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Technischer Bereich
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Diese
Erfindung bezieht sich auf das Typisieren von Hepatitis C-Viren
(HCV). Im Besonderen bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren
zum Typisieren von HCV unter Verwendung von neuen Typus-abhängigen Peptiden.
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Hintergrund
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Virale
Hepatitis ist als von fünf
verschiedenen Viren, die als Hepatitis A, B, C, D und E bekannt
sind, hervorgerufen bekannt. HAV ist ein RNA-Virus und führt nicht
zu klinischen Langzeitsymptomen. HBV ist ein DNA-Virus. HDV ist
ein abhängiger
Virus, der in der Abwesenheit von HDV nicht in der Lage ist, Zellen
zu infizieren. HEV ist ein durch Wasser übertragenes Virus. HCV wurde
zuerst als eine Ursache von nicht-A, nicht-B-Hepatitis (NANBH) identifiziert
und charakterisiert. Houghton et al.,
EPO-Veröffentlichung
Nr. 388 232 . Dies führte
zur Entdeckung einer Anzahl von allgemeinen und spezifischen, als
immunologische Reagenzien bei der Identifizierung von HCV nützlichen
Polypeptiden. Siehe z. B. Choo et al. (1989) Science, 244: 359–362; Kuo
et al. (1989) Science, 244: 362–364;
und Houghton et al. (1991) Hepatology, 14: 381–388. HCV ist die Hauptursache
von mit Bluttransfusion in Verbindung stehender Hepatitis.
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Das
Prototypisolat von HCV wurde (in den)
EP-Veröffentlichungsnr.
318 216 und
388 232 charakterisiert.
Wie er hier verwendet wird, beinhaltet der Begriff ”HCV” neu isolierte
virale Arten des NANBH. Der Begriff ”HCV-1” bezieht sich auf das in den
oben genannten Veröffentlichungen
beschriebene Virus.
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Seit
der ersten Identifizierung von HCV wurden mindestens sechs verschiedene
virale Typen identifiziert und als HCV-1 bis HCV-6 bezeichnet. Cha
et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7144–7148. Innerhalb
dieser Typen gibt es zahlreiche Subtypen. Der Typ des Virus, mit
dem ein Patient infiziert ist, kann die klinische Prognose beeinflussen
und auch auf verschiedene Behandlungen ansprechen. Yoshioka et al.
(1992) Hepatology, 16: 293–299.
Angesichts der Tatsache, dass die schwerwiegendste klinische Folge
einer HCV-Infektion ein hepatozelluläres Karzinom ist, wäre es nützlich,
in der Lage zu sein, zu bestimmen, mit welchem Typus oder welchen
Typen von HCV ein Patient infiziert ist.
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Das
gegenwärtig
verwendete Verfahren zur Bestimmung des Virustypus ist Genotypisieren;
welches die Isolierung von viraler RNA und Bestimmung der Sequenz
von verschiedenen Abschnitten durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
ist. Dieses Verfahren ist nicht nur mühsam und zeitaufwendig, es
ist auch nicht geeignet zur Verwendung mit Proben, die unter Bedingungen
gelagert wurden, die keine Konservierung der RNA erlauben, oder
mit Proben von Patienten, die keine ausreichende Viruslast aufweisen.
Es wäre
nützlich,
ein Verfahren zum Typisieren von HCV durch Immunoanalyse oder Serotypisierung
zu haben.
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Das
gegenwärtige
Verfahren zum Durchmustern von Blut und Diagnostizieren von Patienten
ist ein Immunotest. Der Immunotest verwendet ein Antigen von HCV-1,
das eine ausreichende Anzahl von gemeinsamen Epitopen enthält, um Antikörper gegen
andere Typen des HCV zu detektieren. Der Immunotest unterscheidet
nicht zwischen Infektionen durch verschiedene Typen des HCV.
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WO 94/25602 offenbart einzigartige
Typus-spezifische Sequenzen in den NS4-, NS5- und Kernregionen der
HCV-Typen 4, 5 und 6 zusammen mit einem Peptide Competition Assay
zum Typisieren von HCV-Stämmen
basierend auf einem Epitop, das in dem NS4-Bereich des HCV-Genoms
gefunden wird.
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EP 388 232 offenbart besondere
Epitope aus den Kern-, NS4- und NS5-Bereichen des HCV-Genoms zusammen
mit einem Epitope aus denselben oder unterschiedlichen Peptiden
verwendenden Immunotests. Dennoch enthält dieses Dokument keinerlei
Erkenntnis hinsichtlich welches dieser Epitope Typus-spezifisch sein
könnte.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet Zusammensetzungen und Verfahren
zum Typisieren von HCVs mittels Genotypus und Serotypus. Die Zusammensetzungen
enthalten Typus-spezifische Epitope.
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Ein
Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Typisieren eines Hepatitis
C-Virus, das die Schritte umfasst:
- a) Kontaktieren
einer biologischen Probe mit einem ersten Reagenz, das eine Kombination
von Polypeptiden umfasst, die Typus-spezifische Epitope, die für einen
ersten Typus eines Hepatitis C-Virus spezifisch sind, enthalten,
unter Bedingungen, welche die Bildung von ersten Epitop-Antikörper-Komplexen
ermöglicht;
- b) Prüfen
ob die Anwesenheit von ersten Epitop-Antikörper-Komplexen in der Probe;
- c) Kontaktieren der Probe mit einem zweiten Reagenz, das ein
weiteres Typus-spezifisches Epitop, das für einen zweiten Typus eines
Hepatitis-C-Virus spezifisch ist, umfasst, unter Bedingungen, welche
die Bindung eines zweiten Epitop-Antikörper-Komplexes erlaubt; und
- d) Prüfen
auf die Anwesenheit eines zweiten Epitop-Antikörper-Komplexes in der Probe,
wobei
die Epitope vom ersten Reagenz ausgewählt sind aus den Aminosäuresequenzen
PEGRTWAQ, STGKSWGK, SEGRSWAQ, FAQALPVW, FPPQALPPW, PDYEPPVVHG, PDYVPPVVHG,
PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG und PDYRPPVVHG, und wobei die Epitope vom
zweiten Reagenz ausgewählt
sind aus Epitopen der Kern-, NS4- und NS5-Bereichen des HCV.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum
Typisieren eines Hepatitis C-Virus, das die Schritte a) bis d) wie
oben angegeben umfasst, bei dem die Epitope ausgewählt sind
aus den Aminosäuresequenzen
CASHLPY, CASKAAL und ASKAAL.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Typisieren
eines Hepatitis C-Virus zur Verfügung,
das die Schritte umfasst:
- a) Kontaktieren einer
biologischen Probe mit einer Kombination von Antikörpern, die
für ein
erstes Epitop wie oben definiert spezifisch sind, unter Bedingungen,
welche die Bildung von Epitop-Antikörper-Komplexen ermöglichen;
- b) Prüfen
auf die Anwesenheit von Epitop-Antikörper-Komplexen in der Probe;
- c) Kontaktieren der Probe mit einem zweiten Reagenz, das eine
Kombination von Antikörpern,
die für
ein zweites Epitop wie oben definiert spezifisch sind, umfasst,
unter Bedingungen, welche die Bildung von Epitop-Antikörper-Komplexen ermöglichen;
und
- d) Prüfen
auf die Anwesenheit von zweiten Epitop-Antikörper-Komplexen in der Probe.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Gruppe von Polypeptiden
oder Polypeptidreagentien, die Kombinationen von Typus-spezifischen
Epitopen und/oder Typus-Cluster-spezifischen
Epitopen enthalten, wie sie in Ansprüchen 4 bis 8 definiert sind.
Die Polypeptide sind von drei verschiedenen Regionen aus dem HCV-Genom
abgeleitet. Eine Gruppe von Polypeptiden beinhaltet ein Typus-spezifisches Epitop
oder Typus-Cluster-spezifisches Epitop, das aus der HCV-Kernregion
erhalten wurde. Diese erste Gruppe befindet sich zwischen den Aminosäureresten
67 und 48 von HCV-1 und homologen Regionen von anderen Typen des HCV.
