagcgggg 300 ggagattact acgatagtag ctacgactat gctatggact actggggtca aggaacctca 360 gtcaccgtct cctca 375

<210> 41 <211 >336 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a região VL do anticorpo 14-153 do núcleo do HCV Região

<400> 41

gacattgtgc tgacccaatc cccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgt 336

<210> 42 <211>8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR1 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 42

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Pro 1 5

<210> 43 <211>8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR2 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV e CDR2 da região VH do anticorpo para NS4 do HCV

<400> 43

He Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro 1 5

<210> 44 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 44

Ala Arg Gly Gly Gly Val Arg Arg Gln Val Met Asp Tyr 1 5 10

<210> 45 <211> 12 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR1 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 45

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr 1 5 10

<210> 46 <211>3 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR2 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV e região VL do anticorpo para NS5 do HCV

<400> 46 Trp Ala Ser 1

<210> 47 <211>8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 47

Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr 1 5

<210 48 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR1 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 48

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 1 5

<210 49 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> CDR2 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 49

He Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro 1 5

<210> 50 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 50

Ala Arg Ala Gly Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Tyr Asp Tyr Ala Met 10 15

Asp Tyr

<210> 51 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR1 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 51

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr 1 5 10

<210> 52 <211>3 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> CDR2 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV

<400> 52 Ala Ala Ser 1

<210> 53 <211>9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 53

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr 1 5

<210> 54 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR1 da região VH do anticorpo para NS3 do HCV <400> 54

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr 1 5

<210> 55 <211>8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR2 da região VH do anticorpo para NS3 do HCV <400> 55

He Ser Asn Gly Ala Gly Ser Thr 1 5

<210> 56 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VH do anticorpo para NS3 do HCV <400> 56

Ala Arg Gly Leu Trp Asp Gly Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 57 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR1 da região VL do anticorpo para NS3 do HCV <400> 57

Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10

<210> 58 <211>3 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR2 da região VL do anticorpo para NS3 do HCV e CDR2 da região VL do anticor- po para NS4 do HCV <400> 58 Lys Val Ser 1

<210> 59 <211>9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VL do anticorpo para NS3 do HCV <400> 59

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr 1 5

<210> 60 <211>8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR1 da região VH do anticorpo para NS4 do HCV <400> 60

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser 1 5

<210> 61 <211>7 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VH do anticorpo para NS4 do HCV <400> 61

Thr Arg Gly Gly Thr Gly Tyr 1 5

<210> 62 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR1 da região VL do anticorpo para NS4 do HCV <400> 62

Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10

<210> 63 <211>9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VL do anticorpo para NS4 do HCV <400> 63

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5

<210> 64 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR1 da região VH do anticorpo para NS5 do HCV

<400> 64 Gly Phe Asn He Lys Asp Thr Tyr 1 5

<210> 65 <211>8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220

<223> CDR2 da região VH do anticorpo para NS5 do HCV <400 65

He Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr 1 5

<210> 66 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VH do anticorpo para NS5 do HCV <400> 66

Ala Arg Ser Arg Glu Phe Ala Tyr 1 5

<210> 67 <211> 12 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220

<223> CDR1 da região VL do anticorpo para NS5 do HCV <400 67

Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 68 <211>9 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> CDR3 da região VL do anticorpo para NS5 do HCV <400 68

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 69 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 69

ggttatacct tcacagacta tcca 24

<210> 70 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR2 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV e a CDR2 da região VH do anticorpo para NS4 do HCV

<400> 70

ataaacactg agactggtga gcca 24

<210> 71 <211 >39 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400 71

gctagagggg gtggggtccg acgccaggtt atggactac 39

<210 72 <211 >36 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220

<223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400 72

cagagtctgc tcaatagtag aacccgaaag aactac 36

<210 73 <211> 9 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220

<223> Seqüência que codifica a CDR2 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV e a CDR2 da região VL do anticorpo para NS5

<400> 73

tgggcatcc 9

<210> 74 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 74

aagcaatctt ataatctgta cacg 24

<210> 75 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 75

gggtatacct tcacaaacta tgga 24

<210> 76 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR2 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 76

ataaacacca acactggaga gcca 24

<210> 77 <211 >54 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VH do anticorpo para o núcleo do HCV

