ES2319727T3

ES2319727T3 - Estimulacion de anticuerpos especificos de hcv.

Info

Publication number: ES2319727T3
Application number: ES00993586T
Authority: ES
Inventors: Michael Houghton; Mark Selby; Sergio Abrignani; Jens Heile; Derek O'hagan
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1999-12-01
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2009-05-12
Anticipated expiration: 2020-12-01
Also published as: AU5442501A; US20080095800A1; PT1233782E; US7329408B2; EP1233782A2; CA2393251A1; EP1233782B1; WO2001047551A3; JP2004500366A; CY1108734T1; ATE413190T1; WO2001047551A2; CA2393251C; US20110159039A1; US20020002272A1; DK1233782T3; DE60040755D1

Abstract

Uso de un polinucleótido que codifica el antígeno E2 o E1E2 seleccionado entre el grupo constituido por los aminoácidos 384-746 de una poliproteína HCV; los aminoácidos 384-749 de una poliproteína HCV; los aminoácidos 192-746 de una poliproteína HCV; los aminoácidos 192-809 de una poliproteína HCV; los aminoácidos 192-749 de una poliproteína HCV, en el que el antígeno E2 y E1E2 no se segrega y en el que E2 es de longitud completa, en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmune que genera al menos una neutralización del anticuerpo de unión (NOB) frente a un antígeno E2 o E1E2 del virus de la hepatitis C (HCV) en un sujeto.

Description

Estimulación de anticuerpos específicos de HCV.

Área técnica de la invención

La invención se refiere a la estimulación de anticuerpos y a la neutralización de los anticuerpos de unión frente al virus de la hepatitis C (HCV). Más concretamente, la invención se refiere al uso de polipéptidos o polinucleótidos E1E2 de HCV y E2 de HCV para estimular los anticuerpos anti-E2 y anti-E2 neutralizantes de los anticuerpos de unión en mamíferos.

\global\parskip0.930000\baselineskip

Antecedentes

El virus de la hepatitis C (HCV) es un importante problema sanitario con aproximadamente un 1% de la población mundial infectado con el virus. Alrededor de un 75% de los individuos infectados de manera aguda progresan eventualmente a un estado portador crónico que puede dar como resultado cirrosis, insuficiencia hepática, y carcinoma hepatocelular. Una fracción muy pequeña de los pacientes infectados crónicamente aclara naturalmente el HCV y resuelven la hepatitis crónica. Véase Alter y col. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1899-1905; Resnick y Koff. (1993) Arch. Intern. Med. 153:1672-1677; Seeff (1995) Gastrointest. Dis. 6:20-27; Tong y col. (1995) N. Engl. J. Med. 332:1463-1466.

Existe evidencia de la neutralización de anticuerpos específicos de HCV durante el curso de la infección con HCV. Véase Ishii y col. (1998) Hepatology. 28:1117-1120. Además, la aparición y el mantenimiento de títulos elevados en suero de la neutralización de anti-E2 de los anticuerpos de unión (NOB) en el curso de la infección crónica de HCV se ha correlacionado con la protección de la infección por HCV, el aclaramiento de HCV, y la resolución clínica de la enfermedad de hígado debida a HCV. Ishi y col. (1998); Rosa y col., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1759.

Forns X y col (Vaccine 1999, 17:1992-2002), describen la diferente respuesta celular y humoral inmune a la inmunización de ADN con plásmidos E2 de HCV que contienen cualquiera de la secuencia completa de los genes E2 y p7 o las secuencias truncadas dirigidas a la superficie celular.

Fournillier A. y col (Hepatology, 1999, página 451a), rescriben las respuestas de los anticuerpos a las formas no segregadas de los antígenos E1 y E2 del virus HCV tras la inmunización de plásmido.

Tedeschi Valeria y col (Hepatology, 1997, 25:459-462), describen la respuesta específica del anticuerpo a E2 de HCV estimulado en ratones mediante la inoculación intramuscular de ADN de plásmido que contiene las secuencias de codificación de E2. Sin embargo, hasta la fecha, únicamente los polipéptidos E2 de HCV purificados truncados en el aminoácido 715 han demostrado estimular los NOB anti-E2 en estudios animales. Fournillier y col. (1999) J. Virology 73:7497-75504. De esta manera, permanece una necesidad de procedimientos efectivos para estimular los títulos de anticuerpos NOB anti-E2.

Resumen

Se describen en el presente documento procedimientos para estimular una respuesta inmune, concretamente respuestas inmunes humorales (tales como estimulación de la neutralización de los anticuerpos de unión (NOB)) frente a los antígenos E2 y E1E2 mediante la administración de polinucleótidos que codifican uno o más de estos antígenos. Además, no son necesarios restos carbohidrato para la unión de E2 con las células humanas y únicamente la fracción no agregada monomérica puede unirse a CD81. En las formas de realización preferidas, la inmunización de la proteína y/o el ADN se lleva a cabo usando la proteína E2 monomérica expresada en célula de mamífero purificada a partir de la fracción intracelular. De esta manera, es un objeto de la invención proporcionar procedimientos y reactivos para la estimulación de anticuerpos anti-E2 y anticuerpos anti-E2 que neutralizan la unión de E2 a las células.

De esta manera, en un aspecto, la invención incluye el uso de un polinucleótido que codifica el antígeno E2 o E1E2 seleccionado entre el grupo constituido por los aminoácidos 384-746 de una poliproteína de HCV; los aminoácidos 384-749 de una poliproteína de HCV, los aminoácidos 192-746 de una poliproteína de HCV, los aminoácidos 192-809 de una poliproteína de HCV; los aminoácidos 192-749 de una poliproteína de HCV, en las que los antígenos E2 y E1E2 no se segregan y en el que E2 es de longitud completa, en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmune que genera al menos una neutralización del anticuerpo de unión (NOB) frente al antígeno E2 o E1E2 del virus de la hepatitis C (HCV) en un sujeto. En algunas formas de realización, se administra más de un polinucleótido que codifica diferentes antígenos E2 o E1E2. De esta manera, los polinucleótidos pueden codificar uno o más antígenos E2 de longitud completa y uno o más E1E2. Los polinucleótidos pueden ser, por ejemplo, ADN, ADN de plásmido u otro vector de expresión. En cualquiera de los usos descritos en el presente documento, el sujeto está infectado o no con una o más cepas de HCV. Además, en varias formas de realización, el uso puede adicionalmente comprender la etapa de administrar un coadyuvante (por ejemplo, cardiotoxina) al mamífero.

En cualquiera de los usos descritos en el presente documento, el sujeto puede ser un mamífero, por ejemplo un ratón, un conejo, una cobaya, un macaco, un babuino, un chimpancé, y un ser humano. Los polinucleótidos que codifican HCV pueden administrarse mediante cualquier mecanismo de administración adecuado (por ejemplo, mediante un dispositivo de administración biolístico, micropartículas PLG, y similar). Los polinucleótidos pueden administrarse por vía intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, mucosal, intranasal, oral, e intradérmica o similar.

En otras formas de realización, los usos comprenden además la etapa de detectar la neutralización del anticuerpo de unión. Además, en algunas formas de realización, la neutralización del anticuerpo de unión inhibe la unión de un polipéptido E2 a su receptor análogo en una cantidad que es mayor en relación a la unión del polipéptido E2 con su receptor análogo en ausencia de neutralización del anticuerpo de unión, que incluye pero no se limita a, una neutralización del anticuerpo de unión que inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:70; una neutralización del anticuerpo de unión que inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:140; una neutralización del anticuerpo de unión que inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:300; una neutralización del anticuerpo de unión que inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:600; una neutralización del anticuerpo de unión que inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:800; y una neutralización del anticuerpo de unión que inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:3000.

La invención proporciona de esta manera usos y reactivos para estimular anticuerpos anti-E2 y anticuerpos NOB anti-E2. Los procedimientos y reactivos son particularmente ventajosos para identificar epitopos de un polipéptido E2 de HCV o E1E2 de HCV asociado con la generación de una respuesta fuerte de anticuerpo anti-E2 y una respuesta de anticuerpo NOB anti-E2 y para inmunizar animales, incluyendo seres humanos, frente a HCV.

Estas y otras formas de realización serán fácilmente evidentes para una persona experta en la técnica a la vista de las enseñanzas del presente documento.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que representa los títulos ELISA de ratones inmunizados con 10 ug de ADN de E1E2/PLG (barra de la izquierda); 10 ug de ADN de E1/E2 (barra de el medio) y 100 ug de ADN de E1E2/PLG.

La Figura 2 es un gráfico que representa los títulos ELISA de ratones inmunizados con ADN y/o proteína de E1E2 en diversos adyuvantes.

Las barras negras representan gráficamente los títulos tras el segundo estímulo y las barras blancas representan gráficamente los títulos tras el tercer estímulo.

Las Figuras 3 y 4 son gráficos que representan los títulos ELISA de ratones inmunizados con ADN y/o proteína de E1E2 en diversos adyuvantes. Las barras negras representan gráficamente los títulos tras el segundo estímulo y las barras blancas representan gráficamente los títulos tras el tercer estímulo. Las Figuras 3 y 4 muestran dos experimentos diferentes.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e inmunología, entre las habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición); Methods in Enzimology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); DNA Cloning. Vols. I y II (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames y S. J. Higgins eds.); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed.); Perbal, B. A Practical Guide to Molecular Cloning.

Debe señalarse que, tal como se usa en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "uno", "un" y "el" incluyen los referentes plurales a no ser que el contenido dicte claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un antígeno" incluye una mezcla de dos o más antígenos, y similar.

I. Definiciones

En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que se definan tal como se indica a continuación.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos y no se limitan a una longitud mínima del producto. De esta manera, los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares se incluyen dentro de la definición. Se incluyen en la definición tanto proteínas de longitud completa como fragmentos de las mismas. Los términos incluyen también modificaciones de postexpresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, para los objetivos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como delecciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), en la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante la mutagénesis dirigida al emplazamiento, o pueden ser accidentales, tales como mediante mutaciones de los huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación mediante la PCR.

\global\parskip0.830000\baselineskip

Un polipéptido HCV es un polipéptido, tal como se define anteriormente, derivado de la poliproteína HCV. El polipéptido no necesita derivarse físicamente de HCV, sino que puede producirse de manera sintética o recombinante. Además, el polipéptido puede derivarse de cualquiera de las diversas cepas de HCV, tales como de las cepas 1, 2, 3 ó 4 de HCV. Se conocen numerosas regiones conservadas y variables entre estas cepas y, en general, las secuencias de los aminoácidos de los epitopos derivados de estas regiones tendrán un elevado grado de homología de la secuencia, por ejemplo, homología de la secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente un 30%-40%, preferiblemente al menos un 40%-60%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60%-70%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 70%-75%, más preferiblemente un 80%-82%, más preferiblemente un 85%-90%, incluso más preferiblemente un 92%, aún más preferiblemente un 95%, y lo más preferible un 98% de identidad de la secuencia para la secuencia de referencia sobre una longitud definida de las moléculas, tal como se determina usando los procedimientos descritos en el presente documento cuando las dos secuencias se alinean. De esta manera, por ejemplo, el término polipéptido "E2" se refiere a E2 nativo de cualquiera de las diversas cepas de HCV, así como los análogos de E2, muteínas y fragmentos inmunogénicos, tal como se describe adicionalmente a continuación.