Wie hier verwendet sind die Aminosäureresteabkürzungen wie folgt: A, Alanin;
I, Isoleucin; L, Leucin; M, Methionin; F, Phenylalanin; P, Prolin;
W, Tryptophan; V, Valin; N, Asparagin; C, Cystein; Q, Glutamin;
G, Glycin; S, Serin; T, Threonin; Y, Tyrosin; R, Arginin; H, Histidin;
K, Lysin; D, Aspartansäure;
und E, Glutaminsäure.
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Die
einzelnen Aminosäurerestsequenzen,
die aus der Kernregion abgeleitet wurden, und Subtypen, von denen
sie abgeleitet wurden, sind wie folgt:
- 1. PEGRTWAQ,
Subtypus 1a oder 1b.
- 2. STGKSWGK, Subtypus 2a oder 2b.
- 3. SEGRSWAQ, Subtypus 3a oder 4.
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Eine
weitere Gruppe von Polypeptiden beinhaltet ein Typus-spezifisches
Epitop, das aus der nicht-strukturellen Region 4 des HCV (NS4) erhalten
wurde. Diese zweite Gruppe wird zwischen den Aminosäureresten
1689–1718
von HCV-1 und homologen Regionen von anderen Typen des HCV gefunden.
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Die
einzelnen Aminosäurerestesequenzen
und Typen oder Subtypen, von denen sie hergeleitet sind, sind wie
folgt:
- 1. CSQHLPY, Subtypus 1a.
- 2. CASHLPY, Subtypus 1b.
- 3. CASRAAL, Subtypus 2a oder 2b.
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Eine
weitere Gruppe von Polypeptiden beinhaltet ein Typus-spezifisches
Epitop oder Typus-Cluster-spezifische Epitope, die aus der nicht-strukturellen
Region 5 (NS5) eines Hepatitis C-Virus erhalten wurden. Diese Gruppe
wird zwischen den Aminosäureresten
2281–2313
von HCV-1 und homologen Regionen von anderen Typen von Hepatitis
C-Virus gefunden.
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Die
einzelnen Aminosäurerestesequenzen
und Typen oder Subtypen, von denen sie abgeleitet sind, sind wie
folgt:
- 1. PDYEPPVVHG, Subtypus 1a.
- 2. PDYVPPVVHG, Subtypus 1b.
- 3. PDYQPATVAG, Subtypus 2a.
- 4. PGYEPPTVLG, Subtypus 2b.
- 5. FAQASPVW, Subtypus 1a.
- 6. FPPQALPIW, Subtypus 1b.
- 7. FPQALPAW, Subtypus 2a.
- 8. FPPQALPPW, Subtypus 2b.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
ein Flussdiagramm der experimentellen Strategie des Serotypisierens.
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2 ist
ein Flussdiagramm der umfassenden Epitopkartierungsstrategie.
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3 ist
ein Kombination von Graphen, welche die Ergebnisse der Epitopenkartierung
von HCV 1a (Rodney) darstellen.
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4 ist
eine Kombination von Graphen, welche die Ergebnisse der Epitopenkartierung
von HCV 2b (Nomoto) darstellt.
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Definitionen
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”Hepatitis
C-Virus” oder ”HCV” bezieht
sich auf die viralen Arten, von denen pathogene Typen NANBH verursachen,
und abgeschwächte
Typen oder fehlerhafte interferierende Partikel, die davon abgeleitet
sind. Vergleiche allgemein Veröffentlichungen,
die in dem mit ”Hintergrund” bezeichneten
Bereich zitiert sind. Das HCV-Genom ist aus RNA zusammengesetzt.
RNA-enthaltende Viren haben verhältnismäßig hohe
Raten von spontaner Mutation, wie berichtet in der Größenordnung
von 10–3 bis
10–4 pro
eingebautem Nukleotid. Fields & Knipe
(1986) ”Fundamental
Virology” (Rauen
Press, NY). Da Heterogenität
und Fluidität
des Genotypes in RNA-Viren
inhärent
sind, gibt es vielzählige
Typen/Subtypen innerhalb der HCV-Arten, welche virulent oder avirulent
sein können.
Die Propagierung, Identifizierung, Detektierung und Isolierung von
verschiedenen HCV-Typen oder -Isolaten wird in der Literatur dokumentiert.
Wie hier geschildert, sind alle Nukleotide und Aminosäurerestesequenzen
von den angegebenen HCV-Typen. Die Anzahl der HCV-1-Genom- und Aminosäurerestesequenzen
ist wie in Choo et al. (1990) Brit. Med. Bull., 46: 423–441 beschrieben.
Die hier enthaltene Offenbarung erlaubt die Diagnose der verschiedenen
Typen.
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Wie
hier verwendet bezieht sich ”Typus” auf HCVs,
die genotypisch um mehr als 30% differieren; ”Subtypus” bezieht sich auf HCVs, die
genotypisch um ungefähr
10–20%
differieren und ”Isolat” bezieht
sich auf HCVs, die genotypisch um ungefähr weniger als 10% differieren. ”Typisieren” bezieht
sich auf das Unterscheiden eines Typus von HCV von einem anderen
Typus.
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Informationen
zu mehreren verschiedenen HCV-Typen/Subtypen
sind in der internationalen Veröffentlichungsnr.
WO 93/00365 offenbart,
im Besonderen Typus oder Subtypus CDC/HCV1 (auch als HCV-1 bezeichnet).
Die Informationen von einem Typus oder Subtypus, wie z. B. partielle
genomische oder Aminosäuresequenz,
ist ausreichend, es dem Fachmann zu erlauben, bei Verwendung von
Standardtechniken neue Typen von HCV zu isolieren. Beispielsweise
wurden mehrere verschiedene Typen von HCV wie unten beschrieben
durchmustert. Diese Typen, die aus einer Anzahl von menschlichen
Seren (und aus verschiedenen geographischen Bereichen) erhalten
wurden, wurden durch Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren
und Reagenzien typisiert.
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Die
genomische Struktur und die Nukleotidsequenz der HCV-1-genomischen
RNA wurde gefolgert. Das Genom scheint eine 10000 Nukleotide enthaltende
einzelsträngige
RNA zu sein. Das Genom ist in Positivstrang-Anordnung und enthält einen
durchgehenden, translationellen offenen Leserahmen (ORF), der für eine Polyprotein
von ungefähr
3000 Aminosäuren
kodiert. In dem ORF scheinen das strukturelle Protein/die strukturellen
Proteine in ungefähr
dem ersten Viertel der Amino-terminalen Region kodiert zu sein,
mit dem Großteil
des Polyproteins verantwortlich für nicht-strukturelle (NS)-Proteine. Beim Vergleich
mit allen bekannten viralen Sequenzen werden kleine aber signifikante
Co-lineare Homologien mit den nicht-strukturellen (NS)-Proteinen
der Flavivirus-Familie und mit den Pestiviren (welche nun auch als
Teil der Flaviviren-Familie angesehen werden) beobachtet.
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Basierend
auf dem mutmaßlichen,
in der Nukleotidsequenz von HCV-1 kodierten Aminosäureresten und
anderen Fakten werden mögliche
Proteindomänen
des kodierten HCV-Proteins ebenso wie die ungefähren Grenzen in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1
Vermutete
Domäne | Angenäherte Grenze
(Aminosäurenr.) |
C (Nukleocapsidprotein) | 1–191 |
E1 (Virionhüllprotein) | 192–383 |
E2/NS 1 (Hülle) | 384–800 |
NS 2 (unbekannte
Funktion) | 800–1050 |
NS 3 (Protease) | 1050–1650 |
NS 4 (unbekannte
Funktion) | 1651–2100 |
NS 5 (Polymerase) | 2100–3011 (Ende) |
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Diese
Domänen
sind Schätzwerte.
