JPH02500880A - Ｎａｎｂｖの診断用薬およびワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３７、請求の範囲第３５項に記載のＨＣＶ惑染細胞であって、該細胞は、　ｎｃ ｖ感染個体の肝臓に由来する細胞系である。 ３８、　ＨＣＶに対する抗体を生産する方法であって、　Ｉ（ＣＶエピトープを 含む単離された免疫原性ポリペプチドを、免疫応答を生ずるのに充分な量で個体 に投与することを包含する生産方法。 ３９、　ＨＣＶに対する抗体を生産する方法であって、請求の範囲第１１項に記 載のポリペプチド調製物を個体に投与することを包含し、該調製物が少なくとも １つの免疫原性ポリペプチドを含有し、かつ該投与が免疫応答を生ずるのに充分 な量で行われる。生産方法。 ４０、未確認の感染因子のゲノムに由来するｃＤＮＡを単離する方法であって、 該方法は以下の工程を包含する：（ａ）該感染因子に感染した組織から単離され た核酸から調製されたｃＤＮＡライブラリーを含む発現ベクターで形質転換させ た宿主細胞を用意し、該ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドを発現する条件下 で該宿主細胞を増殖させること；（ロ）該ｃＤＮＡの発現産物を、該感染因子に 感染した個体の抗体含有身体構成部分と、免疫反応を起こす条件下で反応させ。 その結果として形成される抗体−抗原複合体を検出すること；（Ｃ）該工程（ロ ）の抗体−抗原複合体を形成するポリペプチドを発現する宿主細胞を９個々のク ローンとして増殖する条件下で増殖させ、該クローンを単離すること；（ロ）該 工程（Ｃ）のクローン由来の細胞を、該ｃＤＮＡ内にコードされたポリペプチド を発現する条件下で増殖させ、該発現産物を、該工程（ａ）の個体以外の個体で あって該感染因子に感染している個体の抗体含有身体構成部分、および該感染因 子に感染していない対照個体と反応させ、その結果として形成される抗体−抗原 複合体を検出すること： （ｅ）感染した個体および感染している疑いのある個体の抗体含有身体構成部分 から抗体−抗原複合体を形成するが、対照個体の該部分からは抗体−抗原複合体 を形成しないポリペプチドを発現する宿主細胞を９個々のクローンとして増殖す る条件下で増殖させ、該クローンを単離すること：および（０該工程（ｅ）の宿 主細胞クローンからｃＤＮＡを単離すること。 明細書 ＮＡＮＢＶの診　′およびワクチン 葺止芳１ 本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（ＮＡＮＢＶ　）伝染の流行を処置するため の材料および方法に関する。さらに詳しくは。 本発明は２診断用ＤＮＡ断片９診断用タンパク、診断用抗体。 そしてＮＡＮＢ型肝炎の病因因子（すなわち、Ｃ型肝炎ウィルス）に対する防御 抗原および防御抗体に関する。 で　れる Ｂａｒｒら（１９８６）　、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４　：　４２８゜ Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　（１９７９）　、　Ｇｅｎｅ　８　：　１７゜Ｂｒ１ｎｔｏ ｎ、　Ｍ、Ａ、（１９８６）　、　ＴＨＥ　ＶＩＲＵＳＥＳ：　ＴＨＥ　ＴＯＧ ＡＶＩＲＩＤＡＥ　ＡＮＤＦＬＡＶＩＶＩＲＩＤＡｌｌｔ　（シリーズ編集、　 Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅｒ。 ｐ、３２７−３７４゜ Ｂｒｏａｃｈ　（１９８１）　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ、　Ｖｏｌ、　Ｌ　ｐ、 ４４５．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。 Ｂｒｏａｃｈら（１９８３）　、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　１０１：３０？。 Ｃｈａｎｇら（１９７７）　、　Ｎａｔｕｒｅ　１９８　：　１０５６゜Ｃｈｉ ｒｇｓｙｉｎら（１９７９）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　旦：　５２９４ ゜Ｃｂｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよび５ａｃｃｈｉ　（１９８７）　、　Ａｎａｌｙ ｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１６２　：　１５６゜ Ｃ１ｅｓｅｅｌｌら（１９６９）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６２　：　１１５９゜Ｃｌｅｗｅｌｌ　（１９７２）　、　 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ　、１１０＝６６７　。 Ｃｏｈｅｎ　（１９７２）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　６９：２１１０゜Ｃｏｕｓｅｎｓら（１９８７）　、　ｇｅｎｅ　 ６１　：　２６５゜Ｆｅ１ｎｓｔｏｎｅ、　Ｓ、　Ｍ、およびｆｌｏｏｆｎａｇ ｌｅ、　Ｊ、　Ｈ，（１９８４）　、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ。 Ｊ、Ｍｅｄ、３１１：１８５゜ Ｆｉｅｌｄｓ　＆　Ｋｎｉｐｅ　（１９８６）　、　ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ　 ＶＩＲＯＬＯＧＹ　（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ。 Ｇｅｒｅｔｙ、　Ｒ，Ｊ、ら、　ＶＩＲＡＬ　ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ　ＡＮＤ　Ｌ ＩＶＥＲＤＩＳＥＡＳＥ（Ｖｙａｓ、　Ｂ、　Ｎ、＋　Ｄｉｅｎｓｔａｇ＋　Ｊ 、　ｔ、ｌ　およびＨｏｏｆｎａｇｌｅ、　Ｊ、　Ｈ。 編集、　Ｇｒｕｎｅおよび５ｔｒａｔｔｏｎ、　Ｉｎｃ、、　１９８４）　ｐｐ ２３−４７゜Ｇｏｅｄｄｅｌ　ら、（１９８０）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、８　：４０５７゜Ｇｒａｈａ−およびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（ １９７８）　、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２　：　５４６゜Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎお よびＨｏｇｎｅｓｓ　（１９７５）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　７３　：　３９６１゜ Ｇｒｙｃｈ　ら、（１９８５）　、　Ｎａｔｕｒｅ　３１６：７４゜Ｇｕｂｌｅ ｒおよびＨｏｆｆｍａｎ　（１９８３）　、　Ｇｅｎｅ　２５：２６３゜Ｈａｍ ａｅｒｌｉｎｇら　（１９８１）　、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩ ＥＳ　ＡＮＤ　Ｔ−ＣＥＬＬＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ。 Ｈｅ５ｓら（１９６８）　、　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ　７　： 　１４９゜ｔｌｉｎｎｅｎら（１９７Ｂ）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ’ｔ１．　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、７５　：　１９２９゜Ｈｉｔｚｅｓａｎら　（１９８０）　 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２５５：２０７３゜Ｈｏ１ｌａｎｄ　ら　（１９ ７Ｂ）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７　：　４９００゜Ｈｏ１ｌａｎｄ 　（１９８１）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２５６：　１３８５゜Ｒｏｕｇ ｈ　ｔｏｎら（１９８１）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９　： ２４７Ｈｕｎｙｈ、↑、ｖ、ら（１９８５）　、　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ　Ｔ ＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　；０ｘｆｏｒｄ、Ｕ、　Ｋ、）　ｐｐ、４９−７８゜１ａ ＋ｓｕｎ、　Ｒｅｖ、（１９８２）　６２　：　１８５゜Ｉｗａｒｓｏｎ　（１ ９８７）　、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊ、２９５：９４６゜Ｋｅｎ ｎｅｔｔら（１９８０）　、　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　 。 Ｌａｅｍ＋ａｌｉ　（１９７０）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０゜Ｌｅｅ ら（１９８Ｂ）　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９　：　１２８８゜Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、　ｔ、ら（１９８２）　、　？１ＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ　Ｌ ＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＮ、Ｙ、）　。 Ｍａｙｅｒおよび−ａ゛１ｋｅｒ［集（１９Ｂ？）　、　ＩＭＭＵＮＯＣＨＩ！ ＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＩ（ＯＤＳＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢ ＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅ−ｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）　。 Ｍａｘａｍら（１９８０）　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇ ｙ　６５　：　４９９゜Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９８３）　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１：２０−３７゜ＭＥＴＩ（ＯＤＳ　ＩＮ　 ＥＮＺＹＭＯＣＯＺＹ　（Ａｃａｄｓａ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　。 Ｍｉｃｈｅｌｌｅら、Ｉｎｔ、５ｙｓｐｏｓｉｕｓ＋　ｏｎ　Ｖｉｒａｌ　Ｈｅ ｐａｔｉｔｉｓ。 Ｍｏｎａｔｈ　（１９８６）　、ＴＨＥ　ＶＩＲＩＪＳＥＳ：　ＴＨＥ　ＴＯＧ ＡＶＩＲＡＤＡＥ　ＡＮＤＦＬＡＶＩＶＩＲＩＤＡＥ　（シリーズ編集、　Ｆｒ ａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔおよび−ａｇｎｅｒ。 ｐ、３７５−４４０゜ Ｎａｇａｈｕｍａら（１９８４）　、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４１　 ：　７４゜３９７−４０６゜ ０ｖｅｒｂｙ、Ｌ、Ｒ，（１９８５）　、Ｃｕｒｒ、Ｈｅｐａｔｏｌ、５　：４ ９゜０ｖｅｒｂｙ＋　Ｌ、　Ｒ，（１９８６）　、Ｃｕｒｒ、　Ｈｅｐａｔｏｌ 、６　：６５゜０ｖｅｒｂｙ＋　Ｌ、　Ｒ，（１９８７）　、　Ｃｕｒｒ、　Ｈ ｅｐａｔｏｌ、７　＝３５゜Ｐｅｌｅｇ　（１９６９）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２ ２１：１９３゜Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎおよび５ｈａｐｉｒｏ　（１９７４）　 、　ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥＶＩＲＯＬＯＧＹ、　Ｖｏｌ、２　（Ｆｒａｅ ｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔおよび−ａｇｎｅｒｌｉ、　ＰｌｅｎｕｓＮ、　Ｙ、） 　ｐｐ、１７１−２３０゜Ｐｒ１ｎｃｅ、Ａ、Ｍ、（１９８３）　、Ａｎｎｕ、 　Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３７　：　２１？。 Ｒｉｃｅ　（１９８６）　、ＴＨＥ　ＶＩＲＵＳＥＳ：　ＴＨＥ　ＴＯＧＡＶＩ ＲＩＤＡＥ　ＡＮＤ　ＦＬＡＶＩＶＩＲＩＤＡＥ（シリーズ編集、　Ｆｒａｅｎ ｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔおよび−ａｇｎｅｒ、各巻編集。 ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ　、　Ｐｌｅｎｕａ　Ｐ ｒｅｓｓ）　＋ｐｐ、２７９−３２８゜Ｒｏｅｈｒｉｇ（１９８６）、ＴＨＥ　 ＶＩＲＵＳＥＳ：ＴＨＥ　ＴＯＧＡＶＩＲＩＤＡＥ　ＡＮＤ　ＦＬＡＶＩＶＩＲ ＩＤＡＥ（シリーズ編集、　Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅ ｒ、各巻編集、　ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＳ’ｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ　、 　Ｐｌｅｎｕｓ　Ｐｒｅｓｓ）Ｓａｄｌｅｒら（１９８０）　、　Ｇｅｎｅ　８ ．２７９゜５ａｉｋｉら（１９８６）　、　Ｎａｔｕｒｅ　３２４　：　１６３ ゜Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　７４：５４６３゜Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら（１９８６）　、　 Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６０　：　１１５３゜５ｃｈｒｅｉｅｒ、　Ｍ、ら（１９ ８０）　、　ｔｌＹＢＲＩＤＯＭＡ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ５ｃｏｐｅｓ　（１ ９８４）　、　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、　ＰＲＩＮＣＩＰ ＬＥＳ　ＡＮＤＰＲＡＣＴＩＣＥ、　５ＥＣＯＮＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ　（Ｓｐｒ ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、　）　。 Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２９２　：　１２８゜ Ｓｔｅｉｍｅｒら（１９８６）　、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５８＝　９゜５ｔｏ ｌｌａｒ　（１９８０）　、　ＴＨＥ　ＴＯＧＡＶＩＲＵＳＥＳ　（Ｒ，Ｗ、　 Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ＆Ｗ、Ａｃａｄｅｅｅｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎ、Ｙ、） 　、ｐｐ、５８４−６２２゜Ｔａｙｌｏｒら（１９７６）　、　Ｂｉｏｃｈｅａ 、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　４４２：３２４゜Ｔｏｅｙｂｉｎら（１９７ ９）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６、４ ３５０゜ＴｓｕおよびＢｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　（１９８０）　、　５ＥＬＥＣＴ ＥＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬＵＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　（Ｗ、 Ｈ，Ｆｅｅｓａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、）　Ｐｐ、　３７３−３９１゜Ｖｙｔｄｅｈ ａａｇら（１９８５）　、　Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．１３４　：　１２２５゜ Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、ら（１９８２）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２９８：３ ４４゜Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、ら（１９８４）　、　ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ 　Ｂ　（Ｍｉｌｌｍａｎ、　１．ら編集、Ｐｌｅｎｕｓ　Ｐｒｅｓｓ）ｐｐ、２ ２５−２３６゜Ｇｌａｒｎｅｒ　（１９８４）　、　ＤＮＡ　３　：　４０１゜ ＭｕおよびＧｒｏｓｓｓ＋ａｎ　（１９８７）　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ。 １５４、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ　ＤＮＡ、Ｐａｒｔ　Ｅ。 Ｗｕ　（１９８７）　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓ＋ｏｌｏｇｙ　Ｖ ｏｌ　１５５．　ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＤＮＡ、ｐａｒｔ　Ｆ。 Ｚｏｌｌｅｒ　（１９８２）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０ 　：　６４Ｂ？。 ■月］」（配置圧 米国特許第４．３４１，７６１号 米国特許第４．３９９．１２１号 米国特許第４．４２７．７８３号 米国特許第４．４４４．８８７号 米国特許第４，４６６．９１７号 米国特許第４，４７２．５００号 米国特許第４．４９１．６３２号 米国特許第４．４９３，８９０号 ｉ景伎歪 非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢ）Ｉ　）は、伝染性の疾患であるか、あるいはウィル スが誘発すると考えられている疾患群およびウィルスに関連する他の形態の肝臓 疾患とは区別し得る疾患群に属する。これらの疾患には９周知の肝炎ウィルス（ すなわち、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ　）　、　Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）　 。 Δ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）　、およびサイトメガロウィルス（ＣＭＶ　）また はエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ　）　）により引き起こされる疾患が包 含される。ＮＡＮＢＨは輸血した個体において初めて同定された。ヒトからチン パンジーへの伝染およびチンパンジー間における一連の継代は、　ＮＡＮＢＨが １種または複数種の伝染性感染因子によるという証拠を与える。しかしながら、 　ＮＡＮＢＨの原因である伝染性因子はまだ同定されておらず、疾患の原因とな る因子の数も知られていない。 疫学的証拠によると、　ＮＡＮＢＨには次の３つの型があると示唆される：つま り、飲料水媒介の流行型；血液または注射針に関連する型；および散発（集団獲 得（ｃｏｍａ＋ｕｎｉｔｙ　ａｃｑｕｉｒｅｄ）　）型の３つの型である。しか しながら、　ＮＡＮＢＨの原因となり得る因子の数は知られていない。 ＮＡＮＢＨの臨床における診断および同定は、他のウィルスマーカーを排除する ことにより、まず行われてきた。推定されるＮＡＮＢＶ抗原および抗体を検出す るために用いられる方法には、寒天ゲル拡散法、対向免疫電気泳動法、免疫蛍光 顕微鏡法、免疫電子顕微鏡法、放射性免疫検定法、および酵素結合免疫吸着検定 法がある。しかしながら、これらの検定法はいずれも、　ＮＡＮＢＨに関する診 断検査として用いるのに充分感度が高（、特異的であり、かつ再現性があるとは 示されていない。 これまで、　ＮＡＮＢＨ因子に関連する抗原抗体系の同一性または特異性に関し ては、明確ではなく、シかも一致することはなかった。これは、その少な（とも 一部は、以下のことが原因である：つまり１個体におけるＨＢＶの前惑染または ＮＡＮＢＶとの同時感染；ＨＢＶに関連する溶解性の粒子状抗原の周知の複雑さ ：および肝臓細胞のゲノムへのＨＢＶ　ＤＮＡの組込みである。さらに、　ＮＡ ＮＢＨが１種より多くの病原体により引き起こされる可能性、およびＮＡＮＢＨ が誤診されてきた可能性がある。 また、血漿学的な検定法により、　ＮＡＮＢＨ患者の血清中に何が検出されるか は不明であった。寒天ゲル拡散法および対向免疫電気泳動法によれば、血清検体 間に時々生じる自動免疫反応または非特異的なタンパク相互作用は検出されるが 、特異的なＮＡＮＢＶ抗原−抗体反応は示されないと考えられてきた。 免疫蛍光法、酵素結合免疫吸着検定法、および放射性免疫検定法によれば、　Ｎ ＡＮＢＨ患者の血清中、ならびに他の肝臓疾患おらび非肝臓疾患を有する患者に おいても、しばしば存在するりウマチ因子様物質が低レベルで検出されるようで ある。 検出された反応性のいくつかは、宿主により定まる細胞質抗原に対して抗体を表 現し得る。 ＮＡＮＢＶの候補となるものは、数多く存在する。例えば、　Ｐｒ１ｎｃｅ（１ ９８３）　、　Ｆｅ１ｓｔｏｎｅおよびＨｏｏｆｎａｇｌｅ　（１９８４）　、 そして０ｖｅｒｂｙ（１９８５，１９８６，１９８７）による総説、ならびに■ 賀ａｒｓｏｎ　（１９８７）による論文を参照にされたい。しかしながら、これ らの候補がＮＡＮＢＨの病因因子に相当するという証拠はない。 ＮＡＮＢＶのキャリア、およびＮＡＮＢＶで汚染された血液または血液製剤をス クリーニングしかつ同定するための感度が高く特異的な方法が非常に要求されて いる。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は輸血された患者の約１０％において発生する。こ の場合、９０％までがＮＡＮＢＨである。この疾患における大きな問題は、しば しば慢性的な肝臓損傷へ進行することである（２５〜５５％）。 患者を看護し、血液および血液製剤によるＮＡＮＢＨの感染あるいは個体が緊密 に接触することにより起こるＮＡＮＢＨの感染を予防するために、　ＮＡＮＢＶ に関する核酸、抗原、および抗体を検出する信鯨性の高い診断手段および予診手 段が必要とされている。さらに、この疾患を予防および／または処置するための 効果的なワクチンおよび免疫療法剤も必要とされている。 ｌＩ坏ｕ区丞 本発明は、新しく発見されたＮＡＮＢＶ病因因子であるＣ型肝炎ウィルス（ＨＣ Ｖ　）の単離および特徴付けに関する。さらに詳しくは１本発明は、　ＨＣＶゲ ノムの部分的なｃＤＮＡ複製物群を提供す゛る。これらのｃＤＮＡ複製物は、以 下の新規な工程を包含する方法により単離された：つまり、これまでに単離も特 徴付けもされていないウィルス因子のゲノムから誘導される新しく合成された抗 原を検出するために、　ＮＡＮＢＨ！Ａ者の血清で感染した組織中の粒子状因子 から調製されたｃＤＮＡライブラリー由来の発見産物をスクリーニングする工程 ；および非感染個体に比べて感染個体の血清とのみ免疫学的に反応する産物を生 産するクローンを選択する工程である。 ＨＣＶ　ｃＤＮＡから誘導されたプローブを利用したＨＣＶゲノムの性質、およ びＨＣＶ　ｃＤＮＡ内に含まれる配列情報に関する研究は。 ＨＣｖがワラビウイルスまたはワラビ様ウィルスであることを示唆している。 ＨＣＶから誘導されたｃＤＮＡ配列の一部は、試料中のウィルスの存在を診断す るためのプローブとして、および天然に存在するウィルスの変異型を単離するた めのプローブとして有用である。これらの（ＤＮＡを用いれば、　ＨＣＶゲノム 内にコードされているＨＣＶ抗原の有効なポリペプチド配列を調製し９診断検査 における標準または試薬として、および／またはワクチンの成分として有用なポ リペプチドを生産することができる。 これらのポリペプチド配列内に含まれるＨＣＶエピトープに対する抗体は、ポリ クローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれもが１診断検査に、治療薬と して、抗ウィルス剤のスクリーニングに、そしてこれらのｃＤＮＡから誘導され るＮＡＮＢＶ因子の単離に有用である。さらに、これらのｃＤＮＡから誘導され るプローブを利用することにより、　ＨＣＶゲノムの他の部分を単離し、かつ配 列決定することができる。従って、　ＮＡＮＢＨの診断および／または処置、予 防および治療の両方に有用な追加のプローブおよびポリペプチドが提供される。 従って、ポリヌクレオチドに関する本発明のいくつかの局面は以下のとおりであ る：精製された１（ＣＶポリヌクレオチド；組換えＨＣＶポリヌクレオチド：　 ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ　ｃＤＮＡに由来する配列を有する組換えポリヌクレ オチド、　ＨＣＶのエピトープをコードする組換えポリヌクレオチド；上記の組 換えポリヌクレオチドのいずれかを有する組換えベクター；およびこれらベクタ ーのいずれかで形質転換された宿主細胞。 本発明の他の局面は以下のとおりである：　ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ　ｃＤＮ Ａに由来するＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ　）を有する組換 え発現系であって、該ＯＲＦが所望の宿主と適合し得る制御配列に対して作動可 能なように連結され′ている１組換え発現系；該組換え発現系で形質転換された 細胞；および該形質転換細胞により生産されるポリペプチド。 本発明のさらに他の局面は以下のとおりである：精製されたＨＣＶ　；該精製Ｈ ＣＶに由来するポリペプチドの調製物；精製されたＨＣＶポリペプチド；および ＨＣｖに含まれるエピトープと免疫学的に同一であるとみなし得るエピトープを 有する精製されたポリペプチド。 本発明には以下の局面も包含される：組換えｎｃｖポリペプチド；　ＨＣＶゲノ ムまたはＨＣＶ　ｃＤＮＡに由来する配列を有する組換えポリペプチド；　ＨＣ Ｖエピトープを有する組換えポリペプチド；およびＨＣＶポリペプチドを有する 融合ポリペプチド。 本発明には以下のものも包含される：　ＨＣＶエピトープに対するモノクローナ ル抗体：および）ＩＣＶエピトープに対するポリクローナル抗体の精製された調 製物。 本発明の他の局面は、　ＨＣＶ惑染に対して免疫原性の粒子であって、真核生物 宿主内で生産される場合に粒子を形成し得るアミノ酸配列を有する非ＨＣＶポリ ペプチドと、　ＨＣＶエピトープを有する粒子である。 本発明のさらに他の局面は、　ＨＣＶに対するポリヌクレオチドプローブである 。 キットに関する本発明の局面は以下のようなキットである：ＨＣｖに由来するポ リヌクレオチドの存在について試料を分析するためのキットであって、適当な容 器内に、約８個またはそれ以上のヌクレオチドからなるＨＣＶ由来のヌクレオチ ド配列を含むポリヌクレオチドプローブを有するキット；ＨＣＶ抗原の存在につ いて試料を分析するためのキットであって、適当な容器内に、検出されるべきＨ ＣＶ抗原に対する抗体を有する出ツ）ＳＨＣＶ抗原に対する抗体の存在について 試料を分析するためのキットであって、適当な容器内に、　ＨＣＶ抗原に存在す るＨＣＶエピトープを含むポリペプチドを有するキットである。 本発明の他の局面は、固体担体に付着させた。　ＵＣＶエピトープを有するポリ ペプチド；および固体担体に付着させた。 ＨＣｖエピトープに対する抗体である。 本発明のさらに他の局面は以下のような方法である：　ｎｃｖエピトープを含む ポリペプチドを生産する方法であって、　ＨＣＶエピトープを含むポリペプチド をコードする配列を含む発現ベクターで形質転換させた宿主細胞を、該ポリペプ チドを発現させる条件下でインキュベートすること、を包含する生産方法；およ びこの方法により生産された。　ＨＣＶエピトープを含むポリペプチド。 本発明はまた。以下のような方法も包含する：試料中のＨＣＶ核酸を検出する方 法であって、該試料の核酸を、　ＨＣＶポリヌクレオチドに対するプローブと、 該プローブと該試料由来のＨＣＶ核酸との間にポリヌクレオチド二本鎖を形成す る条件下で反応させること；および核プローブを含むポリヌクレオチド二本鎖を 検出すること、を包含する検出方法。 免疫学的検定法もまた９本発明に包含される。これらの免疫学的検定法には、以 下のような工程を包含するＨＣＶ抗原を検出するための免疫学的検定法が包含さ れる：　ＨＣＶ抗原を含んでいる疑いのある試料を、検出されるべきＨＣＶ抗原 に対するプローブ抗体と共に、抗原−抗体複合体を形成する条件下でインキュベ ートすること：および該プローブ抗体を含む抗原−抗体複合体を検出すること。 以下の工程を包含する）ＩｃＶ抗原に対する抗体を検出するための免疫学的検定 法：抗ＨＣＶ抗体を含んでいる疑いのある試料を、　ＨＣＶのエピトープを含む プローブポリペプチドと共に、抗体−抗原複合体を形成する条件下でインキュベ ートすること；および該プローブ抗原を含む抗体−抗原複合体を検出すること。 本発明には以下のものも包含される：　ＨＣＶ感染を処置するためのワクチンで あって、　ＨＣＶエピトープを含む免疫原性ペプチド、不活性化されたＨＣＶＪ 製物、または弱毒化されたＨＣＶ調製物を含有するワクチン。 本発明の他の局面は、　ＦＩＣＶに感染した組織培養増殖細胞である。 本発明のさらに他の局面は、　ＨＣＶに対する抗体を生産する方法であって、　 ＨＣＶエピトープを含む単離された免疫原性ポリペプチドを、免疫反応を生ずる のに充分な量で個体に投与することを包含する生産方法である。 本発明のさらに他の局面は、未確認の感染因子のゲノムに由来するｃＤＮＡを単 離する方法であって、該方法は以下の工程（ａ）〜（ｆ）を包含する：（ａ）該 感染因子に感染した組織から単離された核酸から調製されたｃＤＮＡライブラリ ーを含む発現ベクターで形質転換させた宿主細胞を用意し、該ｃＤＮＡにコード されたポリペプチドを発現する条件下で該宿主細胞を増殖させること；（ハ）該 ｃＤＮＡの発現産物を、該感染因子に感染した個体の抗体含有身体構成部分と、 免疫反応を起こす条件下で反応させ、その結果として形成される抗体−抗原複合 体を検出すること；（Ｃ）該工程（ロ）の抗体−抗原複合体を形成するポリペプ チドを発現する宿主細胞を９個々のクローンとして増殖する条件下で増殖させ、 該クローンを単離すること；＠核工程（Ｃ）のクローン由来の細胞を、該ｃＤＮ Ａ内にコードされたポリペプチドを発現する条件下で増殖させ、該発現産物を、 該工程（ａ）の個体以外の個体であって該感染因子に感染している個体の抗体含 有身体構成部分および該感染因子に感染していない対照個体と反応させ、その結 果として形成される抗体−抗原複合体を検出すること；（ｅ）感染した個体およ び感染している疑いのある個体の抗体含有身体構成部分から抗体−抗原複合体を 形成するが、対照個体の該部分からは抗体−抗原複合体を形成しないポリペプチ ドを発現する宿主細胞を９個々のクローンとして増殖する条件下で増殖させ、該 クローンを単離すること；および（ｆ）該工程（ｅ）の宿主細胞クローンからｃ ＤＮＡを単離すること。 図面の簡単な説明 第１図は、クローン５−１−１におけるＨＣＶ　ｃＤＮＡ挿入物の二本鎖ヌクレ オチド配列、およびこの配列内にコードされたポリペプチドの推定アミノ酸配列 を示す。 第２図は、クローン５−１−１．８１．１−２．および９１の重複１（ＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列の相同性を示す。 第３図は９重複するクローン８１．　１−２．および９１に由来するＨＣＶ　ｃ ＤＮＡの複合配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸配列を示す。 第４図は、クローン８１におけるＨＣＶ　ｃＤＮＡ挿入物の二本鎖ヌクレオチド 配列、およびこの配列内にコードされたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す 。 第５図は、その一部がクローン８１のＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡと重複するクローン ３６のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、おらびこの配列内にコードされたポリペプチド配 列を示す。 第６図は、クローン３６および８１のＨＣＶ　ｃＤＮＡの結合ＯＲＰ　、および このＯＲＦ内にコードされたポリペプチドを示す。 第７図は、その一部がクローン８１と重複するクローン３２のＨＣＶ　ｃＤＮＡ 配列、およびこの配列にコードされたポリペプチドを示す。 第８図は、その一部がクローン３６と重複するクローン３５のＨＣＶ　ｃＤＮＡ 配列、およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 第９図は、クローン３５．３６．８１．および３２のＨＣＶ　ｃＤＮＡの結合Ｏ ＲＦ　、およびこのＯＲＦ内にコードされたポリペプチドを示す。 第１０図は、その一部がクローン３５と重複するクローン３７ｂのＨＣＶ　ｃＤ ＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 第１１図は、その一部がクローン３２と重複するクローン３３ｂのＨＣＶ　ｃＤ ＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 第１２図は、その一部がクローン３７ｂと重複するクローン４０ｂのＨＣＶ配列 、およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 第１３図は、その一部がクローン３３ｂと重複するクローン２５ＣのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。 第１４図は、クローン４０ｂ、　３７ｂ、　３５．３６．８１．３２．３３ｂ。 および２５ｃの広がるＯＲＦのヌクレオチド配列、およびこの配列内にコードさ れたポリペプチドを示す。 第１５図は、その一部がクローン４０ｂおよび３３ｃと重複するクローン３３ｃ のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第１６図は、その一部がクローン３３ｃと重複するクローン８ｈのＨＣＶ　ｃＤ ＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第１７図は、その一部がクローン８ｈと重複するクローン７ｅのＨＣＶ　ｃＤＮ Ａ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第１８図は、その一部がクローン２５ｃと重複するクローン１４ＣのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第１９図は、その一部がクローン１４ｃと重複するクローン８ｆのＨＣＶ　ｃＤ ＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第２０図は、その一部がクローン８ｆと重複するクローン３３ｆのＨＣＶ　ｃＤ ＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第２１図は、その一部がクローン３３ｆと重複するクローン３３ｇのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第２２図は、その一部がクローン７ｅと重複するクローン７ｆのＨＣＶ　ｃＤＮ Ａ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第２３図は、その一部がクローン７ｆと重複するクローン１１ｂのＨＣＶ　ｃＤ ＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第２４図は、その一部がクローンｌｌｂと重複するクローン１４１のＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第２５図は、その一部がクローン３３ｇと重複するクローン３９ＣのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第２６図は、クローン１４ｉ、ｌｌｂ、７　ｆ、７　ｅ、８　ｈ、３３ｃ。 ４０ｂ、　３７ｂ、　３５．３６．８１．３２．３３ｂ、　２５ｃ、　１４ｃ、 ８　ｆ、　３３ｆ、および３３ｇの整列したｃＤＮＡに由来する複合ＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列を示す。さらに、この誘導された配列の拡張ＯＲＦ内にコードされた ポリペプチドのアミノ酸配列が示されている。 第２７図は、その一部がクローン１４ｉと重複するクローン１２ｆのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第２８図は、その一部がクローン３９ｃと重複するクローン３５ｆのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第２９図は、その一部がクローン３５ｆと重複するクローン１９ｇのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列、およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第３０図は、その一部がクローン１９ｇと重複するクローン２６ｇの配列、およ びこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第３１図は、その一部がクローン２６ｇと重複するクローン１５ｅの配列、およ びこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。 第３２図は、クローン１２ｆから１５ｅを５°から３°の方向に整列させること により誘導された複合ｃＤＮＡの配列を示す；さらに。 この連続ＯＲＦ内にコードされたアミノ酸を示す。 第３３図は、　ＢＢ−ＮＡＮＢ　、　ＨＡＶ　、およびＨＢＶ　ニ感染したチン パンジー由来のチンパンジー血清を用いた融合タンパク５ＯＤ−ＮＡＮＢトｌ− １のウェスタンプロットの写真である。 第３４図は、　ＮＡＮＢＶ　、　ＨＡＶ　、　ＨＢＶ　ニ感染したヒト由来の血 清。 および対照のヒト由来の血清を用いた融合タンパク５ｏｎ−ＮＡＮＢＳ−１−１ のウェスタンプロットの写真である。 第３５図は、ベクターｐＡＢ２４の有意な特徴を示す地図である。 第３６図は、融合ポリペプチドＣ１００−３のカルボキシル末端の推定アミノ酸 配列、およびこの配列をコードするヌクレオチドを示す。 第３７図Ａは、酵母内で発現されたＣ１００−３を同定する。クーマシーブルー で染色されたポリアクリルアミドゲルの写真である。 第３７図Ｂは、　ＮＡＮＢＶに感染したヒトに由来する血清を用いたＣ１００− ３のウェスタンプロットを示す。 第３８図は、　ＢＢ−ＮＡＮＢＶに感染したチンパンジーの肝臓から単離され、 クローン８１のＢＢ−ＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡでプローブされたＲＮＡのノーザン プロットのオートラジオグラフを示す。 第３９図は、　ＲＮａｓｅ　ＡまたはＤＮａｓｅ　Ｉで処理され、クローン８１ ノＢＢ−ＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡ　テプローブされたＮＡＮＢＶ核酸のオートラジ オグラフを示す。 第４０図は、抗ＮＡＮＢｓ−１−’＋を有する感染血漿から得たＮＡＮＢＶ粒子 から抽出され、クローン８１由来の３２Ｐ標識化ＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡでプロー ブされた核酸のオートラジオグラフを示す。 第４１図は、クローン８１のＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡから誘導されたコｔｐ標識化 （÷）鎖および（−）鎖ＤＮＡプローブでプローブされた。