Los términos "análogo" y "muteína" se refieren a derivados biológicamente activos de la molécula de referencia, o fragmentos de dichos derivados, que retienen la actividad deseada, tales como la capacidad para estimular una respuesta inmune humoral y/o mediada por células, tal como se define a continuación. En general, el término "análogo" se refiere a los compuestos que tienen una secuencia polipeptídica nativa y la estructura con una o más adiciones, sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa) y/o delecciones de aminoácidos, relativas a la molécula nativa, siempre que las modificaciones no destruyan la actividad inmunogénica. El término "muteína" se refiere a péptidos que tienen uno o más peptidomiméticos ("peptoides"), tales como los descritos en la Publicación Internacional Nº WO 91/04282. Preferiblemente, el análogo o muteína tiene al menos la misma inmunoactividad que la molécula nativa. Se conocen en la técnica los procedimientos para preparar análogos de polipéptidos y muteínas y se describen adicionalmente a continuación.

Los análogos particularmente preferidos incluyen sustituciones que son de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan por sus cadenas secundarias. Específicamente, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) polares no cargados - glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano, y tirosina se clasifican algunas veces como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que una sustitución aislada de leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o una sustitución conservativa similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente, no tendrá un efecto mayor sobre la actividad biológica. Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta 5-10 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o incluso hasta aproximadamente 15-25 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o cualquier entero entre 5-25, siempre que la función deseada de la molécula permanezca intacta. Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente las regiones de la molécula de interés que pueden tolerar cambio por referencia a los gráficos de Hopp/Woods y Kyte-Doolittle, bien conocidos en la técnica.

Por "fragmento" se refiere a un polipéptido constituido únicamente por una parte de la secuencia polipeptídica de longitud completa y estructura intactas. El fragmento puede incluir una delección C-terminal y/o una delección N-terminal del polipéptido nativo. Un "fragmento inmunogénico" o "fragmento antigénico" de una proteína HCV concreta incluirá generalmente al menos aproximadamente 5-10 residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de longitud completa, preferiblemente al menos 20-50 o más residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de longitud completa, que definen un epitopo, o cualquier entero entre 5 aminoácidos y la secuencia de longitud completa, con la condición de que el fragmento en cuestión retenga la actividad inmunogénica o antigénica, tal como se mide mediante los ensayos descritos en el presente documento. Para una descripción de diversos epitopos HCV, véase, por ejemplo, Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien y col., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien y col., Publicación Internacional Nº WO 93/00365; Chien, D. Y., Publicación Internacional Nº WO 94/01778; Solicitudes de Patente, del solicitante, con N^{os} de Serie 08/403.590 y 08/444.818.

El término "epitopo" tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de al menos aproximadamente 3 a 5, preferiblemente aproximadamente 5 a 10 ó 15, y no superior de aproximadamente 1.000 aminoácidos (o cualquier valor entero entre 3 y 1.000), que define una secuencia que por sí misma o como parte de una secuencia más grande, se une con un anticuerpo generado en respuesta a dicha secuencia. No existe límite superior crítico en la longitud del fragmento, que puede comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprende dos o más epitopos procedentes de la poliproteína HCV. Un epitopo para uso en la invención sujeta no se limita a un polipéptido que tiene la secuencia exacta de la porción de la proteína parental de la cual se deriva. Por tanto, los genomas víricos están en un estado de flujo constante y contienen varias regiones variables que presentan grados relativamente elevados de variabilidad entre los aislados. De esta manera, el término "epitopo" abarca las secuencias idénticas a la secuencia nativa, así como las modificaciones de la secuencia nativa tales como delecciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa).

Se pueden identificar las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epitopo usando cualquier número de técnicas de mapeado de epitopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, se pueden determinar los epitopos lineales mediante, por ejemplo, sintetizando en paralelo grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a las porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos siguen unidos a los soportes. Se conocen dichas técnicas en la técnica y se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.708.871; Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. Similarmente, los epitopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos tal como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, por ejemplo., Epitope Mapping Protocols, más arriba. Se pueden identificar también las regiones de las proteínas usando gráficos estándar de antigenicidad e hidropatía, como los calculados usando, por ejemplo, el programa de software Omiga versión 1.0 disponible del Oxford Molecular Group. Este programa de ordenador emplea el procedimiento Hopp/Woods, Hopp y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78: 3824-3828 para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica Kyte-Doolittle, Kyte y col., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132 para los gráficos de hidropatía.

Tal como se usa en el presente documento, el término "epitopo conformacional" se refiere a una porción de una proteína de longitud completa, o un análogo o muteína de la misma, que tiene características estructurales nativas respecto de la secuencia de aminoácidos que codifica el epitopo dentro de una proteína natural de longitud completa. Las características estructurales nativas incluyen, pero no se limitan a, glicosilación y estructura tridimensional. Preferiblemente, un epitopo conformacional se produce de manera recombinante y se expresa en una célula de la cual se puede extraer en condiciones que preservan sus características estructurales deseadas, por ejemplo, sin la desnaturalización del epitopo. Dichas células incluyen células de bacterias, levaduras, insectos, y mamíferos. La expresión y aislamiento de epitopos conformacionales recombinantes procedentes de la poliproteína HCV se describen en por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales N^{os} WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734.

Una "respuesta inmunológica" a un antígeno HCV (incluyendo tanto los polipéptidos como los polinucleótidos que codifican polipéptidos que se expresan in vivo) o composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular a las moléculas presentes en la composición de interés. Para los objetivos de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, mientras que una "respuesta inmune celular" es una respuesta inmune mediada por linfocitos T y/u otros glóbulos blancos de la sangre. Un aspecto importante de la inmunidad celular implica una respuesta específica al antígeno mediante las células T citolíticas ("CTL"). Las CTL tienen especificidad por los antígenos del péptido que se presenta en asociación con las proteínas que codifican el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y se expresan en las superficies de las células. Las CTL ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de los microbios intracelulares, o la lisis de las células infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica al antígeno por las células T cooperadoras. Las células T cooperadoras actúan para ayudar a estimular la función, y enfocan la actividad de las células efectoras no específicas frente a las células que despliegan los antígenos del péptido en asociación con las moléculas MHC sobre su superficie. Una "respuesta inmune celular" se refiere también a la producción de citoquinas, quimioquinas y otras de dichas moléculas producidas mediante las células T activadas y/o otros glóbulos blancos de la sangre, incluyendo las derivadas de las células CD4+ y CD8+.

Una composición o vacuna que estimula una respuesta inmune celular puede servir para sensibilizar un sujeto vertebrado mediante la presentación del antígeno en asociación con moléculas MHC en la superficie celular. La respuesta inmune mediada por células se dirige a, o cerca de, las células que presentan antígeno en su superficie. Adicionalmente, se pueden generar linfocitos T específicos de antígeno para permitir la protección futura de un huésped inmunizado.

El término "antígeno" se refiere a una composición que es capaz de estimular una respuesta inmune y puede ser, por ejemplo, un polipéptido o un polinucleótido que codifica un polipéptido. Se puede determinar la capacidad de un antígeno concreto para estimular una respuesta inmunológica mediada por células mediante numerosos ensayos, tales como mediante ensayos de linfoproliferación (activación del linfocito), ensayos de células citotóxicas CTL, o ensayando los linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Se conocen bien dichos ensayos en la técnica. Véase, por ejemplo, Erickson y col., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe y col., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369-2376; y los ejemplos a continuación. "Determinante antigénico" se refiere al emplazamiento en un antígeno o hapteno al cual se une una molécula de anticuerpo específico o un receptor superficial celular específico.

Así, una respuesta inmunológica tal como se usa en el presente documento puede ser una respuesta inmunológica que estimula la producción de CTL, y/o la producción o activación de las células T cooperadoras. El antígeno de interés puede también estimular una respuesta inmune mediada por anticuerpos, por ejemplo, la neutralización de los anticuerpos de unión (NOB). Por tanto, una respuesta inmunológica puede incluir uno o más de los siguientes efectos; la producción de anticuerpos por las células B; y/o la activación de las células T supresoras y o las células \gamma\deltaT dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos presentes en la composición o vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la infectividad, y/o mediar el complemento del anticuerpo, o la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) para proporcionar protección o alivio de los síntomas de un huésped inmunizado. Se pueden determinar dichas respuestas usando inmunoensayos y ensayos de neutralización convencionales, bien conocidos en la técnica.

Una "secuencia de codificación" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan mediante un codón de inició en el término 5' (amino) y un codón de detención de la traducción en el término 3' (carboxi). Se puede localizar una secuencia de terminación de la transcripción en el 3' de la secuencia de codificación.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Una molécula de "ácido nucleico" o "polinucleótido" puede incluir secuencias de cadena doble y simple y se refiere a, pero no se limita a, ADNc procedente de secuencias de ARNm víricas, procariotas o eucariotas, secuencias de ADN genómico procedente de virus (por ejemplo ADN de virus y retrovirus) o ADN de procariota, y especialmente secuencias de ADN sintético. El término abarca también las secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN.

"Unido de manera operable" se refiere a una disposición de elementos en los que los componentes descritos de esta manera se configuran con el fin de llevar a cabo su función deseada. De esta manera, un promotor dado unido de manera operable a una secuencia de codificación es capaz de efectuar la expresión de la secuencia de codificación cuando están presentes los factores de transcripción apropiados, etc. El promotor no necesita ser contiguo con la secuencia de codificación, siempre que funcione para dirigir la expresión de la misma. De esta manera, por ejemplo, interviniendo en las secuencias transcritas aún no traducidas que pueden estar presentes entre la secuencia del promotor y la secuencia de codificación, se pueden transcribir en intrones, y la secuencia del promotor se puede considerar todavía "unida de manera operable" con la secuencia de codificación.

"Recombinante" tal como se usa en el presente documento para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, vírico, semisintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación no se asocia con todo o una porción del polinucleótido con el que se asocia en la naturaleza. El término "recombinante" tal como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido mediante la expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés se clona y a continuación se expresa en los organismos transformados, tal como se describe adicionalmente a continuación. El organismo huésped expresa el gen anterior para producir la proteína bajo las condiciones de expresión.

Un "elemento de control" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que ayuda en la expresión de una secuencia de codificación a la que se une. El término incluye promotores, secuencias de terminación de la transcripción, regiones reguladoras corriente arriba, señales de poliadenilación, regiones no traducidas, que incluyen 5'-UTR y 3'-UTR y cuando sea apropiado, secuencias líderes y potenciadores, que proporcionan colectivamente la transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula huésped.

