CN1984677A - 截短的丙肝病毒ns5结构域以及含有该截短结构域的融合蛋白 - Google Patents

截短的丙肝病毒ns5结构域以及含有该截短结构域的融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明提供截短的HCV NS5多肽和包含截短的NS5多肽的融合蛋白，在所述融合蛋白中截短的NS5多肽融合于衍生自HCV多蛋白的另一个区域的至少一个其它HCV表位。所述融合蛋白可用于刺激对HCV的免疫应答反应的方法中，例如刺激对HCV的细胞免疫应答反应的方法中，如激活丙肝病毒(HCV)特异性T细胞，包括CD4+和CD8+T细胞。该方法可用于模型系统中以发展HCV特异性免疫原性组合物，以及免疫动物以抗HCV。

Description

截短的丙肝病毒NS5结构域以及含有该截短结构域的融合蛋白
技术领域
本发明涉及丙肝病毒(HCV)多肽。更具体地说，本发明涉及截短的HCVNS5多肽和含有该截短的NS5多肽的融合蛋白。这些蛋白可用于刺激免疫应答反应(如细胞介导的免疫应答反应)、引发和/或激活HCV特异性T细胞、以及用于诊断试剂。
背景技术
丙肝病毒(HCV)感染是一个严重的健康问题，世界上约有1％的人感染该病毒。超过75％的急性感染患者最终发展成可导致肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的慢性携带者状态。见，Alter等，(1992)N.Engl.J.Med.327：1899-1905；Resnick和Koff.(1993)Arch.Intem.Med.153：1672-1677；Seeff(1995)Gastrointest.Dis.6：20-27；Tong等，(1995)N.Engl.J.Med.332：1463-1466。
HCV最初被Houghton等发现和鉴定为NANBH的病因。由于获得序列的方法已知，HCV的病毒基因组序列已知。参见例如国际公开号WO89/04669；WO90/11089和WO90/14436。HCV有9.5kb的正义、单链RNA基因组且是黄病毒(Flaviridae)家族的成员。在系统发生分析的基础上已鉴定了至少六个不同但相关的HCV基因型(Simmonds等，J.Gen.Virol.(1993) 74：2391-2399)。这些病毒编码具有超过3000个氨基酸残基的单个多蛋白(Choo等，Sciencel.(1989) 244：359-362；Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991) 88：2451-2455；Han等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1991) 88：1711-1715)。在翻译中和翻译后，该多蛋白被加工成结构和非结构(NS)蛋白质。
特别地，如图1所示，HCV基因组编码几个蛋白。HCV多蛋白裂解产物的顺序和名称如下：NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。多蛋白最初的裂解由宿主蛋白酶催化，蛋白酶释放三种结构蛋白以及含病毒酶的非结构(NS)蛋白，所述三种结构蛋白是N-末端核壳蛋白(称为“核心”)和两种包膜糖蛋白“E1”(也称为E)及“E2”(也称为E2/NS1)。NS区域命名为NS2、NS3、NS4和NS5。NS2是具蛋白水解活性的整合膜蛋白，它与NS3一起裂解NS2-NS3 sissle键，从而产生NS3 N-末端并释放包括丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的大的多蛋白。NS3蛋白酶用于加工剩余的多蛋白。在这些反应中，NS3释放NS3辅因子(NS4a)、两种蛋白(NS4b和NS5a)和RNA-依赖的RNA聚合酶(NS5b)。多蛋白成熟的完成开始于NS3丝氨酸蛋白酶催化的在NS3-NS4a连接处的自身催化裂解。
尽管在针对某些病毒例如HIV的药物研发方面取得了很大的进展，但是在控制急性和慢性HCV感染方面少有成功。(Hoofnagle和di Bisceglie(1997)N.Engl.J.Med.336：347-356)。具体地，认为细胞免疫应答反应(如强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答反应)对控制和根除HCV感染非常重要。
能够产生细胞免疫应答反应的免疫原性HCV融合蛋白描述于国际专利申请WO/2004/005473和美国专利号6,562,346；6,514,731和6,428,792。然而，本领域仍然需要刺激对HCV的免疫应答反应如细胞免疫应答反应的其它有效方法。