<400> 77 gcaagagcgg ggggagatta ctacgatagt agctacgact atgctatgga ctac 54

<210> 78 <211 >30 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 78

caaagtgttg attatgatgg tgatagttat 30

<210> 79 <211>9 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR2 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 79

gctgcatcc 9

<210> 80 <211 >27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 80

cagcaaagta atgaggatcc gtggacg 27

<210> 81 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VH do anticorpo para NS3 do HCV <400> 81

ggattcactt tcagtgacta ttat 24

<210> 82 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR2 da região VH do anticorpo para NS3 do HCV <400 82

attagtaatg gtgctggtag cacc 24

<210> 83 <211> 30 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VH do anticorpo para NS3 do HCV <400> 83

gcaagaggcc tctgggacgg ccttgactac 30

<210 84 <211 >33 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220 <223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VL do anticorpo para NS3 do HCV <400> 84

cagagccttg tacacagtaa tggaaacacc tat 33

<210> 85 <211>9 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR2 da região VL do anticorpo para NS3 do HCV e a CDR2 da região VL do anticorpo para NS4 do HCV

<400 85

aaagtttcc 9

<210 86 <211 >27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VL do anticorpo para NS3 do HCV <400> 86

tctcaaagta cacatgttcc gtacacg 27

<210> 87 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VH do anticorpo para NS4 do HCV

<400> 87 ggttatacct tcacagacta ttca 24

<210> 88 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VH do anticorpo para NS4 do HCV <400> 88

actaggggag gcacgggcta c 21

<210> 89 <211> 33 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VL do anticorpo para NS4 do HCV <400 89

cagagccttg tatacagtaa tggaaacacc tat 33

<210> 90 <211 >27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VL do anticorpo para NS4 do HCV <400> 90

tctcaaagta cacatgttcc gtggacg 27

<210> 91 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VH do anticorpo para NS5 do HCV <400> 91

ggcttcaaca ttaaagacac ctat 24

<210> 92 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR2 da região VH do anticorpo para NS5 do HCV <400> 92

attgatcctg cgaatggtaa tact 24

<210> 93 <211 >24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VH do anticorpo para NS5 do HCV <400> 93

gctagatcgc gggagtttgc ttac 24

<210 94 <211 >36 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Seqüência que codifica a CDR1 da região VL do anticorpo para NS5 do HCV <400> 94

cagagccttt tatatagtag caatcaaaag aactac 36

<210> 95 <211 >27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência que codifica a CDR3 da região VL do anticorpo para NS5 do HCV <400> 95

cagcaatatt atagctatcc gctcacg 27

<210> 96 <211 >37 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VL do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 96

aaattttcgc gatgcgacat tgtgctgacc caatctc 37

<210> 97 <211 >34 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 3’ de VL do anticorpo para o núcleo do HCV

<400 97

actactcgta cgtttgattt ccagcttggt gcct

34 <210> 98 <211 >55 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 5’ de VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 98

aaattttcgc gattttaaaa ggtgtccagt gtcagatcca gttggtgcag tctgg 55

<210> 99 <211 >36 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador a 3’ de VH do anticorpo para o núcleo do HCV <400> 99

tcctttgtcg acgctgagga gacggtgact gaggtt 36

<210> 100 <211>8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico do núcleo do HCV <400> 100

Gln He Val Gly Gly Val Tyr Leu 1 5

<210> 101 <211>8 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico do núcleo do HCV <220>

<221> VARIAÇÃO <222> 2, 6, 7

<223> Xaa = Qualquer aminoácido <400 101

Gln Xaa Val Gly Gly Xaa Xaa Leu 1 5

<210> 102 <211> 8 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220

<223> Fragmento antigênico do núcleo do HCV <220>

<221> VARIAÇÃO <222> 2, 6, 7

<223> Xaa 1, Xaa2 e Xaa3 = Ala ou Gly <400> 102

Gln Xaa Val Gly Gly Xaa Xaa Leu 1 5

<210 103 <211> 12 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS3 do HCV <400> 103