Beispielsweise liegt die E1-NS2-Grenze vermutlich in der 57–810-Region
und die NS3-NS4-Grenze
bei ungefähr
1640–1650.
Es gibt auch Anhaltspunkte, dass die 191-Aminosäure (AS)-Version von C ein
Präcursor
ist und weiter bis zu einer Länge
von ungefähr
170 AS prozessiert wird; und dass die NS2-, NS4- und NS5-Proteine
jeweils weiter in zwei reife Proteine prozessiert werden.
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Verschiedene
Typen des HCV werden entsprechend verschiedener Kriterien definiert,
wie z. B. einem ORF von ungefähr
9000 Nukleotiden bis ungefähr
12000 Nukleotiden, der für
ein Polyprotein, ähnlich
in der Größe wie dem
des HCV-1, kodiert, einem kodierten Polyprotein von ähnlichem
hydrophoben und/oder antigenischem Charakter zu dem des HCV-1, und dem Vorkommen
von co-linearen Polypeptidsequenzen, die mit HCV-1 konserviert sind.
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Die
folgenden Parameter von Nukleinsäurehomologie
und Aminosäurehomologie
sind entweder allein oder in Kombination beim Identifizieren von
HCV-Typen anwendbar. Allgemein sind, wie oben beschrieben, unterschiedliche
Typen des HCV ungefähr
70% homolog, während
Subtypen ungefähr
80–90%
homolog und Isolate ungefähr
90% homolog sind.
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Wie
hier verwendet bezieht sich ein von einer bezeichneten Sequenz ”abgeleitetes” Polynukleotid
auf eine Polynukleotidsequenz, die aus einer Sequenz von mindestens
ungefähr
6 Nukleotiden, bevorzugt mindestens ungefähr 8 Nukleotiden, bevorzugter
von mindestens ungefähr
10–12
Nukleotiden und noch bevorzugter von mindestens ungefähr 15–20 Nukleotiden,
die einer Region der bezeichneten Nukleotidsequenz entsprechen,
zusammengesetzt ist. ”Entsprechend” bedeutet
homolog zu oder komplementär
mit der bezeichneten Sequenz. Bevorzugt ist die Sequenz von der
Region, aus der das Polynukleotid abgeleitet ist, homolog mit oder
komplementär
zu einer Sequenz, welche einzigartig in einem HCV-Genom ist. Hybridisierungstechniken zum
Bestimmen der Komplementarität
von Nukleinsäuresequenzen
sind dem Fachmann bekannt. Siehe z. B. Maniatis et al. (1982). Zusätzlich können Fehlpaarungen
von Doppelstrangpolynukleotiden, die durch Hybridisierung gebildet
werden, durch bekannte Techniken bestimmt werden, einschließlich z.
B. Verdau mit einer Nuklease wie z. B. S1, welche spezifisch einzelsträngige Bereiche
in Doppelstrangpolynukleotiden verdaut. Bereiche von denen typische
DNA-Sequenzen ”abgeleitet” werden
können
beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, z. B. für Typus-spezifische
Epitope kodierende Regionen ebenso wie nicht-transkribierte und/oder nicht-translatierte Regionen.
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Das
abgeleitete Polynukleotid ist nicht notwendigerweise physisch aus
der gezeigten Nukleotidsequenz abgeleitet, sondern kann auf jegliche
Weise hergestellt werden, einschließlich z. B. chemische Synthese oder
DNA-Replikation oder reverse Transkription oder Transkription. Zusätzlich können Kombinationen
von Regionen, die der bezeichneten Sequenz entsprechen, auf Weisen
modifiziert werden, die im Fachbereich als mit der beabsichtigten
Verwendung konsistent bekannt sind.
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Auf
die gleiche Art und Weise bezieht sich eine von einer bezeichneten
Aminosäure-
oder Nukleinsäuresequenz ”abgeleitete” Polypeptid-
oder Aminosäuresequenz
auf ein Polypeptid, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die identisch
mit der eines in der Sequenz kodierten Polypeptids ist, oder einen
Teil davon, wobei der Teil aus mindestens 3–5 Aminosäuren, bevorzugter aus mindestens
8–10 Aminosäuren und
noch bevorzugter aus mindestens 11–15 Aminosäuren besteht, oder welche mit
einem in diese Sequenz kodierten Polypeptid immunologisch identifizierbar
ist. Diese Terminologie schließt
auch ein aus einer bezeichneten Nukleinsäuresequenz exprimiertes Polypeptid
ein.
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Ein
rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid wird nicht notwendigerweise
von einer bezeichneten Nukleinsäuresequenz
translatiert; es kann auf jede Weise hergestellt werden, einschließlich zum
Beispiel chemische Synthese, oder Expression eines rekombinanten
Expressionssystems, oder Isolierung aus HCV, einschließlich mutiertem
HCV. Die hier beschriebenen Polypeptide sind im Allgemeinen verhältnismäßig kurz
und werden daher relativ einfach chemisch synthetisiert.
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Ein
rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid kann ein oder mehrere
Analoga von Aminosäuren oder
nicht-natürliche
Aminosäuren
in seiner Sequenz beinhalten. Verfahren zum Einfügen von Analogen von Aminosäuren in
eine Sequenz sind dem Fachmann bekannt. Es kann ferner eine oder
mehrere Markierungen enthalten, welche dem Fachmann bekannt sind.
Eine detaillierte Beschreibung von Analoga und ”Mimotopen” befindet sich in
US-Patent-Nr. 5,194,392 .
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Peptidanaloga
beinhalten Deletionen, Additionen, Substitutionen oder Modifikationen
davon, welche das HCV-typisierende
Vermögen
erhält.
Bevorzugte ”Substitutionen” sind solche,
die konservativ sind, d. h. bei denen ein Rest durch einen anderen
des gleichen allgemeinen Typus ersetzt ist. Wie allgemein gut bekannt ist
können
natürlicherweise
vorkommende Aminosäuren
als sauer, basisch, neutral und polar oder neutral und nicht-polar
unterklassifiziert werden. Weiterhin sind drei der kodierten Aminosäuren aromatisch.
Es wird allgemein bevorzugt, dass kodierte Polypeptide, die sich
von dem natürlichen
Epitop unterscheiden, substituierte Codons für Aminosäure enthalten, die aus der
gleichen Gruppe wie die von der ersetzten Aminosäure stammen. Daher sind im
Allgemeinen die basischen Aminosäuren
Lys, Arg und His austauschbar; die sauren Aminosäuren Aspartan (Säure) und
Glutamin (Säure)
sind austauschbar; die neutralen, polaren Aminosäuren Ser, Thr, Cys, Gln und
Asn sind austauschbar; die nicht-polaren, aliphatischen Aminosäuren Gly,
Ala, Val, Ile und Leu sind untereinander konservativ (jedoch sind
wegen der Größe Gly und
Ala näher
verwandt und Val, Ile und Leu näher
verwandt), und die aromatischen Aminosäuren Phe, Trp und Tyr sind
austauschbar. Da Prolin eine nicht-polare, neutrale Aminosäure ist,
bereitet sie Probleme, wegen ihrer Einflüsse auf die Konformation, und Substitutionen
durch oder für
Prolin sind nicht bevorzugt, mit der Ausnahme, dass die gleichen
oder ähnliche konformationelle
Ergebnisse erhalten werden können.
Polare Aminosäuren,
die konservative Wechsel darstellen, beinhalten Ser, Thr, Gln, Asn;
und in geringerem Maße
Met. Zusätzlich
scheinen, obwohl in verschiedene Kategorien klassifiziert, Ala,
Gly und Ser austauschbar zu sein, und Cys passt ebenfalls in diese
Gruppe, oder kann zusammen mit den polaren, neutralen Aminosäuren klassifiziert
werden.