发明概述
本发明的一个目的是提供用于刺激免疫应答的试剂和方法，如刺激对HCV的细胞免疫应答反应的试剂和方法，例如引发和/或激活识别HCV多肽表位的T细胞的试剂和方法。本发明的另一个目的是提供防止和/或治疗HCV感染的组合物。本发明的另一个目的是提供用于检测生物样品中是否存在HCV的诊断检测的试剂和方法。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及C末端截短的NS5多肽，其中所述多肽含有全长NS5a多肽和NS5b多肽的N末端部分。在某些实施方式中，所述多肽是在氨基酸2500和C末端之间的位置截短的多肽(编号相对于全长HCV-1多蛋白)，如在氨基酸2900和C末端之间截短，或在对应于紧随氨基酸2990之后的氨基酸的氨基酸处截短(编号相对于全长HCV-1多蛋白)。
在另一个实施方式中，所述多肽由对应于氨基酸1973-2990的氨基酸序列组成，编号相对于全长HCV-1多蛋白。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种免疫原性融合蛋白，其含有上述任意实施方式的C末端截短的NS5多肽、以及衍生自HCV多蛋白非NS5区域的另一个区域的至少一种多肽。
在另一个实施方式中，所述蛋白还含有修饰的NS3多肽，其含有对应于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代(编号相对于全长HCV-1多蛋白)，从而当修饰的NS3多肽存在于HCV融合蛋白中时，蛋白酶活性被抑制。在某些实施方式中，修饰的NS3多肽含有在对应于Ser-1165的氨基酸处的丙氨酸取代(编号相对于全长HCV-1多蛋白)。
在另一个实施方式中，所述蛋白含有修饰的NS3多肽、NS4多肽和任选地HCV核心多肽。
在另一个实施方式中，所述核心多肽含有C末端截短。在某些实施方式中，所述核心多肽由图3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列组成。
在另一个实施方式中，融合蛋白还含有E2多肽。在某些实施方式中，所述E2多肽是C末端截短的E2多肽，由对应于氨基酸384-715的氨基酸序列组成(编号相对于全长HCV-1多蛋白)。
在另一个实施方式中，融合蛋白中的多肽衍生自相同的HCV分离物。在其它实施方式中，融合蛋白中存在的至少一种多肽与C末端截短的NS5多肽衍生自不同的分离物。
在另一些实施方式中，本发明涉及一种免疫原性融合蛋白，其在氨基末端至羧基末端方向基本由以下多肽组成：
(a)修饰的NS3多肽，其含有在对应于Ser-1165的氨基酸处的丙氨酸取代(编号相对于全长HCV-1多蛋白)，从而抑制蛋白酶活性；
(b)NS4多肽；
(c)C末端截短的NS5多肽，其中所述NS5多肽由对应于氨基酸1973-2990的氨基酸序列组成(编号相对于全长HCV-1多蛋白)；和
(d)任选地，HCV核心多肽。
在其它实施方式中，本发明涉及一种免疫原性融合蛋白，其在氨基末端至羧基末端方向基本由以下多肽组成：
(a)C末端截短的E2多肽，由对应于氨基酸384-715的氨基酸序列组成(编号相对于全长HCV-1多蛋白)；
(b)修饰的NS3多肽，含有在对应于Ser-1165的氨基酸处的丙氨酸取代(编号相对于全长HCV-1多蛋白)，从而抑制蛋白酶活性；
(c)NS4多肽；
(d)C末端截短的NS5多肽，其中所述NS5多肽由对应于氨基酸1973-2990的氨基酸序列组成(编号相对于全长HCV-1多蛋白)；和
(e)任选地，HCV核心多肽。
在某些实施方式中，上述融合蛋白含有HCV核心多肽。在一些实施方式中，所述核心多肽含有C末端截短，如由图3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列组成的核心多肽。
在其它实施方式中，本发明涉及一种组合物，其含有根据上述任一实施方式的C末端截短的NS5多肽，或根据上述任一实施方式的融合蛋白，以及药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，该组合物包含免疫原性HCV多肽，如HCV E1E2复合物。E1E2复合物可与NS5多肽分开提供，或与包含NS5多肽的融合蛋白分开提供。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种在脊椎动物对象中刺激细胞免疫应答反应的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的上述组合物。
在其它实施方式中，本发明涉及产生组合物的方法，所述方法包括将根据上述任意实施方式的C末端截短的NS5多肽、或根据上述任意实施方式的融合蛋白与药学上可接受的赋形剂组合。