Asp Phe Val Pro Val Glu Ser Leu Glu Thr Thr Met 1 5 10

<210> 104 <211> 12 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS3 do HCV <220>

<221 > VARIAÇÃO <222> 5, 7, 10, 11

<223> Xaa = Qualquer aminoácido

<400> 104

Asp Phe Val Pro Xaa Glu Xaa Leu Glu Xaa Xaa Met 1 5 10

<210> 105 <211> 12 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS3 do HCV <220>

<221 > VARIAÇÃO <222> 5, 7, 10, 11 <223> Xaal, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 = Ala ou Gly <400> 105

Asp Phe Val Pro Xaa Glu Xaa Leu Glu Xaa Xaa Met 1 5 10

<210> 106 <211>6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS4 do HCV <400> 106

Leu Tyr Arg Glu Phe Asp 1 5

<210> 107 <211>6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS4 do HCV <220>

<221 > VARIAÇÃO <222> 3

<223> Xaa = Qualquer aminoácido <400> 107

Leu Tyr Xaa Glu Phe Asp

1 5 <210> 108 <211>6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS4 do HCV <220>

<221 > VARIAÇÃO <222>3

<223> Xaa = Ala ou Gly <400> 108

Leu Tyr Xaa Glu Phe Asp

1 5

<210> 109 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS5 do HCV <400> 109

Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu

1 5 10

<210> 110 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS5 do HCV <220>

<221 > VARIAÇÃO <222> 7, 10

<223> Xaa = Qualquer aminoácido <400> 110

Pro Leu Glu Gly Glu Pro Xaa Asp Pro Xaa Leu

1 5 10

<210> 111 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento antigênico da NS5 do HCV <220>

<221> VARIAÇÃO <222> 7, 10

<223> Xaa 1 e Xaa2 = Ala ou Gly <400> 111

Pro Leu Glu Gly Glu Pro Xaa Asp Pro Xaa Leu

1 5 10

Claims

1. Reagente para diagnóstico imunológico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ou mais anticorpos recombinantes que se ligam especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do vírus da hepatite C (HCV), em que o dito um ou mais anticorpos recombinantes são selecionados do grupo que consiste de um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV, um anticorpo quimérico específico para a proteína E2 do HCV, um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV, um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV e um anticor- po quimérico específico para a proteína NS5 do HCV.

2. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito reagente para diagnóstico imunológico compre- ende um anticorpo quimérico selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína do núcleo do HCV de- finida pelos aminoácidos 1-150 da poliproteína do HCV; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS3 do HCV definida pelos aminoácidos 1192 até 1457 da poliproteína do HCV; (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS4 do HCV definida pelos aminoácidos 1920 até 1935 ou pelos aminoácidos 1676 até 1931 da poliproteína do HCV; e (d) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS5 do HCV definida pelos aminoácidos 2054 até 2995 da poliproteína do HCV.

3. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito reagente para diagnóstico imunológico compre- ende um anticorpo quimérico selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apre- sentada na SEQ ID NO: 34; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 35; (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 36; e (d) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 37.

4. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito reagente para diagnóstico imunológico compre- ende um anticorpo quimérico selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apre- sentada na SEQ ID NO: 100; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apre- sentada na SEQ ID NO: 101; e (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apre- sentada na SEQ ID NO: 102.

5. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito reagente para diagnóstico imunológico compre- ende um anticorpo quimérico selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 103; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 104; e (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 105.

6. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito reagente para diagnóstico imunológico compre- ende um anticorpo quimérico selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 106; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 107; e (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 108.

7. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito reagente para diagnóstico imunológico compre- ende um anticorpo quimérico selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 109; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 110; e (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 111.

8. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 1; (b) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 38; (c) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 42, 43 e 44; e (d) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 48, 49 e 50.

9. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 2; (b) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 39; (c) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 45, 46 e 47; e (d) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53.

10. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 9; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56.

11. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 10; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 57, 58 e 59.

12. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 17; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 60, 43 e 61.

13. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 18; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 62, 58 e 63.

14. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 25; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 64, 65 e 66.

15. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 26 e uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da com- plementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 67, 46 e 68.

16. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 7; (b) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 40; (c) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 69, 70 e 71; e (d) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 75, 76 e 77.

17. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 8; (b) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 41; (c) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 72, 73 e 74; e (d) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 78, 79 e 80.

18. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 15; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83.

19. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 16; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 84, 85 e 86.

20. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 23; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 87, 70 e 88.

21. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 24; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 89, 85 e 90.

22. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 31; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 91, 92 e 93.

23. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 32 e uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da com- plementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 94, 73 e 95.

24. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 até 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito reagente para diagnóstico imunológico compreende dois ou mais dos ditos anticorpos recombinantes.

25. Reagente para diagnóstico imunológico de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito reagente para diagnóstico imunológico é um rea- gente selecionado do grupo que consiste de um reagente de detecção, um reagente de pa- dronização e um reagente de controle positivo.

26. Anticorpo quimérico CARACTERIZADO pelo fato de que se liga especificamen- te a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do HCV selecionada do grupo que consiste de proteína do núcleo do HCV, proteína NS3 do HCV, proteína NS4 do HCV e proteína NS5 do HCV.

27. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína do núcleo do HCV de- finida pelos aminoácidos 1-150 da poliproteína do HCV; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS3 do HCV definida pelos aminoácidos 1192 até 1457 da poliproteína do HCV; (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS4 do HCV definida pelos aminoácidos 1920 até 1935 ou pelos aminoácidos 1676 até 1931 da poliproteína do HCV; e (d) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS5 do HCV definida pelos aminoácidos 2054 até 2995 da poliproteína do HCV.

28. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apre- sentada na SEQ ID NO: 34; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 35; (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 36; e (d) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 37.

29. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apre- sentada na SEQ ID NO: 100; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apre- sentada na SEQ ID NO: 101; e (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apre- sentada na SEQ ID NO: 102.

30. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 103; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 104; e (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 105.

31. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 106; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 107; e (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 108.

32. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 109; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 110; e (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela seqüência de aminoácidos que é apresen- tada na SEQ ID NO: 111.

33. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 1; (b) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 38; (c) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 42, 43 e 44; e (d) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 48, 49 e 50.

34. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 2; (b) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 39; (c) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 45, 46 e 47; e (d) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53.

35. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 9; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56.

36. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 10; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 57, 58 e 59.

37. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 17; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 60, 43 e 61.

38. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 18; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 62, 58 e 63.

39. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 25; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 64, 65 e 66.

40. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 26; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 67, 46 e 68.

41. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 7; (b) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 40; (c) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 69, 70 e 71; e (d) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 75, 76 e 77.

42. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 8; (b) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 41; (c) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 72, 73 e 74; e (d) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 78, 79 e 80.

43. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 15; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83.

44. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 16; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 84, 85 e 86.

45. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 23; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 87, 70 e 88.

46. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 24; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 89, 85 e 90.

47. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 31; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 91, 92 e 93.

48. Anticorpo quimérico de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico compreende uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 32 e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 94, 73 e 95.

49.Anticorpo quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 até 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico é substancialmente idêntico ao anticorpo quimérico expresso por uma linhagem de células selecionada do grupo que consiste de HCV núcleo CHO 201-603-486-333, HCV núcleo CHO 14-153-229sc152, HCV NS3 CHO 17-903-132sc171, HCV NS4 CHO E99H6C34sc203 e HCV NS5 CHO 48-311-271-455.

50. Anticorpo monoclonal quimérico de camundongo CARACTERIZADO pelo fato de que é expresso por uma linhagem de células selecionada do grupo que consiste de 201-603-195 anti-núcleo do HCV, 14-153-462 anti-núcleo do HCV, 17-903-127 anti-NS3 do HCV, E99H6C34 anti-NS4 do HCV e 48-311-387 anti-NS5 do HCV.