Un "promotor" tal como se usa en el presente documento es una región reguladora del ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula huésped e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3') unida de manera operable a la anterior. Para los objetivos de la presente invención, una secuencia promotora incluye el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción de un gen de interés a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora hay un punto de inicio de la transcripción, así como regiones de unión de la proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas contendrán a menudo, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT".

Una secuencia control "dirige la transcripción" de una secuencia de codificación en una célula cuando una ARN polimerasa enlace con la secuencia promotora y transcriba la secuencia de codificación en el ARNm, que a continuación se traduce en el polipéptido codificado mediante la secuencia de codificación.

"Cassette de expresión" o "constructo de expresión" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés. El cassette de expresión incluye elementos de control, tal como se describe anteriormente, tales como un promotor que se une de manera operable con (de manera que dirige la transcripción de) la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés, e incluye a menudo también una secuencia de poliadenilación. Dentro de algunas formas de realización de la invención, el cassette de expresión descrito en el presente documento puede estar contenido en el interior de un constructo de plásmido. Adicionalmente a los componentes del cassette de expresión, el constructo de plásmido puede incluir también, uno o más marcadores seleccionables, una señal que permita al constructo del plásmido existir como ADN de cadena única (por ejemplo, un origen de replicación M13), al menos un emplazamiento de clonación múltiple, y un origen de replicación "mamífero" (por ejemplo, un origen de replicación de SV40 o de adenovirus).

"Transformación", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, sin tener en cuenta el procedimiento usado para la inserción: por ejemplo, transformación mediante captación directa, transfección, infección, y similar. Para los procedimientos concretos de transfección, véase adicionalmente a continuación. Se puede mantener el polinucleótido exógeno como un vector no integrado, por ejemplo, un episoma, o alternativamente, se puede integrar en el genoma del huésped.

Una "célula huésped" es una célula que se ha transformado, o que es capaz de transformación, mediante una secuencia de ADN exógeno.

Por "aislado" se entiende, cuando se hace referencia a un polipéptido, que la molécula indicada es separada y discreta a partir de un organismo completo y que la molécula se encuentra en la naturaleza o está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico desprovista de, en todo o en parte, de las secuencias normalmente asociadas con ésta en la naturaleza; o una secuencia, tal como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con la anterior, o una molécula disociada procedente del cromosoma.

El término "purificado" tal como se usa en el presente documento significa preferiblemente que están presentes al menos un 75% en peso, más preferiblemente al menos un 85% en peso, más preferiblemente al menos aún un 95% en peso, y lo más preferible al menos un 98% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo.

"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos restos de polinucleótidos. Dos ADN, o dos secuencias de polipéptidos son "sustancialmente homólogos" entre sí cuando las secuencias presentan al menos aproximadamente un 50%, preferiblemente al menos un 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80%-85%, preferiblemente al menos aproximadamente un 90%, y lo más preferible al menos aproximadamente un 95%-98%, o más, de identidad de la secuencia sobre una longitud definida de las moléculas. Tal como se usa en el presente documento, sustancialmente homóloga se refiere también a las secuencias que muestran identidad completa con el ADN especificado o la secuencia polipeptídica.

En general "identidad" se refiere a una correspondencia exacta nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, respectivamente. Se puede determinar el porcentaje de identidad de la información mediante comparación directa de la secuencia entre dos moléculas mediante el alineamiento de las secuencias, recuento del número exacto de emparejamientos entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta, y multiplicando el resultado por 100. Se pueden usar programas de ordenador fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tales como ALIGN, Dayhoff, M. O. en el Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff ed., Suplemento 5. 3: 353-358. National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances in Appl. Math. 2: 482-489, 1981 para el análisis de péptidos. Los programas para determinar la secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package referido a lo anterior. Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótido concreta respecto de una secuencia de referencia usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización de intervalo de seis posiciones de nucleótidos.

Otro procedimiento para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH cuyos derechos de autor ostenta la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountanin View, CA). Se puede emplear esta suite de paquetes del algoritmo Smith-Waterman en la que se usan parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización de hueco abierto de 12, penalización de extensión de hueco de uno y un hueco de seis). A partir de los datos generados, los valores de "Emparejamiento" reflejan la "identidad de la secuencia". Se conocen generalmente en la técnica otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o la similitud entre secuencias, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con parámetros por defecto. Se pueden usar, por ejemplo, BLASTN y BLASTP usando los siguientes parámetros por defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descriptores = 50 secuencias; clasificar mediante = PUNTUACIÓN ELEVADA; Bases de Datos = no redundantes; GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones CDS del GenBank + proteína Suiza + Spupdate + PIR. Se pueden encontrar los detalles de estos programas en la siguiente dirección de Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, se puede determinar la homología mediante hibridación de los polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido por la digestión con nucleasa(s) específica(s) de cadena única, y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Se pueden identificar las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones restrictivas, según se define para este sistema concreto. Definir las condiciones apropiadas de hibridación está dentro de los conocimientos de la persona experta en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., más arriba, DNA Cloning, más arriba; Nucleic Acid Hybridization, más arriba.

Por "inmunización del ácido nucleico" se entiende la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos seleccionados en una célula huésped, para la expresión in vivo del antígeno o antígenos. Se puede introducir la molécula de ácido nucleico directamente en el sujeto hospedador, tal como mediante administración por inyección, inhalación, oral, intranasal y mucosal, o similar, o se puede introducir ex vivo, en células que se han retirado del huésped. En el último caso, las células transformadas se reintroducen en el sujeto en el que se puede articular una respuesta inmune contra el antígeno codificado por la molécula del ácido nucleico.

Tal como se usa en el presente documento "tratamiento" se refiere a cualquiera de (i) la prevención de la infección o la reinfección, tal como en la vacuna tradicional, (ii) la reducción o eliminación de los síntomas, y (iii) la eliminación sustancial o completa del patógeno en cuestión. Se puede efectuar el tratamiento profiláctico (antes de la infección) o terapéuticamente (después de la infección).

El término "micro partícula" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una partícula de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 150 \mum de diámetro, más preferiblemente aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30 \mum de diámetro, y lo más preferible aproximadamente 500 nm a aproximadamente 10 \mum de diámetro. Preferiblemente la micropartícula tendrá un diámetro que permita la administración parenteral sin taponar agujas y capilares. El tamaño de la micropartícula se determina fácilmente mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como mediante espectroscopia de correlación de fotones, difractometría láser y/o microscopía de barrido de electrones.

Por "sujeto vertebrado" se entiende cualquier miembro del subfilum cordata, incluyendo, sin limitación, seres humanos y otros primates, que incluyen primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio que incluyen roedores tales como ratones, ratas y cobayas; aves, que incluyen aves domésticas, salvajes y de caza tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos, y similares. El término no denota una edad concreta. De esta manera. De esta manera, se pretende que queden incluidos individuos tanto adultos como recién nacidos. La invención descrita en el presente documento se pretende para uso en cualquiera de las especies anteriores de vertebrados, debido a que el sistema inmune de todos estos vertebrados funciona de manera similar.

Revisión

Es un descubrimiento de la presente invención que se pueden estimular los títulos de anticuerpo de la glicoproteína antienvoltura 2 de HCV y la neutralización de los títulos del anticuerpo de unión (NOB) mediante los polipéptidos E2 de HCV, y los polipéptidos E1E2 de HCV, así como por los polinucleótidos que codifican los polipéptidos E2 y E1E2. Además, los polipéptidos E1E2 de HCV o E2 de HCV, con los adyuvantes apropiados, y los polinucleótidos, estimulan respuestas inmunes celulares, tales como las respuestas de las células T cooperadoras y las respuestas de los linfocitos de las células T citotóxicas (CD8^{+}).

La estimulación de los anticuerpos específicos de HCV mediante polinucleótidos y polipéptidos E1E2 y E2 proporciona sistemas de modelos tanto in vitro como in vivo para el desarrollo de vacunas de HCV, concretamente para identificar los epitopos de los polipéptidos E2 de HCV y E1E2 de HCV asociados con la estimulación de un título de anticuerpo anti-E2 fuerte y un título de anticuerpo NOB anti-E2 fuerte. Se pueden usar también los polinucleótidos o polipéptidos E1E2 y E2 para generar una respuesta inmune contra un HCV en un mamífero, concretamente una respuesta del anticuerpo anti-E2 y una respuesta del anticuerpo NOB anti-E2, para cualquier objetivo terapéutico o profiláctico.

Polipéptidos E1E2 y E2

El genoma de un virus de la hepatitis C contiene normalmente un marco de lectura abierto único de aproximadamente 9.600 nucleótidos, que se transcribe en un poliproteína. Una poliproteína HCV se rompe para producir al menos diez productos distintos, en el orden de NH_{2}-Núcleo-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. El polipéptido E1 de HCV es una glicoproteína y se extiende aproximadamente desde el aminoácido 192 hasta el aminoácido 383 (numerado en relación a HCV-1). Véase Choo y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455. Un polipéptido E2 de HCV es una glicoproteína y se extiende aproximadamente desde el aminoácido 384 hasta el aminoácido 746 (numerado en relación a HCV-1). Véase Choo y col. De esta manera, el término "E2 de longitud completa" o "E2 no truncado" tal como se usa en el presente documento se refiere a los polipéptidos (y a los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos) que incluyen, al menos, los aminoácidos 384 hasta el aminoácido 746 de una poliproteína HCV (numerada en relación a HCV-1). Como será evidente a partir de esta descripción, los polipéptidos E2 de longitud completa pueden incluir aminoácidos adicionales corriente arriba y/o corriente abajo de los aminoácidos 384 y 746, tales como los aminoácidos 747-749 o 747-809. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos E2 de longitud completa incluyen los aminoácidos 384-746; 384-749 y 384-809 (así como los constructos que codifican estos polipéptidos).

Normalmente, un polipéptido E2 con delecciones en la región C-terminal se segrega desde una célula, mientras que un polipéptido E2 de longitud completa se retiene en el interior de una célula. Forms y col. (1999) Vaccine 17: 1992-2002; Spaete y col., Virology (1992) 188: 819-830; Ralston y col., J. Virol. (1993) 67: 6753-6761). Debido a que las proteínas E1 y E2 se unen normalmente a la membrana en estos sistemas de expresión, los experimentadores pensaron previamente que era deseable producir formas segregadas para facilitar la purificación de las proteínas para uso adicional. Por ejemplo, se ha descrito una molécula de E2 de HCV, truncada en el aminoácido 661 y que se segrega a partir de células de mamífero. Spaete y col., Virology (1992) 188: 819-830. Se ha descrito también la producción de moléculas E1 y E2 de HCV segregadas, truncadas en la Publicación Internacional Nº WO 96/04301, publicada el 15 de Febrero de 1996 y en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.121.020. Inudoh y col., Vaccine (1996) 14:1590-1596, describen la producción de una molécula E2 de HCV que carece de la región hidrofóbica C-terminal. Esta proteína se segregó en el medio de cultivo y se encontró que era más antigénica que las contrapartes producidas intracelularmente.