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Es
sollte weiterhin beachtet werden, dass, wenn die Polypeptide synthetisch
hergestellt werden, Substitutionen durch Aminosäuren, die durch das Gen nicht
kodiert werden, ebenfalls gemacht werden können. Alternative Reste beinhalten
z. B. die Omega-Aminosäuren
der Formel H2N(CH2)nCOOH, wobei n 2–6 ist. Dieses sind neutrale-nicht-polare
Aminosäuren,
wie es Sarkosin (Sar), t-Butylalanin (t-BuA), t-Butylglycin (t-BuG), N-Methyl-Ile
(N-MeIle) und Norleucin (Nle) sind. Phenylglycin als eine aromatische,
neutrale Aminosäure
kann zum Beispiel Trp, Tyr oder Phe ersetzen; Citrullin (Cit) und
Methioninsulfoxid (MSO) sind polar, aber neutral, Cyclohexylalanin
(Cha) ist neutral und nicht-polar, Cysteinsäure (Cya) ist sauer und Ornithin
(Orn) ist basisch. Die Konformation, welche den Prolinresten Eigenschaften
verleiht, kann erhalten werden, wenn eines oder mehrere dieser durch
Hydroxyprolin (Hyp) ersetzt werden.
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Der
Begriff ”rekombinantes
Polynukleotid” wie
er hier benutzt wird, meint ein Polynukleotid mit genomischer, cDNA,
halbsynthetischer oder synthetischer Herkunft, welches bedingt durch
seine Herkunft oder Manipulation: (1) nicht mit dem gesamten oder
einem Teil eines Polynukleotids assoziiert ist, mit dem es natürlicherweise
assoziiert ist, (2) an ein anderes Polynukleotid geknüpft ist,
als dem, an das es natürlicherweise
geknüpft
ist, oder (3) in der Natur nicht vorkommt.
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Der
Begriff ”Polynukleotid” wie er
hier benutzt wird, bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden
jeglicher Länge,
entweder Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotide. Dieser Begriff
bezieht sich nur auf die Primärstruktur
des Moleküls.
Daher beinhaltet dieser Begriff Doppel- und Einzelsträngige DNA
und RNA. Es beinhaltet auch bekannte Arten der Modifizierung, z.
B. Markierungen, die dem Fachmann bekannt sind, Methylierung, ”Caps”, Substituierung
von einem oder mehreren natürlich
vorkommenden Nukleotiden mit einem Analog, Internukleotid-Modifizierungen
wie z. B. solche mit ungeladenen Verknüpfungen (z. B. Methylphosphonaten,
Phospho triester, Phosphoramidate, Carbamate, etc.) und mit geladenen
Verknüpfungen
(z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, etc.), solche, die
Seitenketten, wie z. B. Proteine, einschließlich, aber nicht beschränkt auf,
Nukleasen, Toxine, Antikörper,
Signalpeptide und Poly-L-Lysin, enthalten; solche mit Intercalatoren
(z. B. Acridin, Psoralen, etc.), solche, die Chelatoren (z. B. Metall,
radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle, etc.) enthalten, solche
die Alkylatoren enthalten, solche mit modifizierten Verknüpfungen
(z. B. alpha-anomere Nukleinsäuren,
etc.), ebenso wie unmodifizierte Formen des Polynukleotids. Die
hier beschriebenen Polynukleotide sind verhältnismäßig kurz und werden deshalb
sehr einfach chemisch synthetisiert.
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Ein ”aufgereinigtes” Polypeptid
bezieht sich auf das Polypeptid in einem Zustand, der im Wesentlichen frei
von anderen Polypeptiden ist, d. h. in einer Zusammensetzung, die
ein Minimum von ungefähr
50 Gewichts-Prozent (gewünschtes
Polypeptid/Gesamtpolypeptid in der Zusammensetzung), bevorzugt ein
Minimum von ungefähr
70% und noch bevorzugter ein Minimum von ungefähr 90% des gewünschten
Polypeptids beinhaltet, ohne Berücksichtigung
der nicht-proteinartigen Materialien in der Zusammensetzung. Techniken zum
Aufreinigen viraler Polypeptide sind im Fach bekannt. Aufgereinigte
Antikörper
werden im Fachbereich auf die gleiche Art und Weise definiert.
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”Epitop”, wie hier
verwendet, bezieht sich auf eine antigenische Determinante eines
Polypeptids. Ein Epitop kann drei oder mehr Aminosäuren umfassen,
welche die Bindungsstelle eines Antikörpers definieren. Im Allgemeinen
besteht ein Epitop aus mindestens fünf Aminosäuren und besteht manchmal aus
mindestens acht Aminosäuren.
Verfahren zum Kartieren von Epitopen sind im Fachbereich bekannt.
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”Typus-spezifisches
Epitop”,
wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Epitop, das in
einem HCV-Typus gefunden wird. Ein ”Typus-Cluster-spezifisches
Epitop” wird
in mehr als einem, aber weniger als allen HZV-Typen gefunden. Zum
Beispiel kann ein bestimmtes Epitop durch Antikörper aus einem, mit HCV-1 infizierten,
Patient erkannt werden, jedoch nicht oder weniger effektiv durch
Antikörper
aus einem mit HCV-2 infizierten Patienten erkannt werden. Gleichermaßen kann
ein aus HCV-3 abgeleitetes Typus-Cluster-spezifisches Epitop durch
Antikörper
aus einem mit HCV-3 oder HCV-4 infizierten Patienten erkannt werden,
aber nicht durch Antikörper
aus einem mit HCV-1 oder HCV-2 infizierten Patienten. ”Konservierte
Epitope” sind
solche, die durch Antikörper,
die spezifisch für
alle HCV-Typen sind, erkannt werden.
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Ein
Polypeptid ist ”immunologisch
reaktiv” mit
einem Antikörper,
das an dieses Peptid wegen der Antikörper-Erkennung eines spezifischen Epitops,
das in dem Polypeptid enthalten ist, bindet. Immunologische Reaktivität kann durch
Antikörper-Bindung
bestimmt werden, insbesondere durch die Kinetiken der Antikörper-Bindung
und/oder durch Wettbewerb (”Competition”) bei der
Bindung bei Verwendung bekannter Polypeptide, die ein Epitop enthalten,
gegen welches der Antikörper
gerichtet ist, als Kompetitoren. Die Techniken zum Bestimmen, ob
ein Polypeptid immunologisch reaktiv mit einem Antikörper ist,
sind im Fachbereich bekannt.
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Wie
hier verwendet bezieht sich der Begriff ”Antikörper” auf ein Polypeptid oder Gruppe
von Polypeptiden, die aus mindestens einer Antikörper-kombinierenden Stelle
zusammengesetzt sind. Eine ”Antikörper-kombinierende
Stelle” oder ”Bindedomäne” wird durch
das Falten variabler Domänen
eines Antikörpermolekül(s) zum
Ausbilden dreidimensionaler Binderäume mit einer inneren Oberflächenform
und Ladungsverteilung komplementär
zu den Eigenschaften eines Epitops eines Antigens gebildet, welche
die immunologische Reaktion mit dem Antigen ermöglicht. Eine Antikörper-kombinierende
Stelle kann aus einer schweren- und/oder einer leichten-Kettendomäne (VH bzw. VL) gebildet
werden, welche hypervariable Schleifen bilden, die zur Antigenbindung beitragen.
Der Begriff ”Antikörper” umfasst
zum Beispiel vertebraten Antikörper,
Hybrid-Antikörper,
chimäre
Antikörper,
veränderte
Antikörper,
einwertige Antikörper,
die Fab-Proteine und Einzeldomänen-Antikörper.
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Gegenüber Polypeptiden
spezifische Antikörper
und Polypeptide können
durch jedes im Fachbereich bekannte Verfahren hergestellt werden.
Zum Beispiel werden die Polypeptide im Allgemeinen in einem physiologisch
akzeptablen Puffer suspendiert, mit einem geeigneten Adjuvans gemischt
und in ein Tier injiziert. Verfahren zum Herstellen polyklonaler
und monoklonaler Antikörper
sind im Fachbereich bekannt und werden im Detail hier nicht beschrieben.