単！５ＮＡＮＢＶ核 酸を有するフィルターのオートラジオグラフを示す。 第４２図は、　ＨＣＶ　ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドと、デング熱ワラ ビウィルス由来のＮＳタンパクとの相同性を示す。 第４３図は、　ＥＬＩＳＡスクリーニングーで決定される。任意抽出試料におけ るＨＣｖ感染の分布ヒストグラムを示す。 第４４図は、　ＥＬＩＳＡ検定法において免疫グロブリン−酵素結合体の２つの 形態を用いた。任意抽出試料におけるｎｃｖ惑染感染布ヒストグラムを示す。 第４５図は、ワラビウイルスのＮＳＩにおける保存配列から誘導されたプライマ ー混合物の配列を示す。 （以下余白） 発Ｉ」ＪＪｌし配友汰 ■、定豆 「Ｃ型肝炎ウィルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃｖｉｒｕｓ　）　Ｊという用語は 、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢ）Ｉ　）の従来知られていなかった病原因子に対し て、この分野の研究者が保留していた用語である。従って１本願で用いる場合、 「Ｃ型肝炎つィルスｊ（ＨＣＶ）という用語はＮＡＮＢＨの病原因子を意味し、 またこのＮＡＮＢＨは。 以前にはＮＡＮＢＶおよび／またはＢＢ−ＮＡＮＢＶと呼ばれていたものである ０本願では、　ＩＩＣＶ　、　ＮＡＮＢＶおよびＢＢ−ＮＡＮＢＶ　という用語 を互換性のある語として使用する。この用語法を拡張して。 以前はＮＡＮＢ肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼んでいたＨＣＶによって発病する疾患を Ｃ型肝炎と呼ぶ。本願では、　ＮＡＮＢＨとＣ型肝炎という用語を互換性のある 語として使用してもよい。 ｒ　ＨＣＶ　Ｊという用語は１本願で用いる場合、　ＮＡＮＢＨを発病させるウ ィルス種および弱毒化されたウィルス株または後者由来の欠損干渉粒子を意味す る。後に述べるように、　ｎｃｖゲノムは、　ＲＮＡで構成されている。　ＲＮ Ａを含有するウィルスの偶発変異率が比較的高いということが知られており、す なわち約１０−ｓ〜１０−’／ヌクレオチドであると報告されている〔フィール ズとナイブ（Ｆｉｅｌｄｓ　ａｎｄ　Ｋｎｉｐｅ）　１９８６年〕。それ故、後 に述べるＨＣＶ種の中には、多くのウィルス株がある０本願記載の組成物と方法 によって１種々の関連ウィルス株の増殖。 同定、検出および単離を行うことができる。さらに各種ウィルス株に対する診断 薬とワクチンを製造することができ、また薬理学的用途の抗ウィルス剤を、　Ｈ ＣＶの複製を阻害するということによりスクリーニングすることができる。 本願で提供する情報は、ある種のＨＣＶ株由来のものであり。 このウィルス株は以後ＣＤＣ／ＨＣＶＩと呼ぶが、ウィルス分離学者がこの種に 属する他のウィルス株を同定するのに充分なものである。本願に記載するように ９本願の発明者らは、　ＨＣＶがワラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）また はワラビ様ウィルス（Ｆｌａｖｉ−１ｉｋｅ　ｖｉｒｕｓ）であることを発見し た。ワラビウィルス粒子の形態と組成は公知であり、プリントン（Ｂｒｉｎｔｏ ｎ、　１９８６年）が考察している。形態については、一般にワラビウィルス類 は、脂質二重層で覆われた中心ヌクレオカプシドを有している。ピリオンは球形 で直径が約４０〜５０ｎｍである。そのコアは直径が約２５〜３０ｎｍである。 ピリオンのエンベロープの外面には、直径が約２ｎｌｌ＋の端末ノブ（ｔｅｒｍ ｉｎａｌ　ｋｎｏｂ　）を有する約５〜１０ｎｅ＋長の突起を有する。 ＨＣｖは１本願に記載のｃＤＮＡが誘導されるＨＣＶゲノム内のエピトープと免 疫学的に同定可能なエピトープをコードするが。 このエピトープは本願に記載のｃＤＮＡ内にコードされることが好ましい、この エピトープは、他の公知のフラビウィルス類ト比較した場合、　ＨＣＶに特有の ものである。このエピトープの独自性は、　ＨＣＶとの免疫学的反応性と、他の ワラビウィルス種との免疫学的反応性の欠如とによって決定することができる。 免疫学的反応性を決定する方法は当該技術分野では公知であり９例えば、放射性 免疫検定法、　ＥＬＩＳＡ法、血球凝集反応法などがあり９分析技術の適切ない （つかの例を本願に示す。 上記に加えて、ウィルス株をＨＣＶとして同定する際に、単独もしくは組合わせ て、下記のパラメータを利用することができる。　ｎｃｖ株は、進化論的に関連 しているので、ヌクレオチドレベルでのゲノムの全相同性は、約４０％以上であ り、好ましくは約６０％以上で、さらに好ましくは約８０％以上であり。 さらに少な（とも約１３のヌクレオチドの対応する連続配列があると考えられる 。推定上のＨＣＶ株のゲノム配列とＣＤＣ／Ｃｕ１ｌＨＣＶのｃＤＮＡ配列との 同一性は、当該技術分野で公知の技術によって決定することができる０例えば、 推定上のＨＣＶ由来のポリヌクレオチドの配列情報と２本願に記載のＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列とを直接比較することによって決定することができる。また例えば、 相同領域間の安定な二本鎖を形成する条件下（例えば、　Ｓｌ消化の前に用いら れる条件）でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし９次いで一本鎖に特 異的なヌクアーゼの一種もしくは複数種で切断し９次に切断によって生成した断 片の大きさを測定することによって決定することができる。 ＨＣＶ株の進化的類縁関係のために、推定上のＨＣＶ株は、ポリペプチドのレベ ルの、その相同性によって同定可能である。 一般にＨＣＶ株は、ポリペプチドのレベルで、約４０％以上相同であり、好まし くは約６０％以上、さらに好ましくは８０％以上相同である。アミノ酸配列の相 同性を決定する技術は、当該技術分野で知られている０例えば、アミノ酸配列を 直接決定して２本願に示した配列と比較することができる。また例えば、推定上 のＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列を決定してもよく（通常、　ｃＤＮＡ 中間体を介して）、これにコードされているアミノ酸配列は決定可能で、対応す る領域を比較することができる。 本願で使用される場合、指定された配列（例えば、　ＨＣＶｃＤＮＡ、特に第１ 〜３２図に例示した配列）か、またはＨＣｖゲノム「由来」のポリヌクレオチド は、少なくとも約６個の対応するヌクレオチド配列からなり、好ましくは少なく とも約８個のヌクレオチド、さらに好ましくは少な（とも約１０〜１２個のヌク レオチド、さらに好ましくは少な（とも約１５〜２０個のヌクレオチドの配列か らなる対応するポリヌクレオチド配列を意味する。つまり、これらのヌクレオチ ドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に相同か、または相補的である。上記 ポリヌクレオチドが誘導される領域の配列は、　ＨＣＶゲ°ツムに特有の配列に 相同または相補的であるのが好ましい。一つの配列がＨＣＶゲノムに特有のもの であるか否かは当業者に公知の技術で決定することができる０例えば、その配列 を、データバンク、例えばシーンバンク（ｇｅｎｅｂａｎｋ　）の配列と比較し て、未感染の宿主または他の生物に存在するか否かを決定する。またその配列は 、公知の配列を有する他のウィルス因子、すなわち、肝炎９例えば、　ＨＡν、 　ＨＢＶおよびＨＤＶを誘発することが知られているウィルス因子、ならびにフ ラビウィルス科のウィルス（Ｆｒａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）の他のメンバーと比較 することもできる。また、誘導された配列が他の配列と一致しているかまたは一 致していないかは、適切な厳密条件下でハイブリダイゼーションさせることによ って決定することができる。核酸の配列の相補性を決定するためのハイブリダイ ゼーション技術は、当該技術分野で公知であり、後に検討する・例えば、マニア チスら（Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　１９８２年）の文献を参照せよ。さ らにハイブリダイゼーションによって形成された。不適正な二本鎖のポリヌクレ オチドも公知の方法で決定することができ、この方法には１例えば、　Ｓｌのよ うなヌクレアーゼによって、二本鎖のポリヌクレオチドの一本鎖領域を特異的に 切断する方法がある。代表的なりＮＡ配列が「誘導される」領域は９例えば、特 異的なエピトープをコードする領域および転写されない領域および／または翻訳 されない領域を含むが、これに限定されるものではない。 誘導されたポリヌクレオチドは、必らずしも、提示されたヌクレオチド配列が物 理的に誘導されるとは限らず、いずれの方法で生成されていてもよい０例えば、 化学合成法、　ＤＮＡ複製法、逆転写法または転写法が挙げられ、これらの方法 は。 ポリヌクレオチドが誘導される一種もしくは複数の領域内の塩基配列が提供する 情報に基づいて実施される。さらに、指定された配列の領域に対応する領域の組 合わせは、当該技術分野で公知の方法で改変され、意図する用途に合致させるこ とができる。 同様に、指定された核酸の配列（例えば、第１〜３２図に示す配列）またはＨＣ Ｖゲノム「から誘導された」ポリペプチドもしくはアミノ酸配列は、上記の配列 にコードされているポリペプチドのアミノ酸配列もしくはその一部分の配列（少 なくとも３〜５のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０のアミノ酸、さらに 好ましくは少なくとも１１〜１５のアミノ酸で構成された部分）と同じアミノ酸 配列を有するポリペプチド。 または上記の配列にコードされているポリペプチドと免疫学的に同定しうるポリ ペプチドを意味する。 組換え体ポリペプチドもしくは誘導されたポリペプチドは。 指定された核酸配列（例えば第１〜２６図に示す配列）、またはＨＣＶゲノムか ら必らずしも翻訳される必要はなく９例えば化学合成法もしくは組換え体発現系 の発現もしくは変位ＨＣＶからの単離を含むいずれの方法モも生成され得る。 本願で用いる１組換え体ポリヌクレオチド」という用語は。 ゲノム、　ｃＤＮＡ、半合成もしくは合成の起源のポリヌクレオチドを意味し、 その起源もしくは操作によって、（１）天然もしくはライブラリーの形態でポリ ヌクレオチドが連結しているポリヌクレオチドの全体もしくは一部分と連結して いないもの。 および／または（２）天然にポリヌクレオチドが連結しているポリヌクレオチド 以外のポリヌクレオチドに連結されているものを意味する。 本願で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さを持ったポリマー 形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）を意 味する。この用語は９分子の一次構造のみを意味する。したがって、この用語に は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ　、および二本鎖と一本鎖のＲＮＡが含まれる 。またこの用語には９例えばメチル化反応および／またはキャッピングによって 修飾された形態のポリヌクレオチドと、未修飾のポリヌクレオチドが含まれる。 本願で用いるｒ　ｃＤＮＡに対応する配列を有するＨＣＶ　Ｊという用語は、そ のＨＣＶが指定されたＤＮＡの配列と相同もしくは相補的な関係にあるポリヌク レオチド配列をもっていることを意味し、　ｃＤＮＡに対する相同性もしくは相 補性の程度は、約５０％以上、好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましく は少なくとも約９０％である。対応する配列は、長さが、少なくとも約７０のヌ クレオチド、好ましくは少なくとも約８０のヌクレオチド、さらに好ましくは少 なくとも約９０のヌクレオチドである。ＨＣＶの配列とｃＤＮＡとの対応は、当 該技術分野で公知の方法で決定することができ９例えば配列された物質と記載さ れたｃＤＮＡとを直接比較すること、またはハイブリダイゼーションし、−末鎖 ヌクレアーゼで切断し、切断により生成した断片の大きさを測定するという方法 がある。 「精製されたウィルスポリヌクレオチド」という用語は。 ＨＣＶゲノムもしくはその断片を意味し、この断片は５本質的に遊離の形態で、 すなわち、ウィルスのポリヌクレオチドが自然に連結されているポリヌクレオチ ドの約５０％未満、好ましくは約７０％未満、さらに好ましくは約９０％未満を 含有している。ウィルス粒子からウィルスポリヌクレオチドを精製する方法は、 当該技術分野で知られており９例えば、ウィルス粒子をカオトロピック剤で破壊 する方法、およびイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ フィー。 および密度による遠心沈降法によってポリヌクレオチドとポリペプチドを分離す る方法がある。 「精製されたウィルスポリペプチド」という用語は、　ＨＣＶポリペプチドもし くはその断片を意味し、その断片は９本質的に遊離の形態で、ウィルスポリペプ チドが天然に連結されている細胞成分の、約５０％未満、好ましくは約７０％未 満、さらに好ましくは約９０％未満を含有している。ウィルスポリペプチドを精 製する技術は当該技術で公知であり、この技術の例については後に考察する。 単細胞因子として培養される微生物もしくは高等真核細胞系を示す「組換え体宿 主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」。 「細胞系」、「細胞培養物」なとの用語は１組換え体ベクターもしくは他の転移 ＤＮＡの受容体として使用可能か、または使用されてきた細胞を意味し、トラン スフェクトされた元の細胞の後代が含まれる。単一の親細胞の後代は、偶発的ま たは計画的な変位によって、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補性が元の 親細胞と、必らずしも完全に同一ではない。 所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列が存在するような適切な性質によ って特徴づけられ、親細胞に充分類似している親細胞の後代は、上記定義の意味 する後代に含まれ。 上記用語で扱われる。 「レプリコン」は、遺伝要素であって９例えばプラスミド。 染色体、ウィルスが含まれ、細胞内でポリヌクレオチドの複製の自律的な単位と して挙動し、すなわち自ら制御しながら複製を行うことができる。 「ベクター」は、他のポリヌクレオチドのセグメントが結合しているレプリコン であって、複製を行い、および／または結合しているセグメントを発現する。 「制御配列」は、ある種のポリヌクレオチド配列を意味し。 この配列が連結している。コード配列を発現するのに必要なものである。このよ うな制御配列の性質は、宿主の生物によって異なり、このような制御配列には、 原核細胞内では一般に、プロモーター、リポソーム結合部位およびターミネータ −が含まれ、真核細胞内では一般に、プロモーター、ターミネータ−およびある 場合にはエンハンサ−が含まれる。「制御配列」という用語は、最小限２発現に 必要なすべての要素を包含し、さらに発現に有利な追加の要素９例えばリーダー 配列を包含し得る。 「作動可能に連結された」という用語は、上記のような要素が、意図した方法で 機能しうるような関係に並置されていることを意味する。コード配列に「作動可 能に連結された」制御配列は、制御配列に適合した条件下でコード配列の発現が 達成されるように、連結される。 「読み取り枠Ｊ　（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配 列の領域であり、この領域は、コード配列の一部またはコード配列全体を意味す る。 「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、　ｍＲＮＡに転 写され、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である 。コード配列の境界は。 ５゛末端の翻訳開始コドンと、３゛末端の翻訳停止コドンによって決定される。 コード配列は、　ｍＲＮＡ、　ｃＤＮＡおよび組換え体ポリヌクレオチド配列を 包含するが、これらに限定されるものではない。 「免疫学的に・・・と同定可能な」という用語は、指定されたポリペプチド、通 常はＨＣＶタンパク内に存在し、かつそのタンパクに特有のエピトープとポリペ プチドが存在することを意味する。免疫学的な同一性は、抗体の結合および／ま たは結合における競争によって決定されるが、この技術は当業者には知られてい ることであり、後述する。エピトープの独自性も、エピトープをコードするポリ ヌクレオチド配列について、公知のデータバンク（例えば、シーンバンク）をコ ンビ゛ユータで調査し、他の公知のタンパクとアミノ酸配列を比較することによ って決定することができる。 本願で用いるｆエピトープｊという用語は、ポリペプチドの抗原決定基を意味し 、エピトープは、エピトープに特有の立体配置で３個のアミノ酸を含有し得るが 、エピトープは。 一般に少なくとも５個のこのようなアミノ酸で構成され、より一般的には少なく とも８〜１０個のこのようなアミノ酸で構成されている。アミノ酸の立体配置の 決定法は、当該技術分野では公知であり２例えば、Ｘ線結晶構造解析および二次 元核磁気共鳴法がある。 ポリペプチドは、これに含まれている特異的なエピトープが抗体を認識すること によって、抗体と結合する場合、抗体と［免疫学的に反応性がある」、免疫学的 反応性は、抗体結合反応、特に抗体結合反応の速度論、および／または抗体が指 向しているエピトープを含有する公知のポリペプチドを。 競争者として用いる結合競争法によって決定される。ポリペプチドが抗体と免疫 学的に反応性であるか否かを決定する方法は、当該技術分野で公知である。 本願に用いる場合、「Ｈｃｖエピトープを含有する免疫原性を有するポリペプチ ド」という用語には、自然に発生するＨＣＶポリペプチドもしくはその断片、お よび他の手段（例えば。 化学合成法または組換え体生物内でのポリペプチドの発現）によって調製される ポリペプチドが包含される。 「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の分子鎖を意味し、特定の長さの生産 物を意味しない、したがってポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチ ドおよびタンパクが包含されるａｔたこの用語は、ポリペプチドの発現後修飾物 ９例えば、グリコジル化物、アシル化物、リン酸化物などを意味しない。 本願で用いる「形質転換」という用語は、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に 挿入することを意味し、挿入法はどんな方法でもよく１例えば、直接取込み法、 形質導入法またはｆ−交配法がある。外因性ポリヌクレオチドは９組込まれてい ないベクター、例えば、プラスミドとして保持されるか、または代わりに宿主ゲ ノムに組込れてもよい。 本願で用いる「処理」という用語は、予防および／または治療を意味する。 本願で用いる「個体」という用語は、を椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを意 味し、家畜、競技用動物、霊長動物およびヒトを含むが、これに限定されるもの ではない。 本願で用いる場合、核酸の「玉鎖」は、ポリペプチドをコードする配列を含有し ている。またｒｇＬ、鎖」は、ｒ正鎖」の配列を相補する配列を含有している。 本願で用いる。ウィルスの「玉鎖ゲノム」は、　ＲＮＡまたはＤＮＡにかかわら ず、−重鎖のゲノムであり、ウィルスのポリペプチドをコードする。玉鎖のＲＮ Ａウィルスの例としては。 トガウィルス科ウィルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ　）　、コロナウィルス科ウ ィルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）　、レトロウィルス科ウィルス（Ｒｅｔ ｒｏｖｉｒｉｄａｅ）　、ピコルナウィルス科ウィルス（Ｐｉｃｏｒｎａ−。 ｖｉｒｉｄａｅ）およびカリチウイルス科ウィルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａ ｅ）がある。またワラビウイルス科ウィルスも含まれるが、これは以前にトガウ ィルス科に分類されていた〔フィールドとナイブの文献（１９８６年）を参照〕 。 本願で用いる「抗体を含有する身体成分」は２問題の抗体の起源である個体の身 体の成分を意味する。抗体を含有する身体成分は、当該技術分野で知られており １例えば、血漿。 血清、を髄液、リンパ液、呼吸器官と腸管と尿生殖器管の外部セクション（ｓｅ ｃｔｉｏｎ　）　、涙、唾液、乳、白血球および骨髄腫細胞が含まれるが、これ に限定されるものでばない。 本願で用いる「精製されたＨＣＶ　Ｊは、ウィルスが通常連結されている細胞構 成要素および感染組織中に存在する他の種のウィルスから単離されたＨＣＶの製 剤を意味する。ウィルスを単離する技術は、当業者には知られており９例えば、 遠心分離法およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれるが、精製ＨＣｖ の製法については後述する。 （以下余白） ■０発１１１戊 本発明の実施においては、特に指示されない限り、当該分野で既知である分子生 物学、微生物学９組み換えＤＮＡ　、および免疫学の従来の手法が採用される。 このような手法は２文献中に充分に説明されている。例えば９次の文献を参照さ れたい：　Ｍａｎｉｓｔｉｓ、　ＦｔｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、　ＭＯ ＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＩＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　 （１９Ｂ２）　：　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ、Ｉ巻および■巻（Ｄ、Ｎ　Ｇ１ｏ ｖｅｒ績集、　１９８５）　；　０ＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＩＩ：　ＳＹＮ Ｔ）ＩＥｓＩｓ（Ｍ、Ｊ、　ＧａｉｔｗＡ集、　１９８４）　；　ＮＵＣＬＥＩ ＣＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ　（Ｂ。 Ｄ、　ｎａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ＆ｌｉＨ集、　１９８４）　 ；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮＡＮＤ　ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ　（Ｂ、Ｄ、　 Ｈａｗ＋ｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇ’ｇｉｎｓ　Ｑ集。 １９８４）　；　ＡＮＩＭＡＬ　ＣＥＬＬ　ＣｔｌＬＴＵＲＥ　（Ｒ，１，Ｆｒ ｅｓｈｎｅｙ１ｇ集、　１９８６）　；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬＳ　 ＡＮＤ　ＥＮＺＹＭＥＳ　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６）　；　Ｂ。 Ｐｅｒｂａｌ、　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥ　Ｔｏ　ＭＯＬＥＣＵＬ ＡＲＣＬＯＮＩＮＧ　（１９８４）　；ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬ ＯＧＹのシリーズ（Ａｃａｄｅ＋＋＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、）　：ＧＥ ＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲＳ　ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬ Ｓ　（Ｊ、Ｈ，ＭｉｌｌｅｒおよびＭ、Ｐ、　Ｃａ１ｏｓＷ集、　１９８７＋　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　；Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、　１５４およびＶｏｌ、　１５ ５　（それぞれ向およびＧｒｏｓｓｍａｎ　；　Ｗｕ編集）、　Ｍａｙｅｒおよ び−ａｌｋｅｒｌｉ集（１９Ｂ？）　：ｌ聞ＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨ ＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ　Ｌ　５ｃｏｐｅｓ、　（１９８７） 　；　ＰＲＯＴＥＩＮＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　：　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　 ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ、　５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅ ｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、）、およびＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲ ＩＭＥＮＴＡＬＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｉ　〜ＩＶ巻（Ｄ、Ｍ、　Ｗｅｉｒおよ びＣ，ＣｏＢｌａｃｋｗｅｌｌｌｉ。 １９８６）　。 ここで述べられる前出および後述の特許出願および公報は参考文献としてここに 取り入れられている。 本発明の有用な物質および方法は、　ＨＣＶ感染チンパンジーの血漿中に存在す る核酸配列由来のｃＤＮＡライブラリーから単離されたヌクレオチド配列と非常 に相同なヌクレオチド配列群の供給により可能となる。このヌクレオチド配列群 はヒトあるいはチンパンジーの起源ではない。なぜなら、このヌクレオチド配列 群は、非感染個体から得られるヒトおよびチンパンジーのゲノムＤＮＡのいずれ にもハイブリダイズせず、この配列群のヌクレオチドはＨＣ■感染したチンパン ジーの肝臓および血漿にのみ存在し、そして、この配列は遺伝子バンクには存在 しないからである。さらに、この配列群は、　ＨＢＶゲノム内に含有される配列 に有意な相同性を示さない。 クローン５−１−１内に含有されるこの群のある配列は、およそ５０個のアミノ 酸のポリペプチドをコードする１つの連続的なオープンリーディングフレーム（ ＯＲＦ　）を有する。ＨＣＶ感染者から得られた血清にはこのポリペプチドに結 合する抗体が含有されている一方、非感染者から得られた血清には、このポリペ プチドに対する抗体が含有されない。最終的に非感染チンパンジーから得られた 血清には、このポリペプチドに対する抗体が含有されないが、この抗体は、急性 ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーにおいて誘導される。さらに、このポリペプ チドに対する抗体はＩ（ＡＶ−およびＨＢＶに感染したチンパンジーおよびヒト においては検出されない。これらの基準によると、この配列はウィルスの配列に 対するｃＤＮＡであり、このウィルスにより生じ、　ＮＡＮＢＨと関連する配列 である。このｃＤＮＡ配列を第１図に示す。後述のように、クローン５−１−１ におけるｃＤＮＡ配列は、単離された他のｃＤＮＡ　（さらに２８個の塩基対を 含有する）とは異なる。 るｃＤＮＡの断片と同等な合成配列をプローブとして用い、単離第６図に示す。 ｃＤＮＡ群の他の構成要素は、クローン１４ｉ、１１ｂ、７ｆ、７ｅ、８ｈ、３ ３ｃ、４．Ｏｂ、３７ｂ、３５＋　３６＋　８Ｌ　３２＋３３ｂ、２５ｃ、１４ ｃ、８　ｆ、３３ｆ、および３３ｇ、および３９ｃに存在する配列を含み、これ らは、　ＩＶ、Ａ節で詳細に説明される。 これらクローン中のｃＤＮＡ複合配列はＩＶ、Ａ　、１８節で詳細に説明されて おり、第２６図に示される。ｃＤＮＡ複合配列はひとつの連続したＯＲＦを含有 し、従って、ポリタンパクをコードしていることが示される。このデータは、後 に考察されるように。 ＨＣＶがワラビウイルスあるいはワラビ様ウィルスであるという示唆と一致する 。 第１図〜第３２図に包括して示すｃＤＮＡ群が入手可能となるため、　ＤＮＡプ ローブの構築およびポリペプチドを得ることが可能となる。上記ポリペプチドは 、　ＨＣＶ惑染感染るＮＡＮＢＨの診断において、そして、供血者、供給された 血液および血液産物が感染しているか否かについてスクリーニングすることにお いて、有用である０例えば、この配列から、約８〜１０個あるいはそれより長い ヌクレオチドを有するＤＮＡオリゴマーを合成することが可能である。このＤＮ Ａオリゴマーは９例えばウィルスを保有している疑いがある被験者血清における ウィルスゲノムの存在を検出するための、あるいは供給された血液についてウィ ルスの存在の有無をスクリーニングするための、ハイブリダイゼーションプロー ブとして、有用である。 ｃＤＮＡ配列の群によりまた。　ＮＡＮＢＨにおいて生じる抗体の存在を検出す る診断用試薬として有用なＨＣＶに特異的なポリペプチドの設計および産生が可 能となる。ｃＤＮＡ由来の精製ポリペプチドに対する抗体は感染個体および血液 中のウィルス抗原を検出するためにも用いられ得る。 これらのｃＤＮＡ配列の知識により、　ＨＣＶに対するワクチンとしてそして抗 体産生のためにも用いられ得る。ポリペプチドの設計および調製が可能となる。 そしてこのポリペプチドは。 次に、　ＵＣＶ疾患に対する保護および／またはＨＣＶ感染個体の治療に用いら れ得る。 さらに、　ｃＤＮＡ配列群によりＨＣＶゲノムを、より特徴づけることを可能に する。これらの配列から得られたポリヌクレオチドプローブは９重複している付 加的なｃＤＮＡ配列についてｃＤＮＡライブラ°リーをクーリーニングするため に用いられ得、このｃＤＮＡ配列はさらに９重複している別の配列を得るために も用いられ得る。ゲノムが分割されており、そのセグメントが共通配列を欠いて いる限り、この手法はゲノム全体の配列を得るために用いられ得る。しかし、ゲ ノムが分割されているならば、ゲノムの他のセグメントは、ここで述べられてい るｃＤＮ＾クローンを単離するために用いられたλ−ｇｔｌｌの血清学的なスク リーニング工程を繰り返すことにより、あるいは。 精製ｎｃｖ粒子からのゲノムを単離することにより得られ得る。 ｃＤＮＡ配列群およびこれら配列由来のポリペプチド、そして。 これらペプチドに対する抗体もまた。　ＢＢ−ＮＡＮＢＶ因子の単離および同定 に有用である０例えば、　ｃＤＮＡ由来のポリペプチドに含まれるＨＣＶエピト ープに対する抗体は、アフィニティークロマトグラフィーをもとにした工程で、 ウィルスを単離するために用いられ得る。あるいは、この抗体は他の手法により 単離されたウィルス粒子を同定するために用いられ得る。単離されたウィルス粒 子のウィルス抗原およびゲノム物質が。 さらに特徴づけられ得る。 ＨＣＶゲノムをさらに配列決定することによって得られる情報により、およびＩ （ＣＶ抗原がさらに特徴づけられ、ゲノムが特徴づけられることにより、付加的 なプローブおよびポリペプチド、そして抗体の設計および合成が可能となる。こ れらは、　ＵＣＶ誘発ＮＡＮＢＨの診断、予防、および治療に、そして感染血液 および血液関連産物のスクリーニングに用いられ得る。 抗原および抗体を含むＨＣＶのプローブ、およびｃＤＮＡ群が誘導されるゲノム 由来のポリヌクレオチドが利用可能であることにより、　ＨＣＶの生物的性質を 明らかにするにあたり主として用いられる組織培養系の発達が可能となった。こ のことにより、　ｎｃｖ複製、あるいはｎｃｖ感染を選択的に阻害する抗ウィル ス化合物に基づいた新しい治療法が開発され得る。 ＮＡＮＢＨの病因因子を同定および単離するために用いられる本性は新規であり ９次のような今までに特徴づけられていない因子の同定および／または単離に適 用され得る。上記因子はゲノムを含有し、ウィルス、ウィロイド、細菌類、菌類 。 および寄生虫によって引き起こされる疾患を包含するさまざまな疾患に関連する 因子である。この方法ではｃＤＮＡライブラリーが、感染個体から得られる感染 組織中に存在する核酸から、調製された。このライブラリーは、　ｃＤＮＡをコ ードするポリペプチドを発現し得るベクター中に調製された。ベクターを含む宿 主細胞のクローンは、病因因子のポリペプチドの免疫反応性断片を発現し、これ は、推定される因子に以前に感染した別の個体由来の抗体含有体成分を有するこ のライブラリーの発現産物を免疫学的にスクリーニングすることによって選択さ れる。免疫学的なスクリーニング法における工程は。 次の工程を包含していた；：ベクターを含むｃＤＮＡの発現産物と、二次的に感 染した個体の抗体含有体成分とを相互作用させる工程；および発現産物と二次感 染個体の抗体との間の抗原−抗体複合配列の形成を検出する工程。単離されたク ローンはさらに次のようにして免疫学的にスクリーニングされる：発現産物を、 推定される因子に感染した他の個体および推定される因子に感染していない対照 の個体の抗体含有体成分と相互に作用させること、および、感染個体由来の抗体 との抗原−抗体複合配列の形成を検出すること。そして、感染個体および該因子 に感染している疑いのある個体由来の抗体と免疫学的に反応するが、対照の個体 由来のものとは反応しないポリペプチドをコードするｃＤＮＡ含有ベクターが、 単離される。ｃＤＮＡライブラリーの構築および免疫学的なスクリーニングに用 いた感染個体は同種である必要はない。 本性により単離されたＤＮＡ発現産物、そして該発現産物に対する抗体は、病因 因子の特徴づけおよび／または捕捉に有用である。さらに、詳細に後述するよう に、この方法は、　ＨＣＶゲノム由来のｃＤＮＡ群を単離するために、好適に利 用される。 Ｉｌ、Ａ、飢■忙死曵廻製 慢性ＨＣＶ惑染感染パンジー由来の貯留血清であって、ウィルスを高力価で、つ まり少な（とも１０６チノパンツー感染量／　ｒａｆｔ　（ｃｈｉ＋ｎｐ　１ｎ ｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｄｏｓｅｓ／　ｒｒｄｌ　；　Ｃ１０７ｍ）を有する血清を 、ウィルス粒子を単離するために用いた。そして、このウィルス粒子から単離し た核酸を、ウィルスゲノムに対するｃＤＮＡライブラリーの構築においてテンプ レートとして用いた。 推定ＨＣＶ粒子の単離およびλ−ｇｔｌｌにおけるｃＤＮＡライブラリーの構築 のための手順は、　ＩＶ、Ａ、１節で考察されている。λ−で生じた特異的な抗 血清で多数の組み換え体ファージをスクリーニングするために、特に開発された ベクターである。およその平均サイズが２００塩基対のｃＤＮＡを有するｃＤＮ Ａブールからのλ−ｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーが以前にＮＡＮＢ肝炎にか かったことのある患者由来の血清に特異的に結合し得るようなコードされたエピ トープについてスクリーニングされた。Ｈｕｙｎｂ＋丁、ｖ、ら（１９８５）。 約１０”個のファージがスクリーニングされ５個の陽性ファージが同定、精製さ れ９次に、　ＨＣＶ因子に以前に感染した異なるヒトおよびチンパンジーから得 た血清に対スる結合の特異性がテストされた。このファージの１つである５−１ −１が、テストしたヒト血清８個のうちの５個と結合した。７個の正常血清はこ のような結合を示さなかったので。 この結合は以前にＮＡＮＢ肝炎にかかった患者由来の血清に選択的であるらしい 。 組換え体ファージ５−１−１におけるｃＤＮＡ配列が、決定され。 それは第１図に示される。このクローン化されたｃＤＮＡによってコードされた ポリペプチドは、融合ポリペプチドのＮ末端β−ガラクトシダーゼ部分として同 一の翻訳枠内にあり、その配列は、該ヌクレオチド配列の上に示される。従って 、翻訳ＯＲＦは、　ＮＡＮＢ肝炎に感染した患者由来の血清によって特別に認識 されるエピトープをコードする。 組換えファージ５−１−１においてｃＤＮＡが利用できるため、ウィルスゲノム に対するｃＤＮＡの付加的な断片および／または他の断片を有する他のクローン を単離することが可能となる。 前出のλ−ｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーは、クローン化された５−１−１ｃ ＤＮＡ配列由来の合成ポリヌクレオチドを用いてスクリーニングされた。このス クリーニングにより、　８１．１−２．　および９１として同定された３個の他 のクローンが得られた。これらのクローン内にあるｃＤＮＡが配列決定された。 ＩＶ、Ａ、３節およびＩＶ、Ａ、４節を参照されたい。４個の独立したクローン 間の相同性を第２図に示す。第２図では相同性が縦線により示されている。クロ ーン５−１−１．８１．　および９１において独特のヌクレオチド配列を小文字 で示す。 クローン５−１−１．８１．１−２．および９１における組換え体ファージにク ローン化されたｃＤＮＡは、相同性が高く、わずかに２個の領域において異なる にすぎない。第一に、クローン１−２の６７番目のヌクレオチドはチミジンであ る一方、他の３個のクローンは、この位置にシチジンを有する。しかし、この置 き変えにより、コードされたアミノ酸の性質は変化しない。 この４つのクローンの第２の違いは、クローン５−１−１が。 他のクローンには存在しないような２８の塩基対を５゛末端に有していることで ある。この特別な配列はクローニングにより５゛末端に人工的に形成されたもの である。クローニングにより５′末端に形成される人工的な配列は２通常、　ｃ ＤＮＡ法の生成物中に観察される。 クローン８１におけるＨＣＶ　ｃＤＮＡの５”領域および３′領域由来の合成配 列は、クローン８１　ｃＤＮＡと重複するλ−ｇｔｌｌのＮＡＮＢＶｃＤＮＡラ イブラリー由来のｃＤＮＡのスクリーニングおよび単離に用いられた（ＩＶ、Ａ 、５節）。クローン３６およびクローン３２の中にそれぞれ存在する得られたｃ ＤＮＡ配列は、第５図および第７図に示される。 同ｌに、クローン３６の５°領域に基づいた合成ポリヌクレオチドは、クローン ３６　ｃＤＮＡに重複するλ−ｇｔｌｌ　ＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡライブラリーか らｃＤＮＡをスクリーニングし単離するのに用いられた（ＩＶ、Ａ、８節）。合 成ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズする組換えファージ含有ｃＤＮＡ の精製クローンはクロ配列は第８図に示される。 得られた。これらクローンの単離はＩＶ、Ａ節で後述する。 単離されたクローン内にコードされたＩ（ＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の 分析により、複合ｃＤＮＡがひとつの長い連続したＯＲＦを有することが示され る。第２６図に、これらのクローンからの複合ＤＮＡ配列を、それによりコード された推定されるＨＣＶポリペプチドとともに、示す。 ｃＤＮＡ配列を得るための方法の記述は、歴史的に興味深い。 得られた配列（およびその相補配列）は本発明により提供され、その配列あるい はその部分的な配列は合成法を用いて。 あるいは２合成法と、ここに記載したのと同様の方法を用いた部分配列を得る方 法とを組み合わせて、調製される。 ＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーからの、そしてクローン５−１−１．８１゜１− ２および９１から複製されるλ−ｇｔｌ１株は、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１　Ｐａｒｋｌ ａｈｎ　Ｄｒ、、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。 Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２．に、ブダペスト条約により寄託されており。 次の受託番号を有する。 に紅ｕＡＴＣＣＮｌｌ！丘且 ＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリー　４０３９４　１９８７年１２月１日クローン８ １　４０３８８　１９８７年１１月１７日クローン９１　４０３８９　１９８７ 年１１月１７日クローン１−２　４０３９０　１９８７年１１月１７日クローン ５−１−１　４０３９１　１９８７年１１月１８日本出願が米国特許として許可 され発行されると、これら寄託物を利用することに関する制限はすべて最終的に 取り除がれる。そして上記命名された寄託物は、　３７ＣＦＲ１，１４および３ ５ＵＳＣ１，２２によりコミッショナーによって権利を与えられた上記出願が係 属している間は、入手可能である。