Se describe en el presente documento el uso de polipéptidos E2 (y los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos), concretamente los polipéptidos E2 y E1E2 no segregados, que son capaces de estimular la neutralización de los anticuerpos de unión (NOB). Opcionalmente, un polipéptido E2 puede comprender aminoácidos adicionales, tales como los aminoácidos 747 a 749 de la poliproteína HCV o los aminoácidos 747 a 809 de la poliproteína HCV. Preferiblemente, un polipéptido E2 comprende los aminoácidos 384-746, 384-749, 384-715 o 384-809 de una poliproteína HCV.

Se puede combinar o sintetizar un polipéptido E2 de la invención con un polipéptido E1 truncado, un fragmento de un polipéptido E1, o un polipéptido E1 de longitud completa, para formar un polipéptido E1E2. Por ejemplo, los fragmentos de los polipéptidos E1 pueden comprender 6, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, ó 175 aminoácidos de un polipéptido E1. Preferiblemente, un polipéptido E1E2 comprende los aminoácidos 192-746, 192-749, 340-674, ó 192-809 de una poliproteína HCV (numerada en relación a HCV-1). Los polipéptidos E1 y E2 pueden ser de la misma o diferente cadenas de HCV. Se pueden producir de manera recombinante los polipéptidos E2 y E1E2 a partir de constructos tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos nº 6.121.020.

Los polipéptidos E1E2 y E2 comprenden al menos un epitopo que se reconoce mediante un anticuerpo anti-E2 o un anticuerpo NOB anti-E2. Se pueden identificar los epitopos contenidos en E2 mediante diversos procedimientos. Por ejemplo, se puede aislar un polipéptido E2 mediante procedimientos tales como purificación mediante inmunoafinidad usando un anticuerpo monoclonal para E2. A continuación se puede seleccionar la secuencia polipeptídica aislada. Se pueden preparar una serie de péptidos cortos, que abarcan conjuntamente la secuencia polipéptidica completa mediante rotura proteolítica. Comenzando con, por ejemplo, los fragmentos de polipéptido 100-mer, pudiendo ensayarse cada fragmento para la presencia de los epitopos reconocidos en un ensayo de anticuerpo NOB anti-E2 o un ensayo inmunosorbente unido a enzima anti-E2 (ELISA). A continuación se pueden ensayar fragmentos progresivamente más pequeños y solapados procedentes de un 100-mer identificado para mapear el epitopo de interés. Los ensayos del anticuerpo NOB se describen en el Ejemplo 1 y en Rosa y col. (1996). Los ensayos ELISA se describen en el Ejemplo 3.

Se producen diversas cepas y aislados de HCV, y se pueden usar los polipéptidos E1E2 o E2 de cualquiera de estas cepas y aislados en la presente invención. Se conocen en la técnica las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de los genes y polipéptidos E1 y E2 de HCV. Por ejemplo, el aislado J1.1 de HCV se describe en Kubo y col. (1989) Japan. Nucl. Acids Res. 17: 10367-10372; Takeuchi y col. (1990) Gene 91: 287-291; Takeuchi y col. (1990) J. Gen. Virol. 71: 3027-3033; y Takeuchi y col. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 4626. Las secuencias de codificación completas de los dos aislados independientes, HCV-J y Bk, se describen por Kato y col., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9524-9528 y Takamizawa y col., (1991) J. Virol. 65: 1105-1113, respectivamente.

Las publicaciones que describen los aislados HCV-1 incluyen Choo y col., (1990) Brit. Med. Bull. 46: 423-441; Choo y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455 y Han y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1711-1715. Los aislados HC-J1 y HC-J4 de HCV se describen en Okamoto y col. (1991) Japan J. Exp. Med. 60: 167-177. Los aislados HCT 18, HCT 23, Th, HCT 27, EC1 y EC10 de HCV se describen en Weiner y col. (1991) Virol. 180: 842-848. Los aislados Pt-1, HCV-K1 y HCV-K2 se describen en Enomoto y col. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 170: 1021-1025. Los aislados A, C, D y E de HCV se describen en Tsukiyama-Kohara y col. (1991) Virus Genes 5: 243-254.

Preferiblemente, un polipéptido E1E2 o E2 se produce de manera recombinante, por ejemplo in vitro o in vivo. Se puede introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido E1E2 o E2 en un vector de expresión que se puede expresar en un sistema de expresión adecuado usando técnicas bien conocidas en la técnica (que se describen a continuación). Están disponibles en la técnica una variedad de sistemas de expresión de bacterias, levaduras, plantas, mamíferos, e insectos y se puede usar cualquiera de dichos sistemas de expresión. Opcionalmente, se puede traducir un polinucleótido que codifica un polipéptido E1E2 o E2 en un sistema de traducción libre de células.

Si se desea, se puede producir un polipéptido E1E2 o E2 como una proteína de fusión, que puede contener también otras secuencias de aminoácidos, tales como ligantes de aminoácidos o secuencias señal, así como ligandos útiles en la purificación de proteínas, tales como glutatión-S-transferasa, etiqueta de histidina, y proteína estafilocócica. Más de un polipéptido E1E2 o E2 puede estar presente en una proteína de fusión. Si se desea, se pueden incluir diversas combinaciones de polipéptidos E1E2 y E2 procedentes de diferentes cepas o aislados de HCV en una proteína de fusión.

Polinucleótidos E1E2 y E2

Los polinucleótidos E1E2 y E2 contienen menos de un genoma completo de HCV y pueden ser ARN o ADN de cadena de cadena simple o doble. Preferiblemente, los polinucleótidos se purifican libres de otros componentes, tales como proteínas y lípidos. Los polinucleótidos E1E2 y E2 codifican los polipéptidos E1E2 y E2 descritos anteriormente. Los polinucleótidos de la invención pueden comprender también otras secuencias de nucleótidos, tales como secuencias que codifican los ligantes, secuencias señal, secuencias señal heterólogas, secuencias de transferencia de detención TMR, regiones transmembrana, o ligandos útiles en la purificación de proteínas tales como glutatión-S-transferasa, etiqueta de histidina, y proteína A estafilocócica.

Se pueden aislar los polinucleótidos E1E2 y E2 de una biblioteca genómica derivada de secuencias de ácido nucleico presentes en, por ejemplo, el plasma, suero, o hígado de un individuo infectado por HCV. Se pueden sintetizar los polinucleótidos E1E2 y E2 en el laboratorio usando, por ejemplo, un sintetizador automático. Se puede usar un procedimiento de amplificación tal como la PCR para amplificar polinucleótidos a partir de cualquier ARN o ADNc genómico de HCV que codifique los polipéptidos E1E2 o E2.

Los polinucleótidos E1E2 y E2 pueden comprender secuencias de codificación para producir polipéptidos E1E2 o E2 naturales o pueden codificar secuencias E1E2 o E2 que no se producen en la naturaleza. Si se desea, se pueden clonar los polinucleótidos E1E2 o E2 en un vector de expresión y transformarse en, por ejemplo, células bacterianas, levaduras, de insecto, o de mamíferos de tal manera que los polipéptidos de la invención se puedan expresar en y aislarse a partir del cultivo celular. Se pueden obtener polinucleótidos E1E2 y E2 en el interior de un plásmido, tal como pBR322, pUC, o ColE1, o un vector de adenovirus, tal como un vector Tipo 2 o de Tipo 5 de adenovirus. Opcionalmente, se pueden usar otros vectores, que incluyen pero no se limitan a virus Sindbis, virus 40 de simios, virus de la leucemia en murino Moloney, y virus del sarcoma de Rous. Se pueden usar vectores bacterianos, tales como Salmonella ssp., Yersinia enterocolitica, Shigella spp., Vibrio cholerae, Mycobacterium cepa BCG, y Listeria monocytogenes. Se pueden usar también minicromosomas tales como MC y MC1, bacteriófagos, partículas de virus, partículas similares a virus, cósmidos (plásmidos en los que se han insertado emplazamientos cos del fago lambda) y replicones (elementos genéticos que son capaces de replicación bajo su propio control en una célula).

Los polinucleótidos contienen menos de un genoma completo de HCV y pueden ser ARN o ADN de cadena de cadena simple o doble. Preferiblemente, los polinucleótidos se aíslan libres de otros componentes, tales como proteínas y lípidos. Los polinucleótidos de la invención pueden comprender también otras secuencias de nucleótidos, tales como las secuencias que codifican los ligantes, las secuencias señal, o ligandos útiles en la purificación de proteínas tales como glutatión-S-transferasa, etiqueta de histidina, y proteína A estafilocócica.

Se pueden usar los constructos de expresión de la presente invención para la inmunización del ácido nucleico, para activar las células T específicas de HCV, usando protocolos estándar de liberación de genes. Se conocen en la técnica los procedimientos para la liberación de genes. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466. Se pueden liberar los genes tanto directamente en el sujeto vertebrado como liberarse alternativamente ex vivo, en las células derivadas del sujeto y reimplantarse las células en el sujeto. Por ejemplo, se pueden liberar los constructos como ADN de plásmido, contenido, por ejemplo, en el interior de un plásmido, tal como pBR322, pUC, o ColE1.

Adicionalmente, se pueden empaquetar los constructos de expresión en liposomas antes de liberarse a las células. Se lleva a cabo generalmente la encapsulación de lípidos usando liposomas que son capaces de unirse o atraparse de manera estable y retener el ácido nucleico. La relación de ADN condensado en la preparación lípida puede variar pero estará generalmente alrededor de 1:1 (mg de ADN : micromoles de lípido), o más de lípidos. Para una revisión del uso de los liposomas como vehículos para la liberación de ácidos nucleicos, véase, Hug y Sleight, Biochim. Biophys. Acta. (1991) 1097: 1-17; Straubinger y col., en Methods of Enzimology (1983), Vol. 101, pp. 512-527.

Las preparaciones liposómicas para uso con la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras, siendo los liposomas catiónicos particularmente preferidos. Los liposomas catiónicos están fácilmente disponibles. Por ejemplo, los liposomas de N[1-2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA) están disponibles bajo la marca comercial Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Véase, también, Feigner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413-7416). Otros lípidos comercialmente disponibles incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Se pueden preparar otros liposomas catiónicos a partir de materiales fácilmente disponibles usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Szoka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 4194-4198; Publicación PCT Nº WO 90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio) propano). Los diversos complejos de liposomas-ácido nucleico se preparan usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Straubinger y col., en METHODS OF IMMUNOLOGY (1983), Vol. 101, pp. 512-527; Szoka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 4194-4198; Papahadjopoulos y col., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394: 483; Wilson y col., Cell (1979) 17: 77); Deamer y Bangham, Biochim. Biophys. Acta (1976) 443: 629; Ostro y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 76: 836; Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 3348); Enoch y Strittmatter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 145); Fraley y col., J Biol. Chem. (1980) 255: 10431; Szoka y Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75; 145; y Schaefer-Ridder y col., Science (1982) 215: 166.