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Der
Begriff ”Polypeptid” bezieht
sich auf ein Polymer von Aminosäuren
und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produktes; daher sind
Polypeptide, Oligopeptide und Proteine innerhalb der Definition des
Polypeptids beinhaltet. Der Begriff bezieht sich auch nicht auf
Modifikationen des Polypeptids nach der Expression oder schließt diese
aus, z. B. Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung und dergleichen. Enthalten
innerhalb der Definition sind z. B. Polypeptide, die ein oder mehrere
Analoge einer Aminosäure
(einschließlich
z. B. unnatürliche
Aminosäuren,
etc.) enthalten, Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen ebenso
wie andere im Fachbereich bekannte Modifikationen, jeweils natürlicherweise
vorkommend und in der Natur nicht vorkommend.
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”Behandlung” wie hier
verwendet bezieht sich auf Prophylaxe und/oder Therapie.
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Ein ”Individuum”, wie hier
verwendet, bezieht sich auf Vertebraten, im Besonderen Mitglieder
der Säugetierart,
und beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf, Tiere (z. B. Hunde,
Katzen, Rinder, Schweine, Schafe, Ziegen, Kaninchen, Mäuse, Ratten,
Meerschweinchen, etc.) und Primaten einschließlich Affen, Schimpansen, Paviane
und Menschen.
-
Wie
hier verwendet enthält
der ”Sinnstrang” einer
Nukleinsäure
die Sequenz, welche Sequenzhomologie zu der von mRNA hat. Der ”Gegensinnstrang” enthält eine
Sequenz, welche komplementär
zu der des ”Sinnstranges” ist.
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Wie
hier verwendet ist ein ”Genom
in Positivstranganordnung” eines
Virus eines, in dem das Genom, ob RNA oder DNA, einzelsträngig ist
und welches für
ein virales Polypeptid (e) kodiert. Beispiele von RNA-Viren mit
Positivstranganordnung beinhalten Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae,
Picornaviridae und Caliciviridae. Ebenfalls beinhaltet sind die
Flaviviridae, welche früher
als Togaviridae klassifiziert wurden. Siehe Fields & Knipe (1986).
-
Wie
hier verwendet bezieht sich ”Antikörper-enthaltende
Körperprobe” auf eine
Komponente des Körpers
eines Individuums, welche eine Quelle für die Antikörper von Interesse ist. Antikörper-enthaltende
Körperkomponenten
sind im Fachbereich bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
zum Beispiel Plasma, Serum, Spinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit,
die äußeren Bereiche
der respiratorischen, intestinalen und Urogenitaltrakte, Tränen, Speichel,
Milch, weiße
Blutzellen und Myeloma.
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Wie
hier verwendet bezieht sich eine ”biologische Probe” auf eine
Gewebsprobe oder Flüssigkeit,
die aus einem Individuum isoliert wurde, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, zum Beispiel Plasma, Serum, Spinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit,
die äußeren Bereiche
der Haut, des respiratorischen, intestinalen und Urogenitaltraktes,
Tränen,
Speichel, Milch, Blutzellen, Tumore, Organe. Ebenfalls umfasst sind
Proben von in vitro-Zellkulturbestandteilen
(einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, aus dem Wachstum von Zellen in Kulturmedium resultierende konditioniertem
Medium, mutmaßlich
viral infizierte Zellen, rekombinante Zellen und Zellkomponenten).
-
Mittel zum Ausführen der
Erfindung
-
Der
praktische Teil der vorliegenden Erfindung wird, soweit nicht anders
angegeben, konventionelle Techniken aus der Molekularbiologie, Mikrobiologie,
rekombinanten DNA, Polypeptid- und Nukleinsäuresynthese und Immunologie
verwenden, welche innerhalb dem Vermögen des Fachmanns liegen. Derartige
Techniken sind vollständig
in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. Maniatis, Fitsch & Sambrook, ”Molecular
Cloning: A Laboratory Manual” (1982); ”DNA Cloning,
Volumes I and II” (D.
N. Glover Hrsg. 1985); ”Oligonucleotide
Synthesis” (M.
J. Gait Hrsg., 1984); ”Nuclei
Acid Hybridization” (B.
D. Hames & S.
J. Higgins Hrsg. 1984); ”Transcription
and Translation” (B.
D. Hames & S.
J. Higgins Hrsg. 1984); ”Animal
Cell Culture” (R.
I. Freshney Hrsg. 1986); ”Immobilized
Cells and Enzymes” (IRL
Press, 1986); B. Perbal, ”A
Practical Guide To Molecular Cloning” (1984); die Serie ”Methods
in Enzymology” (Academic
Press, Inc.); ”Gene
Transfer Vectors For Mammalian Cells” (J. H. Miller und M. P. Carlos
Hrsg., 1984, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth. Enzymol., Band 154
und Band 155 (Wu und Grossman bzw. Wu, Hrsg.), Mayer und Walker,
Hrsg. (1987), ”Immunochemical Methods
In Cell And Molecular Biology” (Academic
Press, London); Scopes, (1987) ”Protein
Purification: Principles and Practice”, zweite Auflage (Springer-Verlag,
N. Y.); und ”Handbook
of Experimental Immunology”, Bände I–IV (D.
M. Weir und C. C. Blackwell Hrsg. 1986).
-
Die
Erfindung beinhaltet Verfahren zum Detektieren von HCV und zum Identifizieren
von Infektion durch verschiedene Typen des HCV. Die Erfindung umfasst
auch Polypeptide und Nukleinsäuremoleküle zum Gebrauch
in diesen Verfahren.
-
Die
Verfahren zum Detektieren und Typisieren einer Infektion durch HCV
beinhalten sowohl Immunotests als auch Nukleinsäureidentifizierung durch Verfahren,
die Southern Blot-Analyse und Polymerase-Kettenreaktion einschließen, aber nicht
darauf beschränkt
sind. Um eine Infektion durch HCV zu identifizieren, wird eine biologische
Probe mit einem der spezifischen Epitope oder Typus-Cluster-spezifischen
Epitope unter Bedingungen inkubiert, die Antigen-Antikörper-Bindung
erlauben; mit einem zweiten Typus-spezifischen Epitop oder Typus-Cluster-spezifischen
Epitop unter Bedingungen kontaktiert, die Antigen-Antikörper-Bindung und
Bestimmen ermöglichen,
ob Antikörper
in der Probe entweder an das erste oder zweite Epitop binden. Diese
Schritte können
mit jeder beliebigen Anzahl von Polypeptiden, die Typus- und/oder
Typus-Cluster-spezifische Epitope enthalten, wiederholt werden.
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Typischerweise
beinhaltet ein Immunotest auf einen/mehrere Anti-HCV-Antikörper Selektieren
und Vorbereiten der Testprobe, die im Verdacht steht, die Antikörper zu
enthalten, wie z. B. eine biologische Probe, dann Inkubieren dieser
mit dem Typus-spezifischen Epitop oder Typus-Cluster-spezifischen Epitop
unter Bedingungen, die es Antigen-Antikörper-Komplexen ermöglichen,
sich zu bilden, und dann Detektieren der Bildung derartiger Komplexe.
Geeignete Inkubierungsbedingungen sind im Fachbereich gut bekannt.
Der Immunotest kann, ohne Einschränkungen, ein heterogenes oder
ein homogenes Format haben und zum Standard- oder kompetitiven Typus
gehören.
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In
einem heterogenen Format ist das Typus-spezifische Epitop oder Typus-Cluster-spezifische
Epitop an einen festen Träger
gebunden, um die Trennung der Probe von dem Polypeptid nach Inkubation
zu erleichtern. Beispiele fester Träger, die verwendet werden können, beinhalten,
sind aber nicht beschränkt
auf, Nitrozellulose (d. h. in Form einer Membran oder Vertiefung
einer Mikrotiterplatte), Polyvinylchlorid (d. h. in Blattform oder
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte), Polystyren-Latex (d. h. in
Kugelform oder den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte), Polyvinylidinfluorid
(bekannt als Immunlon®) diazotisiertes Papier,
Nylonmembranen, aktivierte Kügelchen
und Protein A-Kügelchen.