さらに、その寄託物は、寄託日から３０年間 、あるいは寄託物の最終要求から５年間；あるいは、米国特許の存効である期間 のいずれか長い方の期間の間、維持される。これらの寄託物およびここで述べら れている寄託物は便宜のためにのみ寄託されたものであり、ここでの記載された 内容により本発明を実施することを意図していない、すべての寄託物におけるＨ ＣＶ　ｃＤＮＡ配列は。 参考として、ここに述べられている。 ことによりゲノムを「ウオーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）　Ｊする上記記載により 、全ＨＣＶゲノムに対するｃＤＮＡを単離し得る方法が提供される。しかし０本 明細書で提供される情報が与えられたとしても、これらのｃＤＮＡを単離する他 の方法は当業者には自明である。そのような方法のいくつかはこの後のＩＶ、Ａ 節で述（以下余白） ＩＩ　、Ｂ、ウィルス　ポリペプチドおよびフラグメントのＢ第１〜３２図のｃ ＤＮＡ配列を利用して、後述のように単離されたｃＤＮＡ配列であっても、これ らの図のｃＤＮＡ配列であっても。 このようなｃＤＮＡ配列を利用し得るため、いずれかの鎖においてコードされて いるポリペプチドの抗原的に活性な領域をコードする発現ベクターの構築が可能 となる。これらの抗原的に活性な領域はコートまたはエンベロープ（外被）抗原 、あるいはコア抗原由来であり得、それには例えば、ポリヌクレオチド結合タン パク、ポリヌクレオチドポリメラーゼ、およびウィルス粒子の複製および／また は構築（ａｓｓｅａ＋ｂｌｙ）に必要とされる他のウィルス性タンパクが包含さ れる。所望のポリペプチドをコードするフラグメントは従来の制限消化を用いで あるいは合成法により、　ｃＤＮＡクローンから誘導され１例えばタンパクβ− ガラクトシダーゼあるいはスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）　（好ま しくは５ＯＤ）のような融合配列の一部を有するベクター中に連結される。ＳＯ Ｄの融合配列を有するポリペプチドの産生に有用な方法およびベクターは。 １９８６年１０月１日に公開されたヨーロッパ特許出願公開番号第０１９６０５ ６号に記載されている。ＳＯＤおよび）ＩＣＶポリペプチドの融合ポリペプチド をコードするベクター（つまりＮＡＮＢｓ−＋　−ｒ　。 ＮＡＮＢ、、およびＣ１００−３；　ＨＣＶ　ｃＤＮＡ（７）複合配列中ニコー ドされている）は、それぞれＩＶ、Ｂ、１．１Ｖ、Ｂ、２．およびＩＶ、Ｂ、４ 節に記載されている。どちらのセンス鎖においても、オープンリーディングフレ ームを有するＨＣＶ　ｃＤＮＡの所望の部分は、成熟タンパクあるいは融合タン パクのような組換えポリペプチドとして得られる。あるいは、このｃＤＮＡにコ ードされるポリペプチドは、化学合成により供給され得る。 所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、融合型であっても成熟型であっても ９分泌を可能にするシグナル配列を有していてもいな（でも、適当な宿主に適し た発現ベクターに組み込まれ得る。真核生物および原核生物の両宿主が１組換え ポリペプチドを形成するために現在用いられている。より一般的な制御系および 宿主細胞系を、後述のＩＶ、Ａ節にまとめて示す、このポリペプチドは９次に、 溶解した細胞あるいは培地から単離され、実際の使用に必要な程度にまで精製さ れる。 精製には、当該分野で公知の手法が用いられ得、それには例えば、塩分画、イオ ン交換樹脂でのクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、遠心分 離などがある。例えば＊　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙの種々 のタンパク精製法を参照されたい。このようなポリペプチドは１診断用として用 いられ得るか、あるいは抗体を中和するようなポリペプチドはワクチンに処方さ れ得る。これらのポリペプチドに対して生じた抗体もまた６診断薬として、ある いは受動免疫治療に用いられ得る。さらに、後述のＩｌ、Ｊ節で考察するように 、これらポリペプチドに対する抗体は、　ＨＣＶ粒子の単離および同定に有用で ある。 このＨＣＶ抗原はまた。　ＨＣＶピリオンから単離され得る。このピリオンは９ 組織培養物中のＨＣＶ感染細胞、あるいは感染宿主中で増殖し得る。 Ｉ［、Ｃ，ｌ、ポリペプチドの３．＋１およびキャ１アーとの　入ポリペプチド の抗原性領域は１通常は比較的小さく９代表的には８〜１０個あるいはそれを下 まわる長さのアミノ酸である。せいぜい５個のアミノ酸フラグメントが抗原性領 域を特徴づけている。これらのセグメントは、　ＨＣＶ抗原領域に対応する。従 って、このＨＣＶのｃＤＮＡを基本的に用いると、　ｎｃｖポリペプチドの短い セグメントをコードするＤＮＡは、融合タンパクとして、あるいは単離ポリペプ チドとして９組換え手法により発現させることができる。さらに、短いアミノ酸 配列は、化学合成で都合よく得ることができる。合成ポリペプチドが正しいエピ トープを提供するために正しく形成されているが、小さすぎて免疫原性がない場 合には、このポリペプチドは、適当なキャリアーと結合させることができる。 このような結合を得るための多くの手法が当該分野では公知であり、それには、 　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏａｒｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓから 入手されるＮ−サクシイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（Ｓ ＰＤＰ）およびサクシイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン− １−カルボネート（ＳＭＣＣ）を用いてジスルフィド軸合を形成する方法が包含 される（もしこのペプチドがスルフヒドリル基を欠いていれば、システィン残基 を付加することにより、この方法が用いられ得る）。これらの試薬は、その試薬 自身とあるタンパクのペプチドのシスティン残基との間のジスルフィド結合、お よびリジンのε−アミノ、あるいはその他の遊離のアミノ基によるアミド結合を 生成する。このようなさまざまなジスルフィド／アミド形成試薬は公知である０ 例えば、　Ｉｍｍｕｎ、Ｒｅｖ、（１９８２）６２：１８５を参照されたい。他 の二官能性カップリング試薬は、ジスルフィド結合よりむしろチオエーテルを形 成する。これらのチオ−エーテル生成試薬の多くは市販されており、それには６ −マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイ ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルが包含され る。このカルボキシル基は。 そのカルボキシル基とコハク酸イミドとを、あるいは１−ヒドロキシル−２−二 トロー４−スルホン酸ナトリウム塩とを組み合わせることによって活性化される 。上述の化合物の名称は、それが全てであることを意味せず、その化合物の修飾 物もまた明らかに用いられ得る。 キャリアーとしては、それ自身が宿主に対して有害な抗体の産生を誘導しないも のであれば、いずれのキャーリアーもが用いられ得る。適当なキャリアーは、典 型的には、大きく。 ゆっくり代謝される高分子物質であり、それには例えば、タンパク；ラテックス 機能付与セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどの多糖 体；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのような重合アミノ酸二アミノ酸共重合 体；および不活性ウィルス粒子がある（例えば、］１．Ｄ節を参照のこと）。特 に有用なタンパク基質には、血清アルブミン。 サイログロブリン、オボアルブミン、テタヌス毒素、および当業者に公知の他の タンパクがある。 ＩＩ、Ｄ、ＨＣＶエピトープ　るバイブ！・ド１　、の星製 ＨＣＶのエピトープの免疫原性はまた１粒子形成タンパク（例えば、Ｂ型肝炎の 表面抗原と結合するタンパク）と融合もしくは結合させた噴孔動物の系あるいは 酵母の系で調製することによって増強される。ＮＡＮＢＶエピトープが粒子形成 タンパクコード配列に直接結合している構築物は、　ＨＣＶエピ）　−プに関し て免疫原性のハイブリッドを産生ずる。さらに、調製したすべてのベクターはＨ ＢＶに特異的なエピトープを有し。 例えばプレＳペプチドのように異なる度合の免疫原性を有する。このように、　 ＨＣＶ配列を有する粒子形成タンパクから構築される粒子は、　ＨＣＶおよびＨ ＢＶに関して免疫原性である。 肝炎の表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は、　Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（Ｖａｌｅｎ ｚｕｅｌａら。 （１９８２））　、および例えば哺乳動物細胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、 ら。 （１９８４））において形成され、結合して粒子となることが示されている。こ のような粒子の形成は、単量体のサブユニットの免疫原性を増強することが示さ れてきた。この構築物はまた。 ＨＢＳＡｇの免疫的に優性なエピトープを有し、それはプレ表面（プレＳ）領域 の５５アミノ酸を含有する（Ｎｅｕｒａｔｈら、　（１９８４））。 酵母中に発現され得るプレＳ−ＨＢ５Ａｇ粒子の構築物は、ヨーロッパ特許出願 公開第１７４，４４４号（１９８６年３月１９日公開）に開示されている。酵母 の発現のための異種ウィルス配列を有するハイブリッドは、ヨーロッパ特許出願 公開第１７５，２６１号（１９６６年３月２６日公開）に開示されている。これ らの出願の出願人は本出願人と同一であり、参考としてここに取り入れられてい る。 これらの構築物もまた。　ＳＶ４０のジヒドロ葉酸還元酵素ベクターを用いてチ ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞中で発現させる ことができる（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８４））。 さらに９粒子形成タンパクをコードする配列の部分は、　ＨＣＶエピトープをコ ードするコドンで置き換えられ得る。この置き換えにおいては、酵母あるいは哺 乳動物中で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒介するために必要とされない 部分は削除され得、このようにして、　Ｉ（ＣＶエピトープと競合する部分から 付加的なＨＢＶ抗原部位が除去される。 Ｉｌ、Ｅ、ｌえ±２皇Ｈ製 ワクチンは、　ＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来の免疫原性ポリペプチドおよび第１〜３２ 図のｃＤＮＡ配列由来の免疫原性ポリペプチド、あるいはこれらが対応するＨＣ ｖゲノム由来の免疫原性ポリペプチドの１種あるいはそれ以上から調製される。 ＨＣＶおよびワラビウイルスの間に観察される相同性は、ワクチンとして最も有 効でありそうなポリペプチドと、それらがコードされているゲノム領域に関する 情報を提供する。フラビウイルスゲノムの一般的な構造は、　Ｒｉｃｅら（１９ ８６）により考察されている。こであると考えられ、これは、３つのウィルスの 構造タンパク（つまり、　Ｃ，ＭおよびＥ）、そして、２つの大きな非構造タン パク（ＮＶ４およびＮＶ５）およびより小さな非構造タンパクの複合体の対に翻 訳される。ワラビウイルスの主要な中和エピトープは、　Ｅ（外被：　ｅｎｖｅ ｌｏｐｅ）タンパクに属することは公知である（Ｒｏｅｈｒｉｇ　（１９８６） 　）。対応するＨＣＶ　Ｅ遺伝子およびポリペプチドをコードする領域は、ワラ ビウイルスに対する相同性に基づいて、予想され得る。このように、ワクチンは 、　ＵＣＶＥのエピトープを有する組換えポリペプチドを含有し得る。 これらのポリペプチドは、細菌、酵母、あるいは哺乳動物細胞において発現する か、あるいは、ウィルス調製物から単離され得る。他の構造タンパクもまた。保 護抗ＨＣＶ抗体を生じるエピトープを有し得ることが予期される。このようにｌ 　ＥＩＣｌ　およびｎのエピトープを有するポリペプチドもまた。単独であるい は組み合わせて、　ＨＣＶワクチン中で用いられ得る。 上記に加えて、　Ｎ５Ｉ（非構造タンパク１）で免疫すると黄熱病から保護され ることが示されている（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら（１９８６））　。 たとえ、その免疫により中和抗体が生じないとしてもこのことは正しい。このよ うに、特に、このタンパクはワラビウイルスの間で高い度合で保持されるらしい ので、　ＨＣＶ　ＮＳＩもまた。　ＨＣＶの感染に対して保護作用を有するよう である。さらに、たとえ非構造タンパクが中和抗体の産生を行わないとしても、 非構造タンパクは、ウィルスの病原性に対して保護作用を提供し得ることもまた 示される。 上記の見解においては、　ＨＣＶに対する多価のワクチンは１あるいはそれ以上 の構造タンパク、および／またはｌあるいはそれ以上の非構造タンパクを含有し 得る。これらのワクチンハ１例えば３組換えＨＣＶポリペプチドおよび／または ピリオンから単離されたポリペプチドを含有し得る。さらに、ワクチンにおける 不活性化ＨＣＶの使用を可能にする。不活性化は、ウィルス溶解物の調製による か、゛あるいはワラビウイルスの不活性化を引き起こす当該分野で公知の他の方 法（例えば、有＠溶媒あるいは界面活性剤での処理、あるいはホルマリンでの処 理）により行われ得る。さらに、ワクチンはまた。 弱毒化ＨＣＶ株からも調製され得る。弱毒化ＨＣＶ株の調製は。 後述される。 フラビウイルスにおけるタンパクのい（つかは高度に保持された領域を有するこ とは公知であり、従って、い（つかの免疫学的交差反応性がＨＣＶと他のワラビ ウィルスとの間に予想される。フラビウイルスとＨＣＶとの共有のエピトープは 。 これら病原因子によって引き起こされる１あるいはそれ以上の障害に対する保護 抗体を生じる可能性がある。このように。 この認識に基づく多目的ワクチンを設計することができる。 活性成分として免疫原性のポリペプチドを含有するワクチンの調製は、当業者に 公知である０代表的には、このようなワクチンは、液体溶液あるいは懸濁液のい ずれかとして、注射できるように調製される。注射の前に液体に溶解あるいは懸 濁させるのに適当な固形物の形態としても調製され得る。 この調製物はまた。乳化することもでき、あるいは、リポソームにカプセル化さ れるタンパクであってもよい、この活性免疫原性成分は、薬学的に受容され得、 この活性成分と適合性のある賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤として は１例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど 、およびこれらの組み合わせがある。さらに必要に応じて、このワクチンには少 量の補助物質が含有され得、それには、補湿剤あるいは乳化剤、　ｐＨ緩衝剤、 および／またはこのワクチンの効果を増強するアジュバントがある。効果的なア ジュバントの例としては９次の物質があり。 そしてこれらには限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル −し−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、　Ｎ−アセチル− ツルームラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ　１１６３７．　 ｎｏｒ−ＭＯＰとする）、Ｎ−７セチルムラミルーし一アラニルーＤ−イソグル タミニルーし一アラニンー２−（１”−２゛−ジパルミトイル−５ｎ−クリセロ −３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ｃｃｐ１９８３５Ａ、　 ＭＴＰ−ＰＥとする）、およびＲＩＢＩ、上記ＲＩＢＩは細菌がら抽出される３ つの成分、モノホスホリル脂質Ａ、）レバロースシミコール酸、および細胞壁骨 格成分（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）　、を。 ２％スクアレン／トゥイーン８０乳液中に含んでいる。アジュバントの効果は、 　ＨＣＶ抗原配列を有する免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定するこ とによって決定され得る。 このポリペプチドは１種々のアジュバントを含むワクチン中のこのポリペプチド を投与することにより生じる。 このワクチンは１通常、非経ロ的に注射で投与され、その形態は９例えば、皮下 注射であっても筋肉注射であってもよい、他の投与形態に適当な処方には座薬が あり、場合によっては経口処方もある。座薬として従来のバインダーおよび担体 が用いられ得、それには例えばポリアルキレングリコールあるいはトリグリセリ ドがある。このような座薬は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜 ２％の範囲で含有する混合物から形成される。経口処方物には１通常使用される 賦形剤が含有され、そのような賦形剤には例えば、製剤グレードのマンニトール 、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、 セルロース、炭酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は、溶液、懸濁液１ 錠剤、丸剤、カプセル剤、放出を維持するような処方、あるいは粉剤の形態を有 し、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の割合で含有する。 このタンパクは、そのままであるいは塩の形で、ワクチンに処方され得る。薬学 的に受容され得る塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ基により形成され る）が包含され。 この塩は、無機酸（例えば、塩酸あるいはリン酸）あるいは有機酸（例えば酢酸 、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸など）を用いて形成される。遊離のカルボキシ ル基により形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリ ウム、アンモニア、水酸化カルシウム、あるいは水酸化鉄）および有機塩基（例 えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、 ヒスチジン、ブロヵインなど）からも誘導され得る。 １１、Ｆ、クチンの　および１ このワクチンは投薬処方に適合するように、そして予防効果および／または治療 効果が得られる量で、投与される。投与される量は、一般に１回の投与あたり抗 原が５μｇ〜２５０μｇであり、この投与量は治療される個体、該個体の免疫系 の抗体合成能、および所望する保護の度合に依存する。投与に必要とされる活性 成分の正確な量は、医師の判断によるものであり、それぞれの個体に特有であり 得る。 このワクチンは、１回の投与計画で与えられるが、あるいは好ましくは複数回の 投与計画で与えられ得る。複数回の投与計画では、最初のワクチン投与は、１〜 １ｏ回に分けて行なわれ、第２回目の投与では免疫応答維持もしくは強化するた めに第１回目とは別に所定の間隔をおいて引き続いて１〜４ヶ月投与され、そし て必要であれば数ケガ後にさらに引続き投与が行なわれる。この投与形態はまた 。少な（とも部分的には１個人の必要量によって決定され、医師の判断による。 さらに、免疫原性のＨＣＶ抗原を有するワクチンは、他の免疫調整因子１例えば 免疫グロブリンと組み合わせて投与され上述のようにして調製される免疫原性の ポリペプチドは。 ポリクローナル、および、モノクローナルの両抗体を生産するのに用いられる。 ポリクローナル抗体が所望であれば９選択される哺乳動物（例えば、マウス、ウ サギ、ヤギ、ウマなど）はＨＣＶエピトープを有する免疫原性ポリペプチドを用 いて免疫される。免疫された動物から得られる血清は回収され。 公知の方法によって処理される。ＨＣＶエピトープに対するポリクローナル抗体 を有する血清が他の抗原に対する抗体を含んでいる場合には、このポリクローナ ル抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリク ローナルな抗血清を産生じ、処理する手法は、当該分野では公知であり９例えば ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ（１９８７）を参照されたい。 あるいは、ポリクローナル抗体は、あらかじめＨＣＶに感染させておいた哺乳動 物から単離され得る。感染個体の血清から得られる）ＩＣＶエピトープに対する 抗体を精製する方法の例は、　Ｖ、Ｅ、節で述べられており、これは、アフィニ ティークロマトグラフィーに基づき、　ＳＯＯとｃＤＮＡクローン５−１−１内 にコードされたポリペプチドとの融合ポリペプチドを利用する方法である。 ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル抗体もまた。当業者により容易に生産 され得る。ハイプリドーマによってモノクローナル抗体を作成する一般的な方法 は公知である。永久増殖性の抗体産生細胞系は細胞融合によって作成することが でき、さらに、腫瘍原性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、あるいはＥ ｐｓｔｅｔｎ−Ｂａｒｒウィルスを用いたトランスフェクションのような他の手 法によってもまた作成することができる。例えば、　Ｍ、５ｃｈｒｅｉｅｒら（ １９８０）；　Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）　：Ｋｅｎｎｅｔｔら（１ ９８０）の文献を参照されたい、さらに、米国特許ＮＣＬ４．３４１　、７６１ 　：　Ｎｏ、４　、３９９．１２１　；Ｎｏ、４．４２７．７８３　；Ｎｏ、４ ．４４４　、８８７　：　ｋ４D４６ ６、９１７：　Ｎｏ、４．４７２＋　５００；　Ｎｏ、４．４９１．６３２；お よびＮｏ、４．４９３．８９０もまた。 参照されたい。ＨＣＶエピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネ ルは１種々の目的（例えばアイソタイプ。 トープに対して形成され、特に診断において有用であり、中和抗体１よ受動免疫 治療に有用である。特にモノクローナル抗体は抗イデイオタイプの抗体を生じさ せるために用いられ得る。 抗イデイオタイプ抗体は、それに対して保護が望まれる感染因子の抗原の「内的 イメージ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｉ＋ａａｇｅ）　Ｊを伴う免疫グロブリンである 。例えば＋　Ｎ１５ｏｎｏｆｆ、　Ａ、ら（１９８５）および　Ｄｒｅｅｓｏ＋ ａｎら（１９８５）を参照されたい。 抗イデイオタイプ抗体を生じさせるための手法は、当該分野で公知である。例え ば＋　Ｇｒｚｙｃｈ（１９８５）、　ＭａｃＮａｍａｒａら（１９８４）　。 およびＵｙｔｄｅｈａａｇら（１９８５）を参照されたい。これらの抗イデイオ タイプ抗体は、　ＮＡＮＢＨの治療、およびＨＣｖ抗原の免疫原性領域を解明す るのにも有用である。 １１、Ｈ，ｍ　第１ゴヌクレオチドプロープおよびキ・ト単離されたＨＣＶ　ｃ ＤＮＡの開示部分・（第１〜３２図に示される部分を包含する）を基本として用 いて、約８個あるいはそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴマーが切断あるい は合成によって調製され得る。このオリゴマーは、　ＨＣＶゲノムとハイブリダ イズし、このウィルス性因子の同定、さらにこのウィルス性ゲノムの特徴づけ、 および疾患個体のウィルスの検出に有用である。ＨＣＶポリヌクレオチドプロー ブ（天然あるいは誘導された）は、ハイブリダイゼーションによって独特のウィ ルス配列を検出し得る長さである。６〜８個のヌクレオチドが、その機能を果た し得る長さであるが、１０〜１２個のヌクレオチド配列が好適であり、約２０の ヌクレオチドが最も好適であると考えられる。好ましくは、これら配列は、異種 性を欠いている領域由来である。これらプローブは自動化オリゴヌクレオチド合 成法を含む、定型的な方法を用いて調製され得る。有用なプローブには９例えば １本明細書で開示されたクローン５−１−１および付加的なりローン、そして、 　ｃＤＮＡライブラリーをプローブする際に有用な後述の種々のオリゴマーがあ る。ＨＣＶゲノムのどの独特な部分の相補鎖も充分使用され得る。フラグメント の長さが長くなるにつれ完全に相補性を有する必要はなくなるのであるが、プロ ーブとして使用するには完全な相補性が望まれる。 診断用としてこのようなプローブを使用するには、血液あるいは血清のような分 析されるべき生物学的試料は、必要であれば、そこに含有されている核酸を抽出 するために処理される。この試料から得られた核酸は、ゲル電気泳動あるいは他 のサイズ分離手段にかけられ得る。あるいは、この核酸試料は、サイズ分離を行 うことなくドツトプロットされ得る。 次にこのプローブは標識化される。プローブを標識するための適当な標識物、お よび方法は当該分野では公知であり、それには例えば、ニック翻訳あるいはキナ ーゼ処理で取り込まれた放射性標識物、ビオチン螢光プローブ、および化学発光 プローブが含まれる。試料から抽出された核酸は１次に、適当な厳密さのハイブ リダイゼーション条件下で、標識されたプローブと共に処理される。 このプローブは、　ＨＣＶゲノムに完全に相補的に作成され得る。従って、偽陽 性を防ぐために１通常、厳密性の高い条件が望まれる。しかし、プローブが異種 性を欠くウィルスゲノム領域と相補性を有する場合のみに、厳密性の高い条件が 使用される。ハイブリダイゼーションの厳密さは、ハイブリダイゼーションおよ び洗浄工程中の多（の因子（温度、イオン強度９時間の長さおよびホルムアルデ ヒドの濃度を含む）により決定される。これらの因子は１例えばＭａｎｉａｔｉ ｓ、Ｔ（１９８２）により概説されている。 一般に、このＨＣＶゲノム配列は、感染個体の血清中に比較的低レベル（つまり 、ｌｄあたり約１０”〜１０３個の配列）で。 存在する。このレベルはハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅手法が用 いられることが必要であり得ることを示している。そのような手法は当該分野で は公知である。例えばＥｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎのｒ　Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄｇｅ　Ｊシステムでは、　ＤＮＡプローブに未修飾 の３′−ポリーｄＴテールを付加するために、末端デオキシヌクレオチドトラン スフェラーゼを用いている。ポリｄＴテールを付加したプローブは標的となるヌ クレオチド配列にハイブリダイズされ、ついで、ビオチン修飾ポリＡにハイブリ ダイズされる。ＰＣＴ出願８４１０３５２０およびＥＰＡ１２４２２１には次の ような方法のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記述されている：（１） 被分析物を、酵素標識オリゴヌクレオチドに相補的な単鎖ＤＮＡプローブにアニ ールすオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。ＥＰＡ２０４５１０には次 のような方法のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記述されている。この 方法では９分析物であるＤＮＡを９例えば、ポリｄＴテールのようなテールを有 するプローブと接触させ３次に増幅鎖と接触させる。この増幅鎖は、プローブの テールとハイブリダイズするポリＡ配列のような配列を有し。 複数の標識鎖を結合することが可能である。特に望ましい方法では、まず血清中 標的ＨＣＶ配列が約１０．０００倍、つまり約１０６配列／ｄとなるように、標 的ＨＣＶ配列の増幅が行われる。これは２例えば、　５ａｉｋｉ　ら（１９８６ ）の方法によって行なわれ得る。 この増幅された配列は、ハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて検出され得 る。このハイブリダイゼーションアッセイ法は９本願出願人による係属中の米国 出願（１９Ｂ７年１０月１５日出願：代理人のＤｏｃｋｅｔｋ　２３００−０１ ７１　）中に記載されており。 これは、参考文献としてここに取り入れられている。　１０’　／ｄのレベルで 配列を検出するこのハイブリダイゼーションアッセイ法では、単鎖の分析すべき 核酸に結合し、多数の単鎖標識オリゴヌクレオチドにも結合する核酸多量体を利 用する。 標識されたポリヌクレオチドプローブを用いる。適当な溶液相のサンドイッチア ッセイ、およびプローブの調製法は、１９８７年６月１６日に公開された本願出 願人によるＥＰＯ２２５，８０７に記載されており、これを参考文献としてここ に取り入れる。 このプローブは診断用キット中に組み入れることができる。 診断用キットは、プローブＤＮＡを有し、このプローブＤＮＡは標識されている か、あるいはこのプローブＤＮＡは標識されておらず、標識用の成分がキット中 に入っている。このキットにはまた。特定のハイブリダイゼーションのプロトコ ルに必要な他の試薬および材料（例えば、標準品、およびこのテストを行なうた めの指示書）が適当に包装されて含まれる。 ＩＩ　、１．イムノア・セイおよび鰺　キ・トＨＣＶ抗体を含有する血清と免疫 的に反応するポリペプチド。 およびこれらのポリペプチドのＨＣＶ特異的エピトープに対して生じる抗体は、 イムノアッセイにおいて９例えば血液または血清試料を包含する生物学的試料に おけるＵＣＶ抗体の存在。 あるいはウィルスおよび／またはウィルス抗原の存在を検出するために有用であ る。上記ＨＣＶ抗体は１例えば、　ＩＶ、Ａ節で記載されたクローン由来であり 、あるいは、このクローン内にコードされ、そしてそれらの複合体である。上記 ｔｔｃｖ特異的エピトープに対して生じる抗体については９例えば、　ＩＶ、２ 節を参照されたい、このイムノアッセイの設計は多くの変更を行うことが可能で あり、これらアッセイの多様性については当該分野では既知である０例えば、こ のイムノアッセイでは、１種のウィルス抗原が利用され得る。このウィルス抗原 は１例えば、　ＩＶ、Ａ節で記載のＨＣＶ　ｃＤＮＡを有するクローンのいずれ か由来のポリペプチド、あるいはこれらクローンのｃＤＮＡ由来の複合ｃＤＮＡ 由来のポリペプチド、あるいはこれらのクローンのｃＤＮＡが誘導されるＨＣＶ ゲノム由来のポリペプチドである。あるいは、このイムノアッセイには、これら の源由来のウィルス抗原の組合せが用いられ得る。例えば、ウィルスのエピトー プに対する１種のモノクローナル抗体、ひとつのウィルスの抗原に対するモノク ローナル抗体の組み合わせ、異なるウィルス抗原に対する複数のモノクローナル 抗体、同一のウィルス抗原に対するポリクローナル抗体、あるいは異なるウィル ス抗原に対するポリクローナル抗体が使用され得る。 プロトコルは１例えば、競合分析法、直接分析法、あるいはサンドインチタイプ 分析法を基本とすることができる。このプロトコルではまた。固体支持体を用い るか、あるいはこのプロトコルは、免疫沈澱法であり得る。はとんどのアッセイ は標識化抗体あるいはポリペプチドの使用を含む。この標識物には例えば、螢光 分子、化学発光分子、放射性分子あるいは染色分子がある。このプローブからの シグナルを増幅するアッセイもまた公知である。その例としては、ビオチンおよ びアビジンを利用するアッセイ、および酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ （例えば、　ＥＬＩＳＡアッセイ）がある。 ＨＣＶのワラビウイルスモデルにより、ピリオンの構造タンパクに対する診断用 エピトープの位置の推定が可能となる。 Ｃ９プレＭ、ＭおよびＥドメインはすべて、ウィルス抗原を検出するために、特 に診断用に、有意な可能性のあるエピトープを含有していると考えられる。同様 に、非構造タンパクのドメインは９重要な診断用エピトープ（例えば、推定のポ リメラーゼをコードするＮＳ５：および推定の補体結合抗原をコードするＮ５Ｉ ）を有することが予想される。これらの特異的ドメイン由来のエピトープを有す る組換えポリペプチドあるいはウィルスのポリペプチドは、感染血液提供および 感染患者におけるウィルス抗体の検出に有用である。 さらに、Ｅおよび／またはｉタンパクに対する抗体が、　ＮＡＮＢＩＩによって 引き起こされるＨＣＶ患者および感染血液提供者のウィルス抗原を検出するイム ノアッセイにおいて用いられ得る。 さらに、これら抗体は象、性期のドナーおよび患者を検定するのに非常に有用で ある。 免疫診断に適し、適切に標識された試薬を有するキットが。 適切な材料を適当な容器中に包装することによって得られる。 この適切な材料には、　ＨＣＶエピトープを有する本発明のポリペプチド、ある いはＨＣＶエピトープに対する抗体、およびアッセイの遂行に用いられる他の試 薬および物質、さらにアッセイの指示書のセットを含む。 ＩＩ、Ｊ、ウィルス゛ツムに・　るｃＤＮＡのプローブを　いた。 ＨＣｖ゛ツム　ビ富オンおよびウィルス　゛の　の　ＩＶ、　Ａ、節に記載した クローンのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列の情報は。 第１図〜第３２図に示すように、　ＨＣＶゲノムの配列とＨＣＶ因子の同定と単 離とについての情報をさらに得るために用いられレオチドプローブ、　ＨＣＶゲ ノム由来のポリペプチド、およびエピトープに対応する抗体が得られるようにな る。 上記クローンのｃＤＮＡ配列の情報は、　ＩＶ、　Ａ節に記載されたクローンの ｃＤＮＡの起源であるｔｌｃＶゲノムの未確定領域由来の他のｃＤＮ＾配列を単 離するためのプローブを設計するのに有用である０例えば、約８個またはそれ以 上、好ましくは２０個またはそれ以上のヌクレオチドの配列を有する標識化プロ ーブは、第１．第３．第６．第９．第１４および第３２図に示すＨＣＶｃＤＮＡ 配列の群の５”末端または３°末端に近い領域由来のものであり、　ＨＣＶ　ｃ ＤＮＡライブラリーから重複ｃＤＮＡ配列を単離するのに用いられ得る。上記ク ローンのｃＤＮＡと重複するこれらの配列は、上記クローンのｃＤＮＡの起源で ないゲノムの領域由来の配列も含んでいるが、　ＩＶ、　Ａ節に記載のクローン のｃＤＮＡと必らずしも重複しない、他の重複断片を同定するためのプローブを 合成するのに利用することができる。ＨＣＶゲノムが切断され、そのセグメント が共通の配列を欠いていなければ、ウィルスゲノム由来の重複ｃＤＮＡを単離す る技術を利用して、全ウィルスゲノムの配列を決定することができる。これとは 異なり、ゲノムが切断されていて共通配列を欠いている場合は。 ゲノムの配列は、　ＩＶ、　Ａ節に記載したクローンの単離および配列決定の技 術を用い、クローン５−１−１を単離するのに用いたのと同様に、λｇｔｌｌ　 ＨＣＶライブラリーを血清学的にスクリーニングし、　ｃＤＮＡ単離物の配列を 決定し、単離されたｃＤＮＡを利用して重複断片を単離することによって、決定 することができる。あるいは、ゲノムセグメントの特性決定は。 精製されたＨＣＶ粒子から単離されたウィルスゲノムで行うことができる。ＨＣ Ｖ粒子を精製し、精製中の粒子を検出する方法は後述する。ポリヌクレオチドの ゲノムのウィルス粒子からの単離工程は、当該技術分野では公知であり、利用さ れる一方法を実施例ＩＶ、　Ａ、１．に示す。単離されたゲノムのセグメントは １次に、クローン化され配列決定され得る。このように、ここで提供される情報 によって、その性質にかかわ゛ｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は、当該技 術分野では公知であり、すでに記載し、あるいは後で述べられる。λｇｔｌｌ内 にＨＣＶ　ｃ［ｌＮＡライブラリーを構築する方法は、　ＩＶ、　Ａ、節ですで に述べられている。しかし、核酸プローブでスクリーニングするのに有用なｃＤ ＮＡライブラリーもまた。当該技術分野で公知の他のベクター内１例えばλｇｔ ｌｏ　（ヒュインら（Ｈｕｙｎｈｅｔ　ａｌ　）　、　１９８５年〕内で構築す ることができる。第１〜３２図のｃＤＮＡ由来のプローブ、およびこれらｃＤＮ Ａ由来のポリヌクレオチドから合成されたプローブによって検出された。　ＨＣ Ｖ由来のｃＤＮＡは、単離されたポリヌクレオチドを、適当な制限酵素で切断す ることによって、クローンから単離し、配列を決定することができる。例えば、 クローン５−１−１中のＨＣＶｃＤＮＡと重複するＨＣＶ　ｃＤＮＡの単離と配 列決定とに使用される手法については、　ＩＶ、　Ａ、３節およびＩＶ、　Ａ、 ４節を；クローン８１中のＨＣＶ　ｃＤＮＡと重複するＨＣＶ　ｃＤＮＡの単離 と配列決定とについては、　ＩＶ、　Ａ、５〜ＩＶ、Ａ、７節を；そして、他の クローン（クローン３６）およびクローン８１と重複するクローンの単離と配列 決定とについては、　Ｉｔ／、　Ａ、８節およびＩＶ、　Ａ。 ９節を参照されたい。 これらの重複ＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来の配列情報は、ウィルスゲノム内の相同領域 と異なる領域とを決定するのに有用であり、このことにより、異なる種類のゲノ ムおよび／または欠陥粒子（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　）の集 団の存在を示すことができる。 ＩＩ、　Ｇ、節に記載の手法を利用して、　ＨＣＶの単離（後述する）中に、生 物学的試料中のＩ（ＣＶ　、　ＨＣＶ抗原またはＨＣＶ核酸を検出することはま た。ハイブリダイゼーシッンプローブを設計するのに有用である。さらに９重複 ｃＤＮへは、クローン５−１−１　、３６．８１．９１および１−２内ならびに ＩＶ、　Ａ、節に記載の他のクローン内にコードされているポリペプチドをコー ドするＨＣＶゲノム由来のポリペプチドの発現ベクターを作製するのに利用でき る。ＨＣｖエピトープををするこれらのポリペプチドを作製する技術と、ポリペ プチドに含有されているＨＣＶエピトープに対応する抗体とその用途に関する技 術とは、クローン５−１−１．３２．３５．３６．　１−２．８１および９１に 含まれるＮＡＮＢＶ　ｃＤＮＡ配列由来のポリペプチドについて記載され。 すでに検討されまた後にも検討される技術と類僚する。 クローン５−１−１．３２．３５．３６．８１．９１．　１−２およびＩＶ、　 Ａ０節に記載の他のクローンに含まれているｃＤＮＡ配列の群内に、　ｎｃｖに 特有のものと考えられるエピトープを含有する抗原がコードされている。つまり 、これらの抗原に対する抗体がＨＡＶもしくはＨＢＶに感染した個体に欠けてお り、そしてＨＣＶに感染していない個体に欠けている（ＩＶ、　Ｂ、節に示す血 清学的データ参照）、さらに、これらのｃＤＮＡの配列情報と、　ＨＡＶ　、　 ＨＢＶ　、　ＨＤＶの配列および遺伝子バンクのゲノム配列とを比較すると、こ れらのｃＤＮＡと上記の起源のポリヌクレオチドの配列とには最小の相同性が存 在することが示されている。このように、これらクローンのｃＤＮＡ内にコード されている抗原に対する抗体は、感染した個体から単離したＢＢ−ＮＡＮＢＶ粒 子を同定するのに用いることができる。さらに、この抗体は、　ＮＡＮＢＨ因子 の単離にも有用である。 ＨＣｖ粒子は、　ＢＢ−ＮＡＮＢＶに感染した個体由来の血清または細胞培養物 から、以下のような当該技術分野で公知の方法で単離することができる。公知の 方法としては５例えば、沈降法もしくは排除法のようなサイズ識別に基づく方法 ；密度勾配による超遠心分離法のような密度に基づく方法；ポリエチレングリコ ールのような試薬による沈澱法；またはアニオンもしくはカチオン交換物質、疎 水性によって結合する物質のような種々の物質およびアフィニティヵラムのカラ ムによるクロマトグラフィー法がある。この分離工程中に、　ｎｃｖの存在は次 のような方法で検出できる。すなわち、先に述べたＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来のプロ ーブを用いて、抽出されたゲノムをハイブリダイゼーシッン分析する方法：また は第１〜３２図に示すｃＤＮＡ配列の群内にコードされたＨＣＶ抗原に対する抗 体および先に述ヘタ重複ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列内にコードされたＨＣｖ抗原に対 する抗体をプローブとして用いる免疫検定法（ｎ、ｉ、ｍ参照）がある、抗体は モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、免疫検定法 にこれら抗体を使用する前に精製することが望ましい、クローン５−１−１内に コードされた抗原に対するポリクローナル抗体の精製法は、　ＩＶ、　Ｅ。 節に記載されているが２Ｍ似の精製法を、他のＨＣＶ抗原に対する抗体は、固体 の支持体に固定されており、免疫アフィニティクロマトグラフィーによるＨＣＶ の単離に有用である。免疫アフィニティ、クロマトグラフィーの手法は、当該技 術分野で知られており９例えば、抗体を固体の支持体に固定しその免疫選択活性 を保持する方法がある。