在另一些实施方式中，本发明涉及一种多核苷酸，其含有编码根据上述任意实施方式的C末端截短的NS5多肽的编码序列，或编码根据上述任意实施方式的免疫原性融合蛋白的编码序列。
在另一些实施方式中，本发明涉及一种重组载体，其含有：
(a)上述的多核苷酸；和
(b)与所述多核苷酸可操作性连接的至少一种控制元件，从而编码序列能够在宿主细胞中被转录和翻译。
在另一个实施方式中，本发明涉及含有上述重组载体的宿主细胞。
在另一些实施方式中，本发明涉及一种制备免疫原性C末端截短的NS5多肽或含有该多肽的免疫原性融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述蛋白的条件下培养如上所述的宿主细胞群。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种增强HCV NS5多肽的产量的方法，所述方法包括在产生所述蛋白的条件下培养如上所述的宿主细胞群，其中与相同条件下产生的全长NS5多肽相比，所述蛋白的产量更大。
在阅读了本发明公开内容之后，本发明的这些和另外的实施方式对本领域一般技术人员是显而易见的。
附图简述
图1图示HCV基因组，表示HCV多蛋白的各区域。
图2(SEQ ID NO：3和4)表示代表性的天然、未修饰的NS3蛋白酶结构域的DNA和相应氨基酸序列。
图3(SEQ ID NO：5和6)表示代表性的修饰的融合蛋白的DNA和相应氨基酸序列，所述修饰的融合蛋白中从N末端删除了NS3蛋白酶结构域，该修饰的融合蛋白包含C末端核心的氨基酸1-121。
图4A和4B表示酿酒酵母(S.cerevisiae)AD3菌株中，NS5tCore121(NS5的氨基酸1973-2990和核心的1-121)和NS5Core121(全长NS5，NS5的氨基酸1973-3011和核心的1-121)表达水平的比较。图4A表示25℃时的表达水平，图4B表示30℃的表达水平。泳道1，标准品；泳道2，质粒对照；泳道3，编码NS5tCore121(克隆6)的质粒；泳道4，编码NS5tCore121(克隆7)的质粒；泳道5，编码NS5Core121(克隆8)的质粒；泳道6，编码NS5Core121(克隆9)的质粒；泳道7，标准品。
图5A-5E(SEQ ID NO：7和8)表示代表性融合蛋白的DNA和相应氨基酸序列，所述融合蛋白包含C末端截短的NS5多肽，其中NS5多肽的C末端融合于核心多肽。具体地说，所述C末端截短的NS5多肽含有HCV多蛋白的氨基酸1973-2990(编号相对于HCV-1)(见，Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2451-2455)，融合于包含HCV多蛋白的氨基酸1-121的核心多肽。
发明详述
除非另外说明，本发明的实施将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：a LaboratoryManual)，第二版，1989；《酶学方法》(Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；《DNA克隆》(DNA Cloning)，第I卷和第II卷(D.N.Glover主编)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait主编)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames &S.J.Higgins主编)；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)(R.K.Freshney主编)；Perbal，B.，《分子克隆实践指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)。
必须注意的是，如本说明书和权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”、“该”包括复数参考，除非内容明显说明不包括复数参考。因此，例如，“一多肽”包括两个或多个多肽的混合物等。
文中使用了下列氨基酸缩写：
丙氨酸：Ala(A)    精氨酸：Arg(R)
天冬酰胺：Asn(N)  天冬氨酸：Asp(D)
半胱氨酸：Cys(C)  谷氨酰胺：Gln(Q)
谷氨酸：Glu(E)    甘氨酸：Gly(G)
组氨酸：His(H)    异亮氨酸：Ile(I)
亮氨酸：Leu(L)    赖氨酸：Lys(K)
甲硫氨酸：Met(M)  苯丙氨酸：Phe(F)
脯氨酸：Pro(P)    丝氨酸：Ser(S)