Beispielsweise können Dynatech
Immunlon® 1
oder Immunion® 2-Mikrotiterplatten
oder 6,25 mm (0,25 inch) Polystyrenkügelchen (Precision Plastic
Ball) in dem heterogenen Format verwendet werden. Der das Typus-spezifische
Epitop oder Typus-Cluster-Epitop enthaltende Träger wird typischerweise nachdem
er von der Testprobe getrennt wurde und vor der Detektierung gebundene
Antikörper
gewaschen. Sowohl Standard als auch kompetitive Formate sind im
Fachbereich bekannt.
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In
einem homogenen Format wird die Testprobe in Lösung mit dem Typus-spezifischen
Epitop oder Typus-Cluster-spezifischen
Epitop inkubiert. Dies könnte
beispielsweise unter Bedingungen erfolgen, die alle Antigen-Antikörper-Komplexe ausfällen, die
gebildet werden. Sowohl Standard- als auch kompetitive Formate für diese
Tests sind im Fachbereich bekannt.
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In
einem Standardformat wird die Menge von HCV-Antikörpern, welche den Antikörper-Typus-
oder -Typus-Cluster-spezifisches
Epitop-Komplex bildet, direkt überwacht.
Dies kann durch Bestimmen, ob markierte Anti-Xenogene (d. h. anti-human)
Antikörper,
die ein Epitop auf Anti-HCV-Antikörpern erkennen,
durch Komplexbildung binden werden, durchgeführt werden. In einem kompetitiven
Format wird die Menge von HCV-Antikörpern in der Probe durch Überwachen
des kompetitiven Einflusses auf die Bindung einer bekannten Menge eines
markierten Antikörpers
(oder eines anderen kompetitierenden Liganden) in dem Komplex gefolgert.
-
In
einem Inhibitionstest wird die Fähigkeit
von Antikörpern
bestimmt, an Polypeptide zu binden, die verschiedene unterschiedliche
Typus-spezifische Epitope zu Typus-Cluster-spezifischen Epitopen
enthalten. Die Antikörper
werden zuerst mit Polypeptiden exponiert, die ein Epitop/mehrere
Epitope von einem Typus- oder Typus-Cluster von HCV enthalten und
dann mit Polypeptiden exponiert, die ein Epitop/mehrere Epitope
von einem anderen Typus oder Typus-Cluster von HCV enthalten. Dieses
Verfahren kann für
weitere Typen oder Typen-Cluster von HCV wiederholt werden.
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Gebildete
Komplexe, die Anti-HCV-Antikörper
umfassen (oder im Fall von kompetitiven Tests die Menge des kompetitierenden
Antikörpers)
werden durch eine Anzahl von bekannten Techniken, abhängig vom
Format, detektiert. Beispielsweise können unmarkierte HCV-Antikörper in
dem Komplex durch Verwendung eines Konjugats von antixenogenischem
Ig, das mit einer Markierung (d. h. einer Enzymmarkierung) komplexiert
ist, detektiert werden.
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In
typischen Immunotests wird die Testprobe, üblicherweise eine biologische
Probe, mit Polypeptiden, die ein oder mehrere Typus-spezifische
Epitopen oder Typus-Cluster-spezifische
Epitope enthalten, unter Bedingungen inkubiert, welche die Bildung
von Antigen-Antikörper-Komplexen ermöglichen.
Verschiedene Formate können
angewendet werden. Beispielsweise kann ein ”Sandwich Assay” verwendet
werden, bei dem an einen festen Träger gebundener Antikörper mit
der Testprobe inkubiert; gewaschen; inkubiert wird mit einem zweiten,
markierten Antikörper
gegen das Analyt und der Träger
erneut gewaschen wird. Detektiert wird das Analyt durch Bestimmen,
ob der zweite Antikörper
an den Träger
gebunden ist. In einem kompetitiven Format, das entweder heterogen
oder homogen sein kann, wird eine Testprobe für gewöhnlich mit einem Antikörper inkubiert
und ein markiertes, kompetitierendes Antigen wird ebenfalls inkubiert,
entweder nacheinander oder gleichzeitig. Diese und andere Formate
sind im Fachbereich gut bekannt.
-
Gegen
die Typus-spezifischen Epitope oder Typus-Cluster-spezifischen Epitope
gerichtete Antikörper können in
Immunotests zur Detektierung von viralen Antigenen in Patienten
mit HCV, (das) NANBH verursacht, und in infektiösen Blutspendern verwendet
werden. Weiterhin können
diese Antikörper
sehr nützlich
sein beim Detektieren von Spendern und Patienten in der akuten Phase.
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Ein
Immunotest kann zum Beispiel einen monoklonalen Antikörper, der
gegen ein Typus-spezifisches Epitop oder Typus-Cluster-spezifische
Epitope gerichtet ist, eine Kombination von monoklonalen Antikörpern, die
gegen Epitope eines viralen Antigens gerichtet sind, monoklonale
Antikörper,
die gegen Epitope verschiedener viraler Antigene gerichtet sind,
polyklonale Antikörper,
die gegen das gleiche virale Antigen gerichtet sind, oder polyklonale
Antikörper,
die gegen verschiedene virale Antigene gerichtet sind verwenden.
Protokolle können
auch zum Beispiel Kompetition, oder direkte Reaktion, oder Sandwich-artige
Tests gestützt
sein. Protokolle können
ebenfalls zum Beispiel feste Träger
verwenden oder mittels Immunofällung
erfolgen. Die meisten Tests beinhalten die Verwendung von markiertem
Antikörper
oder Polypeptid; die Markierungen können fluoreszierend, chemiluminescent,
radioaktiv oder Farbmoleküle
sein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Ebenfalls bekannt sind
Tests, welche die Signale aus der Sonde verstärken; Beispiele dafür sind Tests,
die Biotin und Avidin einsetzen, und Enzymmarkierte und -vermittelte
Immunotests, wie z. B. ELISA-Tests.
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Die
Erfindung schließt
weiterhin Nukleinsäuremoleküle ein,
die für
die beschriebenen Aminosäuresequenzen
der Typus-spezifischen
Epitope und Typus-Cluster-spezifischen Epitope kodieren. Diese Nukleinsäuremoleküle sind
als Sonden nützlich,
zum Beispiel in Southern Blots oder anderen DNA-Erkennungstests wie z. B. der in
US-Patent-Nr. 4,868,105 und
5,124,246 beschriebene ”Capture
Assay”.
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Die
Untersuchungen zum antigenischen Kartieren durch Expression von
HCV-cDNAs zeigten, dass eine Anzahl in der diese cDNAs enthaltenden
Klone Polypeptide exprimierten, die immunologisch reaktiv mit Serum
aus NANBH zeigenden Individuen reaktiv waren. Kein einzelnes Polypeptid
war mit allen Seren immunologisch reaktiv. Fünf dieser Polypeptide waren
sehr immunogen, da die Antikörper
gegen die HCV-Epitope in diesen Polypeptiden in vielen verschiedenen
Patientenseren entdeckt wurden, obwohl die Überschneidung bei der Detektierung
nicht vollständig
war. Daher legen die Ergebnisse zur Immunogenität von diesen in den verschiedenen
Klonen kodierten Polypeptiden nahe, dass effiziente Detektierungssysteme
für HCV-Infektion die
Verwendung von Reihen von Epitopen beinhalten kann. Die Epitope
in der Reihe können
in eines oder viele Polypeptide konstruiert werden. Die Tests für die variierenden
Epitope können
aufeinanderfolgend oder gleichzeitig sein.