この方法には、抗体が支持体に吸着されている方法〔例 えば、カースタック（Ｋｕｒｓ　ｔａｋ　）（７）ＥＮＺＹＭＥ　ＩＭＭＵＮＯ ＤＩＡＧＮＯ５ＩＳ、　３１〜３７頁参照〕および抗体が支持体と共有結合され ている方法がある。一般に、これらの方法は、抗原を固体支持体に共有結合させ て使用する方法と同様であり、それはｎ、ｃ、節に概略記載されているが、スペ ーサー茎が二官能性のカップリング試薬に含まれ、抗体の抗原と結合する部位が 近づきやすいようになっている。 精製処理中に、　ＨＣＶの存在が、すでに述べた第１〜３２図に示すＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列の群および重複ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列由来のポリヌクレオチドをプロ ーブとして利用する核酸ハイブリダイゼータジン法によって検出および／または 確認される。この場合。 画分は、ウィルス粒子の崩壊を起こすような条件下で８例えイブリダイゼーシゴ ン法によって検出されるウィルス核酸の存在下で、界面活性剤によって処理され る。単離された粒子がＨＣｖを誘発する因子であるということは、単離されたウ ィルス粒子をチンパンジーに感染させ１次いでＮＡＮＢＨの徴候が感染によるも のであるか否かを決定することによって確認することができる。 次に、精製された調製物から得たウィルス粒子は、さらに特性決定される。その ゲノム核酸が精製された。このゲノム核酸がＲＮａｓｅに対して感受性でＤＮａ ｓｅ　Ｉに感受性でないことから、そのウィルスがＲＮＡゲノムで構成されてい ることが明らかである（後述のＩＶ、　Ｃ，２，節参照）。そのゲノム核酸のス トランドの状態（ｓ　ｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ　）および円形性（ｃｉｒｃｕ− Ｉａｒｉｔｙ）であるか非円形性であるかということは、公知の技術１例えばそ れを電子顕微鏡により視覚化すること、密度勾配により移動させること、および 沈降特性を調べることによって測定される。捕捉されたＨＣＶゲノムがＨＣＶ　 ｃＤＮＡの負のストランドとハイブリダイズすることから、　ＯＣＶは正のスト ランドのＲＮＡゲノムを含むことが明らかである（ＩＶ、　Ｈ，１ｗｉ参照）、 コノような手法は９例えば、　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹに 記載されている。さらに、精製された核酸は、クローン化され、公知の方法（例 えば、ゲノム物質はＲＮＡなので逆転写法）によって配列を決定することができ る。例えば、マニアナイス（１９８２年）、およびグローバー（Ｇｌｏｖｅｒ） 　（１９８５年）の文献を参照されたい、ウィルス粒子由来の核酸を利用すれば 、それが切断されていてもいなくても、全ゲノムの配列を決定することができる 。 １４ｉから３９ｃまでの結合クローン（第２６図参照）の連続ＯＲＦ内にコード されたポリペプチドの相同性の試験を行うと、　ｎｃｖポリペプチドが、ワラビ ウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）の保存された領域内の対応するタンパク と相同性のある領域を有することが示される。この具体例は、　ＩＶ、　Ｈ，３ ，節に示されている。この知見には、多くの重要な効果がある。第１に、この情 報は、　ＩＩＣＶが正のストランドのゲノムを有し、その大きさが約ｔｏ、ｏｏ ｏヌクレオチドであることを示す試験結果とともに、　ＨＣＶがワラビウイルス かまたはワラビ様ウィルスであることを示唆していると考えて矛盾しない。一般 に、フラビウイルスのピリオンとゲノムとは、比較的変化しない構造と組織を有 し、このことは公知である。ライスら（Ｒｉｃｅ　ｅｔ　ａｌ）（１９８６年） 、およびプリントン　エム　ニー（Ｂｒｉｎｔｏｎ　Ｍ、　Ａ、）＋（１９Ｂ８ 年）を参照されたい。従って、ポリペプチドＣ，ブレＭ／ＭおよびＥをコードす る構造遺伝子は、クローン１４ｉの上流の遺伝子の５゛末端に位置し得る。さら に、他のワラビウィルスと比較することによって、これらのタンパクをコードす る配列の正確な位置を予想することができる。 クローン１４ｉのゲノムの上流の配列の単離は１本明細書に示した多くの方法に より達成され得、そのことは、当業者に自明である。例えば、ゲノム“ウオーキ ング法（ｇｅｎｏｍｅ“−ａｌｋｉｎｇ″’　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　）が、クロ ーン１４ｉ内のゲノムの５”側にありそのクローンと重複する他の配列を単離す るのに用いられ得るが、この方法によって、付加的な配列の単離が行いる０例え ば、フラビウィルスは、保存されたエピトープと保存された核酸配列の領域とを 存することが知られている。 保存された配列を含むポリヌクレオチドは、　ＨＣＶゲノムを捕捉するプローブ として用いて、それを単離することができる。 さらに、これらの保存された配列は、第２２図に示すＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来の配 列とともに、ポリメラーゼの連鎖反応の技術を用いて、クローン１４ｉの配列の 上流のゲノム配列を増幅する系に使用するプライマーを設計するのに利用される 。この例は後述される。 ｎｃｖの構造もまた。決定され、その成分が単離され得る。 その形態と大きさは９例えば電子顕微鏡によって決定され得る。コート抗原もし くはエンベロープ抗原のような特異的なウィルスポリペプチド抗原、または核酸 結合タンパク、コア抗原のような内部抗原、およびポリヌクレオチドポリメラー ゼの同定と位置決定とは１例えば、抗原が大きなもしくは小さなウィルス成分と して存在するか否かを測定すること、および単離されたｃＤＮＡ内にプローブと してコードされた特異的抗原に対する抗体を利用すること、によって行なわれ得 る。 この情報は、ワクチンを設計するのに有用である０例えば。 ワクチン調製物に外部抗原を含有させることが好ましい、多価ワクチン（ｓａｕ ｌｔｉｖａｌｅｎｔ　ｖａｃｃｉｎｅ　）は９例えばＥのような構造タンパクを コードするゲノム由来のポリペプチド、および例えば非構造ポリペプチドもしく は構造ポリペプチドのような、ゲノムの別の部分由来のポリペプチドで構成され ていてもよい。 Ｉｌ、に、ａ　の　立　＼と　モー゛ル、ＨＣＶがワラビウイルスもしくはワラ ビ様ウィルスであるという示唆によって、　ＨＣＶ増殖法についての情報が提供 される。 “フラビ様”という用語は、そのウィルスが、ワラビウイルスの公知の保存され た領域に対して有意の相同性を示し、そして、そのゲノムの大部分が単一のＯＲ Ｆであることを意味する。ワラビウイルスの培養法は、当業者に公知である〔例 えば、プリントン（１９８６年）およびストラー、ブイ（Ｓｔｏｌｌａｒ。 Ｖ、）　（１９８０年）の総論を参照されたい〕、一般に、　ａＣＶを培養する のに適切な細胞もしくは細胞としては、ワラビウイルスの複製を維持することが 知られているもの５例えば次のものがある：サル腎臓細胞系（例えば、　Ｍｌｈ 　、　ＶＥＲＯ）　；ブタの腎臓細胞系（例えば、　ｐｓ）　；ベビーハムスタ ーの腎臓細胞系（例えば、　ＢＨＫ　）　；ネズミマクロファージ細胞系（例え ば。 Ｐ３８８Ｄ１．　ＭＫＩ　、　Ｍｏｌ　）　；ヒトマクロファージ細胞系（例え °ば。 Ｕ−９３７）　：ヒト末梢白血球；ヒトの付着性単球；肝細胞もしくは肝細胞系 （例えば、　ＨＵＨ７，ＨＥＰＧ２　）　；胚もしくは胚細胞系（例えば、ニワ トリの胚線維芽細胞）；または無を推動物由来の細胞系。 上記熱を推動物由来の細胞系として好ましいのは昆虫由来のもの（例えば、シロ ウジヨウバエの細胞系）であり、さらに好ましいのは節足動物由来のもので９例 えば蚊の細胞系〔例えば、Ａ、アルボピクッス（＾、　Ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ　 ）　、イーデスイージブチー（’Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ　）　＃　クーテ ックス　トリテニオリンクス（Ｃｕｔｅｘ　ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕ ｓ　）　）もしくはダニ細胞系〔例えば、　ＲＭＬ−１４ダーマセンター　バル マペルッス（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ　ｐａｒｕｍａｐｅｒｔｕｓ）　］である 。 −次肝細胞を培養しついでＨＣＶに感染させてもよいし、あるいは肝細胞培養物 を感染した個体（例えば、ヒトもしくはチンパンジー）の肝臓から得てもよい、 後者の場合は、生体内で感染した細胞が生体外で継代された例である。さらに。 種々の永久増殖細胞化法を、肝細胞培養物由来の細胞系を得るために用いること ができる。例えば、−次肝臓培養物（肝細胞集団の集積の前後）は９種々の細胞 と融合され、安定性を保持する０例えば、永久的または半永久的細胞系を創製す るために、培養物を、形質転換ウィルスに感染させるか、または形質転換遺伝子 でトランスフェクトさせる。さらに９例えば、肝臓培養物中の細胞は、融合され て、確立された細胞系（例えば、　ＨｅｐＧ２　）となり得る。細胞融合法は、 当該技術分野で既知であり９例えば、ポリエチレングリコール、センダイウィル スおよびエプスタイン−バールウィルスのような融合因子が使用される。 上記で述べたように、　ＨＣＶはワラビウィルスもしくはワラビ様ウィルスであ る。従って、細胞系のＨＣＶ感染は、おそらく、細胞をワラビウイルスに感染さ せる当該技術分野で公知の方法によって達成することができる。これらの方法に は。 例えば、細胞内にウィルスが侵入しうる条件下で、細胞をウィルス調製物ととも にインキュベートする方法がある。さらに、細胞を単離されたウィルスポリヌク レオチドでトランスフェクトすることによってウィルスの産生物を得ることがで きる。トガウィルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ　）およびフラビウイルスのＲＮＡが ９種々のを推動物の細胞系〔フェファーコーン（Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ　）お よびシャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ　）　、　１９７４年〕および蚊細胞系、〔ペレ ーグ（Ｐｅｌｅｇ　）　、　１９６９年〕に感染性であることが知られている０ 組織培養細胞を、　ＲＮＡ二本鎖、正のストラドのＲＮＡおよびＤＮＡ　（ｃＤ ＮＡを含む）でトランスフェクトする方法は、当該技術分野では公知であり９例 えば、エレクトロボーレーシゴン法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　）　、 およびＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＢＡＩ！−Ｄｅｘｔｒａｎ）もしくはリン酸 カルシウムによる沈降法を用いる手法がある。　Ｉ（ＣＶ　ＲＮＡの多くの起源 を。 完全ゲノムに対応するＨＣＶ　ｃＤＮＡの転写を生体外で行うことによって得る ことができる。この物質もしくはクローン化されたＨＣＶ　ｃＤＮＡを用いたト ランスフェクションによって、ウィルスが複製されそしてウィルスが生体外で増 殖するようになるはずである。 培養細胞に加えて、動物モデル系がウィルス複製に使用できるが、ワラビウイル スが動物系に存在するということは。 当業者には公知である〔例えば、モナース（Ｍｏｎａ　ｔｈ　）による総説（１ ９８６年）参照〕、従って、　ＨＣＶの複製は、チンパンジーで起こるだけでな く９例えば、マーモセットやサックリングマウスでも起こる。 Ｉｔ、Ｌ、　ＨＣＶに・する　ウィルス　のスフ１−ニングＨＣＶの細胞培養物 と動物モデル系とを利用することによって、　ＨＣＶの複製を阻害する抗ウィル ス剤、特に優先的に細胞を生育・増殖させる一方でウィルスの複製を阻害する抗 ウィルス剤をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニング法は、 当業者には知られている。一般に、抗ウィルス剤は、ウィルスの複製を維持する 細胞培養系でウィルスの複製を阻害する効果と、動物モデル系での感染性もしく はつイルス病原性を阻害する効果（および低レベルの毒性）について種々の濃度 で試験される。 ＨＣＶ抗原とＨＣＶポリヌクレオチドを検出するためのここに記載された方法と 組成物は、ウィルス複製に対する抗ウィルス剤の効果を検出する方法として、細 胞プラーク検定法もしくはｈＤｓ。検定法の代わりにこれらの方法よりもおそら く高感度の方法を提供することから、抗ウィルス剤のスクリーニングに有用であ る０例えば、ここに記載したＨＣＶポリヌクレオチドプローブは、細胞培養で産 生されたウィルス核酸を定量するのに利用できる。このことは２例えば感染した 細胞の核酸と標識したＨＣＶポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーシ ョンまたは競合ハイブリダイゼーションによって達成することができた０例えば 、また抗ＨＣＶ抗体は５本明細書に記載の免疫検定法を利用して細胞培養物中の ＨＣＶ抗原を同定および定量するのに利用できる。さらに、感染細胞の培養物中 のＨＣＶ抗原を競合検定法で定量することは望ましいことであるから２本明細書 に記載したＨＣＶ　ｃＤＮＡ内にコードされたポリペプチドは、これらの競合検 定法に有用である。一般に。 ＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来の組換え体ＨＣＶポリペプチドに標識化し、この標識化ポ リペプチドとＨＣＶポリペプチドとの結合が細胞培養系内に産生された抗原によ って阻害されるのを監視する。さらに、これらの方法は、　ＨＣＶが細胞系内で 細胞死を起こすことなく複製できる場合、特に有用である。 ＩＩ、　Ｍ、、ヒされた１１Ｃｖの１ 上記のことに加えて９組織培養系および／または動物モデル系を利用して弱毒化 されたＨＣＶ株を単離することができる。 これらの株は、ワクチン用もしくはウィルス抗原単離用に適している。弱毒化ウ ィルス株は、細胞培養および／または動物モデルでの複数の継代の後に単離可能 である。感染した細胞もしくは固体の弱毒化株の検出は、当該技術分野で公知の 方法で達成できる。それには９例えば、　ＨＣＶにコードされたひとつまたはそ れ以上のエピトープに対する抗体をプローブとして用いること、あるいは、少な くとも約８個のヌクレオチドの■Ｃｖ配列を含むポリヌクレオチドをプローブと して用いることが包含される。その代わりにあるいはそれに加えて。 弱毒化株は１本明細書に記載のＨＣＶのゲノム情報と９組換え技術を利用して構 築することができる。一般に２例えば病原に関連するポリペプチドをコードする がウィルスの複製は可能であるようなゲノム領域を除去することを試みることが できる。さらに、このゲノム構築によって、　ＨＣＶに対する抗体の中和を起こ させるエピトープの発現が可能になる０次いで。 変化させたゲノムは、　ＨＣＶ複製が可能な細胞と、ウィルス複製が可能な条件 下で増殖する細胞を形質転換するのに利用できる。弱毒化ＨＣＶ株は、ワクチン 製造のみならずウィルス抗原の商業的生産ソースとしても有用である。その理由 は、これらウィルスの処理が、ウィルス生産を行う従業員に対してそれほど厳重 な保護対策をとらなくてもよいからである。 ■、二瓜煎方五 ウィルスからのゲノムの抽出、　ｃＤＮＡライブラリーの調製とブロービング、 クローンの配列決定１発現ベクターの構築。 細胞の形質転換、ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡ検定法のような免疫検 定の実施、培地での細胞の培養などに用いられる一般的な方法は、当該技術分野 で公知であり、これらの方法を記載した実験室のマニュアルを入手することがで きる。 しかし、一般的な指針として、上記の方法およびこれを実施するのに有用な材料 を現在入手できるいくつかの出所を以下に述べる。 ＩＩ、　Ａ、　および　′ 原核および真核の宿主細胞は、指定された宿主に適合する適切な制御配列が用い られた場合に、所望のコード配列の発現に用いることができる。原核細胞宿主の うち、エシェリヒア　コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）が最も汎用される。原核細胞の発現 制御配列には、必要に応じてオペレータ一部分を有するプロモーター、およびリ ポソーム結合部位が含まれている。原核細胞の宿主に適合するトランスファーベ クターは２通常１例えば次のようなものに由来する。つまり、アンピシリンおよ びテトラサイクリンに対する耐性を与えるオペロンを有するプラスミドであるｐ ＢＲ３２２および抗生物質耐性のマーカーを与える配列を有する種々のｐＵｃベ クター由来である。これらのマーカーは、適宜選択することによって、好適な形 質転換細胞を得るのに利用できる０通常用いられる原核細胞の制御配列には、β −ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系〔チャンら （Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ　）　、　１９７７年〕、トリプトファン（ｔｒｐ） プロモーター系〔ゴーデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌｅｔ　ａｔ　）　、　１９８０年 〕およびλ由来Ｐ、プロモーターおよびＮ遺伝子リポソーム結合部位〔シマタケ ら（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ）　。 ｅｔ　ａｌ　）　、　１９８３年〕がある。上記の系は、特にＥ、ｃｏｌｔに適 合する。必要であれば、バシラスもしくはシュードモナス属の菌株のような他の 原核宿主を、対応する制御配列とともに用いてもよい。 真核重上としては、酵母および培養系内の哺乳動物の細胞がある。サツカロミセ ス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびサ ツカロミセス　カールスベルゲンシス（ジに効μ透ジ１郵−ε圧ハ上Ｊ１肋互崩 、）が最も普通に用いられる酵母宿主であり９便利な真菌宿主である。酵母に適 合するは野生型菌株に重金属に対する耐性を与えることによって成功裏に形質転 換された形質転換体を選択することができるようにするマーカーを保有する。酵 母に適合するベクターとしては、２ミクロンの複製起源〔ブローチら（Ｂｒｏａ ｃｈ　ｅｔ　ａｌ）　。 １９８３年）　、　Ｃ２Ｈ４およびＡＲＳＩの組み合わせ、または確実に複製を 行わせる他の手段（例えば、適切なフラグメントを宿主細糖酵素合成のプロモー ター〔ヘスら（ｌｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ）　、　１９６８年；ホーランドら（Ｈｏ ｌｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ　）　、　１９７８年〕を含み、このようなプロモータ ーには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ〔ハイラマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）　 、　１９８０年〕に対するプロモーターが含まれる。ターミネータ−には９例え ばエノラーゼ遺伝子由来のターミネータ−〔ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ　）　 、　１９８１年〕が含まれ得る。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド３− リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターもしくはアルコール脱水素酵素（ ＡＤＨ）調節性プロモーター、　ＧＡＰＤＨ由来のターミネータ−２および分泌 が所望の場合には、酵母α因子由来のリーダー配列を含む系である。さらに１作 動可能に連結されている転写調節領域および転写開始領域は、野生型生物に本来 関係しないものであってもよい。これらの系については。 欧州特許公開第１２０．５５１号（１９８４年１０月３日公開）；同第１１６． ２０１号（１９８４年８月２２日公開）；および同第１６４．５５６号）（１９ ８５年１２月１８日公開）に詳細に記載されており、これらはすべて本発明の出 願人によるものであり９本願に引用文献として記載する。 発現のために宿主として利用可能な哺乳類の細胞系は当該技術分野で知られてお り、　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎ　（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの永久増殖化細胞系がある。それには、 　Ｈｅ１ａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスタ ー腎臓ＣＢＨＫ　）細胞および多くの他の細胞系がある。哺乳類の細胞に対する 適切なプロモーターも当該技術分野では公知であり、それには、シミアンウィル ス４０　（Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ）　（ＳＶ４０）　（フィアース（Ｆｉｅ ｒｓ　）　。 １９７８年〕、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ　）　、アデノウィルス（ＡＤＶ　 ）およびウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ　）由来のプロモーターのようなウィルス プロモーターが含まれる。哺乳類細胞はまた。ターミネータ−配列およびポリＡ 付加配列を必要とし。 発現を増大させるエンハンサ−配列も含まれ、そして、遺伝子の増幅を引き起こ す配列も望ましい、これらの配列は当該技術分野で公知である。哺乳類の細胞で 複製させるのに適切なベクターには、ウィルスレプリコン、またはＮＡＮＢＶエ ピトープをコードする適当な配列を宿主ゲノムに確実に組込む配列が含まれる。 ＩＩｌ、Ｂ　長１転換 形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公知のいずれの方法によっ ても行なわれ得る。それには例えば。 ポリヌクレオチドをウィルスにパッケージングし２次いでそのウィルスを宿主細 胞に形質導入する方法およびポリヌクレオチドを直接取込む方法がある。使用さ れる形質転換法は。 形質転換すべき宿主に依存する０例えば、　Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞を、　ＢＢ− ＮＡＮＢＶ配列を有するλｇｔｌｌで形質転換することが後述の実施例の項で述 べられている。直接取込み法による細菌の形質転換には、一般に、塩化カルシウ ムまたは塩化ルビジウムによる処理が用いられる〔コーヘン（Ｃｏｈｅｎ　）　 、　１９７２年；マニアティス、　１９８２年〕。直接取込み法による酵母の形 質転換は、ヒネンら（Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ）　、　１９７８年、の方法を 用いて行われ得る。直接取込み法による哺乳類の形質転換は、グラハム（Ｇｒａ ｈａａ＋）およびファン　デル　ニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）　１９７８年、 のリン酸カルシウム沈澱法またはこの方法の種々の公知の改変法を用いて行われ 得る。 ｍ、ｃ、二久久二鬼様築 ベクターの構築には、当該技術分野で公知の技術が用いられる０部位特異的なり ＮＡの切断が、適切な制御酵素を用い。 これら市販の酵素のメーカーによって一般に規定されている条件下で処理するこ とによって、実施される。一般に、約１μｇのプラスミドもしくはＤＮＡ配列は 、約２０μｌの緩衝溶液中で１単位の酵素を用いて３７℃の条件下で１〜２時間 時間インバエベートことにより切断される。制限酵素とともにインキュベートし た後、タンパクを、フェノール／クロロホルムによって抽出して除去し、エタノ ールで沈澱させてＤＮＡが回収される。切断断片は、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　６５巻、４９９〜５６０頁、　１９８０年、に記載 された一般的な方法に従って、ポリアクリルアミドもしくはアガロースゲルを用 いた電気泳動法により分離することができる。 粘着末端を有する切断断片は、混合物に存在する適当なデオキシヌクレオチドト リホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で。 Ｅ、ｃｏ￥ｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー）を用いて平滑末端とされ得 る。　Ｓｌヌクレアーゼによる処理も行なわれ得、−末鎖ＤＮＡ部分の加水分解 が行われる。 Ｔ４　ＤＮＡリガーゼとＡＴＰとを用いて標準の緩衝液および温度条件下で連結 反応が行われる。粘着末端の連結には、平滑末端の連結よりも、　ＡＴＰおよび リガーゼの必要量が少い、ベクター断片が連結混合物の一部として用いられる場 合には、ベクター断片は、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ　）または子ウ シ腸アルカリホスファターゼで処理され、５゛末端のリン酸を除去して、ベクタ ーの再連結を防止することが多い、あるいは、不必要な断片の制限酵素による切 断を利用して連結を防止するのに利用することができる。 連結混合物は、　Ｅ、ｃｏｌｉのような適切なりローニング宿主に形質転換され １次いで１例えば、抗生物質耐性によって成功裏に形質転換された形質転換体が 選択され、そして正しい構築物がスクリーニングされる。 ＩＩＩ、Ｄ、　のＤＮＡ１の 合成オリゴヌクレオチドは、ワーナー（賀ａｒｎｅｒ）　（１９８４年）が発表 した自動オリゴヌクレオチ）ド合成装置を用いて調製され得る。必要に応じて９ 合成りＮＡ鎖は９反応の標準条件を用いて、３２Ｐ−ＡＴＰの存在下、ポリヌク レオチドキナーゼで処理することによってｓｔｐで標識化され得る。 ＤＮＡ配列は、　ｃＤＮＡライブラリーから単離されたものも含めて、公知の方 法で修飾することができる。そのような方法としては２例えば、シラー（Ｚｏｌ ｌｅｒ）　（１９８２年）が発表した部位特異的変異誘発法がある。概略を述べ ると、修飾すべきＤＮＡを、−末鎖配列としてファージにパッケージングし１次 にプライマーとして、修飾すべきＤＮＡの部分に相補的であり、それ自体の配列 内に所望の修飾が含ま−れている合成オリゴヌクレオチドを用いて、　ＤＮＡポ リメラーゼで二本鎖ＤＮＡに変換する。得られた二本鎖ＤＮＡは、ファージを保 持する宿主細菌に形質転換される。形質転換された細菌の培養物（ファージの各 鎖の複製物を含む）は、寒天にプレートされてプラークが得られる。理論的には 、新しいプラークの５０％が、変異した配列を有するファージを含有し、残りの ５０％はもとの配列を有する。プラークのレプリカは、正しいストランドとハイ ブリダイゼーション可能であり、かつ未修飾の配列とはハイブリダイゼーション を行わない温度および条件下で、標識化された合成プローブとハイブリダイゼー ションを行なう、ハイブリダイゼーションにより同定された配列は１回収されク ローン化される。 ＤＮＡライブラリーは、グリンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　）およびホッグ ネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ　）　（１９７５年）の方法を用いてプローブ化され得る 。簡単にのべれば、この方法においては、プローブ化されるべきＤＮＡは、ニト ロセルロースフィルタ上に固定され、変性され、そして５０〜５０％ホルムアミ ド、　０．７５ＭＮａＣ１，７５ｍＭ　クエン酸ナトリウム、各々０．０２％（ ｗｔ／ｖ）のウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドンおよびフィコール。 ５０−Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）　、　０．１％ＳＤＳ、そして１１０ ０ｐ／ｄｌキヤリヤーの変性ＤＮＡを含有する緩衝液で、プレハイブリダイゼー ションが行われる。緩衝液中のホルムアミドの濃度（％）、およびプレハイブリ ダイゼーションおよびこれに続くハイブリダイゼーション工程の時間と温度条件 は。 必要とされる厳密さに依存する。厳密さがそれほど必要ではない条件下でのオリ ゴマーのプローブは、一般に、ホルムアミドが低い濃度であり、低温および長い ハイブリダイゼーションの時間で用いられる。　ｃＤＮＡもしくはゲノムの配列 由来のような３０もしくは４０を越えるヌクレオチドを有するプローブを用いる ときには、一般に１例えば、約４０〜４２°Ｃのような高温、および５０％ホル ムアミドのような高濃度が採用される。 プレハイブリダイゼーションに続いて、５゛末端２ｔｐで標識したオリゴヌクレ オチドプローブを緩衝液に添加し５この混合物中で、ハイブリダイゼーションの 条件下にて、上記フィルターをインキュベートする。洗浄後、処理されたフィル ターをオートラジオグラフィーに付すとハイブリダイズしたプローブの位置が示 される。もとの寒天プレート上の、対応する位置のＤＮＡを所望のＤＮＡの起源 として利用する。 １［１，Ｆ、　の　量刀および酉　１゜常套手段により、ベクターを構築する際 には、連結混合物を用いてＥ、ｃｏｌｔ　１８１０１株もしくは他の適当な宿主 を形質転換し、成功裏に形質転換された形質転換体は、抗生物質耐性もしくは他 のマーカーによって選択される０次に、得られた形質転換体から、プラスミドが 、フレウェルら（Ｃｌｅｗｅｌｌクロラムフェニコールによる増幅（フレウェル 、　１９７２年）が行なわれる。そのＤＮＡは、単離され９通常、制限酵素分析 法および／または配列決定法により分析される。配列決定は。 サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（１９７？）の、そしてさらにメリック（Ｍｅｓｓ ｉｎｇ　）らにより述べられた（１９８１年）、ジデオキシ法。 あるいはマキシムらの方法（１９８０年）により実施され得る。 ＧＣに冨んだ領域において時おり観察されるバンドコンブレッジ町ンの問題は、 バールら（Ｂａｒｒ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８６年）の方法に従って、Ｔ−デア ジグアノシン（ｄｅａｚｏ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　）を用いＥＬＩＳＡ法は、抗 原もしくは抗体のいずれかの濃度を測定するのに利用され得る。この方法は、酵 素と、抗原もしくは抗体との結合に依存し、定量の標識として、結合した酵素の 活性を用いる。抗体を測定するには、既知の抗原を固相（例えば、マイクロプレ ートまたはプラスチック製カップ）に固定し、被検血清の希釈物とともにインキ ュベートし、洗浄し。 酵素で標識した抗免疫グロブリンとともにインキュベートし。 再び洗浄する。標識化するために好適な酵素は、当該技術分野で公知であり９例 えば、西洋ワサビペルオキシダーゼがある。固相に結合した酵素活性は、特異的 な基質を添加し、そして生成物の生成または基質の利用率を比色法で測定するこ とによって測定される。結合した酵素の活性は、結合した抗体の量の一次関数で ある。 抗原を測定するには、既知の特異的抗体を固相に固定し。 抗原を含む被検物質を添加し、インキュベートした後、固相を洗浄し、第２の酵 素で標識した抗体を添加する。洗浄後。 基質を添加し１次いで酵素活性を比色法で測定し、抗原濃度に換算する。 （以下余白） ■、案１ｕ脛 以下に述べるのは本発明の実施例である。この実施例は説明のみを目的として提 供するのであって１本発明の範囲を制限するものではない。本発明の開示内容を 考慮すると、特許請求の範囲内の多くの実施態様が当業者に明らかである。例え ば、　ＩＶ、Ａ、節に述べる方法は、もし望まれるならば繰り返し得るが、特に その必要はない。なぜなら１本発明により提供される情報に基づいた所望のヌク レオチド配列の構築のための技術が使用可能であるためである。発現はＥ、　ｃ ｏｌｔで例示されているが、ｍ、Ａ、節でより十分に述べたような他の系も使用 され得る。ゲノム構造に由来する付加的なエピトープも生産され得、以下に述べ るように抗体を生産するのに用いられる。 ＩＶ、Ａ、　Ｉ’ｌＣＶ　ｃＤＮＡノー　オヨヒ＋　’ＩＶ、Ａ、１肛り殖黙亘 且■ ＮＡＮＢ因子の原材料は、慢性ＮＡＮＢＨのチンパンジーから得た血漿プールで あった。このチンパンジーは、プールしたヒト血清由来の第８因子濃縮物混入バ ツチ中のＨＣＶで感染させて得られる別の慢性ＮＡＮＨのチンパンジー由来の血 液で、実験的に感染させられている。このチンパンジーの血漿プールは、高レベ ルのアラニンアミノトランスフェラーゼ活性（この活性はＨＣＶ感染による肝障 害に起因する）を有する多くの個体の血漿試料を合わせて調製されたものである 。静脈注射により投与されたこの血清プールの１Ｏ−８倍希釈液のＬｌは、別の チンパンジーにＮＡＮＢＨを引き起こしたので、そのＣＩＤは少なくとも１０’ ／ｌｌｌである。つまり、高いウィルス感染力価を有する。 高力価血漿プール由来のｃＤＮＡライブラリーを、以下のようにして調製した。 まず、ウィルス粒子を血漿から単離した。 血漿の９０ｍ１を５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　、１　＋ｎＭ　 ＥＤＴＡ、　１００ｍＭ　ＮａＣ１を含有する溶液３１ｈ＋１で希釈した。細胞 破砕物を。 ｉｓ、０００ｘ　ｇで２０分間、２０℃にて遠心分離することにより除去した。 次いで、得られた上清液中のウィルス粒子を、ベックマン５Ｗ２８ｏ−ターで２ ８．ＯＯＯｒｐｍ、　Ｓ時間、２０℃にて遠心分離することによりペレットとし た。ウィルスゲノムを遊離させるために、ペレットを１％ドデシル硫酸ナトリウ ム（ＳＤＳ）　、　１゜１１Ｍ　ＥＤＴＡ、　１０＋ｎＭ　）リス−ＨＣｌ　（ ｐＨ７，５）　、および２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＸを含有する溶液１５＋ ａｌに懸濁し、その後４５℃にて９０分間インキュベートすることにより粒子を 破砕した。キャリアーとして０．８μｇのＭＳ２バクテリオファージＲＮＡを添 加し。 フェノール：クロロホルムの１：ｌ混合液（フェノールは０．５Ｍトリス−ＨＣ ｌ　（ｐＨ７，５）、　０．１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、０．１ ％（Ｖ／Ｖ）ヒドロキシキノリンで飽和させたもの）で上記混合液を４回抽出し 、その後クロロホルムで２回抽出することにより核酸を単離した。　２．５倍容 積の無水エタノールで一２０℃にて一晩沈澱させるのに先立って、水層を１−ブ タノールで濃縮した。ベックマン５Ｗ４１０−ターで４０．００Ｏｒｐｍ、９０ 分間、４℃にて遠心分離することにより核酸を回収し、　Ｏ，ＯＳ％（Ｖ／Ｖ） ジエチルピロカーボネート処理およびオートクレーブ処理しである水に溶解した 。 上記方法により得られた核酸（＜２μｇ）を−１７，５ｍＭ　ＣＨ３ＨｇＯＨで 変性させた。この変性させた核酸を鋳型として用いてｅＤＮＡを合成し、　Ｈｕ ｙｎｈ　（１９８５）により記載されている方法を用いてファージλ−ｇｔｌｌ のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。ただし。 逆転写酵素によりｃＤＮＡ第−鎖を合成する間、ランダムプライマーをオリゴ（ ｄＴ）　１２−１８で置き換えた（Ｔａｙｌｏｒら（１９７６））。 得られた２末鎖ｃＤＮＡをセファロースＣＬ−４Ｂカラムでサイズに従って分画 し；平均サイズ約４００．３００．　２００．　および１００塩基対の溶出され た物質を、それぞれｃＤＮＡブール１．２．３．　および４とした。プール３の ｃＤＮＡから、λ−ｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーを作成した。 プール３から作成したλ−ｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーを、以前にＮＡＮＢ Ｈにかかったことのある患者由来の血清と特異的に結合できるエピトープについ てスクリーニングした。結合ヒト抗体を１２５１で放射性標識したヒツジ抗−ヒ ）１ｇ抗血清を用いて検出したことを除いては、　Ｈｕｙｎｈら（１９８５）の 方法を用い。 約１０’個のファージを患者血清を用いてスクリーニングした。 ５個の陽性ファージが同定され、精製された。次いで、この５個の陽性ファージ を、同様の方法を用いて、以前ＮＡＮＢＨ因子に感染したことのある８人の異な るヒト由来の血清との結合の特異性について試験した。４個のファージが、たっ た−人ングに用いられたヒト）の血清と免疫学的に反応するポリペプチドをコー ドしていた。５番目のファージ（５−１−１）は、８種の試験した血清のうち５ 種と免疫学的に反応するポリペプチドをコードしていた。さらに、このペプチド は、７人の正常な血液提供者由来の血清と免疫学的に反応しながった。それゆえ 、クローン５−１−１は、　ＮＡＮＢの患者由来の血清により免疫学的に特異的 に認識されるポリペプチドをコードすることがわかる。 組換え体ファージ５−１−１のｃＤＮＡを、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）の方法 により配列決定した。本質的には、　ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し。 ゲル電気泳動を用いてサイズ分画することにより単離した。 ＥｃｏＲＩ切断フラグメントをＭ１３ベクターである！＋１）１ｇおよびｍｐ１ ９にサブクローン化しくＭｅｓｓｉｎｇ（１９８３））　、Ｓａｎｇｅｒら（１ ９７７）のジデオキシ鎖終止法を用いて配列決定した。得られた配列を第１図に 示す。 第１図においてコードされるポリペプチドは、ＨＣＶ　ｃＤＮＡでコードされ、 該ポリペプチドが融合しているＮ−末端のβ−ガラクトシダーゼ部分と同じ翻訳 フレーム内にある。ｒＶＪ、節で示したように、、　５−１−１の翻訳オーブン リーディングフレーム（ＯＲＦ）は、　ＮＡＮＢＨに感染した患者およびチンパ ンジー由来の血清により特異的に認識されるエピトープをコードする。 １Ｖ、Ａ、３．　りｏ　−’／　５−１−１のｅＤＮＡにオーバーラツプ　るｕ ｃｖ吐■旦星蓋 クローン５−１−１のｃＤＮＡにオーバーラツプするＨＣＶ　ｃＤＮＡを。 第１図に示すようなりローンＳ−１−１のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列由来の合成ポ リヌクレオチドを用いて、　ＩＶ、Ａ、１．節で記述したのと同様に作成したλ −ｇｔｌ　１ライブラリーをスクリーニングすることにより得た。スクリーニン グに用いたポリヌクレオチドの配列は９次のようであった： ５°−ＴＣＣＣＴＴ　ＧＣＴ　ＣＧＡ　ＴＧＴ　ＡＣＧ　ＧＴＡ　ＡＧＴ　ＧＣ Ｔ　ＧＡＧ　ＡＧＣＡＣＴ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＡＣＴ 　ＣＴＣＧＧＴ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＣＣＣＴＧＴ　ＣＡＧ　ＧＴ−３° 。 Ｈｕｙｎｈ　（１９８５）に記載の方法を用いて、λ−ｇＨ１ライブラリーをこ のプローブでスクリーニングした。約ｓｏ、　ｏｏｏ個のクローンのうち１個の クローンが、このプローブとハイブリダイズした。合成プローブとハイブリダイ ズしたｃＤＮＡを有する３個のクローンに、　８１．　１−２．　および９１と 番号をつけた。 ＩＶ、Ａ、４．　クローン５−１−１のｃＤＮＡにオーバーラツプ　るＨＣＶｃ ＤＮＡのヌクレオチド　１ クローン８１．　１−２．　および９１の３つのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は 、　ＩＶ、Ａ、２．節で述べたのと本質的に同様にして決定した。 これらのクローンの配列は、ファージ５−１−１のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列に関連 しており、第２図で示される。第２図は、検出されたＨＣＶエピトープをコード する鎖を示しており、ヌクレオチド配列における相同性が配列間の垂直線により 示されている。 クローン化されたＨＣＶ　ｅＤＮＡの配列は、オーバーラツプ領域で高い相同性 を有する（第２図を参照のこと）。しかし、２つの領域には相違がある。クロー ン１−２の６７番目のヌクレオチドはチミジンであるが、他の３つのクローンは この位置にシチジン残基を有する。しかし、この位置をＣまたはＴのいずれかが 占める場合、同じアミノ酸がコードされるということは注意すべきである。 第二の相違は、クローン５−１−１が、他の３つのクローンには存在しない２８ 塩基対を有することである。これらの塩基対は。 ５−１−１のｅＤＮＡ配列の開始部分に存在し、小文字で示されている。 