El ADN se puede liberar también en composiciones lípidas cocleadas similares a las descritas por Papahadjopoulos y col., Biochem. Biophys. Acta. (1975) 394: 483-491. Véase también, Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.663.161 y 4.871.488.

Se han desarrollado numerosos sistemas basados en virus para la transferencia de genes en células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de liberación de genes, tales como el virus del sarcoma murino, el virus del tumor mamario de ratón, el virus de la leucemia en murino Moloney, y el virus del sarcoma de Rous. Se puede insertar un gen seleccionado en un vector y empaquetarse en partículas retrovíricas usando técnicas conocidas en la técnica. A continuación se puede aislar el virus recombinante y liberarse en las células del sujeto in vivo o ex vivo. Se han descrito numerosos sistemas retrovíricos (Patente de los Estados Unidos Nº 5.219.740; Miller y Rosman, Bio Techniques (1989) 7: 980-990; Miller, A. D., Human Gene Therapy (1990) 1: 5-14; Scarpa y col., Virology (1991) 180: 849-852; Burns y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin, Cur. Opin. Genet. Develop. (1993) 3: 102-109. De manera breve, los vehículos retrovíricos de liberación del gen de la presente invención pueden construirse fácilmente a partir de una amplia variedad de retrovirus, que incluyen por ejemplo, retrovirus de los tipos B, C y D así como los spumavirus y lentivirus tales como FIV, HIV, HIV-1, HIV-2 y SIV (véase RNA Tumor Viruses, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Se pueden obtener fácilmente dichos retrovirus de depósitos o colecciones tales como la American Type Culture Collection ("ATCC", 1080 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209) o aislarse de fuentes conocidas que usan técnicas comúnmente disponibles.

Se han descrito también numerosos vectores de adenovirus, tales como los vectores de adenovirus Tipo 2 y Tipo 5. A diferencia de los retrovirus, que se integran en el genoma del huésped, los adenovirus persisten fuera del cromosoma minimizando de esta manera el riesgo asociado con mutagénesis insercional (Haj-Ahman y Graham, J. Virol. (1986), 57:267-274; Bett y col., J. Virol. (1993) 67:5911-5921; Mittereder y col., Human Gene Therapy (1994) 5:717-729; Seth y col., J. Virol. (1994) 68:933-940; Barr y col., Gene Thery (1994) 1:51-58; Berkner, K.L. Bio Techniques (1988) 6:616-629; y Rich y col, Human Gene Therapy (1993) 4:461-476).

Se pueden usar también vectores conjugados moleculares, tales como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael y col., J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866-6869 y Wagner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099-6103 para la liberación del gen.

Encontrarán también uso como vectores víricos los miembros del género Alfavirus, tales como, pero sin limitarse a los vectores derivados de los virus Sindbis y Semliki Forest, VEE, para liberar e gen de interés. Para una descripción de los vectores derivados del virus Sindbis útiles para la práctica de los procedimientos presentes, véase, Dubensky y col., J. Virol. (1996) 70: 508-519; y las Publicaciones Internacionales N^{os} WO 95/07995 y WO 96/17072.

Se pueden usar otros vectores, que incluyen pero no se limitan al virus 40 de simios, citomegalovirus, vectores bacterianos; tales como Salmonella ssp. Se puede usar Yersinia enterocolitica, Shigella spp., Vibrio cholerae, Mycobacterium cepa BCG, y Listeria monocytogenes. Se pueden usar también minicromosomas tales como MC y MC1, bacteriófagos, cósmidos (plásmidos en los que se han insertado emplazamientos cos del fago lambda) y replicones (elementos genéticos que son capaces de replicación bajo su propio control en una célula).

Los polinucleótidos (por ejemplo, constructos de expresión) descritos en el presente documento se pueden también encapsular, adsorberse en, o asociarse con, vehículos particulados, por ejemplo, micropartículas. Dichos vehículos presentan copias múltiples de una molécula seleccionada del sistema inmune y promueven el atrapamiento y la retención de moléculas en los nódulos linfáticos locales. Las partículas pueden fagocitarse por los macrófagos y pueden potenciar la presentación del antígeno mediante la liberación de la citoquina. Las micropartículas para uso en el presente documento estarán formadas normalmente de materiales que sean esterilizables, no tóxicos y biodegradables. Dichos materiales incluyen, sin limitación, poli(\alpha-hidroxiácido), ácido polihidroxibutírico, policaprolactona, poliortoéster, polianhídrido. Preferiblemente, las micropartículas para uso con la presente invención se derivan de poli(\alpha-hidroxiácido), en concreto, de un poli(láctido) ("PLA") o un copolímero de D,L-láctido y glicólido o ácido glicólico, tal como poli(D,L-láctido-co-glicólido) ("PLG" o "PLGA"), o un copolímero de D,L-láctido y caprolactona: Las micropartículas se pueden derivar de cualquiera de los diversos materiales de partida poliméricos que tienen una variedad de pesos moleculares y, en el caso de los copolímeros tales como PLG, una variedad de relaciones láctido:glicólido, la selección de las cuales será en gran medida materia de elección, dependiendo en parte del antígeno coadministrado. Los ejemplos de vehículos particulados incluyen los derivados de polímeros de polimetil metacrilato, así como las micropartículas derivadas de poli(láctidos) y poli(láctido-co-glicólidos), conocidos como PLG. Véase, por ejemplo, Jeffery y col., Pharm. Res. (1993) 10: 362-368; y McGee y col., J. Microencap. (1996). Los polímeros de polimetil metacrilato no son degradables mientras que las partículas PLG biodegradan mediante hidrólisis no enzimática aleatorizada de las uniones éster con los ácidos láctico y glicólico que se excretan a lo largo de las rutas metabólicas normales.

Recientes estudios han demostrado que las micropartículas PLG con antígenos atrapados son capaces de estimular la inmunidad mediada por células. Por ejemplo, se ha demostrado que gp 120 del virus de la inmunodeficiencia humana microencapsulado (VIH) induce las respuestas de CD4+ específica de micropartícula y las células T CD8+ en ratones (Moore y col., Vaccine (1995) 13: 1741-1749). Similarmente, se ha demostrado que la ovoalbúmina encapsulada en micropartículas es capaz de estimular las respuestas inmunes celulares in vivo y puede inducir respuestas mucosales de IgA cuando se administra por vía oral (O'Hagan y col., Vaccine (1993) 11: 149-154). Adicionalmente, se han inducido respuestas de anticuerpos y células T en ratones vacunados con un antígeno de Mycobacterium tuberculosis atrapado en PLG (Vordermeier y col., Vaccine (1995) 13: 1576-1582). Se han inducido también respuestas CTL específicas de antígeno en ratones usando péptidos sintéticos cortos microencapsulados a partir de proteína de cricumesporozoíto de Plasmodium berghei. De esta manera, en algunas formas de realización, los polipéptidos y/o polinucleótidos E2 y E1E2 se liberan usando micropartículas PLG (véase, también, Ejemplo 4).

Se puede usar una amplia variedad de diferentes procedimientos para administrar constructos de expresión a las células. Dichos procedimientos incluyen la transfección mediada por dextrano DEAE, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polilisina o poliomitina, o precipitación usando otras sales inorgánicas insolubles, tales como fosfato de estroncio, silicatos de aluminio que incluyen bentonita y caolín, óxido crómico, silicato de magnesio, talco, y similares. Otros procedimientos útiles de transfección incluyen electroporación, sonoporación, fusión de protoplastos, liposomas, liberación de peptoides, o microinyección. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., más arriba, para una discusión de las técnicas de transformación de células de interés; y Feigner, P. L., Advanced Drug Delivery Reviews (1990) 5: 163-187, para una revisión de los sistemas de liberación útiles para la transferencia de genes. Un procedimiento particularmente efectivo de liberación del ADN usando electroporación se describe en la Publicación Internacional Nº WO/0045823.

Adicionalmente, los sistemas de liberación biolísticos que emplean vehículos particulados tales como oro y tungsteno, son especialmente útiles para liberar los constructos de expresión de la presente invención. Las partículas se recubren con el constructo para liberarse y acelerarse a velocidad elevada, generalmente bajo una atmósfera reducida, usando una pistola de descarga de polvo de un "cañón de genes". Para una descripción de dichas técnicas, y de los equipos útiles por tanto, véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.945.050; 5.036.006; 5.100.792; 5.179.022; 5.371.015; y 5.478.744.

Composiciones que comprenden polipéptidos o polinucleótidos E1E2 y E2

La invención proporciona también composiciones que comprenden polipéptidos o polinucleótidos E1E2 o E2. Las composiciones de la invención comprenden preferiblemente un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo no debería inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el huésped. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Dichos vehículos incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos tales como sefarosa funcionalizada con látex, agarosa, celulosa, perlas de celulosa y similares, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina, y similares, copolímeros de aminoácidos, peptoides, liptoides, y partículas de virus inactivas.

Se pueden usar también sales farmacéuticamente aceptables en las composiciones de la invención, por ejemplo, sales minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, o sulfatos, así como sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, o benzoatos. Los sustratos de proteínas especialmente útiles son albúminas de suero, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide del tétanos, y otras proteínas bien conocidas por aquellas personas expertas en la técnica. Las composiciones de la invención pueden contener también líquidos o excipientes, tales como agua, solución salina, glicerol, dextrosa, etanol, o similares, solos o en combinación, así como sustancias tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes o agentes tamponantes del pH. Se pueden usar también liposomas como vehículo para una composición de la invención, dichos liposomas se describen anteriormente.

Si se desea, se pueden incluir moléculas coestimuladoras que potencian la presentación inmunógena de los linfocitos, tales como B7-1 o B7-2, o citoquinas tales como GN-CSF, IL-2, e IL-12, en una composición de la invención. Opcionalmente, se pueden incluir también adyuvantes en una composición. Los adyuvantes que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (véase a continuación) o componentes de pared celular bacteriana, tales como por ejemplo (a) MF59 (Publicación PCT Nº WO 90/14837), que contienen escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, y Span 85 al 0,5% (que contienen opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE), formuladas en partículas submicrométricas que usan un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,5%, polímero L121 bloqueado con pluronic al 5%, y thr-MDP (véase a continuación) microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a vortización para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, y (c) sistema adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene Escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de pared celular bacteriana procedentes del grupo constituido por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox^{TM}); (3) se pueden usar adyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas de los anteriores tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (4) Adyuvante de Freund Completo (CFA) y Adyuvante de Freund Incompleto (IFA); (5) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF); (6) mutantes detoxificados de una toxina ribosilante de ADP bacteriano tal como una toxina del cólera (CT), una toxina pertussis (PT), o una toxina de E. coli lábil al calor (LT), concretamente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; véanse, por ejemplo, los documentos WO 93/13302 y WO 92/19265; (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para potenciar la efectividad de la composición; y (8) micropartículas con macromoléculas adsorbidas, tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 00/06123 y WO/ 00/50006. Se prefieren alum y MF59. Las micropartículas tales como PLG se describen con más detalle anteriormente.