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Kits,
die für
Immunodiagnose geeignet sind, und die passenden markierten Reagenzien
enthalten, werden durch Verpacken der geeigneten Materialien, einschließlich der
Polypeptide der Erfindung, welche Typus-spezifische Epitope und
Typus-Cluster-spezifische Epitope oder gegen Typus-spezifische Epitope
und Typus-Cluster-spezifische Epitope gerichtete Antikörper einschließen, in
geeignete Container zusammen mit den verbleibenden Reagenzien und
Materialien, die für
die Durchführung
des Tests benötigt
werden, zusammen mit einem geeigneten Set von Testinstruktionen
zusammengesetzt.
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Die
Erfindung schließt
ferner Nukleinsäuremoleküle ein,
die komplementär
zu den Nukleinsäuresequenzen
sind, die für
die Typus-spezifischen Epitope und Typus-Cluster-spezifischen Epitope
kodierenden Regionen flankieren. Solche Nukleinsäuremoleküle sind beim Durchführen von
PCR zum Bestimmen des Genotypus eines bestimmten HCV nützlich.
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Es
ist zu beachten, dass variable und hypervariable Bereiche innerhalb
des HCV-Genoms (existieren); daher wird erwartet, dass die Homologie
in diesen Bereichen deutlich geringer als die in dem Gesamtgenom ist.
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Die
Techniken zum Bestimmen von Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzhomologie
sind im Fachbereich bekannt. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz
direkt bestimmt und mit den hier zur Verfügung gestellten Sequenzen verglichen
werden. Alternativ können
die Nukleotidsequenzen des genomischen Materials des mutmaßlichen
HCV bestimmt werden (üblicherweise über ein
cDNA-Zwischenprodukt), die dort kodierte Aminosäuresequenz kann bestimmt und
die entsprechenden Regionen verglichen werden.
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Die
vorangehende Diskussion und die vorangehenden Beispiele veranschaulichen
die Erfindung nur, der durchschnittliche Fachmann wird anerkennen,
dass die Erfindung auf andere Weisen durchgeführt werden kann, und die Erfindung
wird ausschließlich
durch Bezugnahme auf die Ansprüche
definiert.
-
Beispiel 1
-
Vergleich von Hauptepitopen von verschiedenen
unterschiedlichen Typen des HCV
-
Die
Aminosäureresthomologie
zwischen verschiedenen Typen und Subtypen von HCV wurde in verschiedenen
Bereichen verglichen. Der Subtypus von HCV ist wie durch Simmondsphylogenetische
Analyse beschrieben. Die Aminosäuresequenznummerierung
entspricht der für
die Prototyp-HCV-1-Sequenz beschriebenen. Choo et al. Tabelle 2
zeigt die Aminosäureresthomologie
für NS4-Region-Typus-spezifische
Epitope und Typus-Cluster-spezifische Epitope in Prozent und die
konservierten Hauptepitope. Tabelle 3 zeigt die Aminosäureresthomologie
zwischen zwei Typus-spezifischen Epitopen oder Typus-Cluster-spezifischen
Epitopen aus der NS5-Region. Tabelle 4 zeigt die Aminosäureresthomologie
für konservierte
Hauptepitope und Typus-spezifische Epitope aus der Kern-Region in
Prozent. Tabelle 2. Aminosäurehomologien (%) zwischen
verschiedenen HCV-Subtypen
HCV-Subtyp | Abkürzung der
Beispieltypen | Typus-spezifische Hauptepitope
der NS4-Region (1689–1718
AS)* | Konservierte
Hauptepitope der NS4-Region (1910–1936 AS)* |
1a | HCV-1
(1a) gegenüber (1a) | 100% | 100% |
1b | HCV-J
(1a) gegenüber (1b) | 83% | 100% |
2a | HCV-J6
(1a) gegenüber (2a) | 47% | 93% |
2b | HCV-J8
(1a) gegenüber (2b) | 43% | 93% |
Tabelle 3. Aminosäurehomologie (%) zwischen verschiedenen
HCV-Subtypen
HCV-Subtyp | Abkürzung der
Beispieltypen | Typus-spezifische Hauptepitope
der NS5-Region (2281–2313
AS)* | Konservierte
Hauptepitope der NS5-Region (2673–2707 AS)* |
1a | HCV-1
(1a) gegenüber (1a) | 100% | 100% |
1b | HCV-J
(1a) gegenüber (1b) | 76% | 89% |
2a | HCV-J6
(1a) gegenüber (2a) | 70% | 83% |
2b | HCV-J8
(1a) gegenüber (2b) | 73% | 83% |
3a | HCV-E-b1
(1a) gegenüber
(3a) | | 77% |
3b | HCV-Tb
(1a) gegenüber (3b) | | 83% |
Tabelle 4. Aminosäureresthomologie (%) zwischen
verschiedenen HCV-Subtypen
HCV-Subtyp | Abkürzung der
Beispieltypen | Typus-spezifische Hauptepitope
der Kern-Region (10–45 AS)* | Konservierte
Hauptepitope der Kern-Region (67–84 AS)* |
1a | HCV-1
(1a) gegenüber (1a) | 100% | 100% |
1b | HCV-J
(1a) gegenüber (1b) | 98% | 100% |
2a | HCV-J6
(1a) gegenüber (2a) | 98% | 61% |
2b | HCV-J8
(1a) gegenüber (2b) | 98% | 61% |
3a | HCV-E-b1
(1a) gegenüber
(3a) | 93% | 89% |
4 | HCV-EG-21
(1a) gegenüber
(4) | 98% | 83% |
-
Beispiel 2
-
Peptidsynthese
-
Zwei
Gruppen von Polypeptiden wurden synthetisiert. Die erste Gruppe
wurde entworfen, um Eptitopkartierung von HCV-1 durchzuführen, und
die zweite Gruppe wurde entworfen, um zu bestimmen, welche Epitope,
die in den Epitopkartierungsstudien identifiziert wurden, Typus-spezifische
Epitope enthalten. In der ersten Gruppe von Polypeptiden wurden
64 Sätze
(im Doppel) von überlappenden
Oktapeptiden durch Mimotope über
das gesamte HCV-1-Polyprotein (3011 Aminosäurereste) synthetisiert.
-
Die
zweite Gruppe von Polypeptiden wurde entsprechend dem von Geysen
(1990) J. Trop. Med. Pub. Health, 21: 523–533; und Merrifield (1963)
J. Am. Chem. Soc., 85: 2149–2154
beschriebenen Verfahren hergestellt. In der zweiten Gruppe von Polypeptiden
wurden vier antigenische Bereiche, welche die Hauptepitope von nicht-konservierten
Sequenzen in HCV-1 aus dem Kern, NS4, NS5 und deren entsprechenden
Sequenzen aus den HCV-Subtypen 1b, 2a, 3a und Typus 4 repräsentieren,
für Typus-spezifische
Epitopsynthese ausgewählt.
Die Sequenz aus dem Kern wurde aus der weniger konservierten Region
der Aminosäurereste
67–88 ausgewählt. Die
Sequenz aus der NS4-Region
wurde aus der Aminosäureresteregion
1689–1718
ausgewählt. Die
aus der NS5-Region ausgewählten
Sequenzen stammen aus den Aminosäureresteregionen
2281–2313 und
2673–2707.
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Beispiel 3
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Biologische Proben
-
Um
die Effektivität
der Polypeptide beim Unterscheiden zwischen Antikörpern, die
für verschiedene
Typen des HCV spezifisch sind, zu bestimmen, wurden Antiseren von
24 Patienten mit chronischer NANBH aus verschiedenen Gebieten der
Welt einschließlich
der Ost- und Westküste
der vereinigten Staaten, Japan, westeuropäischen Ländern, südeuropäischen Ländern und Südafrika gewonnen. Die Isolierung
viraler RNA, cDNA-Synthese, PCR-Amplifikation, DNA-Sequenzierung
und Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden wurde wie von Cha et
al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7144–7148 beschrieben durchgeführt.