後述のＩＶ、Ｄ、節で論じるラジオイムノアッセイのデータに基づ（と、　ＨＣ Ｖエピトープはこの２８ｂｐ領域でコードされ得るということが可能である。 クローン８１．１−２．　および９１に５−１−１の２８塩基対が存在しないと いうことは、これらのクローンのｃＤＮＡは欠損したＨＣＶゲノムから得られた ということを意味し得る；あるいは、２８ｂｐ領域はクローン５−１−１の末端 が人工的に変化したものであり得る。 クローン８１および９１のヌクレオチド配列における小文字の配列は、単にこれ らの配列が他のｃＤＮＡで見い出されていないことを示す。なぜならば、これら の領域にオーバーラツプするｃＤＮＡはまだ単離されていないからである。 クローン５−１−１．８１．　１−２．　および９１０オーバーラツプしている ｃＤＮＡ由来のＨＣＶ　ｃＤＮＡ複合配列を、第３図に示す。しかし。 この図では、クローン５−１−１に特有の２８塩基対は省略されて、いる。この 図は、複合ＨＣＶ　ｃＤＮＡのＯＲＦ内にフードされるポリペプチドの配列も示 す。 ＩＶ、Ａ、５．　クローン８１のｃＤＮＡにオーバーラツプ　るＨＣＶ　ｅＤＮ Ａの虱限 クローン８１　ｃＤＮＡの配列の上流にあり、該配列とオーバーラツプするＨＣ Ｖ　ｃＤＮＡ配列の単離を、以下のようにして行った。 ＩＶ、Ａ、１．節に記述したようにして調製したλ−ｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブ ラリーを、クローン８１のＳ°末端配列と相同性を有する合成ポリヌクレオチド プローブとハイブリダイズさせることによリスクリーニングした。クローン８１ の配列を第４図に示す。 スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は１次のようであった： ５°ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＣＧ　Ｇ ＡＣ３゜方法は、　Ｈｕｙｎｈ、（１９８５）に記載されているのと本質的に同 じであったが、厳密な条件下でライブラリーのフィルターを２回洗浄した。すな わち、　５ｘＳＳＣ，，０，１％ＳＤＳ中で５５℃にてそれぞれ３０分間洗浄を 行った。約Ｓｏ、　０００個のクローンのうち１個のクローンがこのプローブと ハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する陽性組換 え体ファージを単離・精製した。このファージにクローン３６という番号を付け た。 クローン８１のカルボキシル末端にオーバーラツプする下流ｃＤＮＡ配列を、上 流ｃＤＮＡ配列の単離に用いたのと同様の方法を用いて単離した。ただし１合成 オリゴヌクレオチドプローブをクローン８１の３°末端と相同性を有するように 調製した。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は２次のようで あった： ５°ＴＴＴ　ＧＧＣＴＡＧ　ＴＧＧ　ＴＴＡ　ＧＴＧ　ＧＧＣＴＧＧ　ＴＧＡ　 ＣＡＧ　３゜この後者の配列とハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する陽性組換え 体ファージを単離・精製し、クローン３２という番号を付けた。 ＴＶ、Ａ、６．　クローン３６のＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド　ダクローン ３６のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は１本質的にＴＶ、Ａ。 ２、節に記述したようにして決定した。このｃＤＮＡの二本鎖配列。 クローン８１のＨＣＶ　ｃＤＮＡとオーバーラツプする該ｃＤＮＡの領域。 およびＯＲＦによりコードされるポリペプチドを第５図に示す。 クローン３６のＯＲＦは、クローン８１でコードされるＨＣＶ抗原と同じ翻訳フ レーム内にある。゛このように１組合せて、クローン３６および８１におけるＯ ＲＦは大きなＨＣＶ抗原の一部を表すポリペプチドをコードする。この推定ＨＣ ｖポリペプチドの配列。 ならびに該配列をコードする二本鎖ＤＮＡ配列（クローン３６および８１のＨＣ Ｖ　ｃｌ）ＮＡの結合ＯＲＦ由来）を第６図に示す。 ｒＶ、Ａ、７．　クローン３２ノＨＣｖＣＤＮＡノヌクレオチド１クローン３２ のｃ　ＤＮＡのヌクレオチド配列は、クローン５−１−１の配列についてＴＶ、 Ａ、２．節で記述したのと本質的に同様にして決定した。配列のデータは、クロ ーン３２組換え体ファージのｃＤＮＡが、二つの異なる材料厚由来であることを 示した。 ｃＤＮＡの一つのフラグメントはＨＣＶゲノム由来の４１８ヌクレオチドを有し ；他のフラグメントはバクテリオファージＭＳ２ゲノム由来の１７２ヌクレオチ ドを有していた。このバクテリオファージＭＳ２ゲノムは、　λ−ｇｔｌｌ血漿 ｃＤＮＡライブラリーの調製の間キャリアーとして用いたものである。 ＨＣＶゲノムの配列に対応するクローン３２のｃＤＮＡの配列を、第７図に示す 。クローン８１の配列とオーバーラツプする配列の領域、およびＯＲＦによりコ ードされるポリペプチドもこの図に示す。この配列は、クローン８１によりコー ドされる■Ｃｖ抗原と同じ翻訳フレーム内にある一つの連続したＯＲＦを有する 。 ＴＶ、Ａ、Ｂ、クローン３６のｃＤＮＡにオーバーラツプ　るＨＣＶ　ｃＤＮＡ の星風 クローン３６　ｃＤＮＡの配列の上流にあり、該配列とオーバーラツプする）Ｉ ＣＶ　ｃＤＮＡ配列の単離を、クローン８１のｃＤＮＡとオーバーラツプする配 列についてｌＶ、Ａ、　５．節に記述したようにして行うた。ただし１合成ポリ ヌクレオチドはクローン３６の５゜領域に基づいたものであった。スクリーニン グに用いた合成ポリヌクレオチドは９次のようであった：５°ＡＡＧ　ＣＣＡ　 ＣＣＧ　ＴＧＴ　ＧＣＧ　ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＣＴＣＡＡＧ　ＣＣＣ３゜約ｓｏ、 　ｏｏｏ個のクローンのうち１個のクローンが、このプローブとハイブリダイズ した。この配列とハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する組換え体ファージを単離 ・精製したクローンを、クローン３５と命名した。 ＩＶ、Ａ、９．　クローン３５のＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配ダ１クロー ン３５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は１本質的にＩＶ、Ａ。 ２、節で記述したようにして決定した。この配列、クローン３６のｃＤＮＡ配列 とオーバーラツプした該配列の領域、および該配列においてコードされる推定ポ リペプチドを、第８図に示す。 クローン３５は、明らかに一つの連続的なＯＲＦを有する。このＯＲＦハ、クロ ーン３６．クローン８１．オヨヒクローン３２によりコードされるのと同じ翻訳 フレーム内で、一つのポリペプチドをフードする。第９図は、クローン３５．３ ６．　８１．　および３２にわたって延びている長く連続したＯＲＦの配列を、 該配列でコードされる推定ＨＣｖポリペプチドと共に示す。この配列は、この結 合配列は、同じλ−ｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリー由来の他の独立したｃＤＮ Ａクローンを用いて確認されている。 ＴＶ、Ａ、　１０．　クロー　７３５（７）ｅＤＮＡニオ−バーラップする１’ ｌＣＶ　ｅＤＮＡ１７）１風 クローン３５　ｃＤＮＡの配列の上流にあり、該配列とオーバーラツプするＨＣ Ｖ　ｃＤＮＡ配列の単離を、クローン３６のｃＤＮＡとオーバーラツプする配列 についてＩＶ、Ａ、　８．節に記述したようにして行った。ただし１合成ポリヌ クレオチドはクローン３５の５゜領域に基づいたものであった。スクリーニング に用いた合成ポリヌクレオチドは９次のようであった：５°ＣＡＧ　ＧＡＴ　Ｇ ＣＴ　ＧＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＧＴ　３’約ｓｏ、　ｏｏｏ個の クローンのうち１個のクローンが、このプローブとハイブリダイズした。この配 列とハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する組換え体ファージを単離・精製したク ローンを、クローン３７ｂと命名した。 ｒＶ、Ａ、１１．　クローン３７ｂノＨＣｖノヌクレオチド１クローン３７ｂｃ ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は１本質的にＩＶ、Ａ。 ２、節で記述した。ようにして決定した。この配列、クローン３５のｃＤＮＡの 配列にオーバーラツプする該配列の領域、および該配列においてコードされる推 定ポリペプチドを、第１０図に示す。 クローン３５の５°末端のヌクレオチドはＴであるが、クローン３７ｂの対応す るヌクレオチドはＡである。ＩＶ、Ａ、　１０．節に記述した。クローン３７ｂ を単離した工程の間に単離された他の３つの独立したクローン由来のｃＤＮＡも 、配列決定されている。これらのクローン由来のｃＤＮＡも、この位置にＡを有 する。このように、クローン３５の５°末端のＴは、クローニング工程の人工産 物であり得る。しばしばｃＤＮＡ分子の５′末端に人工的に変化したものが生じ るということは、公知である。 クローン３７ｂは明らかに、オーバーラツプしているクローン３５．３６．８１ および３２にわたうて延びているＯＲＦにおいてコードされるポリペプチドの続 きであるポリペプチドをコードする。一つの連続的なＯＲＦを有する。 ＴＶ、Ａ、　１２．　クローン３２のｃＤＮＡにオーバーラツプ　るＨＣＶ　ｃ ＤＮＡの監歴 クローン３２の下流のＨＯＷ　ｃＤＮＡ配列の単離は、以下のようにして行った 。まず、クローンｃｌａを、クローン３２のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチ ド配列に基づいた合成ハイブリダイゼーションプローブを用いて単離した。方法 は９本質的にＴＶ、Ａ、５゜節に記述したとおりであった。ただし９合成プロー ブの配列は次のようであった： ５’　ＡＧＴ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　Ａ ＧＣＣＴＴ　３°。 クローンｃｌａ由来のヌクレオチド配列を用いて、別の合成ヌクレオチドを合成 した。この合成ヌクレオチドは次の配列を有していた： ５°ＴＣＣＴＧＡ　ＧＧＣＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴ　ＧＧＡ　ＴＡＡ　ＧＣＴ 　３°。 クローンｅｔａ由来の配列をプローブとしてを用いたλ−ｇｉｌｌライブラリー のスクリーニングは、約ｓｏ、　ｏｏｏ個の陽性コロニーのうち１個のコロニー をもたらした。このプローブとハイブリダイズしたクローンを単離・精製し、ク ローン３３ｂと命名した。 ＩＶ、Ａ、１３．り０−７３３ｂノＨＣＶｃＤＮＡ１７）ヌクｌｚｔチＦ　Ｉク ローン３３ｂのｅＤＮＡのヌクレオチド配列は２本質的にｒＶ、Ａ。 ２、節で記述したようにして決定した。この配列、クローン３２のｃＤＮＡの配 列とオーバーラツプする該配列の領域、および該配列においてコードされる推定 ポリペプチドを、第１１図に示す。 クローン３３ｂは明らかに、オーバーラツプしているクローン３７ｂ、３５．３ ６．８１および３２のＯＲＦの延長である。一つの連続的なＯＲＦを有する。ク ローン３３ｂでコードされるポリペプチドは、これらのオーバーラツプしている クローンの延長されたｒＶ、Ａ、　１４．　クローン３７ｂのｃＤＮＡおよびク ローン３３ｂのｃＤＮＡにオーバーラツプ　るＨＣＶ　ｃＤＮＡの クローン３７ｂおよびクローン３３ｂのｃＤＮＡにオーバーラツプするＨＣＶ　 ｃＤＮＡを単離するために、これらのクローンのｃＤＮＡ由来の次の合成オリゴ ヌクレオチドプローブを用い１本質的に■、Ａ、３．節に記述した方法を用いて 、λ−ｇｔｌｌライブラリーをスクリーニングした。それぞれ、クローン３７ｂ および３３ｂの配列にオーバーラツプするＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を有するコロニ ーを検出するためのプローブは６次のようであった：５°ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＧＣ Ｔ　ＧＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＧＴ　Ｃ３゜約ｓｏ、　ｏｏｏ個の クローンのうち１個のクローンが、それぞれのプローブを用いて検出された。ク ローン３７ｂのｃＤＮＡの上流に・あり、該ｃＤＮＡにオーバーラツプするｃＤ ＮＡを有するクローンを。 クローン４０ｂと命名した。クローン３３ｂのｃＤＮＡの下流にあり。 該ｅＤＮＡにオーバーラツプするｃＤＮＡを有するクローンを、クローン２５ｃ と命名した。 ＴＶ、Ａ、１５．　りＩ：Ｉ−：／４０ｂおよびりｏ　−７２５ｃノＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ１７）　５Ｌ　クレ±ｆｌ烈 クローン４０ｂおよびクローン２５ｃのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、　ＩＶ 、Ａ、２．節で記述したのと本質的に同様にして決定した。 ４０ｂおよび２５ｃの配列、クローン３７ｂおよび３３ｂのｅＤＮＡにオーバー ラツプする該配列の領域、およびそこでコードされる推定ポリペプチドを、第１ ２図（クローン４０ｂ）および第１３図（クローン２５ｃ）に示す。 クローン４０ｂの５°末端のヌクレオチドはＧである。しかし。 ＴＶ、Ａ、　１４．節で記述した。クローン４０ｂを単離した工程の間に単離さ れた他の独立した５個のクローン由来のｃＤＮＡも配列決定されている。これら のクローン由来のｃＤＮＡもまた。この位置にＴを有する。このように、Ｇはク ローニングの結果人工的に変化したものであることを意味し得る（ＩＶ、Ａ、１ １．節の考察を参照のこと）。 クローン２Ｓｃの５°末端はＡＣＴであるが、クローンｃｌａ　（配列は示して いない）、およびクローン３３ｂのこの領域の配列はＴＣＡである。この違いは また。クローン５−１−１の２８個の過剰の５゜末端ヌクレオチドのように、ク ローニングの人工産物を意味し得る。 クローン４０ｂおよび２５ｃはそれぞれ、明らかに、以前に配列決定したクロー ンの連続的なＯＲＦの延長であるＯＲＦを有する。 クローン４０ｂ、　３７ｂ、　３５．３６．８１．３２．　３３ｂ、および２５ ｃにわたって延びている一０ＲＦのヌクレオチド配列、および該配列においてフ ードされる推定ポリペプチドのアミノ酸配列を、第１４図に示す。この図では、 可能性のある人工的に変化したものは配列から省かれており１．その代わりに、 オーバーラツプする複数のクローンの非５゛末端領域の対応する配列が示されて いる。 ＩＶ、Ａ、　１６．　クローン３６８１　および３２のｃＤＮＡか゛の　ＡＨＣ ｖｌｌぼ号ｌ毀 複合ＨＣＶ　ｃＤＮＡであるＣ１００は、以下のようにして構築した。 まず、クローン３６．８１．　および３２由来のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いて 切り出した。各クローン由来のｃＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメントを、ベクター ｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ　（Ｐｒｏ＋ａｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）のＥｃｏＲＩ部位 に個々にクローン化した。クローン３６．　８１．　および３２由来のｃＤＮＡ を有する得られた組換え体ベクターを、それぞれｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／　３６ ．　ｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／　８１．　およびｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／　３２と 命名した。適当な方向性を有するｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／　８１組換え体をＮａ ｅ　ＩおよびＮａｒ　Ｉで切断し、大きい（約２８ＳＯｂｐ）フラグメントを精 製した。そしてこのフラグメントを、ｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／　３６から得た小 さな（約５７０ｂｐ）　Ｎａｅ　Ｉ　／　Ｎａｒ　Ｉ　制限フラグメント精製物 と連結した。このクローン３６および８１由来のｃＤＮＡの複合配列を、これら のクローンのオーバーラツプしているｅＤＮＡに含まれる。連続的なＨＣＶ　Ｏ ＲＦを有する他のｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅベクターを作成するのに用いた。次いで 、約６８０ｂｐのフラグメントを切り離すために、この新しいプラスミドをＰｖ ｕＩ［およびＥｃｏＲＩで切断した。次いで、このフラグメントを適当な方向性 を有するｐＧＥＭ３−ｂｌ　ｕｅ／　３２プラス−ミドから単離した小さな（５ ８０ｂｐ）Ｐｖｕ　ＩＩ　／　ＥｃｏＲＩ　フラグメントと連結した。そして、 クローン３６、８１．　および３２由来の複合ｃＤＮＡを、ＩＶ、Ｂ、１．節に 記述されているベクターｐｓＯＤｃｆｌをＥｃｏＲＩで直線化させたものに連結 し。 これを細菌においてクローンＳ−１−１を発現するのに用いた。 複合ＨＣＶ　ｃＤＮＡの約１２７０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント（Ｃ１００） を有する組換え体を選択し、プラスミド由来のｃＤＮＡＧ　ＥｃｏＲＩで切断し 、精製した。 ＴＶ、Ａ、　１７．又！：２二Ｂ且−比Ｌ」ムーｈ１ハ、１江１月占−■２３３ ｆ　３３　および３９ｃのＨＣＶ　ｅＤＮＡの　およびヌクレオチド烈 クローン１４ｉ、ｌｌｂ、７ｆ、７ｅ、　８ｈ、３３ｃ、１４ｃ、　８ｆ、３３ ｆ、３３ｇ。 および３９ｃのＢＣＶ　ｃＤＮＡを、　ＩＶ、Ａ、１．節に記述したＨＣＶ　ｃ ＤＮＡのλ−ｇｔｌｌライブラリー由来のオーバーラツプしたｃＤＮＡフラグメ ントを単離する方法により単離した。使用した方法は、　■。 Ａ、３６節に記述したのと本質的に同様であった。ただし、使用したプローブは 、最後に単離したクローンのヌクレオチド配列の、複合ＨＣＶ配列の５°末端お よび３°末端から設計されたものである。以下に記述するプローブとハイブリダ イズするクローンの頻度は、それぞれの場合で約ｓｏ、　ｏｏｏ個につき１個で あった。 クローン１４ｉ、　７ｆ、　７ｅ、　８ｈ、　３３ｃ、　１４ｃ、　８ｆ、　３ ３ｆ、　３３ｇ、および３９ｃのＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は１本質 的にＴＶ、Ａ、２゜節に記述したのと同様にして決定した。ただし、クローン５ −１−１から単離したｃＤＮＡの代わりにこれらのファージから切り出したｃＤ ＮＡを用いた。 クローン３３ｃは、クローン４０ｂのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイ ゼーシ嘗ンプローブを用いて単離した。クローン４０ｂのヌクレオチド配列は、 第１２図に示されている。３３ｃを単離するのに用いたプローブのヌクレオチド 配列は１次のようであった： ５°ＡＴＣＡＧＧ　ＡＣＣＧＧＧ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＡＣＣＡ ＣＴ　３”６りｏ　−７３３Ｃ１７）　ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、およびりｏ−ン ４０ｂのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列とのオーバーラツプを、第１５図に示す。この図 は、該配列でコードされるアミノ酸も示す。 クローン８ｈは、クローン３３ｃのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用い て単離した。このプローブのヌクレオチド配列は１次のようであった： ５°ＡＧＡ　ＧＡＣＡＡＣＣＡＴ　ＧＡＧ　ＧＴＣＣＣＣＧＧＴ　ＧＴＴ　Ｃ３ °。 クローン８ｈのＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびクローン３３ｃのＨＣＶｃＤＮ Ａの配列とのオーバーラツプ、ならびに該配列でフードされるアミノ酸を、第１ ６図に示す。 クローン７ｅは、クローン８ｈのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて 単離した。このプローブのヌクレオチド配列は１次のようであった°： Ｓ’　ＴＣＧ　ＧＡＣＣＴＴ　ＴＡＣＣＴＧ　ＧＴＣＡＣＧ　ＡＧＧ　ＣＡＣ３ °。 クローン７ｅのＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、クローン８ｈとのオーバーラツプ、お よび該配列でコードされるアミノ酸を、第１７図に示す。 クローン１４ｃは、クローン２５ｃのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用 いて単離した。クローン２５ｃの配列を第１３図に示す。クローン１４ｃの単離 に用いたプローブは１次の配列を有していた： ５°ＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴ　ＡＡＴ　ＧＣＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧ　ＧＧＣ３ ’。 クローン１４ｃのＢＣＶ　ｃＤＮＡの配列、該配列のクローン２５ｃの１ｃｙｃ ＤＮＡの配列とのオーバーラツプ、および該配列でコードされるアミノ酸を、第 １８図に示す。 クローン８ｆは、クローン１４ｃのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用い て単離した。このプローブのヌクレオチド配列は２次のようであった： ５°ＴＣＣＡＴＣＴＣＴ　ＣＡＡ　ＧＧＣＡＡＣＴＴＧ　ＣＡＣＣＧＣＴＡＡ　 ３’。 クローン８ｆのＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、該配列のクローン１４ｃのＨＣＶｃＤ ＮＡの配列とのオーバーラツプ、および該配列でコードされるアミノ酸を、第１ ９図に示す。 クローン３３ｆは、クローン８ｆに存在するヌクレオチド配列に基づいたプロー ブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は９次のようであった： ５’　ＴＣＣＡＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡ　ＡＧＴ 　３°。 りｏ　−：ｙ　３３ｆノＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、該配列のりｏ−７８ｆ　ｆ： Ｉ　ＨＣＶｃ　ＤＮＡの配列とのオーバーラツプ、および該配列でコードされる アミノ酸を、第２０図に示す。 クローン３３ｇは、クローン３３ｆのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用 いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は２次のようであった： ５°ＧＣＧ　ＡＣＡ　ＡＴＡ　ＣＧＡ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　ＡＧ ＣＣＣＧ　３°。 りｏ−ン３３ｇ（７）　ＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、該配列のりｏ　−ン３３ｆノ ＨｃＶｃＤＮＡの配列とのオーバーラツプ、および該配列でコードされるアミノ 酸を、第２１図に示す。 クローン７ｆは、クローン７ｅのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて 単離した。このプローブのヌクレオチド配列は２次のようであった： ５°ＡＧＣＡＧＡ　ＣＡＡ　ＧＧＧ　ＧＣＣＴＣＣＴＡＧ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　Ｔ ＡＡ　Ｔ　３°。 バーラップ、および該配列でコードされるアミノ酸を、第２２図に示す。 クローンｌｌｂは、クローン７ｆの配列に基づいたプローブを用いて単離した。 このプローブのヌクレオチド配列は１次のようであった： ５°ＣＡＣＣＴＡ　ＴＧＴ　ＴＴＡ　ＴＡＡ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＣＡＣＴＣＣＴ ＣＴ　３°。 クローンｌｌｂのＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、該配列のクローン７ｆとのオーバー ラツプ、および該配列でフードされるアミノ酸を、第２３図に示す。 クローン１４ｉは、クローンｌｌｂのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用 いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は２次のようであった： ５°ＣＴＣＴＧＴ　ＣＡＣＣＡＴ　ＡＴＴ　ＡＣＡ　ＡＧＣＧＣＴ　ＡＴＡ　Ｔ ＣＡ　３°。 クローン１４ｉのＨＣＶ　ｅＤＮＡの配列、該配列のｌｌｂとのオーバーラツプ 、および該配列でコードされるアミノ酸を、第２４図に示す。 クローン３９ｃは、クローン３３ｇのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用 いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は１次のようであった： ５°　ＣＴＣＧＴＴ　ＧＣＴ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＴＴＴ　ＧＧ Ｔ　ＧＴＡ　３°。 クローン３９ｃのＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、該配列のクローン３３ｇとのオーバ ーラツプ、および該配列でコードされるアミノ酸を、第２５図に示す。 ＴＶ、Ａ、１８．　ＨＣＶ　ｃＤＮＡを　る　クローンノ　ムＨＣＶ弧獲りこ阻 複合ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を作成するために、前述の単離クローンのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列を並べた。５°から３°の方向に並べた単離クローンは：　１４ｉ、 ７ｆ、７ｅ、８ｈ、３３ｃ、　４０ｂ、　３７ｂ、３５．　３６．　８１．３２ ゜３３ｂ、２５ｅ、１４ｅ、８ｆ、３３ｆ、３３ｇおよび３９ｃである。 単離クローン由来の複合ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、および該配列でコードされるア ミノ酸を、第２６図に示す。 複合配列を作成するにあたり、以下の配列の異質性が考慮されている。クローン ３３ｃは、クローン４０ｂおよび３７ｃのｃＤＮＡとオーバーラツプする８００ 塩基対のＨＣＶ　ｃＤＮＡを有する。クローン３３ｃにおいては、他の５つのオ ーバーラツプしているクローンと同様に、７８９番目のヌクレオチドはＧである 。しかし。 クローン３７ｂにおいては（ＩＶ、Ａ、１１．節を参照のこと）、対応するヌク レオチドはＡである。この配列の違いは、該配列でそれぞれＧまたはＡに対して コードされるアミノ酸は、　ｃｙｓまたはＴＹＲのいずれかであると、いう明ら かな異質性をもたらす。 この異質性は、タンパクの折りたたみに関する重要な分枝を有し得る。 クローン８ｈのＨＣＶ　ｃＤＮＡの２番目のヌクレオチド残基はＴである。しか し、以下に示すように、クローン７ｅの対応する残基はＡであり；さらに、この 位置のＡは、他の３つのオーバーラツプしている単離クローンても見い出される 。このように。 クローン８ｈのＴ残基は、クローニングの人工的な変化を意味し得る。それゆえ 、第２６図では、この位置の残基はＡとされる。 クローン８ｆのＨＣＶ　ｃＤＮＡの３°末端ヌクレオチドはＧである。 しかし、クローン３３ｆおよび他の２つのオーバーラツプするクローンの対応す る残基はＴである。それゆえ、第２６図では。 この位置の残基はＴとされる。 クローン！３ｆのＨＣＶ　ｃＤＮＡの３°末末端列はＴＴＧＣである。しかし、 クローン３３ｇおよび他の２つのオーバーラツプするクローンの対応する配列は ＡＴＴＣである。それゆえ、第２６図では、対応する領域はＡＴＴＣで示される 。 クローン３３ｇのＨＣＶ　ｃＤＮＡの４番目のヌクレオチド残基はＴである。し かし、クローン３３ｆおよび他の２つのオーバーラツプするクローンの対応する 残基はＡである。それゆえ、第２６図では、対応する残基はＡで示される。 クローン１４ｉの３°末端はＡＡである。しかし、クローン１１ｂおよび他の３ つのクローンの対応するジヌクレオチドはＴＡである。 それゆえ、第２６図では、　ＴＡ残基が示されている。 他の配列の異質性の解明については、前述で考察している。 複合ＨＣＶ　ｃＤＮＡを調べると、該ｃＤＮＡが一つの大きなＯＲＦを有するこ とが示される。このことは、ウィルスのゲノムが、翻訳と同時に、またはその後 プロセッシングされる大きなポリペプチドに翻訳されるということを示唆する。 （以下余白） ＩＶ、Ａ、　１９．クローン１２ｆ　３Ｓｆ　１９　２６　およびＩＳｅのＨＣ ＶｃＤＮＡの　およびヌクレオチド　ダ１クローン１２ｆ、　３Ｓｒ、１９ｇ、 　２６ｇ、および１５ｅのＨＣＶ　ｃＤＮＡを。 本質的にｒＶ、Ａ、　１７．節に記述した方法により単離した。ただし。 プローブは以下に示すようであった。クローンがこのプローブとハイブリダイズ する頻度は、それぞれの場合で約ｓｏ、　ｏｏ。 個につき１個であった。これらのクローンのＢＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配 列は１本質的にＴＶ、Ａ、　２．節に記述したようにして決定した。ただし、ク ローン５−１−１から単離したｃＤＮＡの代わりに、指示したクローン由来のｃ ＤＮＡを用いたロ第２６図のＨＣＶ　ｃＤＮＡの上流のｃＤＮＡを有するクロー ン１２ｆの単離は、クローン１４ｉのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイ ゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は２次の ようであった：５’　ＴＧＣＴＴＧ　ＴＧＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＣＴＡ　ＣＴＣ ＡＴＡ　ＴＣＣＣＡＡ　３°。 クローン１２ｆのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、該配列のクローン１４ｉとのオーバー ラツプ、および該配列でコードされるアミノ酸を、第２７図に示す。 第２６図のＨＣＶ　ｃＤＮＡ下流のｃＤＮＡを有するクローン３Ｓｆの単離は、 クローン３９ｃのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブ を用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は９次のようであった： ５°　ＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＴＣＡＡＡ　ＡＧＴ　ＧＡＡ　ＧＧＣＴＡＡ　ＣＴ Ｔ　３°。 クローン３５ｆの配列、該配列のクローン３９ｃの配列とのオーバーラツプ、お よび該配列でコードされるアミノ酸を、第２８図に示す。 クローン１９ｇの単離は、クローン３５ｆの３°配列に基づいたハイブリダイゼ ーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は９次のよ うであった：５°ＴＴＣＴＣＧ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴ　 ＧＡＣＴＣＣ３°。 クローン１９ＧのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、該配列のクローン３５ｆの配列とのオ ーバーラツプ、および該配列でコードされるアミノ酸を。 第２９図に示す。 クローン２６ｇの単離は、クローン１９ｇの３°配列に基づいたハイブリダイゼ ーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は１次のよ うであった：５°ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＡＣＴ　ＴＡＧ　ＴＣＧ　 ＴＴＡ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　３’。 クローン２６ｇのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、該配列のクローン１９ｇの配列とのオ ーバーラツプ、および該配列でコードされるアミノ酸を。 第３０図に示す。 クローンＩＳｅは、クローン２６ｇの３°配列に基づいたハイブリダイゼーショ ンプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は９次のようで あった：５°ＣＡＣＡＣＴ　ＣＣＡ　ＧＴＣＡＡＴ　ＴＣＣＴＧＧ　ＣＴＡ　Ｇ ＧＣＡＡＣ３°。 クローンＩＳｅのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、該配列のクローン２６ｇの配列とのオ ーバーラツプ、および該配列でコードされるアミノ酸を。 第３１図に示す。 この節で記述したクローンは、Ｉ［、Ａ、節で記述した期間および条件でＡＴＣ Ｃに寄託されており、以下の受託番号が授与されている。 クローン３５ｆ クローン１５ｅ 前述の単離クローンのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列は、複合ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を作 成するのに並べられている。５°から３°の方向に並べられた単離クローンは： 　１Ｎ、１４ｆ、７ｆ、７ｅ、８ｈ、３３ｃ、４０ｂ、３）ｂ。 ３５、３６．８１．３２．３３ｂ、　２Ｓｃ、１４ｃ、　８ｆ、　３３ｆ、　３ ３ｇ、３９ｃ、　３５ｆ。 １９ｇ、　２６ｇ、およびＩＳｅである。 単離クローン由来の複合ＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、および該配列でコードされるア ミノ酸を、第３２図に示す。 ＩＶ、Ａ、　２Ｇ、　クローン１２ｆのＨＣＶ　ｃＤＮＡ　！上゛１のｃＤＮＡ 　ダ１を上流の配列の逆転写を開始させるために、クローン１２ｆのＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ由来の第３２図の５°ＨＣＶ配列のほとんどに基づいて。 逆転写酵素の小さな合成オリゴヌクレオチドブライマーを合成し一、　ＨＣＶゲ ノムＲＮＡ中の対応する配列に結合させるのに用いる。プライマー配列はクロー ン１２ｆの既知の５°末末端列に近いが、プライマー配列上流のプローブ配列の 設計を許容するのに十分に下流である；ブライミングおよびクローニングの７　 推定される）の上流の配列を用いてスクリーニングされる。 ＨＣＶゲノムＲＮＡは、　ＮＡＮＢＨのチンパンジー由来の血漿または肝臓試料 、またはＮＡＮＢＨのヒト由来の類似の試料のいずれかから得られる。 ＨＣＶ　ＲＮＡゲノムの５°最最末端列を単離するために、逆転写の初回ｃＤＮ Ａ生成物（これは、鋳型ＲＮＡにより二本鎖とされる）を、オリゴＣで尾部付加 処理する。これは、この生成物をＣＴＰ存在下でターミナルトランスフェラーゼ とインキユベートすることにより行われる。ｃＤＮＡの第−鎖の相補鎖を生成さ せる第２回のｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素反応のプライマーとしてオ２０、節で 記述したのと同様である。ターミナルトランスフェラーゼを用いた尾部付加処理 、および逆転写酵素反応のための方法は、　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）と 同様である。次ｔ１で、　ｃＤＮＡ生成物をクローン化し、スクリーニングし、 そして配列決定。・　を　したＩの　′ この方法は、フラピウイルスのＲＮＡ１７）ｃＤＮＡをクローニングするために 以前に使用された方法に基づいている。この方法では、　ＲＮＡは、３°末端の 二次構造を除去するために変性条件に置かれる。そして、その後ｒＡＴＰを基質 として用い、ポリＡポリメラーゼで尾部付加処理される。ポリＡを尾部付加処理 したＲＮＡの逆転写は、オリゴｄＴをプライマーとして用い、逆転写酵素により 触媒される。ｃ　ＤＮＡの第２鎖を合成し、　ｃＤＮＡ生成物をクローン化し、 スクリーニングし、そして配列決定する。 ＩＶ、Ａ、２３　きなｃＤＮＡインサートを　するλ−ｔｌｌ　ＨＣＶ　ｃＤＮ Ａ５血ヱ１ユニ立立底 λ−ｇｔｌｌライブラリーを作成し、スクリーニングするのに用いた方法は、Ｉ Ｖ、Ａ、１．節に記述したのと本質的に同様である。ただし、ライブラリーはセ ファロースＣＬ−４Ｂカラムから溶出した大きなサイズのｃＤＮＡのプールから 作成した。 ＩＶ、Ａ、　２４．　プライマーとして４　オリゴマーを　いたＨＣＶｅＤＮＡ ライブラリーの 新しいＢＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーは、ＴＶ、Ａ、１．節に記述した感染チン パンジーの血漿プール由来のＲＮＡから、ならびにこの感染動物の肝臓由来のポ リＡ”　ＲＮＡ画分から調製されている。ｅＤＮＡは。 Ｇｕｂｌｅｒおよび■ｏｆｆ＋ａａｎ　（１９８３）により記述されているのと 本質的に同様にして構築した。ただし、最初のｅＤＮＡＤＮＡ混合物のプライマ ーは、前述のＨＣｖゲノムの配列に基づいた二つの合成オリゴマーであった。ク ローンｌｌｂおよび７ｅの配列に基づいたプライマーは、それぞれ。 ５°ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＴＧＡ　ＡＧＡ　ＡＴＣ３゜および ５°ＡＧＴ　ＴＡＧ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＴＡＴ　ＧＣ３゜であった。得 られたｃＤＮＡは、λバクテリオファージベクターにクローン化し、配列が第３ ２図のＨＣＶ配列に基づいた種々の他の合成オリゴマーを用いてスクリーニング した。 された生　のｎｃｖ　としての５ ＴＶ、Ｂ、１．　クローン５−１−１においてコードされるポリペプチドの１里 クローン５−１−１においてコードされる■Ｃｖポリペプチド（ＩＶ、Ａ、２． 節を参照のこと、前出）を、スーパーオキシドジスムターゼ（５ＯＤ）との融合 ポリペプチドとして発現させた。これは、以下のように、クローンＳ−１−１の ｃＤＮＡインサートを発現ベクターｐｓＯＤｅｆｌ　（Ｓｔｅｉｍｅｒら（１９ ８６）　＞にサブクローン化することにより行った。 まず、　ｐｓＯＤｃｆＬから単離したＤＮＡをＢａ＋＋ＨＩおよびＥｃｏＲＩで 処理し、これらの制限酵素により作られる直線状のＤＮＡに以下のリンカ−を結 合させた： ５°ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　Ａ　３’３’　ＧＡ　 ＣＣＴ　ＴＡＡ　ＧＡＣＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＡ　Ｓ’クローニングの後、インサ ートを有するプラスミドを単離した。 インサートを有するプラスミドを、　ＥｃｏＲＩで切断した。りａ−ｙＳ−１− １ノＨＣＶ　ｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩ　テ切断し、コノＥｃｏＲＩ直線 化プラスミドＤＮＡに連結した。このＤＮＡ混合物を。 Ｌ、　ｃｏｌｔ　Ｄ１２１０株（Ｓａｄｌｅｒら（１９８０））を形質転換する のに用いた。第１図に示した。　ＯＲＦの発現について正しい方向性を有する５ −１−１ｃＤＮＡでの組換え体は、制限酵素切断地図作製およびヌクレオチド配 列決定により同定した。 ＩＰＴＯの存在下で細菌を生育させることにより、１個のクローン由来の組換え 体細菌が、５ＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチドを発現するように誘導され た； ＩＶ、Ｂ、２．　クローン８１においてコードされるポリペプチドの発弧 クローン８１に含まれるＨＣＶ　ｃＤＮＡを、５ＯＤ−ＮＡＮＢ、、融合ポリペ プチドとして発現させた。この融合ポリペプチドをコードするベクターを調製す るための方法は、　５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−１−、をコードするベクターを作製す るのに用いたのと類似の方法であった。ただし、ＨＣＶ　ｃＤＮＡの材料源はク ローン８１であり、これはＩＶ、Ａ、３節で記述したように単離され、　ｃＤＮ Ａ配列がＩＶ、Ａ、４節で記述したように決定されたものである。