Tal como se ha mencionado anteriormente, los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), -acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, denominado como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, denominado como MTP-PE), etc.

Opcionalmente, se puede potenciar la eficiencia de liberación de los polinucleótidos E1E2 o E2 mediante la inyección de cardiotoxina, purificada a partir de veneno de Naja nigricollis, aproximadamente una semana antes de una inyección de polinucleótido E1E2 o E2. Se inyecta un músculo con entre aproximadamente 0,1 a 20 \muM de cardiotoxina disuelta en un vehículo farmacológicamente aceptable, tal como NaCl al 0,9%.

De esta manera, se pueden usar dichos polipéptidos E2 y E1/E2 y polinucleótidos recombinantes o sintéticos de HCV en vacunas y para diagnóstico. Además, tal como se detalla a continuación, los anticuerpos que aumentan frente a estos polipéptidos se pueden usar también para diagnóstico, o en inmunoterapia pasiva. Adicionalmente, los anticuerpos de estos polipéptidos son útiles para el aislamiento y la identificación de partículas de HCV.

Anticuerpos

Se pueden usar los polipéptidos o polinucleótidos E1E2 o E2 de la invención para estimular anticuerpos anti-E2 y/o anticuerpos NOB anti-E2. Se puede usar la estimulación de los anticuerpos anti-E2 y/o NOB anti-E2, entre otros, para proporcionar sistemas de modelos para optimizar las respuestas de los anticuerpos anti-E2 y/o NOB anti-E2 de HCV y proporcionar tratamiento profiláctico o terapéutico contra la infección por HCV.

Se pueden producir anticuerpos policlonales administrando la proteína de fusión a un mamífero, tal como un ratón, un conejo, una cabra, o un caballo. El suero procedente del animal inmunizado se recoge, y los anticuerpos se purifican a partir del plasma mediante, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía, preferiblemente cromatografía de afinidad. Se conocen en la técnica las técnicas para producir y procesar antisuero policlonal.

Se pueden producir también fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra los epitopos específicos de HCV presentes en las proteínas de fusión. Se pueden fusionar las células B normales de un mamífero, tal como un ratón, inmunizarse con, por ejemplo, polipéptido E1E2 o E2 con, por ejemplo, células de mieloma de ratón sensibles a HAT para producir hibridomas. Se pueden identificar los hibridomas que producen anticuerpos específicos de HCV usando RIA o ELISA y aislarse mediante clonación en agar semisólido o mediante dilución limitante. Los clones que producen anticuerpos específicos de HCV se aíslan mediante otra ronda de selección.

Los anticuerpos, monoclonales y policlonales, que se dirigen contra los epitopos de HCV, son particularmente útiles para detectar la presencia de HCV o antígenos de HCV en una muestra, tal como una muestra de suero de un ser humano infectado por HCV. Un inmunoensayo para un antígeno de HCV puede utilizar un anticuerpo o diversos anticuerpos. Un inmunoensayo para un antígeno de HCV puede usar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido hacia un epitopo de HCV, una combinación de anticuerpos monoclonales dirigida hacia los epitopos de un polipéptido de HCV, anticuerpos monoclonales dirigidos hacia los epitopos de diferentes polipéptidos de HCV, anticuerpos policlonales dirigidos hacia el mismo antígeno de HCV, anticuerpos policlonales dirigidos hacia diferentes antígenos de HCV, o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Se pueden basar los protocolos de inmunoensayo, por ejemplo, en ensayos tipo competición, reacción directa, o de sándwich usando, por ejemplo, anticuerpo marcado. Las marcas pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimioluminiscentes, o radioactivas.

Se pueden usar los anticuerpos policlonales o monoclonales adicionalmente para aislar partículas de HCV o antígenos mediante columnas de inmunoafinidad. Los anticuerpos se pueden fijar a u soporte sólido mediante, por ejemplo, adsorción o mediante enlace covalente de tal manera que los anticuerpos retengan su actividad inmunoselectiva. Opcionalmente, se pueden incluir grupos separadores de tal manera que el emplazamiento de unión del antígeno del anticuerpo permanezca accesible. A continuación se pueden usar los anticuerpos inmovilizados para unir las partículas o los antígenos de HCV procedentes de una muestra biológica, tal como sangre o plasma. Las partículas o los antígenos de HCV unidos se recuperan de la matriz de la columna mediante, por ejemplo, un cambio en el pH.

Anticuerpos NOB anti-E2

Los polipéptidos E1E2 y E2 de HCV se unen específicamente a la superficie de células que expresan un receptor análogo, por ejemplo, el CD81 humano, Flint y col. (1999) J. Virol. 73: 6235. Esta unión es potencialmente responsable de la unión de HCV y la posterior infección de las células huésped. Rosa y col. (1996) Los anticuerpos NOB anti-E2 de HCV inhiben ("neutralizan") la unión de un receptor E2 de HCV con su análogo en al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100%.

Existen al menos dos epitopos de E2 que pueden estimular una respuesta del anticuerpo NOB anti-E2. Los anticuerpos NOB anti-E2 de pacientes infectados con los tipos 1b, 2a, y 2b de HCV pueden neutralizar la unión de un polipéptido E2 a partir del tipo 1a de HCV en células de mamíferos. Por tanto, es probable que se conserve en los genomas de HCV al menos un epitopo responsable de estimular una respuesta del anticuerpo NOB anti-E2. Además, un anticuerpo monoclonal frente a la región1 hipervariable de E2 de HCV (HVR1) (aminoácidos 384-414) puede neutralizar parcialmente la unión de E2 a las células de mamíferos, sugiriendo la presencia de un epitopo en HVR1. Por tanto, al menos dos neutralizaciones de los epitopos de unión, una de ellas que es hipervariable, existen en el polipéptido E2.

Se pueden detectar anticuerpos NOB anti-E2 de HCV y/o cuantificarse usando un ensayo de anticuerpo NOB anti-E2 tal como se describe en el documento WO 96/05513; Ishii y col. (1998), y Rosa y col. (1996). El ensayo del anticuerpo NOB anti-E2 detecta la inhibición de la unión de un polipéptido E2 a las células que comprenden un receptor para un polipéptido E2 de HCV o para el CD81 soluble. Para un ensayo, un polipéptido E2 se mezcla con diluciones en serie de suero de, por ejemplo, un mamífero que se ha infectado con un HCV y/o se ha vacunado o tratado de una infección de HCV. El mamífero puede ser, por ejemplo, un ratón, un conejo, una cobaya, un macaco, un babuino, un chimpancé, o un ser humano. Se incuban el suero y el polipéptido E2. Las células, tales como la línea Molt-4 de linfoma de células T humanas, líneas celulares de hepatocarcinoma, o células B, se añaden a la mezcla y se incuban. Opcionalmente, se pueden usar las células que se han transfectado con CD81 humano. Tras el lavado, se evalúa la neutralización de la unión de E2 a las células. Se determina la presencia o cantidad de E2 unido a las células incubando las células con suero procedente de las mismas especies de mamífero que proporcionan el suero neutralizante, pero que se ha inmunizado con el polipéptido E2 concreto usado en el ensayo. A continuación se marcan las células usando un compuesto de marcado fluorescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina, rodamina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído o fluorescamina. En una forma de realización preferida, se usa antisuero de IgG conjugado con isotiocianato de fluoresceína como marca detectable. La unión de un polipéptido E2 a las células se detecta preferiblemente indirectamente usando procedimientos tales como citometría de flujo. Se define un título de anticuerpo NOB anti-E2 como la dilución de suero que da como resultado al menos un 10 a un 90%, y preferiblemente al menos un 50% de neutralización de la unión de E2 con su receptor análogo.

Anticuerpos anti-E2

Los anticuerpos anti-E2 son moléculas de anticuerpo que se unen de manera específica y estable con un polipéptido E2 de HCV o fragmento del mismo. Los anticuerpos anti-E2 de HCV se pueden detectar y/o cuantificarse usando por ejemplo, ensayos de unión directa tales como radioinmunoensayo (RIA) o ensayos ELISA. Por ejemplo, en un ensayo ELISA un polipéptido E2 se une a un soporte sólido, tal como las paredes de una placa multipocillos de plástico. Se marca una población de anticuerpos, se añade al soporte sólido y se deja unir al antígeno E2 no marcado, bajo condiciones en las que se bloquea la adsorción no específica, y cualquier anticuerpo no unido y otras proteínas se separan por lavado. La unión del anticuerpo se detecta mediante una reacción que convierte un sustrato incoloro en un producto de reacción coloreado.

Existe una correlación directa entre la generación de títulos de anticuerpos NOB anti-E2 y la protección de la infección por HVC. Rosa y col. (1991); Ishii y col. (1998). Ordinariamente, la infección por un HVC no estimula un elevado nivel mantenido de título de anticuerpo NOB anti-E2. Sin embargo, el pequeño porcentaje de individuos infectados por HVC que resuelve de manera espontánea la infección por HVC no tiene un elevado nivel mantenido de títulos de anticuerpo NOB anti-E2. De esta manera, la apariencia y el mantenimiento de títulos elevados de suero de anticuerpos NOB anti-E2 en el curso de infección crónica por HVC está correlacionado con el aclaramiento y la resolución clínica de la infección por HVC. Se ha encontrado que la generación de una respuesta de anticuerpo anti-E2 es importante para proporcionar una vacunación contra la infección por un HCV. Choo y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1294-1298. Adicionalmente, la generación de un título de anti-E1 puede ser importante en la protección de y el aclaramiento de la infección por HVC.

Se puede usar la detección y/o cuantificación de títulos de anticuerpo anti-E2 o títulos de anticuerpo NOB anti-E2 tras la liberación de un polipéptido o polinucleótido E1E2 o E2 para identificar epitopos E2 que son particularmente efectivos en la estimulación de títulos de anticuerpo anti-E2 y/o títulos de anticuerpo NOB anti-E2. Se pueden identificar los epitopos E1E2 o E2 responsables de una respuesta fuerte de anticuerpo anti-E2 y/o anticuerpo NOB anti-E2 a HCV estimulando anticuerpos anti-E2 y/o anticuerpos NOB anti-E2 dirigidos contra polipéptidos E1E2 o E2 de longitudes diferentes, por ejemplo, que terminan en el aminoácido 661, 715, 746, 749, o 809 del polipéptido de HCV, o eliminando aminoácidos del término amino del polipéptido de HCV. A continuación se pueden ensayar los anticuerpos anti-E2 y NOB anti-E2 estimulados por un epitopo concreto del polipéptido E2 usando un ensayo ELISA de anti-E2 o un ensayo del anticuerpo NOB anti-E2 para determinar qué polipéptidos contienen epitopos que son más efectivos en la generación de una respuesta fuerte. A continuación se pueden construir los polipéptidos E1E2 o las proteínas de fusión que contienen estos epitopos o polinucleótidos que codifican los epitopos y usarse para estimular una respuesta fuerte del anticuerpo anti-E2 y/o una respuesta fuerte del anticuerpo NOB anti-E2.