-
Beispiel 4
-
Epitopkartierungsverfahren
-
Um
zu bestimmen, welche Regionen des HCV Epitope enthalten, ob gruppenspezifisch
oder konserviert (war), wurde das gesamte HCV-1-Polyprotein einer
Epitopkartierung unterzogen. Das verwendete Verfahren ist im Wesentlichen
wie in 2 dargestellt.
-
Vierundsechzig
Gruppen (im Duplikat) von überlappenden
Oktapeptiden wurden mittels Mimotopen® über das
gesamte HCV-1 Polyprotein (3011 Aminosäuren) synthetisiert. Eine Reihe
von 40 Proben, die 25 reaktive HCV-Antikörperproben aus den vereinigten
Staaten, 9 HCV-reaktive Proben aus Japan und 6 HCV-nicht-reaktive
negative Kontrollproben enthielt, wurde zur Epitopkartierung und
Clusteranalyse ausgewählt.
Die Immunotests wurden durch Verwendung von Standard-ELISA-Verfahren durchgeführt.
-
Die
Kriterien zum Identifizieren von Hauptepitopen basierten auf der
Antikörper-Reaktionssequenz und
der Antikörperreaktionsintensität (Titer)
auf diese Epitope. Die Ergebnisse sind in 3 und 4 dargestellt.
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Beispiel 5
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Peptid-abgeleiteter ”Enzyme-linked Immunosorbent
Assays”
-
Um
den optimalen, die in Beispiel 2 beschriebenen Polypeptide verwendenden
Immunotest zu bestimmen, wurden zwei getrennte Arten von Polypeptid-abgeleiteten ”Enzyme-linked
Immunosorbent Assays” (ELISA)
durchgeführt
und die Ergebnisse verglichen. Der erste Typ des ELISA war der Nunc
MaxiSorbTM, auf den die Peptide einfach
adsorbiert waren, und der zweite Typ verwendetete Nunc Covalink
NHTM, auf den die Polypeptide covalent geknüpft waren.
Die Bildung von Amidbindungen zwischen Carboxylsäuren und Arminen wird durch
die Zugabe von Carbodiimid gestartet. Um Hydrolyse zu verringern
kann der aktive Ester durch Zugabe von N-Hydroxy-Succinimid (NHS)
zum obigen Konjugationsverfahren gebildet werden.
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Die
Mikrotiterplatten für
die erste Art des ELISA wurden wie folgt vorbereitet. Die Polypeptide
wurden mit einer Konzentration von 1 μg/Vertiefung in 100 μl phosphatgepufferter
Salzlösung
(PBS) in die Vertiefungen der Nunc MaxiSorbTM-Mikrotiterplatten
gegeben. Die Polypeptide konnten bei Raumtemperatur über Nacht
absorbieren. Die Mikrotiterplatten wurden dann viermal mit PBS ohne
Detergens gewaschen. Die Vertiefungen wurden dann mit 220 μl Superblock® (Pierce)
für eine
Stunde nachträglich
bedeckt und dann ohne weiteres Waschen abgesaugt und vakuumgetrocknet.
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Der
Test wurde wie folgt durchgeführt.
Die Serumprobenmenge von 5 μl
wurde mit 100 μl
von 5% Magermilch zu den Vertiefungen gegeben und für eine Stunde
bei 37°C
inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann fünfmal mit PBS mit 0,05% Tween
gewaschen. Ein Konjugat aus affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-Human
IgG, das mit Meerrettich Peroxydase (Jackson Laboratories) markiert
war, wurde dann verwendet, um den Grad der Bindung von menschlichen
Antikörpern
an die Polypeptide zu bestimmen. Das Konjugat wurde vorher auf 5% IgG
in 150 mM NaCl, PBS, 5% Pferdeserum (hitzedenaturiert) verdünnt. 100 μl des Konjugats
wurde in die Vertiefungen gegeben und für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Die Vertiefungen wurden dann fünfmal
mit PBS/Tween gewaschen und OPD[o-Phenylen-Diamin-2HCL, eine Tablette
pro Entwicklungspuffer (Citratphosphat-gepuffertes 0,02% H2O2); Sigma] für 30 Minuten
bei Raumtemperatur (inkubiert) und die Abs bei 492 nm und 620 nm
wurde bestimmt. Die Grenze der Messgenauigkeit (”Cut off”) wurde mittels 200 zufälliger (normaler)
Proben ermittelt, bei denen 7 Standardabweichungen vom Mittelwert
oder ungefähr
0,45.
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Die
Mikrotiterplatten für
den zweiten ELISA-Typ wurden wie folgt vorbereitet. Die Polypeptide
wurden mit einer Konzentration von 10 mg/Vertiefung in 50 μl Wasser
in die Vertiefungen der Nunc MaxiSorbTM-Mikrotiterplatten
gegeben. 25 μl
von 0,1 M NHS (Sulfo-N-Hydrosuccinimid, Pierce) und 25 μl von 0,1
M EDC [1-Ethyl-3(3-Dimethylaminopropylcorboiimid) Sigma] wurden
zu den Polypeptiden zugegeben und bei Raumtemperatur für 30 Minuten
auf einem Schütteltisch
gemischt. Die gesamten Inhalte wurden dann zu 52 ml eiskaltem 0,1
M Na Carbonat pH 8,6 zugegeben. 100 μl der Mischung wurden verwendet,
um die Vertiefungen der Mikrotiterplatten zu bedecken und dann bei
4°C für 30 Minuten
inkubiert. Die Platten wurden dann viermal mit PBS/0,1% Triton X-100
gewaschen. Die Platten wurden dann mit Superblock behandelt und
der Test wie oben beschrieben durchgeführt.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 5–14 dargestellt.
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Beispiel 6
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Inhibierungstest
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Die
Inhibierungstests wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die
Peptide miteinander um die Bindung an Antikörper kompetitieren. Drei Gruppen
von kurzen Polypeptiden aus den Kern-, NS4- und NS5-Regionen aus
verschiedenen Typen von HCV-Sequenzen wurden synthetisiert. Diese
Polypeptide decken die Sequenzbereiche von Aminosäure 1689–1695, 1696–1702 und
1711–1917
ab. Die Inhibierungstests wurden durch Zugabe von 10 μg der obigen
Polypeptide zu der Probe und Inkubation bei 37°C für eine Stunde durchgeführt und
die Leistung der ELISA-Tests wurde wie oben beschrieben (bestimmt).
Wenn eine Inhibierung von mehr als 50% gefunden wurde, wurde die
Antikörperbindung
des Polypeptids als inhibitorisch betrachtet. Die erhaltenen Resultate
werden in der folgenden Tabelle 15 dargestellt.
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Beispiel 7
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Typisieren klinischer HCV-Proben
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Die
in Tabelle 16 oben angegebenen Typus- oder Typus-Cluster-spezifischen Epitope wurden
in dem ELISA-Test von Beispiel 5 verwendet, um 13 klinische Proben
von nicht-A, nicht-B-Hepatitispatienten (zehn bezahlte Spender,
drei mit Transfusion in Beziehung stehende chronische nicht-A, nicht-B-Patienten) zu testen.
Tabelle 17 zeigt die Ergebnisse von diesen Tests. Jede klinische
Probe wurde auf die Reaktivität
mit 12 verschiedenen Peptiden getestet, die den gegebenen Regionen
(AS 67–84,
1689–1718
oder 2281–2313)
entsprechen, welche die verschiedenen Typus-spezifischen oder Typus-Cluster-Epitope repräsentieren.
Jede Probe ergab eine nicht-reaktive
(NR), schwach-reaktive (WR) oder reaktive (R) Antwort mit jedem
typisierenden Peptid. Diese Ergebnisse sagen einen HCV-Genotyp für jede Probe
voraus, der mit dem HCV-Genotyp korreliert, der durch PCR bestimmt
wurde und in der rechten Spalte angegeben ist.
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