クローン８１ のＨＣＶｃＤＮＡのヌクレオチド配列、および該配列でフードされるポリペプチ ドの推定アミノ酸配列を、第４図に示す。 クローン８１のＨＣＶ　ｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩで切断し、リンカ−（ ＩＶ、Ｂ、１．節を参照のこと）を有し、かつＥｃｏＲＩでの処理により直線化 されたｐｓＯＤｃｆｌに連結した。このＤＮＡ混合物を。 Ｅ−、ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０株を形質転換するのに用いた。第４図に示されるＯ ＲＦの発現について正しい方向でクローン８１　ＨＣＶ　ｃＤＮＡを有する組換 え体を、制限酵素切断地図作製およびヌクレオチド配列決定により同定した。 ＩＰＴＧの存在下で細菌を生育させることにより、１個のクローンからの組換え 体細菌が、　５ＯＤ−ＮＡＮＢＢ、ポリペプチドを発現するように誘導された。 ｒＶ、Ｂ、３．　りｏ−７５−１−１ニおいてＨＣＶおよびＮＡＮＢＨ連　とし てコードされるポリペプチドの石 を、　ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーおよびヒトの血清が融合ホＩＪ　ヘフ ｆ　Ｆ　５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−ｔ−ｔと免疫学的に反応することを証明すること により、　ＮＡＮＢＨ関連抗原として同定した。この５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−＊− ｔ（ｔ−そのＮ末端にスーパーオキサイドジスムターゼを、そしてそのＣ末端に フレーム内（１ｎ−ｆ　ｒａｍｅ）の５−１−１抗原を有する。この同定は、以 下のような“ウェスタン”プロッティング法（Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９））に より行った。 ＩＶ、Ｂ、１．節で記述した。　５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−ｔ−ｔをコードする発現 ベクターで形質転換した細菌の組換え体株を、ＩＰＴＧの存在下で生育させるこ とにより融合ポリペプチドを発現するように誘導した。全部の細菌溶解物を、　 、Ｌａｅｍ＋ａｌｆ（１９７０）に従って、　ＳＤＳ存在下でポリアクリルアミ ドゲルに通して電気泳動を行った。 分離されたペプチドは、ニトロセルロースフィルターに移した（Ｔｏｗｂｉｎら （１９７９））。次いで、このフィルターを細片に切断し、この細片を異なるチ ンパンジーおよびヒトの血清と個々にインキユベートした。結合した抗体は、　 ＴＶ、Ａ、１．節に記述したように　１２Ｊ−標識ヒツジ抗ヒトＩｇと共にさら にインキユベートすることにより検出した。 ウェスタンプロットに用いたチンパンジー血清の特徴付け。 およびオートラジオグラフィーを行った細片の写真に示される結果を、第３３図 に示す。ポリペプチドを含むニトロセルロースＩＩＩ片ヲ、　急性ＮＡＮＢＨ（ ハッチンソン株）感染（レーン１−１６）、Ａ型肝炎感染（レーン１７−２４） 　、　およびＢ型肝炎感染（レーン３４−４４）の間の異なった時期におけるチ ンパンジーから得た血清とインキ１ベートした。レーン２５および４５は、陽性 の対照を示す。該対照では、免疫プロットを、　λ−ｇｔｌｌｃＤＮＡライブラ リーのオリジナルスクリーニングにおいて組換え体クローン５−１−１を同定す るのに用いた（ＴＶ、Ａ、１．節を参照のこと）患者由来の血清とインキユベー トした。 第２３図の対照レーン２５および４５における目視しうるバンドは、抗体がＳＯ Ｄ融合ポリペプチドのＮＡＮＢｓ　−１−１部分に結合していることを示す。こ れらの抗体は、単独のＳＯＤとの結合を示さない。なぜならば、単独のＳＯＤも これらの試料における陰性の対照として含まれており、５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−１ −、融合ポリペプチドよりも有意に速く移動するバンドとして現れるからである 。 第３３図のレーン１−１６は、４匹のチンパンジーの血清試料中の抗体の結合を 示し；この血清は、ＮＡＮＢＨに感染する直前およびその後の急性感染の期間中 に得たものである。図かられかるように、　５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−１−、ポリペ プチドと免疫学的に反応する抗体は、感染性のＨＣＶ接種材料の投与前および感 染の急性期の早い時期に得た血清試料には存在しなかった。ところが、４匹の動 物は全て、急性期後期またはその後の時期に。 最終的にこのポリペプチドに対する循環抗体を誘導した。番号３および４のチン パンジーの場合の免疫プロットで観察される付加的なバンドは、宿主の細菌タン パクに結合したバックグラウンドによるものであっ゛た。 ＮＡＮＢ）Ｉに感染したチンパンジー由来の血清で得られた結果とは対照的に、 融合ポリペプチドのＮＡＮＢｓ−１−、部分に対する抗体の発生は、　ＨＡＹに 感染した４匹のチンパンジーまたはＨＢＶに感染した３匹のチンパンジーでは観 察されなかった。これらの場合における唯一の結合は、ＨＣＶに感染した試料で も生じる。宿主の細菌タンパクに結合したバックグラウンドであった。 ウェスタンプロットに用いたヒト血清の特徴付け、およびオートラジオグラフを 行った細片の写真に示される結果を。 第３４図に示す。ポリペプチド牽含むニトロセルロース細片を。 ＮＡＮＢＨ（レーンｌ−２１）　、　ＨＡＹ　（レ−ン３３−４０）　、および ＨＢＶ　（レーン４ｌ−４９）に感染している間の異なった時期におけるヒトか ら得た血清とインキユベートした。レーン２５および５ｏは、陽性の対照を示す 。該対照では９免疫プロツトを、前述のλ−ｇｔｌｌライブラリーのオリジナル スクリーニングで用いた患者由来の血清とインキユベートした。レーン２２−２ ４および２６−３２は、血清を“正常な”血液提供者から得た。”非感染の”対 照を示す。 第３４図かられかるように、λ−ｇｔｌｌライブラリーをスクリーニングするの に用いた血清を含む９人のＮＡＮＢＨ患者由来の血清は、融合ポリペプチドのＮ ＡＮＢＢ−＞−を部分に対する抗体を含有していた。ＮＡＮＢＨの３人の患者由 来の血清は、これらの抗体を含有しなかった。これらの患者に抗ＮＡＮＢｓ−ｔ −を抗体が将来発生する可能性はある。異なったＮＡＮＢＶ因子に起因するこの 反応の欠如が、非反応血清を採取した個体に病気を引き起こし得ることもまた。 可能である。 箪３４図はまた。　ＩＩＡＶおよびＨＢＶに感染した多くの患者由来の血清が抗 ＮＡＮＢ、−、−、抗体を含有していないこと、およびこれらの抗体は″正常な ”対照由来の血清にも存在しないことも示す。あるＭＡＹ患者（レーン３６）は 抗ＮＡＮＢ６−１−　、抗体を有するように見えるが、この患者は以前にＨＣＶ に感染していたということが可能である。なぜならば、ＮＡＮＢＨの発生率は非 常に高＜、シばしば潜在性であるからである。 これらの血清学的な研究は、　ＢＢ−ＮＡＮＢＶに感染した患者および動物由来 の血清により特異的に認識されるエピトープを。 クローン５−１−１のｃＤＮＡがコードすることを示している。さらに、　ｃＤ ＮＡは霊長類のゲノム由来ではないらしい。クローン５−１−１またはクローン ８１から作製されたハイブリダイゼーシヨンプローブは、唯一のシングルコピ・ −遺伝子が検出され得る条件下で１．非感染個体由来の対照のヒトおよびチンパ ンジーのゲノムＤＮＡの“サザン”プロット把ハイブリダイズしなかった。これ らのプローブはまた。対照のウシのゲノムＤＮＡのサザンプロットにもハイブリ ダイズしなかった。 クローン３６．　８１および３２にわたるＯＲＦでコードされるＨＣＶポリペプ チドを、　ＳＯＤとの融合ポリペプチドとして発現させた。 これは、複合ｃＤＮＡであるＣ１００をヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ 遺伝子を有する発現カセットに挿入すること１発現カセットを酵母の発現ベクタ ーに挿入すること、および酵母でポリペプチドを発現させることにより行った。 クローン３６．８１および３２由来の複合Ｃ１００ｃＤＮＡを有する発現カセッ トを、約１２７０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをベクターｐＳ３−５６　（ｐ ｓ３５６とも呼ばれる）のＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより構築し、プラス ミドｐＳ３−５６ｃｓｓｓを作製した。Ｃ１００の構築は、前述のＩＶ、Ａ、１ ６節に記述されている０ｐＢＲ３２２の誘導体であるベクターｐＳ３−５６は、 ヒトのスーツく一オキサイドジスムターゼ遺伝子上流のＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ／ ＼イブリッド酵母プロモーター、および下流のＧＡＰＤＨ転写終結信号を含む発 現カセットを有する。これらの制御要素およびスーパーオキサイドジスムターゼ 遺伝子を有する同様のカセットは。 Ｃｏｕｓｅｎｓら（１９ｇ？）　、　および本発明の出願人による同時係属のヨ ーロッパ特許出願第１９６，０５６号（１９８６年１０月１日公開）に記載され ている。しかしながら、　ｐＳ３−５６のカセットはＣｏｕｓｅｎＳら（１９８ ７）のカセットとは異なる。ｐＳ３−５６のカセットには。 異種のプロインシュリン遺伝子および免疫グロブリンのヒンジが欠失しており、 かつスーパーオキサイドジスムターゼのｇｔｎｔｓ４にＥｃｏＲＩ部位を有する アダプター配列が続いている。 このアダプターの配列は次のようである：５°−ＡＡＴ　ＴＴＧ　ＧＧＡ　ＡＴ Ｔ　ＣＣＡ　ＴＡＡ　ＴＧＡ　Ｇ　−３゜ＥｃｏＲＩ部位は、カセットを有する ベクターから発現する場合には１次のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドリン カ−を介してスーパーオキサイドジスムターゼに融合するポリペプチドを生じる 。異種配列の挿入を可能にしているニーａｓｎ−１ｅｕ−ｇｌｙ−ｉ　１ｅ−ａ ｒｇ−０ｐＳ３Ｓ６の試料は、ブタペスト条約のらとに１９８８年４月２９日に アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）　、１２３０１Ｐａｒｋ ｌａｖｎ　Ｄｒ、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５３に 寄託されており、受託番号第６７６８３号が与えられている。寄託物を入手し得 る期間および寄託物の入手方法、ならびに寄託物の保持については、　ＮＡＮＢ Ｖ−ｃＤＮＡを有する株についてＩ［、Ａ、節で明記したのと同様である。この 寄託は便宜のみを意図しており１本明細書の記述により本発明を実施するための ものではない。 この寄託物を、参照としてここに引用する。 正しい方向でＣ１００ｃＤＮＡインサートを有する組換え体を単離した後、　Ｃ １００ｃＤＮＡを有する発現カセットをｐＳ３−５６ｃ、１ｌｌｌからＢａｗｌ 　Ｉで切り出し、このカセットを有する約３４００ｂｐのフラグメントを単離・ 精製した。次いで、このフラグメントを酵母ベクターｐＡＢ２４のＢａ＋ｎＨ１ 部位に挿入した。 重要な特徴を第３５図に示すプラスミドｐＡＢ２４は、複製のための完全な２μ 配列［Ｂｒｏａｃｈ　（１９８１）　］およびｐＢＲ３２２配列を有する酵母シ ャトルベクターである。このプラスミドは、プラスミドＹＥｐ２４　［Ｂｏｔｓ ｔｅｉｎら−（１９７９）　］由来の酵母ＵＲＡ　３遺伝子、およびプラスミド ｐｃ１／ｌ由来の酵母ＬＥＵ”遺伝子も有する。 ＥＰＯ公開第１１６，２０１号公報。プラスミドｐＡＢ２４は１部分的な２μ配 列を除去するためにＹＥｐ２４をＥｃｏＲＩで消化し、このベクターを再連結す ることにより構築した。得られたプラスミドＹＥＰ２４ｄｅｌｔａＲＩを、Ｃ１ ａＩで切断することにより直線化し、　Ｃ１ａ■で直線化されている完全な２μ プラスミドと連結した。次いで、得られたプラスミドｐＣＢｏｕをＸｂａ　Ｉで 切断し、　８６０５ｂｐのベクターフラグメントをゲルで単離した。この単離さ れたＸｂａ　Ｉフラグメントを、ｐｃ１／１から単離されたＬＥＵ”遺伝子を有 する４４６０ｂｐのＸｂａ　Ｉフラグメントと連結した。このＬＥＵ”遺伝子の 方向は、υＲＡ３遺伝子と同じ方向である。発現の挿入は。 ｐＢＲ３２２配列の唯一のＢａｗＨＩ部位であった。従って、テトラサイクリン に対する細菌の抵抗性についての遺伝子を阻止している。 ５ＯＤ−Ｃ１００発現カセットを有する組換え体プラスミドｐＡＢ２４Ｃ１００ −３を、酵母ＪＳＣ３０１１株およびその他の株に導入した。細胞をＨｉｎｎｅ ｎら（１９７８）により記載されているように形質転換し。 ｕｒａ−選択プレートにブレーティングした。単一のコロニーを１ｅｕ−選択培 地に接種し、飽和状態となるまで増殖させた。この培養物は、１％グルコースを 含有するＹＥＰで生育させることにより、　５ＯＤ−Ｃ１００ポリペプチド（Ｃ １００−３と呼ぶ）を発現するように誘導された。 ＪＳＣ３０８株は、　ＡＤＲＩ遺伝子座に組み込まれている遺伝子型がＭＡＴ　 ＠、１ｅｕ２．　ａｒｇ３　（ｄｅｌ）　ＤＭＩＳ　（ＧＡＰ／ＡＤＲＩ）であ る。ＪＳＣ３０８においては、正の活性化遺伝子産物ＡＤＲＩの過剰な発現は１ 発現された異種タンパクがＡＤＨ２ＵＡＳｇ節シス子システム合成される場合に は、過度の抑制解除（ｈｙｐｅｒｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　）　（皿野生型対 照に関連する）と、そのようなタンパクの非常に高い収量とをもたらす。酵母Ｊ ＳＣ３０８株の構築は、係属中の米国特許出願番号（代理人Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎα ２３００−０２２９）に開示されており、この特許出願を本願と同時に出願し、 これを参照文献としてここに引用する。ＪＳＣ３０８の試料は、ブタペスト条約 の下に１９８８年５月５日に。 ＡＴＣＣに寄託されており、受託番号第２０８７９号が与えられている。寄託物 を入手し得る期間および寄託物の入手方法、ならびに寄託物の保持については、 ＨＣＶ　ｃＤＮＡを有する株についてＩｌ、Ａ、節で明記したのと同じである。 ｐＡＢ２４ｃ１００−３でコードされる完全なＣ１００−３融合ポリペプチドは 、アミノ末端にヒトＳＯＤの１５４個のアミノ酸と、ＥｃｏＲＩ部位を有する合 成アダプター由来の５個のアミノ酸残基と。 Ｃ１００ｃＤＮＡ由来の３６３個のアミノ酸残基と、クローン３２のＨＣＶｃＤ ＮＡに隣接したＭＳ２ヌクレオチド配列由来の５個のカルボキシ末端アミノ酸と を有するはずである。（ＴＶ、Ａ、７．節を参照のこと）。ＳＯＤの最後から２ つ目のＡｌａ残基で始まる。このポリペプチドのカルボキシ末端の推定アミノ酸 配列を、第３６図に示す。このポリペプチドのこの部分をフードするヌクレオチ ド配列も同様に示す。 ＴＶ、Ｂ、５．　Ｃ１００にコードされるポリペプチドのＮＡＮＢＨ′＊　、至 上」ヱＮ虱定 酵母ＪＳＣ３０８株内のプラスミドｐＡＢ２４ｃ１００−３から発現するＣ１０ ０−３融合ポリペプチドを、サイズについて特徴付けした。 そして、　Ｃ１００内にコードされるポリペプチドを、その慢性ＮＡＮＢＩ（の ヒト由来の血清との免疫学的反応性によりＮＡＮＢＢ−関連抗原として同定した 。 ＩＶ、Ｂ、４．節で記述したように発現するＣ１００−３ポリペプチドは、以下 のようにして分析した。酵母ＪＳＣ３０８細胞をｐＡＢ２４またはｐＡ８２４ｃ １００−３で形質転換し、外来プラスミドがコードするポリペプチドを発現する ように誘導した。培養物（ＯＤ６Ｓｌｌｎ＊が約２０）　１＋ｍｌ中の誘導酵母 細胞を１０．　ＯＯＯｒｐｍで１分間遠心分離することによりペレットとし、そ れらを２容量の溶液および１容量のガラスピーズ（直径０．２ミリミクロン）と ともに激しく渦巻攪拌（ＩＯＸＩ分）することにより細胞溶解させた。この溶液 は、　５０ｍＭ　）リス−〇ＣＩ（１）■８．０）　、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　 １ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）　、　および１Ｍｇ　 ／　！ｌ　１ペプスタチンを含有していた。ＣＬＯＯ−３ポリペプチドを含有す る細胞溶解物中の不溶性物質を、遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ、　Ｓ分間）に より集め、　Ｌａｅ＋ｍｍ１１のＳＤＳ試料緩衝液中で５分間煮沸することによ り溶解させたｏ　（Ｌａｅｍ＋ｍｌｉ　（１９７０）を参照のこと〕０誘導され た酵母培養物０．３ｍｌ中の量に相当する量のポリペプチドを、　Ｌａｅｍｍｌ ｉ　（１９７０）に従い、　ＳＤＳ存在下で１０％ポリアクリルアミドゲルによ り電気泳動前行った。タンパク標準物質を一緒にゲル電気泳動した。発現された ポリペプチドを含有するゲルは、クマシーブリリアントブルーで染色するか、ま たはｐＡＢ２４およびｐＡＢ２４ｃ１００−３から発現されたポリペプチドの免 疫学的反応性を決定するために慢性ＮＡＮＢＨの患者由来の血清を用いて、　Ｔ Ｖ、Ｂ、２．節で記述したような“ウェスタン”プロットに供した。 結果を第３７図に示す。第３７図Ａでは、ポリペプチドをクマシーブリリアント ブルーで染色した。ｐＡＢ２４で形質転換したＪＳＣ３０８由来の不溶性ポリペ プチド、およびｐＡＢ２４ｃ１００−３で形質転換したＪＳＣの異なる二つのコ ロニー由来の不溶性ポリペプチドを、それぞれレーン１　（ｐＡＢ２４）　、な らびにレーン２および３に示す。レーン２および３とレーン１との比較は、ｐＡ Ｂ２４ｃ１００−３で形質転換したＪＳＣ３０Ｂ由来の分子量が約５４，０００ ダルトンに相当するポリペプチドの、誘導された発現を示す。このポリペプチド は、　ｐＡＢ２４で形質転換したＪＳＣ３０ｇでは誘導されない。このポリペプ チドを矢印で示す。 第３７図Ｂは、　ｐＡＢ２４　（レーン１）またはｐＡ８２４ｃ１００−３　（ 、レーン２）で形質転換したＪＳＣ３０８で発現される。不溶性ポリペプチドの ウェスタンプロットの結果を示す。　ｐＡＢ２４から発現されるポリペプチドは 、　ＮＡＮＢＨのヒト由来の血清と免疫学的な反応性を示さなかった。しかしな がら、矢印で示したように。 ｐＡ８２４ｃ１００−３で形質転換したＪＳＣ３０８は、ヒトＮＡＮＢＨ血清と 免疫学的に反応する約５４．０００ダルトンのポリペプチドを発現した。レーン ２の、免疫学的ζε反応性のあるその他のポリペプチドは、この約５４．　Ｇｏ ｏダルトンのポリペプチドの分解産物および／または凝集物であり得る。 ＩＶ、Ｂ、６．融合ポリペプチドＣＩＧＯ−３の　１Ｎ末端にＳＯＤを、モして Ｃ末端にフレーム内（ｉｎ−ｆｒａ璽ｅ）のＣ１００ＨＣＶ−ポリペプチドを有 する融合ポリペプチドＣ１００−３を。 ポリペプチドが発現された宿主酵母細胞抽出物の不溶性画分を分別抽出すること により精製した。 融合ポリペプチドＣ１００−３を、　ＴＶ、Ｂ、４．節に記述したように。 ｐＡＢ２４ｃ１００−３で形質転換した酵母ＪＳＣ３０ｇ株で発現させた。次い で、酵母細胞をホモジナイズすることにより溶解させ、溶解物中の不溶性物質を ｐｕ　１２．０で抽出した。そして、残った不溶性画分中のＣ１００−３を、　 ＳＤＳを含有する緩衝液に可溶化した。 酵母溶解物を９本質的にＮａｇａｈｕｍａら（１９８４）に従って調製した。　 ２０１Ｍ　）リスＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　、１ｍＭ　ジチオスレイトール。 および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＰ）を含有する溶液 （緩衝液Ａ）中に、３３％細胞（ｖ／ｖ）の割合で。 酵母細胞懸濁液を調製した。この懸濁液の所定量（１５＋ｎｌ）を等量のガラス ピーズ（直径０．４５−０．５０＋＋ｍ）と混合し、この混合物を５ｕｐｅｒ　 Ｍｉｘｅｒ　（Ｌａｂ　Ｌｉｎｅ　Ｉｎ５ｔｒｕＩＩｌｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、） の最高速度で８分間渦巻攪拌した。このホモジネートおよびガラスピーズを分離 し、もとの細胞沈澱物と同様に、ガラスピーズを等量の緩衝液Ａで３回洗浄ｑた 。洗浄液とホモジネートとを合わせた後、ホモジネートを７．ＯＯＯＸｇで１５ 分間、４℃で遠心分離し、ペレットをもとの細胞沈澱物の２倍量に相当する量の 緩衝液Ａに再懸濁し、　？、０００Ｘｇで１５分間遠心分離して物質を再びペレ ットとすることにより、溶解物中の不溶性物質を得た。この洗浄工程を３回繰り 返した。 溶解物からの不溶性物質は、以下のようにしてｐＨ１２，０で抽出した。ペレッ トを０．５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する緩衝液に懸濁した。ここ で、懸濁液の容量は、もとの細胞沈澱物の１．８倍量に相当した。懸濁液のｐＨ は、０．２容量の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１２，０）を添加する ことにより調整した。混合した後、懸濁液を７．ＯＯＯＸｇで１５分間、４℃で 遠心分離し、上清を除去した。この抽出を２回繰り返した。抽出したペレットは 、もとの細胞沈澱物の２倍量に相当する懸濁液量を用い、該ペレットを０．５Ｍ 　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡに懸濁し１次いで？、０ＯＯＸ　ｇで１５分間、 ４℃で遠心分離することにより洗浄した。 ペレット抽出物中のＣ１００−３ポリペプチドは、　ＳＤＳで処理することによ り可溶化した。このペレットをもとの細胞沈澱物の容量の０．９容量に相当する 量の緩衝液Ａに懸濁し、０．１容量の２％ＳＤＳを添加した。懸濁液を混合した 後、　？、ＯＯＯＸｇで１５分間、４℃で遠心分離した。得られたペレットをＳ ＤＳで３回以上抽出した。Ｃ１００−３を含有する。得られた上清をプールした 。 この工程により、　Ｃ１００−３は酵母ホモジネートの不溶性画分から１０倍以 上精製され、ポリペプチドの回収率は５０％以上を越える。 融合ポリペプチドの精製調製物は、　Ｌａｅｍｍｌｉ　（１９７０）に従い。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。この分析に基づくと、ポリペ プチドはその純度が８０％を越え、見かけの分子量約５４，０００ダルトンを有 していた。 ＴＶ、ｃ、　ＨＣＶ　ｃＤＮＡにハイブリダイズ　る　黙染　のＲＮＡの西ＴＶ 、ｃ、１．　ＣｖｃＤＮＡにバイブ１　イズ　る　ＮＡＮＢＨのチンパンジーの 　のＲＮＡの６ 以下のように、　ＮＡＮＢＨのチンパンジーの肝臓由来のＲＮＡは。 ノーザンプロットによりクローン８１に含有されるＨＣＶ　ｃＤＮＡとハイブリ ダイズする種類のＲＮＡを含有することが示された。 ＲＮＡを、高力価の血漿が得られたチンパンジーの肝臓の生検材料から単離した （　ＩＶ、Ａ、　１．節を参照のこと）。これには。 哺乳動物細胞からの全ＲＮＡの単離、ならびに該ＲＮＡのポリＡ”画分およびポ リＡ−画分への分離についてＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載された技術 を用いた。これらのＲＮＡ画分を、ホルムアルデヒド／アガロースゲル（１％Ｖ ／Ｖ）での電気泳動に供し。 ニトロセルロース膜に移した。（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２））。ニトロセ ルロースフィルターを、クローン８１　由来の放射性標ｒｔＨＣＶ　ｃＤＮＡ　 （インサートのヌクレオチド配列については、第４図を参照のこと）とハイブリ ダイズさせた。放射性標識プローブを調製するために、クローン８１から単離し たＨＣＶ　ｃＤＮＡインサートを、ＤＮＡポリメラーゼｌを用いたニックトラン スレージ謬ン（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９Ｂ２））により３２ｐで放射性標識し た。 ハイプリダイゼーシ璽ンは、１０％（Ｗ／Ｖ）デキストランスルフェート、５０ ％（ｖ／ｖ）脱イオン化ホルムアミド、７５０１Ｍ　ＮａＣ１゜７　Ｓ＋ｏＭク エン酸ナトリウム、２０ｍＭ　Ｎａ２ＢＰＯａ　（ｐＨａ、ｓ）　、０．１％Ｓ ＤＳ、　０．０２％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、　０．０２％ （！／Ｖ）フィコール−４００，０，０２％（ｖ／ｖ）ポリビニルピロリドン。 １００μｇ／ｍｌの超音波処理および変性処理によりせん断したサケ精子ＤＮＡ 、および１０”ＣＰＭ／　＋ｅｌのニックトランスレーションしたｃＤＮＡプロ ーブを含有する溶液中で１８時間、４２°Ｃで行った。 プローブで処理したフィルターのオートラジオグラフを。 第３８図に示す。レーンｌは、３２Ｐ−標識した制限フラグメントマーカーを含 有する。レーン２−４は、以下のようなチンパンジー肝臓のＲＮＡを含有する： レーン２は、３０Ｐｇの全ＲＮＡを含有し；レーン３は、　３０ＰｇのポリＡ− ＲＮＡを含有し：そしてレーン４は、２０ＰｇのポリＡ”ＲＮＡを含有する。第 ３８図に示すように。 ＮＡＮＢＨのチンパンジーの肝臓は、　ＨＣＶ　ｅＤＮＡプローブにハイブリダ イズし、かつ約５０００ヌクレオチドから約１１．０００ヌクレオチドの大きさ と考えられる。ポリＡ”ＲＮＡ分子関連の異種集団を含有する。ＨＣＶ　ｃＤＮ ＡにハイブリダイズするこのＲＮＡは、細菌ゲノムおよび／または細菌ゲノムの 特異的転写物を意味し得る。 以下のＴＶ、Ｃ，２，節に記述した実験は、　ＨＣＶは一つのＲＮＡゲノムを有 するという示唆と一致する。 ＴＶ、Ｃ，２，５３か′た　’　１７）ＨＣＶ　ＲＮＡノ１５ＩＶ、Ａ、１．節 で記述したように、核酸を、高力価のチンパンジーＮＡＮＢＨ血漿から単離した 粒子から抽出した。単離した核酸の一定量（もとの血漿の１璽ｌに相当する）を 、２０μｍの５ｈ＋Ｍ１１ｅｐｅｓ　（ｐＨ７，５）　、　１＋ａｍ　ＥＤＴＡ および１６μｓ／ｍｌ酵母可溶性ＲＮＡに再懸濁した。試料は、５分間煮沸した 後、直ちに凍結することにより変性させ、　ＲＮａｓｅ　Ａ　（５μｌ　；　２ ５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液、４０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７，５）に０．１＋ｍｇ／ｍ ｌ　ＲＮａｓｅ　Ａを含有する）またはＤＮａｓｅＩ　（５μｍ；　１０ｍＭ　 ＭｇＣｌ２．２Ｓ＋ａＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７，５）中に１単位のＤＮａｓｅ　 Ｉを含有する）で処理した。対照の試料は、酵素なしでインキュベートした。イ ンキユベーションの後、２μｇ／＋ｎｌ酵母可溶性ＲＮＡを含有する２３０μｌ の氷冷２ＸＳＳＣを添加し、試料をニトロセルロースフィルターで濾過した。こ のフィルターを。 ニックトランスレージ璽ンにより３２ｐ−標識したクローン８１由来のｃＤＮＡ プローブとハイブリダイズさせた。第３９図は、このフィルターのオートラジオ グラフを示す。ノ翫イブリダイゼーシ１ンのシグナルは、ＤＮａｓｅ処理試料お よび対照試料（それぞれ、レーン２および１）で検出されたが、ＲＮａｓｅで処 理した試料（レーン３）では検出されなかった。このように、ＲＮａｓｅＡ処理 により粒子から単離した核酸が分解され、　ＤＮａｓｅ　Ｉ処理は何の影響もな かったので、この証拠により、　ＨＣＶゲノムがＲＮＡにより一構２成されると いうことが強く示唆される。 （以下余白） ＩＶ、Ｃ６３，ＮＡＮＢＨるチンパンジーから′６られるおよび　將°　・にお けるＨＣＶ　配置　の−ＨＣｖ　配置の ＮＡＮＢＨを有するチンパンジーの肝臓および血漿中に存在するＨＣｖ核酸、お よび対照のチンパンジーにおけるＨＣＶ核酸は。 基本的に５ａｉｋｉ　ら（１９８６）が記述したポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ） の手法を用いて増幅された。このプライマーオリゴヌクレオチドは、クローン８ １．あるいはクローン３６および３７におけるＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来であった。 この増幅された配列は、適当なｃＤＮＡオリゴマー（これは、２つのプライマー の間の領域を有するが２つのプライマーを含まない）をプローブとして用い、ゲ ル電気泳動およびサザンブロッティングによって検出された。 増幅系によって調べられるＨＣＶ配列を含むＲＮＡ試料は、　ＮＡＮＢＨを保有 する３匹のチンパンジーおよび２匹の対照のチンパンジーの肝臓の生体試料から 単離された。ＲＮＡ画分の単離は。 ｒｖ、ｃ、ｉ節に記載したグアニジウムチオシアネート法により行なった。 増幅系によって調べられるべきＲＮＡ試料もまた。２匹のＮＡＮＢＨ保有チンパ ンジーおよび１匹の対照チンパンジー、さらに対照のチンパンジーから得られる 貯留した血漿から単離された。 １匹の感染チンパンジーは、１０６　と同等がそれを越えるＣＩＤ／ｄを有し、 他の感染チンパンジーは、１ｏ５と同等がそれを越えるＣＩＤ　／ｄを有する。 この核酸は１次のようにして血漿から抽出した。血漿の０．１ｉのもしくは０． ０１ｄを１０ｄｇ／ｄのポリアデニル酸を含有するＴＥＮＢ／プロティナーゼＫ 　／ＳＤＳ溶液（０，０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。 ｐＨ８，０、０，００１Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．１　Ｍ　ＮａＣ１，１■／ｍｌ！ プロテイナーゼに、および０．５％ＳＤＳ　）で最終体積が１．Ｏｄになるよう に希釈し、３７°Ｃにて６０分間インキュベートした・このプロテイナーゼＫに よる分解の後、フェノール飽和ＴＥ　（１０，抛ＨＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８ ，０、１量Ｍ　ＥＤＴＡ）を用いた抽出により、脱タンパクした。遠心分離によ りフェノール層を分離し・０・１％のＳＯ５を含むＴＥＮＢで再抽出した。それ ぞれの抽出で得られる水相をプールし１等容量のフェノール／クロロホルム／イ ソアミルアルコール（１：　１　（９９：　２）　）溶液で２度抽出し。 その後等容量のクロロホルム／イソアミルアルコール（９９：１）の混液を用い て、２度抽出した。遠心分離により相分離し、水相を、酢酸ナトリウムの最終濃 度が０．２Ｍとなるようにし、エタノールを２倍量添加することにより核酸を沈 澱させた。沈澱した核酸は、　５Ｗ４１のローターで３８Ｋにて４°Ｃで６０分 間超遠心分離を行なうことにより回収した。 上記に加えて、高力価のチンパンジーの血漿およびプールされた対照の血漿のど ちらか一方を、　Ｃｈｏｍｃｙｚｓｋｉおよび５ａｃｃｈ　１（１９８７）の方 法により、５０ＭｇのポリＡ担体を用いて抽出した。この方法では、酸グアニジ ウムチオシアナー）　（ａｃｉｄｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａ ｔｅ　）抽出を使用する。ＲＮＡを、エツペンドルフ　マイクロフユージ中で、 ４°Ｃにて１０分間、　１０．０００ＰＰＭにて遠心分離することにより９回収 した。 ２つの場合においては、　ＰＣＲ反応におけるｃＤＮＡの合成に先立って、プロ テイナーゼに／ＳＤＳ　／フェノール法によって血漿から抽出された核酸は、さ らにＳおよびＳエルチップ−Ｒ（Ｓ　Ｅｌｕｔｉｐ−Ｒ）カラムに結合させ、こ のカラムから溶出させることにより精製した。それに続く工程は製造者の指示に より行なった。 ＰＣＲ反応の鋳型として用いられたｃＤＮＡは、上述のように調製された核酸（ 全核酸または全ＲＮＡ　）から誘導された。エタノール沈澱に続き、沈澱した核 酸を乾燥し、蒸留水処理したＤＨＰＣに再懸濁した。核酸の２次構造を、試料を ６５°Ｃにて１０分間加温することによって引き離し、そして、速やかに試料を 氷で冷却した。ｃＤＮＡは、肝臓、あるいは１０〜１００μｌの血漿から抽出さ れた核酸（あるいはＲＮＡ　）から得られる総チンパンジーＲＮＡ　１〜３μｇ を用いて合成された。この合成は逆転写酵素を利用し、製造者ＢＲＬによって詳 細に述べられているプロトコールを用い、２５μｌの反応液中で行われた。　ｃ ＤＮＡ合成用のプライマーは、後述のＰＣＲ反応でもまた利用されているプライ マーであった。　ｃＤＮＡ合成のすべての反応混合物には。 ＲＮＡａｓｅ阻害剤であるＲＮＡ５ＩＮ”　（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｐｒｏｍｅｇａ） を２３Ｕ含有していた。ｃＤＮＡ合成に続き、この反応混合物を水で希釈し。 １０分間煮沸し、氷上ですばやく冷却した。 このＰＣＲ反応は、１ＭｇのＲＮａｓｅ　Ａの添加を除いては、製造者（Ｃｅｔ ｕｓ−Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の指示に従って行なった。この反応は、最終 容量が１００μｌとなるように行なわれた。このＰＣＲは、３７℃、７２℃、お よび９４°Ｃの条件下で、３５サイクルにわたって行なわれた。 ｃＤＮＡ合成用プライマーおよびＰＣＲ反応プライマーは、クローン８１．クロ ーン３６．あるいはクローン３７ｂのいずれかにおけるＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列か ら得られた。（クローン８１．３６および３７ｂのＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列は、第 ４図、第５図および第１０図にそれぞれ示されている。）クローン８１由来の２ 個の１６量体プライマーの配列は次のとおりである： ５’　ＣＡＡ　ＴＣＡ　ＴＡＣＣＴＧ　ＡＣＡ　Ｇ　３”および ５”ＧＡＴ　ＡＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧ　Ａ　３’。 クローン３６から得られるプライマーの配列は次のとおりである： ５“ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　Ｔ　３’。 クローン３７ｂから得られるプライマーの配列は次のとおりである： ５’　ＡＣＡ　ＡＴＡ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　ＴＣＡ　Ｃ３’。 このＰＣＲ反応において、このプライマーの対は、クローン８１由来の２つの１ ６量体プライマ一対；あるいはクローン３６由来の１６量体プライマーとクロー ン３７ｂ由来の１６量体プライマーとの対のいずれによっても構成される。 にかけサザンブロッティングを行い、プライマーと重複しないＨＣＶ　ｃＤＮＡ 領域由来の３２Ｐ標識内部のオリゴヌクレオチドプローブにより増幅されたＨＣ Ｖ−ｃＤＮＡ配列を検出することによって分析された。このＰＣＲ反応混合物を フェノール／クロロホルムで抽出し、核酸を、塩およびエタノールを用いて水相 から沈澱さた。沈澱させた核酸を遠心分離で回収し、蒸留水に溶解させた。試料 の一部は、１．８％アルカリアガロースゲルで電気泳動を行った。６０．　１０ ８および１６１のヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡを９分子量マーカーとして、同 時に電気泳動にかけた。電気泳動後、このゲル中のＤＮＡを、　Ｂｉｏｒａｄ　 ＺｅｔａＰｒｏｂｅ　”紙に移した。ブレハイブリダイゼーションおよびハイブ リダイゼーション、および洗浄条件は、製造者（Ｂｉｏｒａｄ）によって規定さ れる条件に従った。 増幅されたＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列のハイブリダイゼーション検出に用いられたプ ローブは次のとおりである。　ＰＣＲプライマーの対がクローン８１由来である ときには、２つのプライマーの配列の間の領域に位置する配列に対秘する配列を 有する１０８量体であった。このＰＣＲプライマ一対がクローン３６および３７ ｂ由来であるとき、このプローブはクローン３５由来の、ニック翻訳されたＨＣ ’Ｖ　ｃＤＮ＾挿入物であった。このプライマーはクローン３７挿入物の１５５ 〜１７０ヌクレオチドおよびクローン３６挿入物の２０６〜２６８ヌクレオチド 由来である。クローン３５におけるＨＣＶ　ｃＤＮＡ挿入物の３゛末端は、クロ ーン３６の挿入物の１〜１８６のヌクレオチドと重複しており、そして、クロー ン３５挿入物の５”末端はクローン３７ｂの挿入物の２０７〜２６９ヌクレオチ ドと重複する。（第５．第８．および第１０図を比較されたい、）このように、 クローン３５中のｃＤＮＡの挿入物は、クローン３６および３７ｂ由来のプライ マーの配列間の領域部分にまでおよび、これらプライマーを含む増幅配列のため のプローブとして有用である。 肝臓試料由来のＲＮＡの分析は、プライマーおよびプローブの両セットを利用す る上記方法に従って行なった。３匹のＮＡＮＢＨ保有チンパンジーの肝臓由来の ＲＮＡは、予期されるサイズの増幅配列（８１および３６および３７ｂにおいて 、それぞれ１６１および５８６ヌクレオチド）については、ハイブリダイゼーシ ョンの結果が陽性であり、他方、対照のチンパンジーについては、ハイブリダイ ゼーションの結果が陰性であった。この実験を３回繰りかえしたところ同じ結果 が得られた。 血漿から得られる核酸およびＲＮＡの分析もまた。クローン８１由来のプライマ ーおよびプローブを利用する上記方法により行なわれた。この血漿は、２匹のＮ ＡＮＢＨ保をチンパンジー由来の血漿、対照の°チンパンジー由来の血漿、そし て対照のチンパンジーから得られるプールされた血漿である。両ＮＡＮＢＨ血漿 は、核酸／ＲＮＡを有し、　ＰＣＲ増幅アッセイで陽性の結果が得られ、他方９ 両対照血漿は陰性の結果が得られた。これらの結果は数回繰り返して得られた。 ■、Ｄ、序　の　ゞ　のＨＣＶ　を　るための立２主王ムムヱＬ土工 ＨＣＶ抗原に対する抗体を検出する固相ラジオイムノアッセイは、　Ｔｓｕおよ びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　（１９８０）の方法を基にして開発された。マイクロ タイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ　２．　Ｒｅｓｏｖａｗｅｌｌｓｔｒｉｐｓ ）をＨＣＶエピトープを有する精製ポリペプチドで被覆する。この被覆プレート は、　ＨＣＶエピトープに対する抗体を有する疑いのあるヒト血清試料、あるい は適当な対照試料とともにインキュベートされる。インキュベートを行なう間に 。 抗体が存在するのであれば、該抗体は固相抗原に免疫学的に結合する。非結合物 質を除去し、そしてこのマイクロタイタープレートを洗浄後、ヒト抗体−ＮＡＮ ＢＶ抗原複合体は　ＩｔＪ標識ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンとともにインキュベ ートすることによって検出される。結合しなかった標識抗体を吸引によって除去 し、そしてプレートを洗浄する。個々のウェルの放射能が測定される。結合ヒト 抗ＨＣＶ抗体の量はウェル中の放射能に比例する。 ＩＶ、Ｄ、１．　”　’−、ＩＩ　ヘア’チ）’５ＯＤ−ＮＡＮＢ　−−（７） 　’ＩＩＶ、　Ｂ、１．節に記載の組換え体細菌中で発現する融合ポリペプチド ５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−＋−＋　は１組換え体Ｅ、ｃｏｌｉから、尿素で細胞抽出 物を分画抽出することによって９次いで１次のように陰イオンおよび陽イオン交 換カラムでのクロマトグラフィーにかけることによって精製された。 ｌｌの培養物から得られる溶解細胞を、　０．ＯＩＭ　）リス−〇ＣＩ　、　ｐ Ｈ８，０、を含有すル１０ｍｅ（７）２０％（Ｗ／Ｖ）　シュークロース中に再 懸濁し、　０．４　＃ｄ！の０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０、を添加した 。０°Ｃにて５分後、この混合物を４．０００Ｘｇにて１０分間遠心分離した。 得られたペレットを０．０５Ｍ　）リス−ＨＣｌ　、　ｐＨ８，０，１ｍＭフェ ニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ　）およびペブスクチンＡ　１Ｍ ｇ／ｄを含有する１０ｍの２５％（Ｗ／Ｖ　）シェークロース液に懸濁させ９次 いで、　０．５　ｍのリゾチーム（１０■／ｄ）を添加し、０°Ｃで１０分間イ ンキュベートした。　０．０５Ｍ　）リス−〇ＣＩ　、　ｐＨ８，０、１ｗＭ　 ＥＤＴＡ中に１％（Ｖ／Ｖ）のトリトンＸ−１００を含む溶液１０ＩＩＩｌを添 加後、この混合液を９時々振盪しながらひきつづき０℃にて１０分間インキュベ ートした。得られた粘稠な溶液を、　２０ゲージの滅菌皮下注射針を６回通すこ とにより、ホモジナイズし、　１３．０００Ｘ　ｇにて２５分間遠心分離した。 ペレット化した物質を、　０．０１Ｍ　）リス−〇ＣＩ　（ｐＨ８，０）　５ｍ に懸濁させ、この懸濁液を、　４．０００Ｘｇにて１０分間遠心分離した。５Ｏ Ｄ−ＮＡＮＢｓ−＋−＋融合タンパクを含有するペレットを、　０．０２Ｍ　） リス−ＩＣＩ　ＣｐＨ８，０）　。 １ｍＭジチオスレイトール（緩衝液Ａ）中に６Ｍ尿素を含む溶液５Ｉ１１に溶解 させ、緩衝液Ａで平衡化したＱ−セファロースファースト　フローカラムにかけ た。ポリペプチドは、緩衝液ＡＯＮａＣ１中０．０〜０．