\vskip1.000000\baselineskip

Administración

Se puede administrar un polipéptido E1E2 o E2 o un polinucleótido E1E2 o E2 a un mamífero, tal como un ratón, por ejemplo ratones CB6/F1 o C57B1/6, conejos, cobayas, macacos, babuinos, chimpancés, o seres humanos, para estimular anticuerpos anti-E2 o NOB anti-E2 in vivo. Se prefiere la inyección de un polinucleótido E1E2 o E2. Adicionalmente a las ventajas prácticas de simplicidad de construcción y modificación, la inyección de un(os) polinucleótido(s) E1E2 o E2 da como resultado la síntesis de un polipéptido E1E2 o E2 en el huésped. De esta manera, el polipéptido E1E2 o E2 se presenta en el sistema inmune del huésped con modificaciones post-traduccionales nativas, de estructura, y conformación. Un polinucleótido E1E2 o E2 se libera preferiblemente como "ADN desnudo". La administración de un polinucleótido o un polipéptido puede ser mediante cualquier medio conocido en la técnica, que incluye la inyección intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, o subcutánea, incluyendo la inyección que usa un cañón balístico biológico ("cañón de genes"). La administración puede ser también intranasal u oral. Además, se puede acompañar l administración mediante electroporación. Véase, Mishimura (2000) Vaccine 18: 675. Preferiblemente, un polinucleótido o polipéptido E1E2 o E2 está acompañado por un vehículo de proteína para la administración oral. Se puede usar también una combinación de procedimientos de administración para estimular una respuesta del anticuerpo anti-E2 y/o NOB anti-E2.

La administración de polipéptidos E1E2 o E2 o polinucleótidos E1E2 o E2 puede estimular un título de anticuerpo anti-E2 y/o un título de anticuerpo NOB anti-E2 en el mamífero que dura al menos 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 año, o más. Opcionalmente, se puede mantener un título de anticuerpo anti-E2 o NOB anti-E2 en un mamífero proporcionando una o más inyecciones de recuerdo del polipéptido E1E2 o E2 o del polinucleótido E1E2 o E2 a 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 1 año, o más después de la inyección principal.

Preferiblemente, un polipéptido E1E2 o E2 o polinucleótido E1E2 o E2 estimula un título de anticuerpo NOB anti-E2 de al menos 1:25, 1:50, 1:70, 1:73, 1:75, 1:100, 1:140, 1:200, 1:300, 1:375, 1:400, 1:420, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1.000, 1:3.000, 1:4.000, o mayor.

Preferiblemente, un polipéptido E1E2 o E2 o polinucleótido E1E2 o E2 estimula un título de anticuerpo anti-E2 de al menos 100, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 750, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000 (título en media geométrica) o mayor.

Una composición de la invención que comprende un polipéptido E1E2 o E2, polinucleótido E1E2 o E2, o una combinación de los mismos se administra de una manera compatible con la composición concreta usada en una cantidad que es efectiva para estimular un título de anticuerpo NOB anti-E2 según se detecta mediante un ensayo NOB anti-E2 o un título de anticuerpo anti-E2 según se detecta mediante un ELISA, tal como se describe anteriormente. U polinucleótido E1E2 o E2 se inyecta preferiblemente por vía intramuscular a un mamífero grande, tal como un ser humano, a una dosis de 0,01, 0,05, 0,5, 0,75, 1,0, 2,0, 2,5, 5 o 10 mg/kg. Se pueden administrar los polipéptidos E1E2 y/o los polinucleótidos E1E2 o E2 a un mamífero que no está infectado con un HCV o se puede administrar a un mamífero infectado por HCV. Las dosificaciones concretas de los polinucleótidos E1E2 o E2 o los polipéptidos E1E2 o E2 en una composición dependerán de muchos factores que incluyen, pero no se limitan a la especie, edad, y estado general del mamífero al cual se administra la composición, y al modo de administración de la composición. Se puede determinar fácilmente una cantidad efectiva d la composición de la invención usando únicamente experimentación rutinaria. Se pueden emplear los modelos in vivo e in vitro descritos anteriormente para identificar las dosis apropiadas. La cantidad de polinucleótidos E1E2 o E2 o polipéptidos E1E2 o E2 usados en el ejemplo a continuación proporciona una directriz general que se puede usar para optimizar la estimulación de anticuerpos anti-E2 y/o NOB anti-E2. Si se desea, se pueden proporcionar también moléculas coestimuladoras o adyuvantes antes, después, o conjuntamente con las composiciones E1E2 o E2.

Se pueden potenciar las respuestas inmunes del mamífero generadas por la liberación de una composición de la invención, que incluyen la estimulación de anticuerpos anti-E2 y NOB anti-E2, variando la dosificación, ruta de administración, o regímenes de refuerzo. Se pueden proporcionar las composiciones de la invención en un calendario de dosis única, o preferiblemente en un calendario de dosis múltiples en el que un curso primario de la vacunación incluye 1-10 dosis diferentes, seguidas por otra dosis proporcionadas a intervalos de tiempo posteriores requeridos para mantener y/o reforzar una respuesta inmune, por ejemplo, a 1-3 meses para una segunda dosis, y opcionalmente 3-6 meses para una tercera dosis, y si se necesita, una dosis posterior o dosis después de algunos meses. Similarmente, en algunas formas de realización, se estimula una respuesta inmune usando una estrategia de estímulo-refuerzo (uno o más estímulos de ADN y uno o más refuerzos de proteína).

Se proporciona lo siguiente únicamente con objetivos de ejemplificación.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 La inmunización con un polipéptido o polinucleótido E2 truncado estimula un título de anticuerpo NOB anti-E2 Composiciones E2

Se ligaron los polinucleótidos que codificaban E2 de HCV de longitud completa o E2 de HCV truncado en el aminoácido 661 o 715 en el vector plásmido pnewCMV. pnewCMV es un vector de clonación basado en pUC19 que comprende los siguientes elementos: un origen de replicación SV40, un potenciador/promotor CMV humano, un intrón CMV humano, un líder activador plasminógeno de tejido humano (tPA), y un terminador poli A de la hormona de crecimiento bovina, Los vectores pnewCMV aislados y purificados que contenían un inserto de E2 se disolvieron en tampón salino al 0,9% estéril.

Se produjo de manera recombinante un polipéptido E2 truncado en el aminoácido 715 y se purificó usando una columna de S-Sefarosa. El polipéptido E2 truncado en el aminoácido 661 es un polipéptido segregado producido de manera recombinante disponible de Abbott Laboratories.

Se obtuvo cardiotoxina, purificada de veneno de Naja nigricollis de Latoxin (Francia). Se diluyó la cardiotoxina en NaCl al 0,9% hasta una concentración final de 10 \muM.

\vskip1.000000\baselineskip

Inmunización

Se dividieron ratones CB6/F1 en 6 grupos de 10 ó 12 ratones cada uno. El grupo 1 de ratones recibió inyecciones de 100 \mug de ADN de plásmido que contenía un polinucleótido que codificaba E2 de longitud completa (ADN de pnewCMVE2-746). El grupo 2 recibió inyecciones de 100 \mug de ADN de plásmido que contenía un polinucleótido que codificaba E2 truncado en el aminoácido 715 (ADN de pnewCMVE2-715). El grupo 3 recibió inyecciones de 100 \mug de ADN de plásmido que contenía un polinucleótido que codificaba E2 truncado en el aminoácido 661 (ADN de pnewCMVE2-661). El grupo 4 recibió inyecciones de 1 \mug de polipéptido E2 truncado en el aminoácido 715 (CHO E2-715 1 \mug). El grupo 5 recibió inyecciones de 1 \mug de polipéptido E2 truncado en el aminoácido 661 (CHO E2-661). El grupo 6 recibió inyecciones de 5 \mug de polipéptido E2 truncado en el aminoácido 715 (CHO E2-715 5 \mug). Se administraron las composiciones E2 de acuerdo con el calendario de la Tabla 1.

1

\newpage

La cardiotoxina, 0,05 ml de solución 10 \muM, se inyectó por vía intramuscular en cada músculo tibial anterior de ratón. El plásmido E2 en solución salina al 0,9% (1 mg/ml) se inyectó por vía intramuscular en cada músculo tibial anterior de ratón (0,05 ml en cada músculo), para un total de aproximadamente 100 \mug de ADN inyectado. El polipéptido E2 a aproximadamente 0,02 mg/ml ó 0,1 mg/ml se combinó 1:1 con adyuvante MF59-0 y se inyectaron 0,05 ml por vía intramuscular en cada músculo tibial anterior, para un total de aproximadamente 1 \mug o 5 \mug de polipéptido inyectado. Para los ratones de los grupos 1-5, se obtuvieron 0,2 ml de sangre de cada ratón en el día 21, día 43, día 99. Para los ratones del grupo 6, se obtuvieron 0,2 ml de sangre de cada ratón en el día 55 y el día 83.

Detección y medida de títulos de NOB anti-E2

Se produjo polipéptido E2 recombinante y se purificó a partir de células de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban el ADN complementario de tipo Ia de HCV (ADNc) que codificaba la región de envoltura de E2 (aminoácidos 384-715). Se aglomeraron células Molt-4 (10^{5} por pocillo) en microplacas de fondo en U de 96 pocillos mediante centrifugación a 200 x g durante 5 minutos a 4ºC. Se mezclaron 20 \mul de polipéptido E2 diluido en PBS a diferentes concentraciones con diversas diluciones de suero de ratones que se había infectado con HCV o se habían inmunizado con proteínas recombinantes de HCV. Tras la incubación a 4ºC durante 1 hora, se añadieron las células Molt-4 y se incubaron durante 1 hora a 4ºC. Las proteínas y los anticuerpos de HVC no unidos se eliminaron mediante dos centrifugaciones en PBS a 200 x g durante 5 minutos a 4ºC. Las células se incubaron posteriormente durante 30 minutos a 4ºC con dilución 1/100 del suero de ratones que se habían inmunizado con las proteínas recombinantes de la envoltura de HCV. Cuando fue posible, se usó el suero preinmune correspondiente como controles. Se lavaron las células dos veces en PBS y se incubaron durante 30 minutos con las diluciones apropiadas del antisuero de IgG conjugado con isotiocanato de fluoresceína. Se lavaron las células en PBS a 4ºC y se volvieron a suspender en 100 \mul de PBS.