51. Linhagem de células CARACTERIZADA pelo fato de que expressa um anticor- po quimérico que se liga especificamente a uma região relevante para diagnóstico de uma proteína do vírus da hepatite C proteína, em que a dita linhagem de células é selecionada do grupo que consiste de HCV núcleo CHO 201-603-486-333, HCV núcleo CHO 14-153- 229sc152, HCV NS3 CHO 17-903-132sc171, HCV NS4 CHO E99H6C34sc203 e HCV NS5 CHO 48-311-271-455.

52. Linhagem de células CARACTERIZADA pelo fato de que expressa um anticor- po monoclonal quimérico de camundongo que se liga especificamente a uma região relevan- te para diagnóstico de uma proteína do vírus da hepatite C, em que a dita linhagem de célu- las é selecionada do grupo que consiste de 201-603-195 anti-núcleo do HCV, 14-153-462 anti-núcleo do HCV, 17-903-127 anti-NS3 do HCV, E99H6C34 anti-NS4 do HCV e 48-311- 387 anti-NS5 do HCV.

53. Método de padronização de um ensaio de detecção de anticorpo para HCV CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o emprego como um grupo de sensibilida- de o reagente para diagnóstico imunológico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 25.

54. Método para a detecção da presença de antígenos do HCV CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) obtenção de uma amostra de teste; (b) contato da dita amostra de teste com o reagente para diagnóstico imunológico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 25 sob condições que permitem a formação de um complexo anticorpo quimérico:antígeno; e (b) detecção de qualquer complexo anticorpo quimérico:antígeno formado como in- dicador da presença dos ditos antígenos do HCV.

55. Método para a detecção da presença de anticorpos para HCV CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) obtenção de uma amostra de teste; (b) contato da dita amostra de teste com um ou mais antígenos do HCV específicos para os anticorpos para HCV sob condições que permitem a formação de um complexo an- tígeno:anticorpo; e (c) detecção de qualquer complexo antígeno:anticorpo formado como indicador da presença dos ditos antígenos do HCV, em que a melhoria compreende o fato de que o reagente para diagnóstico imunoló- gico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 25 é empregado no dito método como um controle positivo ou um reagente de padronização.

56. Kit para diagnóstico para a detecção do vírus da hepatite C CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o reagente para diagnóstico imunológico de qualquer uma das reivindicações 1 até 25.

57. Método de identificação de resíduos de aminoácidos dentro do epítopo de uma proteína do HCV que estão ligados através de um anticorpo que se liga especificamente ao dito epítopo de proteína do HCV1 CARACTERIZADO pelo fato de que o dito método com- preende as etapas de: (a) obtenção de uma biblioteca de exibição de leveduras que compreende uma sé- rie de peptídeos exibidos na superfície de células hospedeiras (isto é, células de levedura), em que a dita série de peptídeos exibidos pelas leveduras compreende seqüências de ami- noácidos que correspondem à seqüência de aminoácidos do dito epítopo em que cada ami- noácido individual do dito epítopo foi substituído seqüencialmente por alanina; (b) contato da dita biblioteca de exibição de leveduras com um anticorpo que se liga especificamente ao dito epítopo sob condições que permitem a ligação do dito anticorpo ao dito epítopo; e (c) identificação dos peptídeos exibidos nas células de levedura que não estão liga- dos pelo dito anticorpo na etapa (b), em que uma ausência de ligação de anticorpo indica que o peptídeo exibido pelas leveduras contém um resíduo de alanina em uma posição de aminoácido ligada pelo dito anticorpo no epítopo.

58. Polipeptídeo isolado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma par- te de um anticorpo quimérico que se liga especificamente a uma região relevante para diag- nóstico de uma proteína do HCV selecionada do grupo que consiste de proteína do núcleo do HCV, proteína NS3 do HCV, proteína NS4 do HCV e proteína NS5 do HCV.

59. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína do núcleo do HCV de- finida pelos aminoácidos 1-150 da poliproteína do HCV; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS3 do HCV definida pelos aminoácidos 1192 até 1457 da poliproteína do HCV; (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS4 do HCV definida pelos aminoácidos 1920 até 1935 ou aminoácidos 1676 até 1931 da poliproteína do HCV; e (d) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS5 do HCV definida pelos aminoácidos 2054 até 2995 da poliproteína do HCV.

60. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vh selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 1; (b) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 38; (c) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 42, 43 e 44; e (d) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 48, 49 e 50.

61. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vl selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 2; (b) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 39; (c) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 45, 46 e 47; e (d) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53.

62. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vh selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 9; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- 30 das nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56.

63. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vl selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 10; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 57, 58 e 59.

64. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região VH selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região VH que compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 17; e (b) uma região VH que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 60, 43 e 61.

65. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região VL selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região VL que compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 18; e (b) uma região VL que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 62, 58 e 63.

66. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região VH selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região VH que compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 25; e (b) uma região VH que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 64, 65 e 66.

67. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região VL selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região VL que compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 26; e (b) uma região VL que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 67, 46 e 68.

68. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região VH selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região VH que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 7; (b) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 40; (c) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 69, 70 e 71; e (d) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 75, 76 e 77.

69. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vl selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 8; (b) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 41; (c) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 72, 73 e 74; e (d) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 78, 79 e 80.

70. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vh selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 15; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83.

71. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vl selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 16; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 84, 85 e 86.

72. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vh selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 23; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 87, 70 e 88.

73. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vl selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 24; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 89, 85 e 90.

74. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vh selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 31; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 91, 92 e 93.

75. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende uma região Vl selecionada do grupo que consis- te de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 32 e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 94, 73 e 95.

76. Polinucleotídeo isolado CARACTERIZADO pelo fato de que codifica uma parte de um anticorpo quimérico que se liga especificamente a uma região relevante para diag- nóstico de uma proteína do HCV selecionada do grupo que consiste de proteína do núcleo do HCV, proteína NS3 do HCV, proteína NS4 do HCV e proteína NS5 do HCV.

77. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo quimérico é selecionado do grupo que consiste de: (a) um anticorpo quimérico específico para a proteína do núcleo do HCV que se liga especificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína do núcleo do HCV de- finida pelos aminoácidos 1-150 da poliproteína do HCV; (b) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS3 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS3 do HCV definida pelos aminoácidos 1192 até 1457 da poliproteína do HCV; (c) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS4 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS4 do HCV definida pelos aminoácidos 1920 até 1935 ou pelos aminoácidos 1676 até 1931 da poliproteína do HCV; e (d) um anticorpo quimérico específico para a proteína NS5 do HCV que se liga es- pecificamente a um epítopo compreendido pela região da proteína NS5 do HCV definida pelos aminoácidos 2054 até 2995 da poliproteína do HCV.

78. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 1; (b) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 38; (c) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 42, 43 e 44; e (d) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 48, 49 e 50.

79. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 2; (b) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 39; (c) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 45, 46 e 47; e (d) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 51, 52 e 53.

80. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 9; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 54, 55 e 56.

81. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 10; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 57, 58 e 59.

82. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 17; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 60, 43 e 61.

83. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 18; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 62, 58 e 63.

84. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 25; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 64, 65 e 66.

85. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência que é apresentada na SEQ ID NO: 26; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências apresenta- das nas SEQ ID NOs: 67, 46 e 68.

86. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 7; (b) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 40; (c) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 69, 70 e 71; e (d) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 75, 76 e 77.

87. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 8; (b) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 41; (c) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 72, 73 e 74; e (d) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 78, 79 e 80.

88. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 15; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 81, 82 e 83.

89. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 16; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 84, 85 e 86.

90. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 23; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 87, 70 e 88.

91. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vl selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 24; e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 89, 85 e 90.

92. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vh selecionada do grupo que consiste de: (a) uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 31; e (b) uma região Vh que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 91, 92 e 93.

93.

Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo codifica uma região Vl selecionada do grupo que

consiste de: (a) uma região Vl que compreende uma seqüência de aminoácidos substancial- mente idêntica à seqüência codificada pela SEQ ID NO: 32 e (b) uma região Vl que compreende seqüências de regiões de determinação da complementaridade substancialmente idênticas a uma ou mais das seqüências codificadas pelas SEQ ID NOs: 94, 73 e 95.