３Ｍのリニアグラジェ ントで溶出した。 溶出後、各両分を、　ＳＯＤの存在下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ て分析し、　５００−ＮＡＮＢｓ−１−＋の含量を決定した。 このポリペプチドを含有する画分をプールし、　０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩 衝液（ｐＨ６，０）　、１ａ＋Ｍジオチスレイトール、に６Ｍ尿素を含む緩衝液 （緩衝液Ｂ）に対して透析した。この透析試料を、緩衝液Ｂで平衡化したＳ−セ ファロース　ファースト　フローカラムにかけ、ポリペプチドを緩衝液Ｂ中でＮ ａＣ１０，０〜０．３Ｍのリニアグラジェントで溶出させた。この両分を、ポリ アクリルアミドゲル電気泳動で分析し、　５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−＋−＋の存在を 調べ、適当な画分をプールした。 この５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−＋−ｔポリペプチドの最終調製物を、　ＳＯＳの存在 下で、ポリアクリルアミド電気泳動にかけて調べた。この分析によれば、この調 製物は、８０％を越える純度であった。 ＩＶ、　Ｄ、２　１人ポリペプチド５ＯＤ−ＮＡＮＢ　の　＋１１Ｖ、　Ｂ、２ ．節で記載の組換え体細菌中で発現した融合ポリペプチド５ＯＤ−ＮＡＮＢ□は １組換え体Ｌｃｏｌｉから、尿素を用いた細胞抽出物の分画抽出により１次いで 、融合ポリペプチド５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−＋−＋を単離するために記載された工 程（ＴＶ、Ｄ。 １、節を参照されたい）を用いて、陰イオンおよび陽イオン交換カラムクロマト グラフィーを行なうことにより精製された。 ５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ＋ポリペプチドの最終調製物は、　ＳＤＳの存在下でポリア クリルアミドゲル電気泳動によって調べられた。この分析によれば、この調製物 は５０％を越える純度であった。 ＩＶ、Ｄ、３．　−ジオイムノア・セイによるＨＣＶエピトープに・　る　の ＮＡＮＢＨを有すると診断された３２人の患者から得られる血清試料を、ラジオ イムノアッセイ（ＲＩＡ　）によって分析し、融合ポリペプチド５ＯＤ−ＮＡＮ Ｂｓ−＋　−＋および５ＯＤ−ＮＡＮＢａｔ中に存在するＨＣＶエピトープに対 する抗体が検出されるか否か決定した。 マイクロタイタープレートを５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−Ｉ−Ｉ　あるいは５ＯＤ−Ｎ ＡＮＢ□（それぞれ、　ＩＶ、　Ｄ、１節およびＩＶ、　Ｄ、２節に従って２部 分精製されている）で被覆した。この分析は２次のようにして行なわれた。 ０．１２５　Ｍホウ酸緩衝液、　ｐＨ８，３、０，０７５Ｍ　ＮａＣ１（ＢＢＳ ）中に０・１〜０・５μｇの５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−ｓ−＊あるいは５００−ＮＡ ＮＢｓｔを含む１００μｆｆｉを、マイクロタイタープレー）　（Ｄｙｎａｔｅ ｃｈＩｍｓｕｌｏｎ　２　Ｒｅａ＋ｏｖａｓｓｅｌｌ　５ｔｒｉｐｓ　）の各ウ ェルに添加した。このプレートを湿潤チャンバー内で４°Ｃにて一晩インキユベ ートシ、その後、このタンパク溶液を除去し、　０．０２％　トリトンＸ−１０ ０を含有するＢＢＳ　（ＢＢＳＴ）で３度このウェルを洗浄した。非特異的な結 合を防ぐために、このウェルを牛血清アルブミン（ＢＳＡ　）で被覆した。この 操作は、　ＢＳＡを５　［／ｄの割合でＢＢＳに溶解させた溶液１００μｌ添加 し２次いで、室温で１時間インキュベートすることによって行なった。このイン キュベートの後、　ＢＳＡ溶液を除去した。被覆されたウェル中のポリペプチド を血清と反応させ、該血清含有ウェルを３７°Ｃにて１時間インキュベートした 。上記血清との反応は、１０■／ｄ　ＢＳＡを含有する含０．０１Ｍリン酸ナト リウム緩衝液。 ｐＨ７，２，０，１５Ｍ　ＮａＣ１，（ＰＢＳ）中に１：１００の割合に希釈さ れた血清試料１００μｌを添加することにより行なった。インキュベートの後、 この血清試料を吸引除去し、このウェルをＢＢＳＴで５回洗浄した。この融合ポ リペプチドに結合した抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋およびＮＡＮＢｓ　Ｉは　１０■標 識Ｆ’　（ａｂ）、ヒツジ抗ヒトＩｇＧをこの被覆ウェルに結合させることによ り、決定された。標識プローブ（比活性５〜２０μＣｉ／μｇ）１００μｌを各 ウェルに添加し、このプレートを、３７℃にて１時間インキュベートした０次い で、過剰のプローブを吸引除去し、　ＢＢＳＴで５回洗浄した。各ウェルに結合 した放射能の量を、Ｔ線を検出するカウンターでカウントし決定した。 ＮＡＮＢＨ保有個体における抗ＮＡＮＢｓ−ｒ　−ｔおよび抗ＮＡＮＢｓ＋の検 出結果を１表１に示す。 表１ ＮＡＮＢ、　ＨＡＶおよびＨＢＶ肝炎患者の血清中の抗５−１−１および抗８１ の検出 ４．３１　慢性ＮＡＮＢ、　ＰＴ’　１６．０９　８．０５９．３６　末期ＡＶ ＨＮＡＮＢ　ＰＴ　１１．８４　５．７９１０．３７　ＡＶＨ，ＮＡＮＢ、ＩＶ Ｄ　６．５２　１．３３１１、３８　末期ＡＶＨＮＡＮＢ、ＰＴ　３９．４４　 ３９．１８１２、３９　慢性ＮＡＮＢ、　ＰＴ　４２．２２　３７．５４１３． ４０　ＡＶＢ、ＮＡＮＢ、ＰＴ　１．３５　１．１７１４、４１　慢性ＮＡＮＢ ？　ＰＴ　Ｏ，３５０，２８１５，４２ＡＶＨ，ＮＡＮＢ、ＩＶＤ　６．２５　 ２．３４１６、４３　慢性ＮＡＮＢ、ＰＴ　Ｏ，７４０，６１１７，４４ＡＶＨ ，ＮＡＮＢ、ＰＴ　５．４０　１．８３１８、４５　慢性ＮＡＮＢ、　ＰＴ　Ｏ ，５２０，３２１９，４６ＡＶＨ，ＮＡＮＢ　２３．３５　４．４５２０．４７ 　ＡＶＨ，Ａ型　１．６０　１．３５２１．４８　ＡＶＨ，Ａ型　１．３０　０ ．６６２２．４９　ＡＶＨ，Ａ型　１．４４　０．７４最近症状銘さまっＴｈＡ ＶＨ。 Ａ型　０．８０　０．６５ ２７．５４　ＡＶＨ，Ａ型　１．３５　０．７４２８、５５　末期ＡＶＩＤ、　 ＨＢＶ　Ｏ，５８０，５５２９、５６慢性ＨＢＶ　Ｏ，８４１，０６３０、５７ 末期ＡＶＨ，ＨＢＶ　３．２０　１．６０３１、５８　慢性ＨＢＶ　Ｏ，４７０ ，４６３２，５９１ＡＶＨ，ＨＢＶ　Ｏ，７３０，６０治癒ＬｋＡＶＨ，ＨＢＶ 　Ｏ，４３０，４４３３，６０’　ＡＶＨ，ＨＢＶ　１．０６　０．９２治癒Ｌ ｋＡＶＩ（、ｔｌＢＶ　Ｏ，７５０，６８３４，６１’　ＡＶＨ，ＨＢＶ　１． ６６　０．６１治癒した／Ｉｖ）Ｉ、ＨＢＶ　Ｏ，６３０，３６３５、６２重　 ＡＶＨ，ＨＢＶ　１．０２　０．７３治癒ｕＡｖｎ、　ＨＢＶ　Ｏ，４１０，４ ２３６，６３’　ＡＶｔｌ、ＨＢＶ　１．２４　１．３１治癒ＬｈＡＶＨ，ＨＢ Ｖ　１．５５　０．４５３７．６４１　ＡＶＨ，ＨＢＶ　Ｏ，８２０，７９治癒 ＬｋＡＶＨ，ＨＢＶ　Ｏ，５３０，３７３８，６５’　ＡＶＨ，ＨＢＶ　Ｏ，９ ５０，９２治癒Ｌｌ＝ＡＶＨ，ＨＢＶ　Ｏ，７００，５０！これらの患者から入 手した連続血清試料（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｓｅｒｕｍ　ｓａａ＋ｐｌｅ） ”　ＩＶＤ　＝静脈注射薬使用者 ”　ＡＶＨ＝急性ウィルス肝炎 ’ＰＴ＝輸血後 表１かられかるように、　ＮＡＮＢＨを保有していると診断された患者から得ら れた３２の血清のうち１９が、　５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−ｓ−ｚおよび５ＯＤ−Ｎ ＡＮＢｓ＋に存在するＨＣＶエピトープに対する抗体について陽性であった。 しかし、陽性であった血清試料は、　５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−＋−＋および５ＯＤ −ＮＡＮＢｓ　ｌと同様に免疫学的に反応性を有しているわけではなかった。Ｎ α１の患者から得られた血清試料は、　５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ＋に対しては陽性で あったが５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−＋−＋に対しては陽性ではなかった。Ｎα１０． １５および１７の患者から得られた血清試料は５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−ｒ　−＋に 対しては陽性であったが、　５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ＋に対しては陽性ではなかった 。Ｎα３，８．１１および１２の患者から得られた血清試料は５ＯＤ−ＮＡＮＢ ｓ−＋−＋および５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ、の両融合ポリペプチドと同程度に反応す るが、これに対してＮα２゜４．７および９の患者から得られる血清試料におい ては、　５ＯＯ−ＮＡＮＢｓｓに対するよりも５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−ｌ−ｒに対 する反応の方が。 ２〜３倍反応性が高かった。これらの結果によりＮＡＮＢｓ−＋−＋およびＮＡ ＮＢｅ＋が少なくとも３個の異なるエピトープを有し得ることが示唆される。つ まり、各ポリペプチドが少なくとも１個の独特のエピトープを有し、そして、２ 個のポリペプチドが少なくとも１個のエピトープを共有していることが可能ＮＡ ＮＢＨについての固相ＲＩＡの特異性は、　ＨＡＶあるいはＨＢＶに感染した患 者から得られる血清および対照個体から得られる血清の分析を行なうことにより 試験された。部分精製された５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−ｔ−ｔおよび５ＯＤ−ＮＡＮ Ｂ＠ｔを使用する分析は、実施例ＴＶ、　Ｄ、３節に記載した方法により行なわ れた。但し、血清は、　ＨＡＶあるいはＨＢＶを有しているとあらかじめ診断さ れた患者から得られた血清であるか、あるいは血液バンクの提血者である個体か ら得られた血清である。ＨＡＶおよびＨＢＶ惑染感染からの血清についての結果 を表１に示す。ＨＡＶ感染患者から得られた１１個の血清試料、およびＨＢＶ感 染患者から得られた２０個の血清試料を用いて、　ＲＩＡにより試験が行なわれ た。表１に示すように、これら血清のいずれもがＢＢ−ＮＡＮＢＶエピトープを 有する融合ポリペプチドとの陽性の免疫反応を行わなかった。 ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗原を用いたＲＩＡが、対照個体から得られる血清の免疫学 的反応性を決定するために用いられた。正常血液提供者集団から得られる２３０ 個の血清検体のかち、２個だけがＲＩＡにおいて陽性反応を示した（データは示 されていない）。 これら血清サンプルの源である２人の血液提供者は、以前にＨＣＶにさらされた 可能性がある。 ＩＶ、　Ｄ、５．　ＮＡＮＢ）Ｉ感　゛佳′−におするＮＡＮＢ−−の　１２人 の患者および４匹のチンパンジーのＮＡＮＢＨ感染進行中ニオケＺｒ　抗ＮＡＮ Ｂｓ−＋　−＋抗体の存在カ、■、Ｄ、３ｗｉニ記載されたＲＩＡ法を用いて追 跡された。さらに、感染チンパンジーにおいて、　ＨＡＶおよびＨＢＶの感染進 行中における抗ＮＡＮＢｓ−ｒ　−ｒ抗体の有無を決定するためにＲＩＡが用い られた。 その結果を表２に示す。この結果により、チンパンジーおよびヒトにおいては、 抗ＮＡＮＢｓ−Ｉ−＊抗体は、　ＮＡＮＢＨ惑染の急感染状の発現に従って検出 された。抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体は、　ＨＡＶあるいはＨＢＶに感染したチン パンジーから得られる血清試料では検出されなかった。このように、抗ＮＡＮＢ ｓ−ｓ−ｓ抗体は。 個体がＨＣＶにさらされたことを示すマーカーとしての働きを有する。 （以下余白） 表２ ５−１−１抗原を用いた肝炎患者およびチンパンジーから得られる連続した血清 試料における血清転換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓ　ｉｏｎ）ＩＴ−最初にサンプ リングした日 （以下余白） ＩＶ、Ｅ、　ＮＡＮＢ−＋−＋に・　るポリクロ−ル　′　の　１ＳＯＤ−ＮＡ ＮＢｓ−＊−ｔポリペプチドと、　ＮＡＮＢＩＩの患者由来の血清試料中の抗体 との特異的な免疫学的反応性に基づいて、　ＮＡＮＢｓ−ｓ−を中のエピトープ と免疫学的に反応する血清抗体の精製法が開発された。この方法はアフィニティ ークロマトグラフィーを利用する方法である。精製された５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ− ＊−ｒポリペプチド（ＩＶ、Ｄ、１．１ｆｆ参照）を、不溶性の支持体に結合さ せたが。 その結合は、固定されたポリペプチドが、　ＮＡＮＢｓ−ｚ−＊に対する抗体の 親和性を保持するような結合である。血清試料中の抗体は、マトリックスに結合 したポリペプチドに吸収される。 洗浄して、非特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した後、　ｐＨの変更 および／また１よりオトロビック試薬（例えば尿素）によって、結合した抗体を 、これが結合している５ＯＤ−ＨＣｖポリペプチドから脱離させる。 結合５ＯＤ−ＮＡＮＢｓ−＋−＋を含有するニトロセルロース膜を下記のように して調製した。ニトロセルロースの膜（２，１ａｍのザルトリウス（Ｓａｒｔｏ ｒｉｕｓ）、微細孔の径：０．２　ｐｔａ　）を、　ＢＢＳで３分間ずつ３回洗 浄した。精製した製剤を、　ＢＢＳ中、室温で２時間かまたは４℃で一夜インキ ュベートすることによって５００−ＮＡＮＢｓ−ｒ　−ｒを上記の膜に結合させ た。未結合の抗原を含有する溶液を除去し、フィルターをＢＢＳで３分間ずつ３ 回洗浄した。膜に残っている活性部位を、５■／ＩｄのＢＳＡ溶液とともに３０ 分間インキュベートすることにより、　ＢＳＡでブロックした。得られた膜を、 　Ｂｕｓで５回、蒸留水で３回洗浄して、過剰のＢＳＡを除去した。ウィルス抗 原とＢＳＡを含有する膜を１次に、　０．０５Ｍの塩酸グリシン（ｐＨ２，５） 　、　０．１０Ｍ　ＮａＣ１（Ｇｌｙ　ＨＣＬ）で１５分間処理し１次いでＰＢ Ｓで３分間ずつ３回洗浄した。 ＮＡＮＢＨに感染した個体由来の血清との融合ポリペプチドを含有する膜を、２ 時間インキュベートすることによって、ポリクローナル抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗 体を単離した。インキュベーション後、フィルターをＢＢＳで５回、蒸留水で２ 回洗浄した。 次いで結合している抗体を、各フィルターから、　ＧｌｙＨＣｌを５回、３分間 ずつ用いて溶離した。各溶離液を、２．０Ｍ）リスＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０） の入っている試験管に集めて、溶離液のｐＨを８．０に調整した。アフィニティ ークロマトグラフィーで処理した後の抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体の回収率は約５ ０％である。 結合ウィルス抗原を含有するニトロセルロース膜は、結合容量はそれほど減少す ることなしに数回使用することができる。膜を再使用するには、抗体を溶離した 後、膜をＢＢＳで３）ＨＣｖ１　を　る　；　されたｌ　の　−のＨＣＶｃＤＮ Ａへのハイブリ　゛イゼーションＩＶ、Ｆ、１．ヒトポ１りｏ−７１／　−１（ ＣＶ　を　イテＦｅＩｔ？Ｌ將カ゛ＨＣｖ１　を　、する　法 ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの感染性血漿中に存在するタンパク−核酸複 合体を、ポリスチレンビーズに結合させた精製ヒトポリクローナル抗ＨＣｖ抗体 を用いて精製した。 ポリクローナル抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体は、クローン５−１−１にコードされ た５ＯＤ−１（ＣＶポリペプチドを用いて、　ＮＡＮＢＨに感染したヒト由来の 血清から精製した。精製法はＩＶ、Ｅ、節に記載の方法を用いた。 精製抗ＮＡＮＢｓ−ｒ　−ｒ抗体を、ポリスチレンビーズ（直径ス”。 鏡面仕上げ、　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ　Ｃｏ、、シカ ゴ、イリノイ）に、各々、室温で一夜、１Ｍ！１の抗体〔ホウ酸緩衝食塩水（ｐ Ｈ８，５）中１μｇ　／ｄ）とともにインキュベートすることによって結合させ た。−夜インキユベーションした後に、ビーズを、　ＴＢＳＴ　（５０ｍＭ　） リスＩＣＩ　ｐＨ８，０緩衝液、　１５０ｓ＊Ｍ　ＮａＣ１＋０．０５％（Ｖ／ Ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　２０）で１回洗浄し２次に１０［／ｄ　ＢＳＡを含有するリ ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。 精製抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体を全ヒト免疫グロブリンと取替えること以外は、 同様にして対照のビーズを調製した。 ビーズに結合させた抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体を用いて、　ＮＡＮＢＨに感染し たチンパンジーの血漿から、　ＨＣＶを次のようにして捕獲した。使用した。　 ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの血漿についてはＩＶ、Ａ、１．節に記載し である。ＮＡＮＢＶに感染したチンパンジーの血漿の一部（ｌＩｎ１）を、抗Ｎ ＡＮＢｓ−＋　−＊抗体または対照の免疫グロブリンでコートした５個のビーズ の各々と。 ３７°Ｃで３時間インキュベートした。得られたビーズをＴＢＳＴで３回洗浄し た。 ＩＶ、Ｆ、２．　れた１　のノ　のＮＡＮＢＶ−ｃＤＮＡへのバイブＩダイ」上 台とＬＺ 抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体によって捕獲された粒子から遊離した核酸成分を、ク ローン８１由来のＨＣＶ　ｃＤＮＡとハイブダイゼーションさせて分析した。 ＩＶ、Ｆ、１．節に記載したのと同様にして、　ＨＣＶ粒子をＮＡＮＢＨに感染 したチンパンジーの血清から捕獲した。該粒子から核酸を遊離させるために、洗 浄したビーズを、プロテイナーゼＫ（１■／Ｉｄ）、１０ａＩＭトリスＨＣＩ　 ｐＨ７，５緩衝液、　１０ｏＭ　ＥＤＴＡ、０゜２５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、　１ ０＃ｇ　／ｌｄの可溶性酵母ＲＮＡを含有する溶液の０．２ａｆ／ビーズととも に、３７°Ｃで６０分間インキユベートシ。 次いで上澄み溶液を取出した。この上澄み液をフェノールとクロロホルムで抽出 し１次いで核酸をエタノールで、−夜−２０℃にて沈殿させた。この核酸の沈殿 を、遠心分離して集め。 乾燥し、　５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ７，５に溶解させた。抗ＮＡＮＢｓ− ＋−＋抗体でコートされたビーズから得た試料および全ヒト免疫グロブリンを含 有する対照ビーズで得た試料からの可溶性核酸の二つの部分をニトロセルロース フィルターに吸い取らせた。 これらのフィルターを、クローン８１中の精製ＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片で作製した 　！！ｐで標識し、ニックトランスレーションを行ったプローブとハイプツトさ せた。プローブ調製法およびハイブリダイゼーション法は、　ＩＶ、Ｃ，１，節 に記載しである。 抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体を含有するビーズによって捕獲された粒子由来の核酸 を含有するプローブされたフィルターのオートラジオグラフを第４０図に示す。 抗ＮＡＮＢｓ−ｓ−＋抗体を用いて得た抽出物（Ａ１．　Ａりから、対照の抗体 抽出物（Ａｓ、Ａ４）および対照の酵母ＲＮＡ　（Ｂ＋、　ｔｈ）に比べて明確 なハイブリダイゼーションシグナルを得た。精製クローン８１　ｃＤＮＡ断片の ＩＰｇ。 ５ｐｇおよび１０ｐｇからなる標準物をそれぞれＣ１−３に示す。 これらの結果は、抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体によってＮＡＮＢＨ血漿から捕獲さ れた粒子が、クローン８１内のＨＣＶ　ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションする 核酸を含有することを示し、その結果これらのクローン中のｃＤＮＡは、　ＮＡ ＮＢＨの病原体から誘導されるという別の証拠を提供している。 ＩＶ、Ｇ、　Ｃ１００−３と　ｆｌｌＩＮＡＮＢ−１−との　８・　ひＣ１００ −３融合ポリペプチドと抗ＮＡＮＢ、−１−、抗体との免疫学的反応性を、放射 性免疫検定法によって測定したが、この検定法では、固相に結合した抗原が、精 製抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体に投与され、生成した抗原抗体複合物が、！１１で 標識したヒツジ抗ヒト抗体で検出された。Ｃ１００−３ポリペプチドの免疫学的 反応性を、　５ｏｎ−ＮＡＮＢ５−＋−を抗原のそれと比較した。 れぞれ記載したのと同様にして合成し精製した。融合ポリペプチド５ＯＤ−ＮＡ ＮＢｓ−＋−＋をＩＶ、Ｂ、１．節とＩＶ、Ｄ、１．節にそれぞれ記載したのと 同様にして合成し精製した。精製抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋抗体を、　■、Ｅ、節に 記載したのと同様にして得た。 ０．１２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，３）　、　０．０７５Ｍ　Ｎａ Ｃ１（ＢＢＳ）中９種々の量の精製Ｃ１００−３抗原を含有する１００μｌのア リコツトを、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｍｍｕｌｏｎ２ 　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ　５ｔｒｉｐｓ　）の各ウェルに添加した。このプレー トを加湿チャンバー内で、−夜４°Ｃにてインキュベートした。 次いでタンパク溶液を除き、ウェルを０．０２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００含 有のＢＢＳ　（ＢＢＳＴ）で３回洗浄した。非特異的結合を防止するために、５ ■／ｄのＢＳＡを含有するＢＢＳ溶液を１００μ２添加することによって、ウェ ルをＢＳＡでコート６９次いで室温で１時間インキュベートした後、過剰のＢＳ Ａ　溶液を除去した。 ウェル当り１μｇの抗体を添加することによって、コートされたウェル内のポリ ペプチドを、精製抗ＮＡＮＢｓ−＋　−を抗体と反応させ１次いでその試料を３ ７℃で１時間インキュベートした。 インキュベートした後、過剰の溶液を吸引によって除去し。 ウェルをＢＢＳＴで５回洗浄した。＠ｔｓＩで標識したＦ”（ａｂ）　ｚヒツジ 抗ヒトＩｇＧを、コートされたウェルに結合させることによって、融合ポリペプ チドに結合した抗ＮＡＮＢｓ−＋−＋を測定した。 標識したプローブ（比放射能：５〜２０μＣｉ／■）の１００μｌずつを各ウェ ルに添加し、そのプローブを３７°Ｃで１時間インキュベートし、過剰のプロー ブを吸引で除去し、　ＢＢＳＴで５回洗浄した。各ウェルに結合した放射能の量 は、Ｔ線を検出するカウンターで計数することによって測定した。 Ｃ１００の精製抗ＮＡＮＢｓ−ｓ−＋との免疫学的反応性を、　ＮＡＮＢｓ−＋ −＋の精製抗体との免疫学的反応性と比較した結果を表３に示す。 （以下余白） 表３ Ｃ１００−３とＮＡＮＢ、−−１との　・　による疹　・　、・　の　六 ＲＩＡ　（ｃｐｍ／検定） 一観ｋ（転）−一一迎ｌ−−」匣−−二筺艶−」旦し一一舅）０−ＮＡＮＢｓ− ＋−＋　７３３２　６７３２　４９５４　４０５０　３０５１　５７Ｃ１００− ３７４５０６９８５５９２０５５９３４０９６６７表３の結果は、抗ＮＡＮＢｓ −＋−＋が、Ｃ１００−３ポリペプチドのＣ１００の部分内のエピトープを認識 するということを示している。したがってＮＡＮＢ％−３−１と０１００は共通 のエピトープをもっている。これらの結果は、このＮＡＮＢＶエピトープをコー ドするｃＤＮＡ配列が、クローン５−１−１とクローン８１の両者に存在する配 列であるということを示唆している。 ＩＶ、）１．匹しΩ立且失定 ＴＶ、Ｈ，１，ＨＣｖ゛ツムのス　−ンドの　Ｆ−５ｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ　 の豊立決定 抗ＮＡＮＢ、　、　−、抗体でコートしたポリスチレンビーズに捕獲された粒子 から核酸の画分を単離し９次に単離した核酸が。 ＨＣＶ　ｃＤＮＡの玉鎖および／または負鎖とハイブリダイゼーションするか否 かを測定することによって、　ＨＣＶゲノムをそのストランドの状態について特 性決定した。 ＩＶ、Ｆ、１．節に記載したようにして、免疫学的に精製した抗ＮＡＮＢｓ−ｒ 　−を抗体でコートしたポリスチレンビーズを用いて。 ＨＣＶに感染したチンパンジーの血漿から１粒子を捕獲した。 粒子の核酸成分を、　ＩＶ、Ｆ、２．節に記載した方法を用いて遊離させた。３ ｒｄの高力価血漿と当量の単離されたゲノム核酸のアリコツトを、ニトロセルロ ースフィルターに吸い取らせた。 対照として、クローン８１由来の変性ｎｃｖ　ＣＤＮＡ　Ｃ２ｐｇ）のアリコツ トを同じフィルターに吸い取らせた。そのフィルターを。 ＨＣＶ　ｃＤＮＡからクローン化された一本鎖ＤＮＡの、玉鎖または負鎖の３２ Ｐで標識した混合物でプローブした。なお該ｃＤＮＡは。 クローン４０ｂ、８１および２５ｃから切り出されたものである。 ＥｃｏＲＩでクローン８１．４０ｂおよび２５ｃからＨＣＶ　ｃＤＮＡを切り出 し、そのｃＤＮＡ断片をＭ１３ベクターの−ｐｌＢとｍｐｌＱ内でクローン化す ることによって、−末鎖のプローブを得た〔メリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　１ ９８３年）。そのＭ１３クローンの塩基配列を決定し、そのクローンがＨＣＶ　 ｃＤＮＡ由来のＤＮＡの玉鎖もしくは負鎖をもっているかどうかを決定した。塩 基配列の決定は、サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　（１９７７年）の ジデオキシチェーンターミネーシジン法で行った。 捕獲された粒子から単離されたＨＣＶゲノムの一部を含有する二重のフィルター の各セットを、　ＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来の玉鎖または負鎖のプローブとハイブリ ダイゼーションさせた。第４１図は、　ＮＡＮＢＶゲノムを、クローン８１．４ ０ｂおよび２５ｃ由来のプローブの混合物でプローブして得たオートラジオグラ フを示す。この混合物は、ハイブリダイゼーション検定法の感度を増大させるた めに用いた。パネル■の試料を、玉鎖プローブの混合物とハイブリダイゼーショ ンさせた。パネル■の試料を、負鎖のプローブ混合物でハイブリダイゼーション させることによってプローブした。免疫プロット法に付したパネルの試料を表４ に示す。 表４ 第４１図の結果から分かるように、負鎖のＤＮＡプローブだけ−が、単離された ＨＣｖゲノムとハイブリダイゼーションする。 この結果は、ゲノムがＲＮａｓｅには感受性であるがＤＮａｓｅには感受性でな いという結果（ＩＶ、Ｃ，２，！ｆｌｉ参照）と併せて、　ＮＡＮＢＶのゲノム が玉鎖のＲＮＡであることを示唆している。 これらのデータと、推定上のＮＡＮＢＶの物理化学的性質に関する他の実験室の データは、　ＨＣＶがワラビウイルス科に属する可能性があることを示している 。しかし、　ｔｌｃＶが、新種のウィルス因子に相当する可能性も無視できなか った。 ＩＶ、　Ｈ，２，ＰＣＲテ　−　た８ム　り０−７８１　（７）ＨＣＶｃＤＮＡ とバイブ１　゛イゼーション　る　１　の　の■ 捕獲粒子のＲＮＡを、　ＩＶ、　Ｈ，１，節に記載したのと同様にして得た。ク ローン８１由来のＨＣＶ　ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションする塩基配列の分 析を、第１Ｖ、　Ｃ，３節に記載したのと同様にしてＰＣＲ増幅法を利用して行 ったが、ハイブリダイゼーシゴンプロープはクローン８１　ｃＤＮＡ塩基配列由 来のキナーゼで活性化されたオリゴヌクレオチドを用いた。試験結果は、増幅さ れた塩基配列がクローン８１由来のＨＣＶ　ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼ ーションすることを示した。 ＴＶ、Ｈ０３デング軌フラビウイルス　ＭＮＷＷＶＤＩ　のジ告タンパクと　３ ９Ｃに　入　れたクローン１４ｉのＯＲＦによ　てコードされる■Ｃｖポリペプ チドとの日の３９Ｇによって結合されたクローン１４ｉのＨＣＶ　ｃＤＮＡは、 第２６図に示すように一つの連続ＯＲＦを含有している。これにコードされたポ リペプチドを、デング熱フラビウイルス（ＭＮＷＶＤＩ）の非構造ポリペプチド の領域との配列相同性について分析した。この分析は、デイホッフ（Ｄａｙｈｏ ｆｆ　）のタンパクデータベースを用い、コンピュータで行った。結果を第４２ 図に示すが９図中、記号（：）は厳密な相同性を示し、記号（、）は塩基配列が 若干置換されていることを示し、ダッシュ記号は。 最大の相同性を得るため塩基配列中に挿入されたスペースを示す。この図から分 かるように、　Ｉ（ＣＶ　ｃＤＮＡにコードされた塩基配列と、デング熱ワラビ ウィルス非構造タンパクとの間には有意な相同性がある。第４２図に示す相同性 に加えて、　ｃＤＮＡの３゛末端の領域にコードされ゛たポリペプチドセグメン トには。 分析した結果、デング熱ポリメラーゼの塩基配列と相同性の塩基配列が含まれて いた。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対して必須であると考えられる標準的 なＧｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ　（ＧＤＤ　）配列が、　ＨＣＶ　ｃＤＮＡにコード されたポリペプチドに含まれ、その位置がデング熱２ウィルス内の位置と一致し ているということは重要なことである（データは記載していない）。 ２種の研究結果は、　ＨＣＶ−ＤＮＡが、　ＮＡＮＢＨに感染した個体由来の組 織内には検出できないことを示唆している。これらの結果は、　ＩＶ、Ｃ０とＩ Ｖ、　Ｈ，１，とＩＶ、　Ｈ，２，の各節に記載した結果と併せて、　ＨＣＶが ＤＮＡを含有するウィルスではなく、その複製にはｃＤＮＡを含まないｔいう証 拠を提供している。 ＩＶ、　）（，４，ａ、ヱエｌブ旦ヱ上ユＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの 肝臓が、検出可能な■ｃｖ−ＤＮＡ　（もしくはＨＣＶ−ｃＤＮＡ）を含有して いるが否かを決定するために、この起源から単離したＤＮＡの制限酵素による断 片をサザンプロット法に付して、プロット物を２２ｐで標識したＨＣＶｃＤＮＡ でプローブした。上記の標識したＨＣＶ　ｃＤＮＡは、感染チンパンジーの肝臓 由来のプロットされたＤＮＡとハイブリダイゼーションをしないという結果を示 した。また同じ標ｍｎｃｖ　ｃＤＮＡは、正常なチンパンジーの肝臓由来の対照 のプロットされたＤＮＡともハイブリダイゼーションをしなかった。これに対し て、陽性対照においては、β−インターフェロン遺伝子の標識したプローブが、 制御酵素で切断したヒト胎盤ＤＮＡのサザンフロット法に付したものと強くハイ ブリダイゼーションした。これらの系は、標識したプローブで検出すべき遺伝子 の単一コピーを検出するために設計された。 ＮＡＮＢＨに感染した２頭のチンパンジーの肝臓からＤＮＡを単離した。対照の ＤＮＡを、未感染のチンパンジー肝臓とヒト胎盤から単離した。ＤＮＡの抽出は 、基本的にはマニアティスら（１９８２年）の方法によって行い、そのＤＮＡ試 料は、単離工程中、　ＲＮＡ５ｅで処理した。 各ＤＮＡ試料は、メーカーの説明書に従って、　ＥｃｏＲＩ　、　Ｍｂｏｌまた は旧ｎｃＩ［（１２μｇ）で処理した。切断したＤＮＡを１％中性寒天ゲルで電 気泳動し、ニトロセルロース上にサザンプロットし１次いでプロットされた物質 は、適当なニックトランスレーションされたプローブｃＤＮＡとハイブリダイゼ ーションした（　３　Ｘ　１０’ｃｐｏ＋／　ａｊ！のハイブリダイゼーション ミックス）。 感染チンパンジーの肝臓と正常な肝臓由来のＤＮＡは、クローン３６と８１由来 の３２Ｐで標識したＨＣＶ　ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションし、またヒト胎 盤由来のＤＮＡはβ−インターフェロン遺伝子由来の３２Ｐで標識したＤＮＡと ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、プロットしたものを 、厳密条件下、すなわち、　０．Ｉ　Ｘ５ＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液を用 い６５°Ｃで洗浄した。 β−インターフェロン遺伝子ＤＮＡを、ホートンら（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　ｅｔ　 ａｌ）　（１９８１年）が記述しているのと同様にして調製した。 ＩＶ、Ｈ，４，ｂ、匹ｌ」江−ＬＬｌ幡ＨＣＶ−ＤＮＡが、　ＮＡＮＢＨに感染 したチンパンジーの肝臓内に検出できるか否かを決定するために、　ＤＮＡをそ の組織から単離し、プライマーとクローン８１のＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来のプロー ブポリヌクレオチドを用いて、　ＰＣＲ増幅検出法に付した。陰性対照は、未感 染ＨｅｐＧ２組織の培養細胞と、未感染と思われるヒト胎盤とから単離したＤＮ Ａ試料を用いた。陽性対照は、陰性対照にクローン８１由来のＨＣＶ　ｃＤＮＡ 挿入物の比較的少ない既知量（２５０分子）を添加した試料を用いた。 さらに、　ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの同じ肝臓から単離したＲＮＡ画 分が、　ＨＣＶ−ｃＤＮＡプローブに対して相補的な配列をもっていることを確 認するために、　ＰＣＲ増幅検出法を、単離したＲＮＡ試料にも用いた。 この研究では、　ＤＮＡはＩＶ’、Ｈ，４，ａ節に記載の方法で単離し、　ＲＮ Ａは、チャーギンら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８１年）が記述 しているのと同様にして抽出した。 ＤＮＡの試料を、２頭の感染チンパンジーの肝臓、未感染のＨｅｐＧ２細胞およ びヒト胎盤から単離した。各ＤＮＡの１μｇをメーカーの説明書にしたがってＨ ｉｎｄｌ［Ｉで切断した。逆転写酵素工程を省略したことを除いて、、ＴＶ、Ｃ ，３節に記載したのし、増幅したＨＣＶ　ｃＤＮＡを検出した。　ＰＣＲプライ マーとプローブは、　ＨＣＶ　ｃＤＮＡクローン８１由来のものであり、　ＩＶ 、Ｃ，３゜節に記載されている。増幅する前に、陽性対照については。 各ＤＮＡの試料１μｇは、クローン８１から単離したＨＣＶ　ｃＤＮＡ挿入物の ２５０分子を添加することによって「スパイク」された。 １（ＣＶ配列が、　ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの肝臓から単離したＲＮ Ａに存在しているか否かを決定するために、０．４　μｇの全ＲＮ＾を含有する 試料を、陰性対照試料のいくつかから逆転写酵素の工程を省略すること以外は、 　ＩＶ、Ｃ，３０節に記載したのと同様の増幅法に付した。ＰＣＲプライマーと プローブは、上記の記載と同様に、　ＨＣＶ　ｃＤＮＡクローン８１由来のもの であった。 その結果、　ＨＣＶ　ｃＤＮＡプローブに相補的な増幅された配列は。 感染チンパンジーの肝臓由来のＤＮＡ中には検出できず、また陰性対照にも検出 できなかった。これとは異なり、感染チンパンジーの肝臓由来のＤＮＡを含む試 料が増幅される前に１（ＣＶｃＤＮＡでスパイクされた場合、クローン８１の配 列がすべての陽性対照の試料に検出された。さらに、　ＲＮＡの研究では、増幅 されたＨＣＶ　ｃＤＮＡクローン８１の配列が、逆転写酵素を用いた時にのみ検 出されたが、これは、この結果がＤＮＡ汚染が原因でないことを強く示唆してい る。 これらの結果は、　ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジー由来の肝細胞が、　ＨＣ Ｖ　ＤＮＡを全く含有しないか、または・検出不可能なよれば、　ＨＣＶ　ＤＮ Ａが存在する場合、それは０．０６コピー／肝細胞よりはるかに低い濃度である 。これに対し、同じ肝臓試料由来の全ＲＮＡのＨＣＶ配列は、　ＰＣＲ法によっ て容易に検出された。 全試料を、　ＨＣＶ　ｃｌｏｏ−３ＥＬＩＳＡ法を用いて検定した。この検定法 は、　ＨＣＶ　ｃｌｏｏ−３抗原（ＩＶ、　８．　５節に記載したのと同様にし て合成し精製した）と、マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧのホースラディツシ ュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ　）複合体とを利用する。 ＨＣＶ　ｃｌｏｏ−３抗原でコートしたプレートを次のようにして調製した。コ ーティング緩衝液（５０ｄ　ホウ酸ナトリウム、　ｐｔｔ９．０　）　（７）２ １１Ｉ１１／プレート、　ＢＳＡ　（２５μｇ　／ａｄりおよびｃｌｏＯ−３（ ２，５０μｓ　／ｄ）を含有する溶液を、　Ｒｅｏ＋ｏｖｅａＴＩ４ｅｌｌ　Ｉ ＋＋ｍｕｌｏｎ■プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｃｏｒｐ、）に添加する直前に 調製した。 ５分間混合後、上記溶液０．２　ｄ／ウェルをプレートに添加した。プレートを カバーし２時間３７℃でインキュベートし１次いで溶液を吸引して除去した。ウ ェルを４００μｉの洗浄緩衝液（１００ｍ１Ｍす７酸＋　）　リウム（ｐＨ７， ４）　、　１４０　ｍＭ塩化ナトリウム、　ｏ、ｉ％（Ｗ／Ｖ）　カゼイン、１ ％（Ｗ／Ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，０１％（Ｗ／Ｖ）　Ｔｈｉｍｅ ｒｏｓａｌ）で１回洗浄した。洗浄液を除いた後。 後コート溶液２００μｌ／ウエル〔１抛Ｈリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２　）　 、　１５０　ｍＭ塩化ナトリウム、　０．１％（Ｗ／Ｖ）　、Ｉ！ＩＩゼインオ ヨび２ｍ＋？！フン化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）　）を添加し。 プレートをゆるくカバーして蒸発を防止し、室温で３０分間放置した０次にウェ ルから吸引して溶液を除き、保存加熱せずに一夜凍結乾燥した。得られたプレー トを、密封したアルミニウムパウチ内に２〜８°Ｃで貯蔵する。 ＥＬＩＳＡ法で決定するために、２ｏｕｐ、の血清試料または対照試料を、２０ ０μｌの試料希釈側〔１００■Ｈリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）　、　５００ 　ｍＭ塩化ナトリウム、１ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ　、　０．１％（Ｗ／Ｖ）カゼイン 、　０．０１５％（Ｗ／Ｖ）’Ｔｈｅｒｏｓａｌ）　、１％（Ｗ／Ｖ）　Ｔｒｉ ｔｏｎ　Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ　酵母エキス〕の入ったウェルに添加し た。プレートを密封し、３７℃で２時間インキュベートし、その後溶液を吸引し て除き、４００μｌの洗浄緩衝液（０，０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含有するリ ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）　）でウェルを洗浄した。洗浄したウェルを、２００ μ！のマウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を含有する。オルト複合体希釈剤（１ ０１１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，２）　、　１５０　ｍＭ塩化ナトリウム、 ５０％（Ｖ／Ｖ）胎仔ウシ血清、１％（Ｖ／Ｖ）熱処理ウマ血清、１　ｍＭ　Ｋ ｓＦｅ　（ＣＮ）４０．０５％（Ｗ／Ｖ）　Ｔｓｍｅｅｎ　２０．０．０２％（ Ｗ／Ｖ）　Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）の溶液で処理した。３７℃で１時間処理を行 い、溶液を吸引によって除去し。 ウェルを洗浄緩衝液で洗い、緩衝液を吸引で除去した。結合した酵素接合体の量 を測定するために、　２００　ｔｔ　ｊ！