Se analizó la fluorescencia unida a célula con un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson) usando el programa de software Lysis II de Becton Dickinson. Se calculo la intensidad promedio de fluorescencia (MFI) de la población celular. La MFI se relaciona directamente con la densidad superficial de proteínas de HCV marcadas fluorescentemente unidas a las células. En este ejemplo, el título del anticuerpo NOB se define como la dilución de suero que muestra un 50% de neutralización de la unión de E2.

Se informa en la Tabla 2 del promedio de título de anticuerpo NOB anti-E2 de ratones que presentan un título NOB. Se muestra entre corchetes el número de ratones de cada grupo que presentan un título de anticuerpo NOB anti-E2 bajo el promedio del título de anticuerpo NOB anti-E2.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Título de anticuerpo NOB anti-E2 al 50%

2

La Tabla 2 demuestra que la inmunización con ADN de plásmido que codifica E2 y los truncamientos del mismo estimulan un título de anticuerpo NOB anti-E2. Se estimuló un título de anticuerpo NOB anti-E2 incluso aunque se liberó E2 mediante el ADN del plásmido. No se había demostrado anteriormente que los anticuerpos NOB anti-E2 se estimulasen mediante plásmidos que comprenden polipéptidos E2 de longitud completa. La Tabla 2 demuestra que la inmunización con polipéptidos E2 estimula un título de anticuerpo NOB anti-E2, incluso aunque los polipéptidos E2 se trunquen en el aminoácido 715 ó 661.

Ejemplo 2 La inmunización con ADN que codifica un polipéptido E1E2 estimula un título de anticuerpo NOB anti-E2 Composiciones E1E2

Se ligaron polinucleótidos que codificaban E1E2 en un vector plásmido pnewCMV. Los polinucleótidos codificaban los aminoácidos 192-746 (pnewCMVE1E2-746), los aminoácidos 192-749 (pnewCMVE1E2-749), los aminoácidos 192-809 (pnewCMVE1E2-809) de una poliproteína HCV (aminoácidos numerados en relación a HCV-1). Los vectores pnewCMV aislados y purificados que contenían un inserto E1E2 se disolvieron en tampón salino al 0,9% estéril.

Inmunización

Se inyectó cardiotoxina por vía intramuscular a los grupos de ratones CB6/F1 a las 0,4, y 8 semanas tal como se describe en el Ejemplo 1. Se inyectó a los ratones 100 \mug de ADN de plásmido (pnewCMVE1E2-746, pnewCMVE1E2-749, o pnewCMVE1E2-809) a las 1, 5, y 9 semanas tal como se describe en el Ejemplo 1.

Detección y medida de título NOB anti-E2

Se determinó el promedio del título de anticuerpo NOB anti-E2 de cada grupo de ratones tal como se describe en el Ejemplo 1. En la Tabla 3 se muestran los resultados. Se muestra entre corchetes el número de ratones de cada grupo que presentan un título de anticuerpo NOB anti-E2 bajo el promedio del título de anticuerpo NOB anti-E2.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Título de anticuerpo NOB anti-E2 al 50%

3

La Tabla 3 demuestra que la inmunización con ADN de plásmido que codifica E1E2 estimula un título de anticuerpo NOB anti-E2. Se estimuló un título de anticuerpo NOB anti-E2 incluso aunque se liberara E1E2 mediante el ADN de plásmido. No se había demostrado anteriormente que los anticuerpos NOB anti-E2 se estimulasen por plásmidos que comprenden polipéptidos E1E2 de longitud completa.

Ejemplo 3 La inmunización con ADN que codifica un polipéptido E1E2 o ADN que codifica un polipéptido E2 estimula un título de anticuerpo anti-E2 Composiciones E1E2 y E2

Se preparó el ADN de los plásmidos pnewCMVE2-746, pnewCMVE1E2-746, pnewCMVE1E2-749, y
pnewCMVE1E2-809 tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2.

Inmunización

Se inyectó cardiotoxina por vía intramuscular a los grupo de ratones CB6/F1 a las 0, 4, y 8 semanas tal como se describe en el Ejemplo 1. Se inyectó a los ratones 100 \mug de ADN de plásmido (pnewCMVE2-746, pnewCMVE1E2-746, pnewCMVE1E2-749, o pnewCMVE1E2-809) a las 1, 5, y 9 semanas tal como se describe en el Ejemplo 1.

Detección y medida de los títulos de anticuerpo anti-E2

Se llevó a cabo mediante ELISA la detección y medida de los anticuerpos anti-E2, esencialmente tal como se describe en Ishii y col. (1998) Hepatology 28: 1117-20, y Tedeschi y col. (1997) Hepatology 25: 459-462. De manera breve, se diluyeron los antígenos E2 o E1/E2 de HCV, producidos a partir de células CHO recombinantes, en PBS y se recubrieron en los pocillos de las placas de microvaloración. Los sueros del ratón de ensayo se diluyeron en un diluyente muestra y se incubaron en las placas durante una hora a 37ºC. Se lavaron los pocillos con tampón de lavado de placas. Se añadió a cada pocillo anticuerpo IgG murino anti-humano monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano picante. Se añadieron a los pocillos diclorhidrato de O-fenilenodiamina (OPD) y peróxido de hidrógeno. Los resultados se leen usando un lector de placas de microvaloración a 492/620 nm (Tetertek MCC/340; Flow Laboratories). Se determinaron los valores de densidad óptica de corte (DO) para estos antígenos como el promedio de muestras negativas (extraídas con antelación) más siete veces la desviación estándar de la DO promedio. Se determinaron los títulos de las muestras ensayadas como el intervalo relativamente lineal de la señal DO/corte de DO multiplicado por los factores de dilución. Se informa en la Tabla 4 la media geométrica (GMT) del título.

TABLA 4

4

La Tabla 4 demuestra que la inmunización con ADN de plásmido que codifica E1E2 o E2 estimula un título de anticuerpo anti-E2. Se estimuló un título de anticuerpo anti-E2 incluso aunque se liberara E1E2 o E2 de longitud completa mediante el ADN del plásmido. No se había demostrado anteriormente que los anticuerpos anti-E2 se estimulasen mediante plásmidos que comprenden polipéptidos E1E2 o E2 de longitud completa, en los que el polipéptido no comprende un polipéptido p7.

Ejemplo 4 Inmunización con ADN liberado de PLG

Se obtuvieron polímeros de poliláctido-co-glicólido (PLG) de Boehringer Ingelheim, EE.UU. El polímero PLG usado en este estudio fue RG505, que tiene una relación de copolimerización de 50/50 y un peso molecular de 65 kDa (datos de los fabricantes). Se prepararon micropartículas catiónicas con ADN absorbido usando un procedimiento de evaporación de solvente modificado, esencialmente tal como se describe en Singh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 811-816. De manera breve, se prepararon las micropartículas emulsificando 10 ml de una solución polimérica al 5% p/v en cloruro de metileno con 1 ml de PBS a velocidad elevada usando un homogeneizador IKA. A continuación se añadió la emulsión primaria a 50 ml de agua destilada que contenía bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) (0,5% p/v). Esto dio como resultado la formación de una emulsión agua/aceite/agua que se agitó a 6000 rpm durante 12 horas a temperatura ambiente, dejando evaporar el cloruro de metileno. Las micropartículas resultantes se lavaron dos veces en agua destilada mediante centrifugación a 10.000 g y se criocongelaron. Tras la preparación, lavado y recogida, se adsorbió el ADN sobre las micropartículas incubando 100 mg de micropartículas catiónicas en 1 mg/ml de solución de ADN a 4ºC durante 6 horas. A continuación se separaron las micropartículas mediante centrifugación, se lavo el residuo con tampón TE y se criocongelaron las micropartículas, se volvieron a suspender y se administraron a sujetos animales.

Se midieron los títulos de anticuerpo mediante ensayos ELISA tal como se describe en el presente documento. Las Figuras 1 y 2 muestran los resultados de la inmunización con PLG usando los siguientes constructos de ADN: constructos que codifican los aminoácidos 384-746 (E2) y 192-746 (E1E2) de una poliproteína HCV. Las Figuras 3 y 4 muestran los resultados de la inmunización con PLG usando constructos que codifican los aminoácidos 384-749 (E2) y 192-749 (E1E2) de una poliproteína HCV. Los resultados demuestran que la inmunización de ratones usando ADN de PLG/E1E2 da como resultado unos títulos elevados de anticuerpo.

Claims

1. Uso de un polinucleótido que codifica el antígeno E2 o E1E2 seleccionado entre el grupo constituido por los aminoácidos 384-746 de una poliproteína HCV; los aminoácidos 384-749 de una poliproteína HCV; los aminoácidos 192-746 de una poliproteína HCV; los aminoácidos 192-809 de una poliproteína HCV; los aminoácidos 192-749 de una poliproteína HCV, en el que el antígeno E2 y E1E2 no se segrega y en el que E2 es de longitud completa, en la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmune que genera al menos una neutralización del anticuerpo de unión (NOB) frente a un antígeno E2 o E1E2 del virus de la hepatitis C (HCV) en un sujeto.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica un polipéptido E1E2.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el polinucleótido codifica un polipéptido E2 de longitud completa.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polinucleótido es un plásmido.

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sujeto está infectado con un HCV.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sujeto no está infectado con un HCV.

7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medicamento es para la administración con una cardiotoxina.

8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el medicamento es para la administración usando una micropartícula.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que la micropartícula es una partícula de PLG.

10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el sujeto es un mamífero.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que el mamífero se selecciona entre el grupo constituido por un ratón, un conejo, una cobaya, un macaco, un babuino, un chimpancé, y un ser humano.

12. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el medicamento es para la administración usando un dispositivo de liberación por inyección intravenosa rápida.

13. El uso de de la reivindicación 1, en el que el medicamento es para la administración mediante un procedimiento seleccionado entre el grupo constituido por la administración intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, oral, e intradérmica.

14. El uso de la reivindicación 1, en el que la neutralización del anticuerpo de unión inhibe la unión de un polipéptido E2 con su receptor análogo en una cantidad que es mayor en relación a la unión del polipéptido E2 con su receptor análogo en ausencia de la neutralización del anticuerpo de unión.

15. El uso de la reivindicación 1, que comprende además la etapa in vitro de detectar la neutralización del anticuerpo de unión.

16. El uso de la reivindicación 1, en el que la neutralización del anticuerpo de unión inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:70.

17. El uso de la reivindicación 1, en el que la neutralización del anticuerpo de unión inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:140.

18. El uso de la reivindicación 1, en el que la neutralización del anticuerpo de unión inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:300.

19. El uso de la reivindicación 1, en el que la neutralización del anticuerpo de unión inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:600.

20. El uso de la reivindicación 1, en el que la neutralización del anticuerpo de unión inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:800.

21. El uso de la reivindicación 1, en el que la neutralización del anticuerpo de unión inhibe la unión del polipéptido E2 en al menos un 50% a una dilución de al menos 1:3000

22. El uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento es para la administración con un polipéptido codificado por el polinucleótido.