の基質溶液（１０■のＯ−フェニレン ジアミンニ塩酸塩１５ＩＩ１．の展開剤溶液）を添加した。展開剤溶液は、リン 酸によってｐＨ５，１に調節された５０ｗＭのクエン酸ナトリウムと、０．６μ ｍ７ｄｌの３０％Ｈ２０゜を含有している。基質溶液が入ったプレートを、暗所 内で。 ３０分間室温でインキュベート６９反応は５０μｍ７ｓｄの４Ｎ硫酸を添加して 停止させ、　００を測定した。 下記の実施例は、　ＨＣＶ　Ｃ１００−３抗原を利用するマイクロタイタープレ ートのスクリーニングＥＬＩＳＡ法が高い特異性を有することを示す。このこと は、初期反応率が約１％で２反復反応率が任意のドナーについて約０．５％であ ることによって証明されている。この検定法は、感染の急性期後および疾患の慢 性期の両方における免疫応答を検出することができる。さらに、この検定法は、 　ＮＡＮＢＨに対する代理試験についてマイナスの評価をされているい（つかの 試料を検出することができる。なおこれらの試料は、　ＮＡＮＢＨの病歴を持つ 個体またはＮＡＮＢＨ伝染に関係があるドナー由来のものである。 以下の実施例では２次の略号が用いられる。 ＡＬＴ　アラニンアミノ転移酵素 抗−ＨＢｃ　ＨＢｃに対する抗体 抗−ＨＢｓＡｇ　ｔｌＢｓＡｇに対する抗体ＨＢｃ　、　Ｂ型肝炎コア抗原 ＡＢｓＡｇ　Ｂ型肝炎表面抗原 ＩｇＧ　免疫グロブリンＧ ＩｇＭ　免疫グロブリンＭ Ｉ　１１／Ｌ　国際単位／ε ＮＡ　入手不能 ＮＴ　試験せず Ｎ　試料の大きさ Ｎｅｇ　陰性 ＯＤ　光学密度 Ｐｏｓ　陽性 Ｓ／Ｃｏ　シグナル／カットオフ ＳＤ　標準偏差 Ｘ　平均値 ＷＮＬ　標準限界内 ＩＶ、Ｉ、１．１　のドナー　・におけるＨＣＶＯ感任意のドナーから得た１　 、　０５６試料（新鮮な血清）を、　ＩｒｗｉｎＭｅｓ＋ｏｒｉａｌ　Ｂｌｏｏ ｄ　Ｂａｎｄ　（米国、カリフォルニア州、サンフランシスコ）から得た。これ らの試料によって得た試験結果を。 ＯＤ値の分布を示すヒストグラムにまとめる。（第４３図）。第４３図から分か るように、４試料が３より大きい値を示し、１試料が１と３の間、５試料が０． ４と１の間、および残りの１゜０４６試料が０．４より小さい値を示し、これら の試料の９０％以上が０．１より小さい。 反応性であった任意試料についての試験結果を表５に示す。 平均値＋５標準偏差に等しいカットオフ値を用いた場合、１゜０５６試料中の１ ０試料（０，９５％）が最初反応性であった。これらの試料中５試料（０，４７ ％）は、前記のＥＬＩＳＡ法を用いて２回目の検定を行ったところ繰り返し反応 性を示した。また表５は、繰り返し反応性を示した各試料に対してＡＬＴおよび 抗ＨＢｄ状態を示している。特に興味深いのは、繰り返し反応性であった５試料 全部が、　ＮＡＮＢＨに対する両代理試験で陰性であり、一方ＨＣＶ　ＥＬＩＳ Ａ法法では陽性であったということである。 （以下余白） 、表」− ひ　の　る　、旨の ４２２７　０．４６２　０．０８４　ＮＡ　ＮＡ６２９２　０．５６９　０．２ ９４　ＮＡ　ＮＡ６１Ｂ８　０．６９９　０．３２６　ＮＡ　ＮＡ６１５７　０ ．７３５　０．１８７　ＮＡ　ＮＡ６２７７　０．８８３　０．１５２　ＮＡ　 ＮＡ６３９７　１．５６７　１．３９２　３０．１４　１．４３３６０１９　＞ ３．０００　＞３．０００　４６．４８　１．０５７６６５１　＞３．０００　 ＞３．０００　４８．５３　１．３４３６６６９　＞３．０００　＞３．０００ 　６０．５３　１．１６５４００３　＞３．０００　３．０００　ＷＮＬ’″川 　陰性１０／１０５６＝０．９５χ５／１０５６＝０．４７χ１　平均値および ＳＯを計算する際には、　＞１．５を示す試料を考慮しなかった。 ”　ＡＬＴ２６８１Ｕ／Ｌは正常値の範囲を越えている。 −申−抗ＨＢｃｘ０．５３５（競合検定法による）は陽性であると考えられる。 一傘一　讐ＮＬ：正常値の範囲内。 ＩＶ、１．２．チンパンジー　ゞ°′・１１匹のチンパンジーから得た血清試料 を、　ＨＣＶ　ｃｌｏｏ−３を用いたＥＬＩＳＡ法により試験した。これらのチ ンパンジーのうち４匹には、疾患管理センター（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏ ｒ　ＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ　）のＤａｎｉｅｌ　Ｂｒａｄｌｅｙ博士と 共同して確立された方法に従って、第■因子の汚染バッチに由来するＮＡＮＢＨ （おそらくは、ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）株であると推測される） を感染させた。対照として、他の４匹のチンパンジーにはＢＡＶを、そして３匹 にはＨＢＶを感染させた。血清試料は、感染後の様々な時期に採取した。 これらの結果は２表６に要約されているが、ハッチンソン株のＮＡＮＢＨに感染 させたすべてのチンパンジーにおいて実証された抗体の血清転換を示している。 感染の急性期（ＡＬＴレベルが有意に上昇し、続いて正常レベルに戻ることから 示される）の後は、　ＨＣＶ　ｃｌｏｏ−３に対する抗体がＮＡＮＢＨに感染さ せた４匹のチンパンジーのうち４匹の血清中で検出し得るようになった。これら 試料は、すでにＩＶ、８．３節で考察したように。 ウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析および放射性免疫検定法（ＲＩＡ）により陽 性であることが示されている。これとは対照的に。 ＨＡＶまたはＨＢＶに感染させた対照のチンパンジーはＥＬＩＳＡ法における反 応性を示した。 （以下余白） ｌ旦 チノパンツー血パ−。 ｌ旦 長並鵠１や徂 コードされたパネルは、２２個の独自の試料から構成されていた。ただし、これ らの試料は、各々につき二重検定を行うので１合計で４４個であった。これらの 試料は、慢性ＮＡＮＢｆｌキャリアから得た保証感染性血清、関係供血者から得 た感染性血清、および急性ＮＡＮＢＩＩ患者から得た感染性血清からのものであ った。さらに、非常に由来が明確な陰性対照群、および他の疾患対照群からも試 料を得た。このパネルは９国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙ−１ａｎｄ）の Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅ部のＨ，Ａｌｔｅｒ博士か ら提供された。このパネルは、数年前にＡｌｔｅｒ博士により構築され、推定Ｎ ＡＮＢＨ検定の適合パネルとして、　Ａｌｔｅｒ博士により使用されてきた。 上記の全パネルをＥＬＩＳＡ法で２度分析し、その結果を評価するためにＡ　ｌ 　ｔｅｒ博士に送付した。評価の結果を表７に示す。 この表には、二重検定の一方の組の結果が示されているが。 二重検定試料の各々について同じ値が得られた。 表７に示すように、チンパンジーモデルにおいて感染性であると証明された６個 の血清は非常に陽性であった。７番目の感染性血清は、急性ＮＡＮＢＨの場合の 試料に対応しており。 このＥＬＩＳＡにおいて反応性ではなかった。正常ＡＬＴレベルを有し、かつチ ンパンジーでの研究結果が不明確であった関係供血者から得た試料は、上記の分 析において反応性ではなかった。急性ＮＡＮＢＨの１個体から得た３個の他の一 連の試料も反応性ではなかった。非常に由来が明確な陰性対照群からの全ての試 料は、少なくとも１０回の献血で肝炎の疑いがなかった供血者から得たものであ るが、上記のＥＬＩＳＡにおいて反応性ではなかった。最後に、検査試料のうち ４個は、他人により開発された推定ＮＡＮＢＨ検定において陽性であると以前は 評価されていたが、これらの分析では確定できなかった。これらの４個の試料は 上記のＨＣＶ　ＥＬＩＳＡ法では陰性と判定された。 麦エ パネル　結果１　結果２ ＩＶ、１．４．パネル２：　風　のＮＡＮＢＨ前記のコードされたパネルは、輸 血に関連するＮＡＮＢＨについて供血者および受血者が明確な１０事例からなり 、試料の合計は１８８であった。各事例は、受血者に対する数人またはすべての 供血者の試料、およびこの受血者から得た（輸血後。 ３力月、６カ月、および１２力月目に採血した）一連の試料からなるものであっ た。また、輸血前に予め受血者から採血された血液試料も含まれていた。コード されたパネルは、　ＮＩＨのＨ，Ａｌｔｅｒ博士により提供されたものであり、 結果は評価を行うために同博士へ送付した。 これらの結果は１表８に要約したが、　ＥＬＩＳＡ法により、輸血に関連するＮ ＡＮＢＨの１０事例のうち９事例において、抗体血清転換が検出されたことを示 している。事例４の試料（血清転換が全（検出されなかった）は、前記ＥＬＩＳ Ａ法において。 −貫して反応性に乏しかった。１０個の受血者試料のうち２個は、輸血後３力月 で反応性があった。１２力月では、事例４を除いて、すべての試料が反応性であ った。さらに、少なくとも１人の抗体陽性供血者が１０事例のうち７事例に見い 出され。 事例１Ｏには２人の陽性供血者が存在した。また、事例１０では。 輸血前に採血した受血者の血液はＨＣＶ抗体について陽性であった。二〇受血者 から得た１力月目の採血試料は反応性レベルの境界線まで低下したが、４力月お よび１０力月目の採血試料では陽性レベルにまで上昇した。一般に、　Ｓ／Ｃｏ が０．４であれば、陽性であると考えられる。従って、この事例では１個体が事 前にＨＣＶ惑染感染いたことを示している。 反応性である（すなわち、陽性である）すべての試料に対するＡＬＴおよびＨＢ ｃの状態を表９に要約する。この表から明らかなように、供血者試料の１７８は １代理マーカーに対しては陰性であったが、　ＨＣＶ抗体ＥＬＩＳＡ法では反応 性であった。 他方、受血者試料（輸血後１２力月まで引き続き採血された）は、高いＡＬＴを 有するか、または抗ＨＢｃが陽性であるか、あるいはその両方であった。 （以下余白） 紅 のＮＡＮＢパ　ル Ｈ，ＡＬＴＥＲの　のＮＡＮＢパ　ル 並　Ｍ岨　」ＬＭ印　００　Ｓ／並　並　鉦並　」Ｌ　鉦並１、　−−−　−− −　．０３２　０．０？　、１１２０．２６　＞３．０００　＞６゜９６　＞３ ．０００　＞６．９６２、　−−−　−−−　．０５９　０．１４　．０５０　 ０．１２　１．６８１　３．９０　＞３．０００　＞６．９６３、　．４０３　 ０．９４　．０４９　０．１１　．０５？　０．１３　＞３．０００　＞６．９ ６　＞３．０００　＞６．９６４、　−−−　−−−　．０６５　０．１５　． ０７３　０．１７　．０６７　０．１６　．２１７　０．５０５、　＞３．００ ０　＞６．９６　．０３４　０．０Ｂ　、０９６　０．２２　＞３．０００　＞ ６．９６　＞３．０００　＞６．９６６、　＞３．ＱＱＱ　＞６．９６　．０５ ６　０．１３１．４７５　３．４４　＞３．０００　＞６．９６　＞３．ＯＯＱ 　＞６．９６７、　＞３．０００　＞６．９６　．０３４　０．０Ｂ　、８５６ 　０．１３　＞３．０００　＞６．９６　＞３．０００　＞６．９６８、　＞３ ．０００　＞６．９６　．０６１　０．１４　．０７８　０．１Ｂ　２．２６２ 　５．２８　＞３．０００　＞６．９６９、　＞３．０００　＞６．９６　．０ ８０　０．１９　．１２７　０．３０　．０５５　０．１３　＞３．０００　＞ ６．９６１０、　＞３．０００　＞６．９６　＞３．０００　＞６．９６　．３ １７”　０．７４　＞３．０００”＞６．９６　＞３．０００””＞U．９６ ＞３．０００　＞６．９６ ０１力月、　−４力月、　′″′″１１０カ月試料　抗ＡＬＴ”　ＨＢｃ” 但」〔１ 訊皇宣 １Ｖ、１．５．３ｉｌｔ！　−グループの−°ｚにお番る８Ｃｖ感仇）゛高危険 率グループから得られた試料は、　）ＩｃＶ　ｃｌｏｏ−３抗原に対する反応性 を決定するＥＬＩＳＡ法を用いてモニターされた。 これらの試料は、　Ｇａｒｙ　Ｔｅｇｔｍｅｉｅｒ博士（Ｃｏ＋＋＋＋ｎｕｎｉ ｔｙ　ＢｌｏｏｄＢａｎｋ、　Ｋａｎｓａｓ　Ｃ１ｔｙ　）から得られた。結果 を表１０に要約する。 この表に示されているように１反応性の最も高い試料は。 血友病者から得られる（７６％）、さらに、　ＡＬＴが上昇し、抗ＨＢｃについ て陽性の個体から得られた試料は、５１％が反応性であると評価されたが、この 値は、臨床データから予想される値と一致しており、このグループ内にはＮＡＮ ＢＨが流行していた。ＨＣＶに対する抗体の発生率は、　ＡＬＴが高いだけの供 血者、Ｂ型肝炎コアに対する抗体について陽性であるだけの供血者、そして任意 の志願供血者に比べてＡＬＴが高いか、あるいは抗コア抗体を有するということ 以外の理由で拒否された供血者においても高かった。 （以下余白） １刊 ＮＡＮＢＩＩ　グループの　・ 抗ＨＢｃ　２４　５　＞３．０００　２０．８χ拒否された供血者　２５　５　 ＞３．０００　２０．０χＩＶ、１．６．　ＨＣＶ　ｃｌｏｏ−３ＥＬＩＳＡ　 におしる　２　として　■Ｇいた　・・　六 抗ＩｇＧモノクローナル複合体を用いたＥＬＩＳＡ法の測定感度は、抗１ｇＭモ ノクローナル複合体を用いるか、あるいはこれら両者をＨ鎖およびＬ鎖の両方に 特異的であると報告されたポリクローナル抗血清で置き換えることにより得られ る測定感度と比較された。以下の研究が行われた。 ＩＶ、１．６．ａ、’　−、−’目゛れたー・の−。 ＮＡＮＢ血清転換者の３つの事例から得られた一連の試料を。 ＨＣＶ　ｃｌｏｏ−３ＥＬＩＳＡ法で研究した。、：　（７）ＥＬＩＳＡ法では 、酵素複合体に抗ＩｇＧモノクローナル抗体だけを用いるか、または抗ＩｇＧモ ノクローナル抗体と組合わせて用いるか、あるいはポリクローナル抗血清を用い た。これらの試料は、　Ｃ１ａｄｄ　５ｔｅｖｅｎｓ博士（Ｎ、Ｙ、　Ｂｌｏｏ ｄ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎ、Ｙ、Ｃ，、Ｎ、Ｙ、）により提供された。試料の歴史を 表１１に示す。 抗ＩｇＧモノクローナル抗体−酵素複合体を用いて得られた結果を表１２に示す 、これらのデータは、事例１，２．および３の各試料１−４．２−８．および３ −５において、最初に強い反応性が検出されることを示している。 抗ＩｇＧモノクローナル複合体および抗Ｉｇｌ’！複合体の組合わせを用いて得 られた結果を表１３に示す。抗１ｇＭに対する抗ＩｇＧの３つの異なる割合で試 験した；抗ＩｇＧの希釈率１　：　１０．０００は終始一定であった。抗１ｇＭ モノクローナル複合体の試験された希釈率は、１　：３０，０００．　１　：６ ０，０００．および１　：　１２０．０００であった。これらのデータは、抗Ｉ ｇＧだけを用いた研究と同様に、試料１−４．２−８．および３−５において、 最初の強い反応性が検出されることを示している。 抗ＩｇＧモノクローナル複合体（希釈率１　：　１０，０００）　、またはＴａ ｇｏポリクローナル複合体（希釈率１　：　８０．０００）　、あるいはＪａｃ ｋｓｏｎポリクローナル複合体（希釈率１　：８０．０００）を用いたＥＬＩＳ Ａ法で得られた結果を表１４に示す。これらのデータは、３種類の形態をすべて 用いると、試料１−４．２−８．および３−５において、最初の強い反応性が検 出されることを示している：　Ｔａｇｏのポリクローナル抗体は最も低いシグナ ルを与えた。 上に与えた結果は、　（ＡＬＴ上昇により明らかとなる）疾患の急性期後の同時 期に、３種類の形態により９反応性の試料が検出されることを示している。また 、これらの結果は、抗ＩｇＧモノクローナル−酵素複合体を用いたＨＣＶ　ｃｌ ｏｏ−３ＥＬＩＳＡ法の感度が、該酵素複合体について試験された他の形態と同 等またはそれ以上であることを示している。 （以下余白） ノＵユ Ｃ１ａｄｄ　５ｔｅｖｅｎｓのパネルか′た゛　・のｉ゛皇■上 ！■主 塵」［影 川 跋葺　旦付　肚　並　Ｓ／Ｃ０ 亨ｊ口Ｌ１ １１口り亀 杢ｊ口Ｌ１ 表井 棗■左上 棗例Ｕ又 事別皇主　− 衷■ ポリクロ−ル　人　を　いて′＝゛れたＥＬＩＳＡ法の！医ｕよ ！例皇呈 ！惺互主 ＩＶ、１．６．ｂ、　の　か゛”ｉｎ、ｆ、−’任意抽出の供血者から得られた 試料（ＩＶ、１．１．節参照）を。 ＨＣＶ感染ニツイテ、　ＨＣＶ　ｃｌｏｏ−３ＥＬＩＳＡ法によリスクリーニン グした。このとき、抗体−酵素複合体は、抗ＩｇＧモノクローム複合体またはポ リクローナル複合体のいずれかであった。 スクリーニングされた試料の総数は、ポリクローナル複合体およびモノクローナ ル複合体に対して、それぞれ１０７７個および１０５６個であった。スクリーニ ング結果の要約を表１５に示す。 また、試料の分布を第４４図のヒストグラムに示す。 平均値および標準偏差の計算は、シグナルが１．５を超えるような試料を除いて 行った。すなわち、ポリクローナル複合体を利用した場合の計算には１０７３個 のＯＤ値を用い、抗１ｇＧモノクローナル複合体を利用した場合の計算には１０ ５１個のＯＤ値を用いた。表１５から明らかなように、ポリクローナル複合体を 用いた場合には、平均値が０．０４９３から０．０９３１にシフトし。 標準偏差は０．０７４から０．０９３３に増加した。また、これらの結果は、ｘ ＋５ＳＤという基準を用いて分析のカットオフ値を定義すれば、　ＥＬＩＳＡ法 におけるポリクローナル酵素複合体の形態が、より高いカットオフ値を必要とす ることを示している。 このことは、モノクローナル系に比べて分析特異性が低いことを示している。さ らに、第４４図のヒストグラムから明らかなように、抗１ｇＧモノクローナル複 合体を用いたＥＬＩＳＡ法で任意抽出の供血者をスクリーニングした場合には、 市販のポリクローナル標識を用いた分析に比べて、陰性および陽性の結果の分布 間が大きく分離する。 ｌ■ 壬５、の　か′＝°れた゛　−Ｓにおしる２　のＥＬＩＳＡ　ンしの　六 試料数　１０７３　１０５１ 平均（ｘ）　０．０９３１　０．０４９２６標準偏差（ＳＤ）　０．０９３３　 ０．０７４２７５　ＳＤ　Ｏ，４６６６０，３７１４ 高いＡＬＴ値に基づくとＮＡＮＢＨ保持の疑いがあるが、　ＨＡＶおよびＨＢＶ 試験においては陰性である患者から得られた血清を。 ＨＣＶ　ｃｌｏｏ−３抗原をマイクロクイタープレートのスクリーニング抗原と して用いたこと以外は実質的にＴＶ、Ｄ、節で述べたように、　ＲＩＡ法を用い てスクリーニングした。表１６に示された結果から明らかなように、　ＲＩＡに より、陽性試料が高い割合で検出された。 （以下余白） 紐 なる　のＮＡＮＢＨｐｑ　日の　ｃｌｏｏ−３に・する血ゝ六　の国　オランダ 　イタリア　日本 検査数　５　３６　２６ 陽性数　３　２９　１９ 明白でない（すなわち、輸血、静脈注射による薬剤使用。 乱婚などが危険因子として同定されない）１００人のＮＡＮＢＨ患者から得た血 清は、　Ｍ、　Ａｌｔｅｒ博士（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓ ｅＣｏｎｔｒｏｌ　）およびＪ、　Ｄｉｅｕｓｔａｇ博士（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供された。これらの試料を、　ＨＣＶ　ｃｌｏｏ− ３抗原をマイクロタイタープレートに付着させるスクリーニング用抗原として用 いたこと以外は実質的にＩＶ、Ｄ、節で述べたように、　ＲＩＡ法を用いてスク リーニングした。得られた結果は、１００個の血清試料のうち５５個の試料が、 　ＨＣＶ　ｃｌｏＯ−３抗原と免疫学的に反応する抗体を有することを示した。 上述の結果は、「集団獲得型Ｊ　ＮＡＮＢＨもまた。　ＢＣＶにより引き起こさ れることを示唆している。また、　ＢＣＶがフラビウィルス属（その大部分は節 足動物により伝染する）と関係のあることがここで示されているので、「集団獲 得型」の場合におけるＨＣＶの伝染もまた９節足動物による伝染に起因すること が示唆される。 ■ル、　ＮＡＮＢＨの云洗に矢　、の　る　のＨＣＶ　および゛マーカーの　の 　へ ＮＡＮＢＨ陽性の疑いのある供血者から輸血され、　ＮＡＮＢＨとなった受血者 が、抗ＨＣＶ抗体陽性に血清転換するかどうかを決定し得る見込みがある研究を 実施した。ＮＡＮＢＨ感染のマーカーとして現在使われている代用マーカー（す なわち、高いＡＬＴ値および抗コア抗体の存在）の異常について供血者を試験し た。さらに、抗ＨＣＶ抗体の存在についても供血者を試験した。 抗１（ＣＶ抗体の存在は、　ＩＶ、に、節で述べた放射性免疫検定法を用いて決 定した。この研究の結果を表１７に示す。この表には以下の項目が示されている ：患者の番号（第１列）；患者の血清中における抗ＨＣＶ抗体の存在（第２列） ；患者の輸血回数、各輸血は異なる供血者によるものである（第３列）；供血者 の血清中における抗ＨＣＶ抗体の存在（第４列）；そして。 供血者の代用マーカーの異常（第５列）　（ＮＴ、すなわち・・・試験していな いことを意味する）　（ＡＬＴは高いトランスアミナーゼであり、抗ＨＢｃは抗 コア抗体である）。 表１７の結果は、　ＨＣＶ抗体試験が、感染供血者を検出するのに９代用マーカ ー試験より正確であることを示している。　ＮＡＮＢＨの症状を示す１０人の患 者のうち９人を試験したところ、抗ＨＣＶ抗体血清転換に関して陽性であった。 陽性の疑いのある１１人の供血者のうち（ＮＡＮＢ）Ｉキャリアである疑いのあ る２人の別々の個体から輸血されたのは患者６であるカリ、９人は抗ＨＣＶ抗体 に関して陽性であり、１人は陽性の境界線上であり、（患者１に対する供血者は ）不明確であった。これに対し、高ＡＬＴ試験を用いると、１０人の供血者のう ち６人が陰性であり。 抗コア抗体試験を用いると、１０人の供血者のうち５人が陰性であった。しかし ながら、非常に重要なことは、３つの場合（患者８．．１者９．および患者１０ に対する供血者の場合）において、　ＡＬＴ試験および抗ＨＢｃ試験の結果が一 致しなかったことである。 （以下余白） ＩＶ、Ｍ、フービウイルスの゛ツム　の　１　１゛銖　れたＰＣＲおよびプーイ マ−１したＨＣＶ　ｃＤＮＡこ　のクローニｌ久夙壇彊 ＨＣＶがフラビウイルスまたはワラビ様ウィルスであることを示唆している上記 の結果は、　ＰＣＲ技術と、フラビウイルスの保存アミノ酸配列をコードする領 域から誘導されたプライマーとを利用して、特徴付けられていないＨＣＶ　ｃＤ ＮＡ配列をクローニングすることを可能にする。一般に、プライマーの一方は定 義されたＨＣＶゲノム配列から誘導され、配列決定されていないＨＣＶポリヌク レオチド領域に隣接する他方のプライマーはフラビウイルスゲノムの保存領域か ら誘導される。フラビウイルスゲノムは、フラビウイルスゲノムの５′側領域に コードされるＮＳＩポリペプチドおよびＥポリペプチド内に保存配列を有するこ とが知られている。これらの領域をコードする対応配列は、第２６図に示すＨＣ Ｖ　ｃＤＮＡ配列の上流にある。 従って、　ＨＣＶゲノムのこの領域から誘導されたｃＤＮＡ配列を単離するには 、これらのワラビウイルスボリペプチド内の保存配列から誘導される上流プライ マーが設計される。下流プライマーはＨＣＶ　ｃＤＮＡの既知部分の上流側端部 から誘導される。 コードが縮重しているので、フラビウィルスプローブと。 対応するｎｃｖゲノム配列との間には不一致が存在し得る。従って、　Ｌｅｅ（ １９８８）により述べられた方法と同様の方法を用いる。　Ｌｅｅの方法は、ア ミノ酸配列の逆転写産物に相補的な混合オリゴヌクレオチドプライマーを利用す る：混合プライマーの配列は保存アミノ酸配列に関するすべてのコドン縮重を考 慮したものである。 ３組のプライマー混合物は、デング熱−２，４ＣＤ−２，４）、日本脳炎（ＪＥ Ｖ）、黄熱病（ＹＦ）　、および西ナイルウイルス（ＷＮ）を包含する数種のワ ラビウイルスに見い出されるアミノ酸相同性に基づいて生じたものである。最も 上流の保存配列から誘導されたプライマー混合物（５”−１）はアミノ酸配列ｇ ｌｙ−ｔｒｐ−ｇｌｙに基づいており、このアミノ酸配列は、　Ｄ−２Ｐ　ＪＥ Ｖ。 ＹＥ、およびＫＮのＥタンパク中に見い出される保存配列ａｓｐ−ａｒｇ−ｇｌ ｙ−ｔｒｐ−ｇｌｙ−ａｓｐＮの一部である０次のプライマー混合物（５’−２ ）はＥタンパク中にある下流保存配列ｐｈｅ−ａｓｐ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｓｅｒ −ｔｙｒ−ｉ　ｌｅｕ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−１１ｅｕに 基づいており！ｐｈｅ−ｇｌｙ−ａｓｐから誘導される：保存配列は、　Ｄ−２ ，ＪＥＶ、　ＹＥ。 および−Ｎに存在する。第３のプライマー混合物（５’−３）はアミノ酸配列ａ ｒｇ−ｓｅｒ−ｃｙｓに基づいており、このアミノ酸配列は、　Ｄ−２，Ｄ−４ ，ＪＥＶ、　ＹＦ、および−Ｎ（７）ＮＳＩタンパク中にある保存配列ｃｙｓ− ｃｙｓ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｃｙｓの一部である。５”−３中で混合物を形成する 各プライマーを第４５図に示す。保存領域から誘導された様々な配列に加えて、 各混合物中の各プライマーもまた。制限酵素）１ｉｎｄｌＩ［、Ｍｂｏｌ、およ びＥｃｏＲＩに対する部位をコードする配列を含む５”末端の定常領域を有する 。 下流プライマー５ｓｃ５ｈ２０Ａはクローン５ｈのヌクレオチド配列から誘導さ れており、この配列はクローン１４ｉおよびｌｌｂの配列と重複する配列を有す るＨＣＶ　ｃＤＮＡを含む。５ｓｃ５ｈ２ＯＡの配列は。 ５’　ＧＴＡ　ＡＴＡ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡ　３’である。 他方のプライマー５ｓｃ５ｈ３４Ａもまた。使用し得る。このプライマーはクロ ーン５ｈの配列から誘導され、さらに制限酵素部位を形成する５゛末端のヌクレ オチドを有する。従って。 クローニングが容易になる。５ｓｃ５ｈ３４Ａの配列は。 ５’　ＧＡＴ　ＣＴＣＴＡＧ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＧＧＴ　ＧＡ ＣＡＧＡ　ＧＴＣＡ　３’である。 ５ａｉｋｉら（１９８６）により最初に述べられたＰＣＲ反応は、　ｃＤＮＡの 鋳型が、　ＩＶ、Ｃ，２，節で述べたようにＨＣＶ惑染感染チンパンジーの肝臓 から単離されたＲＮＡであるか、あるいはＩＶ、Ａ、１゜節で述べたようにＨＣ Ｖ感染したチンパンジー血清から単離されたウィルス粒子から単離されたＲＮＡ であること以外は、実質的にＬｅｅら（１９８８）が述べたようにして行われる 。さらに。 アニール条件は第１回目の増幅ではあまり厳密でなくてもよい（０，６Ｍ　Ｎａ Ｃ１，および２５℃）、なぜなら、　ＨＣＶ配列とアニールするプライマ一部分 は、わずか９個のヌクレオチドであり一９不一致が存在し得るからである。また 、　５ｓｃ５ｈ３４Ａを用いた場合には、　ＨＣＶゲノムから誘導されなかった 付加配列はプライマー−鋳型ハイブリッドを不安定化する傾向がある。第１回目 の増幅後は、アニール条件は非常に厳密である（０．０６６ＭＮａＣ１，および ３２−”Ｃ〜３７°Ｃ）。なぜなら、増幅される配列は。 この段階では、プライマーに相補的な領域またはプライマーの重複部分である領 域を有するからである。さらに、最初の１０サイクルの増幅は、クレノー酵素■ を用い、この酵素に適したＰＣＲ条件下で実施される。これらのサイクルが完了 した後、試料を抽出し、Ｃｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒにより供給され ているキット指示書に従って、　Ｔａｇポリメラーゼで処理する。 増幅後、増幅されたＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列は、クローン５ｈから誘導されたプロ ーブを用いたハイブリダイゼーションにより検出される。このプローブは、プラ イマーを誘導するのに用いた配列の上流にある配列から誘導されるが、プライマ ーを誘導したクローン５ｈの配列とは重複しない。このプローブの配列は。 ５’　ＣＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＡ　ＣＧＣＧＣＴ　ＧＧＡ　ＣＡＣＧＧＡ　ＧＧ Ｔ　ＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧ　ＴＧＧ　ＣＧＧ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＴＣＴ　Ｃ ＧＴ　ＣＧＧ　ＧＴＴ　ＧＡＴ　ＧＧＣＧＣ３”である。 皮粟上皇息里性 本発明は、ここに開示された様々な表現で、多くの産業上の用途を有する。これ らの用途のいくつかは次のとおりである。）ＩＣＶ　ｃＤＮＡは、試料中のＨＣ Ｖ核酸を検出するためのプローブの設計に用いられる。ｃＤＮＡから誘導された プローブは９例えば化学的な合成反応においてＨＣＶ核酸を検出するのに用いら れる。これらのプローブはまた。培養細胞系または動物モデル系においてウィル スの複製を阻害する際に抗ウィルス剤の効果を決定するためのスクリーニングプ ログラムに用いられる。ＨＣＶポリヌクレオチドプローブは、ヒトにおいてウイ ルス核酸を検出するのにも有用であり、従ってヒトにおけるＨＣＶ感染の診断薬 の主成分として役立ち得る。 上記のことに加えて、ここで与えられるｃｌ）ＨＡは、　ＨＣＶの、エピトープ を有するポリペプチドを合成するための情報および手段を提供する。これらのポ リペプチドはＨＣＶ抗原に対する抗体を検出するのに有用である。ＨＣＶ惑染感 染する一連の免疫検定法は、　ＨＣＶエピトープを有する組換え体ポリペプチド に基づくものである。これらの免疫検定法は、ここで説明されており、　ＮＡＮ ＢＨを誘発するｎｃｖを診断したり、　ｔｉｃｖにより引き起こされる伝染性肝 炎について血液銀行における供血者をスクリーニングしたり、また伝染性の供血 者に由来する汚染された血液を検出したりする産業上の用途が見い出される。 ウィルス抗原はまた。動物モデル系における抗ウィルス剤の効力をモニターする のにも有用である。さらに、ここに開示されたＨＣＶ　ｃＤＮＡから誘導された ポリペプチドは、　ｎｃｖ惑染感染置するためのワクチンとして有用である。 ＨＣＶ　ｃＤＮＡから誘導されたポリペプチドは、上述の用途の他にも、抗ＨＣ Ｖ抗体を生じさせるのにも有用である。−従らて。 これらのペプチドは抗ＨＣｖワクチンに使用され得る。しかしながら、　ＨＣＶ ポリペプチドで免疫した結果、生産される抗体もまた。試料中のウィルス抗原の 存在を検出するのに有用である。従って、これらのペプチドは、化学系における ＨＣＶポリペプチドの生産を分析するために用いられ得る。抗ｎｃｖ抗体はまた 。抗ウィルス剤が組織培養系で試験されるスクリーニングプログラムにおいて、 これらの抗ウィルス剤の効力をモニターするのに用いられる。これらの抗ＨＣＶ 抗体はまた。 受動免疫療法や、供血者および受血者の両方においてウィルス抗原を検出するこ とにより、　ＮＡＮＢＨを引き起こすＩ（ＣＶを診断するのにも用いられる。抗 ＨＣＶ抗体の他の重要な用途には。 ウィルスおよびウィルスポリペプチドを精製するためのアフィニティークロマト グラフィーにおける使用がある。精製されたウィルスおよびウィルスポリペプチ ドの調製物はワクチンに用いられ得る。しかしながら、精製されたウィルスはま た。　ＨＣＶを複製する細胞培養系の開発に有用である。 ＨＣＶに感染した細胞を有する細胞培養系は多くの用途を有する。これらの細胞 培養系は９通常は力価の低いウィルスである［（ＣＶの比較的大規模な生産に用 いられ得る。これらの培養系はまた。このウィルスの分子生物学的な解明にも有 用であり、抗ウィルス剤の開発をもたらす。これらの細胞培養系はまた。抗ウィ ルス剤の効力をスクリーニングする際にも有用である。さらに、　ＨＣＶ許容性 の細胞培養系は９弱毒化したＨＣＶ株の生産に有用である。 便宜的には、抗ＨＣＶ抗体およびＨＣＶポリペプチドは、天然物であっても組換 え体であっても、キットに組み込まれ得る。 ＨＣＶ　ｃＤＮＡを単離するのに用いられる方法は１個体の感染組織から誘導さ れたｃＤＮＡライブラリーを発現ベクター中に調製すること、および非感染個体 ではなく他の感染個体に由来する抗体含有身体構成成分中の抗体と免疫学的に反 応する発現産物を生産するクローンを選択することを包含する。この方法は、ゲ ノム成分からなる。これまで特徴付けられていない他の疾患関連因子から誘導さ れたｃＤＮＡの単離にも適用できる。 この方法により９次には、これらの因子が単離され、かつ特徴付けられ、またこ れらの他の疾患関連因子に対する診断用の薬剤およびワクチンがもたらされ得る 。 ＣＩＮＡター１−１　の翻話 ）”ＩＧＵＲＥ　１ ＤＮＡ　ｆ−１−１、Ｐ＋　、　Ｐ＋　、ｋ！Ｗ’　／−２＃　翻’ｉｇｆ。 ＦＩＧＵＲＥ　３ ＤＮＡ　Ｂ１の翻９訊 ＦＩＧＵＲＥ　４ ＤＮＡ　３６の＠羽訣 ＦＩＧ因ε　５ ｆ）ＮＡＡｓｘド°２１の経会ＱＲＦ ＤＮＡ　３２　ｅｈ　劃１　言及 ＤＮ＾３５の楢′８ｇ１ ｒ工ＧＵＲＥ　８ Ｃ））ＪＡ　３ｒ、　３＆／　ｔｒ、　Ｈｉｈ”３２　ｔｙｚ　Ｐ−合ＤＦＦＦ ＩＧＵＲＥ　９ ＦＩＧＬＩＲＥ　９　（クゲ？） ｐＮＡ　３ワｈの番羽言及 Ｆ工ＧＵＲＥ　１０ Ｃ）ＮＡ　３３　ｂ　ノｔｒｔＪ　ｔｌＦＩＣｒｕＥＥ　／７ ＤＮＡ　４０ｂ　ｆｆｉ　４羽ｔｉ− ｒ工ＧＵＲＥ　１２ ＤＮＡ　２Ｓｃ　ｅ　書羽畜Ｌ ＦＩＧじＲＥ１３ ＤＮＡ　４Ｄｂ／３１１）／ｊｒ／　ｊ４／　ＰＩ　／３２／　３３ｂ／　２Ｆ Ｃ−ａ　島’Ｑ’　ｏ＊ＦＦＩＧ、　１４−３ ｐにλ　ココＣΦ＃ｙｉ尺 り鳳、ａｈの副１１尺 ＦＩＧＵ只Ｅ１６ ｒ工ＧＴＪＲＸ　１７ ＤＮＡ　１４ｃ　ｒ＋　１羽訳 ｒｚｃＵ社１８ Ｃ）ＦＪ、４　＠ｆめ釦ｊ江 ｒ）ｒＪＡ　３３子ｃ９ｔｌｌｔＫ しＦＪＡ　３相／＋１陶１！尺 ＦＩＧＵλＥ２１ ＤＮＡ　７ｆ　６１訓：Ｉ訳 ＦＩＧＬＩＲＥ　２２ ＩＸＡ　ｌｌｂ　の＃Ｉり言メ５ ＤＮＡ　１４１の側１言尺 ＤＮＡ　３９ｃ　ｙ）＄ｐｌｑ　＠ｌ！。 ＦＩＧＬ！ＲＥ　２５ ＤｈＪＡ　１４１／ｌｌｂ／７ｆ／７ｅ／８ｈ／３３ｃ／４０ｂ／３７ｂ／コ５ ／３６／８１／３２／３３ｂ／２５ｃ／１４ｃ／Ｉｌｆ／３Rｆ／３３ｇ／コ９ ｃ Φ、シ台合ＯＲＦ ＧＬｙＭｅｔＶａｌＳｅｒＬ７ｓｃ１ｙｒｒｐＡｒｑＬｅｕＬｅｕＡｌａＰｒｏ 　！ｌｅτｈｒｕａＴｙｒＡＬａＧｌｎＧＬｎτ階＊ｏ１　ｙｃｃｍ高π式高部 式απ刀ｇで＝改ポ刀ｃｃｃｃυニスｃａａｃａｘＮ℃ｃｃｏぶｗ話ＴＡＣＣＴ 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Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．精製されたＨＣＶポリヌクレオチド。
2. ２．組換えＨＣＶポリヌクレオチド。
3. ３．ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ　ｃＤＮＡに由来する配列を有する組換えＨＣＶ ポリヌクレオチド。
4. ４．ＨＣＶのエピトープをコードする組換えポリヌクレオチド。
5. ５．請求の範囲第２項，第３項，または第４項のポリヌクレオチドを含む組換え ベクター。
6. ６．請求の範囲第５項のベクターで形質転換された宿主細胞。
7. ７．ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ　ｃＤＮＡに由来するＤＨＡのオープンリーディ ングフレーム（ＯＲＦ）を有する組換え発現系であって，該ＯＲＦが所望の宿主 と適合し得る制御配列に対して作動可能なように連結されている，組換え発現系 。
8. ８．請求の範囲第７項の組換え発現系で形質転換させた細胞。
9. ９．請求の範囲第８項の細胞により生産されたポリペプチド。
10. １０．精製されたＨＣＶ。
11. １１．請求の範囲第１０項のＨＣＶに由来するポリペプチドの調製物。
12. １２．精製されたＨＣＶポリペプチド。
13. １３．ＨＣＶに含まれるエピトープと免疫学的に同一であるとみなし得るエピト ープを有する精製されたポリペプチド。
14. １４．組換えＨＣＶ　ポリペプチド。
15. １５．ＨＣＶ　ゲノムまたはＨＣＶ　ｃＤＮＡに由来する配列を有する組換えポ リペプチド。
16. １６．ＨＣＶ　エピトープを有する組換えポリペプチド。
17. １７．ＨＣＶ　ポリペプチドを有する融合ポリペプチド。
18. １８．ＨＣＶ　エピトープに対するモノクローナル抗体。
19. １９．ＨＣＶ　に対するポリクローナル抗体の精製された調製物。
20. ２０．ＢＣＶ　感染に対して免疫原性の粒子であって，真核生物宿主内で生産さ れる場合に粒子を形成し得るアミノ酸配列を有する非ＨＣＶ　ポリペプチドと， ＨＣＶ　エピトープとを有する粒子。
21. ２１．ＨＣＶ　に対するポリヌクレオチドプローブ。
22. ２２．ＨＣＶ　に由来するポリヌクレオチドの存在について試料を分析するため のキットであって，適当な容器内に，約８個またはそれ以上のヌクレオチドから なるＨＣＶ　由来のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブを有する キット。
23. ２３．ＨＣＶ　抗原の存在について試料を分析するためのキットであって，適当 な容器内に，検出されるべきＨＣＶ　抗原に対する抗体を有するキット。
24. ２４．ＨＣＶ　抗原に対する抗体の存在について試料を分析するためのキットで あって，適当な容器内に，ＨＣＶ　抗原に存在するＨＣＶ　エピトープを含むポ リペプチドを有するキット。
25. ２５．固体担体に付着させた，ＨＣＶ　エピトープを有するポリペプチド。
26. ２６．固体担体に付着させた，ＨＣＶ　エピトープに対する抗体。
27. ２７．ＨＣＶ　エピトープを含むポリペプチドを生産する方法であって，ＨＣＶ 　エピトープを含むポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターで形質転 換させた宿主細胞を，該ポリペプチドを発現する条件下でインキュベートするこ と，を包含する生産方法。
28. ２８．請求の範囲第２７項の方法により生産された，ＨＣＶ　エピトープを含む ポリペプチド。
29. ２９．試料中のＨＣＶ　核酸を検出する方法であって，（ａ）該試料の核酸を， ＨＣＶ　ポリヌクレオチドに対するプローブと，該プローブと該試料由来のＨＣ Ｖ　核酸との間にポリヌクレオチド二本鎖を形成する条件下で反応させること； および（ｂ）該プローブを含むポリヌクレオチド二本鎖を検出すること， を包含する検出方法。
30. ３０．ＨＣＶ　抗原を検出するための免疫学的検定法であって，（ａ）ＨＣＶ　 抗原を含んでいる疑いのある試料を，検出されるべきＨＣＶ　抗原に対するプロ ーブ抗体と共に，抗原−抗体複合体を形成する条件下でインキュベートすること ；および（ｂ）該プローブ抗体を含む抗原−抗体複合体を検出すること，を包含 する免疫学的検定法。
31. ３１．ＨＣＶ　抗原に対する抗体を検出するための免疫学的検定法であって， （ａ）抗ＨＣＶ　抗体を含んでいる疑いのある試料を，ＨＣＶ　のエピトープを 含むプローブポリヌクレオチドと共に，抗体−抗原複合体を形成する条件下でイ ンキュベートすること；および（ｂ）該プローブ抗原を含む抗体−抗原複合体を 検出すること，を包含する免疫学的検定法。
32. ３２．ＨＣＶ　感染を処置するためのワクチンであって，ＨＣＶ　エピトープを 含む免疫原性ポリペプチドを含有し，該免疫原性ポリペプチドが薬学的に容認し 得る賦形剤中に，薬学的に効果的な用量で存在する，ワクチン。
33. ３３．ＨＣＶ　感染を処置するためのワクチンであって，薬学的に容認される賦 形剤中に，薬学的に効果的な用量で，不活性化されたＨＣＶ　を含有するワクチ ン。
34. ３４．ＨＣＶ　感染を処置するためのワクチンであって，薬学的に容認される賦 形剤中に，薬学的に効果的な用量で，弱毒化されたＨＣＶ　を含有するワクチン 。
35. ３５．ＨＣＶ　に感染した組織培養増殖細胞。
36. ３６．請求の範囲第３５項に記載のＨＣＶ　感染細胞であって，該細胞は，ヒト のマクロファージ細胞系，肝細胞系，カの細胞系，ダニの細胞系，マウスのマク ロファージ細胞系，または胚細胞である。
37. ３７．請求の範囲第３５項に記載のＨＣＶ　感染細胞であって，該細胞は，ＨＣ Ｖ　感染個体の肝臓に由来する細胞系である。
38. ３８．ＨＣＶ　に対する抗体を生産する方法であって，ＨＣＶ　エピトープを含 む単離された免疫原性ポリペプチドを，免疫応答を生ずるのに充分な量で個体に 投与することを包含する生産方法。
39. ３９．ＨＣＶ　に対する抗体を生産する方法であって，請求の範囲第１１項に記 載のポリペプチド調製物を個体に投与することを包含し，該調製物が少なくとも １つの免疫原性ポリペプチドを含有し，かつ該投与が免疫応答を生ずるのに充分 な量で行われる，生産方法。
40. ４０．未確認の感染因子のゲノムに由来するｃＤＮＡを単離する方法であって， 該方法は以下の工程を包含する：（ａ）該感染因子に感染した組織から単離され た核酸から調製されたｃＤＮＡライブラリーを含む発現ベクターで形質転換させ た宿主細胞を用意し，該ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドを発現する条件下 で該宿主細胞を増殖させること；（ｂ）該ｃＤＮＡの発現産物を，該感染因子に 感染した個体の抗体含有身体構成部分と，免疫反応を起こす条件下で反応させ， その結果として形成される抗体−抗原複合体を検出すること；（ｃ）該工程（ｂ ）の抗体−抗原複合体を形成するポリペプチドを発現する宿主細胞を，個々のク ローンとして増殖する条件下で増殖させ，該クローンを単離すること；（ｄ）該 工程（ｃ）のクローン由来の細胞を，該ｃＤＮＡ内にコードされたポリペプチド を発現する条件下で増殖させ，該発現産物を，該工程（ａ）の個体以外の個体で あって該感染因子に感染している個体の抗体含有身体構成部分，および該感染因 子に感染していない対照個体と反応させ，その結果として形成される抗体−抗原 複合体を検出すること； （ｅ）感染した個体および感染している疑いのある個体の抗体含有身体構成部分 から抗体−抗原複合体を形成するが，対照個体の該部分からは抗体−抗原複合体 を形成しないポリペプチドを発現する宿主細胞を，個々のクローンとして増殖す る条件下で増殖させ，該クローンを単離すること；および（ｆ）該工程（ｅ）の 宿主細胞クローンからｃＤＮＡを単離すること。