苏氨酸：Thr(T)    色氨酸：Trp(W)
酪氨酸：Tyr(Y)    缬氨酸：Val(V)
I.定义
在本发明的描述中，使用了下列术语，并如下定义。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，并不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在该定义中。全长的蛋白质及其片段包括在该定义中。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，为了本发明的目的，“多肽”指包括天然序列的修饰，例如缺失、添加和取代(通常性质保守)，只要蛋白质维持所需活性。这些修饰可以是经过设计的，如通过定点诱变，或可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主突变，或由于PCR扩增引起的错误。
HCV多肽是一种如上所述的衍生自HCV多蛋白的多肽。该多肽不需要物理衍生自HCV，可以合成或重组产生。另外，该多肽可衍生自任何各种HCV株和分离物，包括具有Simmonds等，J.Gen.Virol(1993)74：2391-2399所述的6种HCV基因型(例如株1、2、3、4等)中任意基因型的分离物，以及新发现的分离物，和这些分离物的亚型，如HCV1a和HCV1b等。在这些株之间已知有许多保守和可变的区域，一般当两条序列排列时，衍生自这些区域的表位的氨基酸序列将具有高度的序列同源性，例如高于30％，优选高于40％的氨基酸序列同源性。因此，例如术语“NS5”多肽指任何各种HCV株的天然NS5、以及NS5类似物、突变蛋白和免疫原性片段(如下进一步定义)。
术语“类似物”和“突变蛋白”指参照分子的保留了所需活性(如下所述的刺激细胞介导的免疫应答反应的能力)的生物活性衍生物，或这些衍生物的片段。在修饰的NS3的情况下，“类似物”或“突变蛋白”指缺乏天然蛋白水解活性的NS3分子。通常，术语“类似物”指具有天然多肽序列和结构，以及相对于天然分子的一个或多个氨基酸添加、取代(通常是性质保守的取代，在修饰的NS3的情况下，在活性蛋白水解位点的性质非保守的取代)和/或缺失的化合物，只要修饰不破坏免疫原性的活性。术语“突变蛋白”指具有一种或多种肽模拟物(“拟肽”)的肽。优选类似物或突变蛋白至少具有与天然分子相同的免疫活性。制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的，如下进一步描述。
如上所述，类似物一般包括性质上保守的取代，即这些取代发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。具体而言，氨基酸一般被分成四类：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测：单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸对氨基酸作出类似的保守取代，这样的取代将不会对生物活性有重要影响。例如，感兴趣的多肽可包括多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多达约15-25个保守的或不保守的氨基酸取代，或5-25之间任何整数，只要该分子的所需功能仍维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。
“C末端截短的NS5多肽”指包含全长NS5a多肽和NS5b多肽的N末端部分、但不包含全长NS5b区域的NS5多肽。下面提供了C末端截短的NS5多肽的具体例子。
“修饰的NS3”指具有修饰从而破坏了NS3多肽的蛋白酶活性的NS3多肽。所述修饰可包括相对于天然分子的一个或多个氨基酸添加、取代(通常是性质上非保守的取代)和/或缺失，其中破坏了NS3多肽的蛋白酶活性。下面描述了检测蛋白酶活性的方法。
术语“片段”指仅由完整的全长多肽序列和结构的一部分组成的多肽。该片段可包括该天然多肽的C末端缺失和/或N末端缺失。特定的HCV蛋白的“免疫原性片段”一般包括至少该全长分子的约5-10个连续的氨基酸残基，较佳至少含有该全长分子的约15-25个连续的氨基酸残基，最佳至少含有该全长分子的约20-50个或以上的连续的氨基酸残基，这些氨基酸残基限定了一个表位；或者含有5个氨基酸和全长序列之间的任何整数，只要所述的片段在下文所述的检测中保留免疫活性。
术语“表位”在文中指至少约有3-5个、较佳地约5到10或15个、但不超过约1000个氨基酸(或其中的任何整数)的序列；它定义了一条序列，该序列自身或作为较大序列的一部分与在对其应答中产生的抗体结合。该片段的长度没有严格的上限，它几乎可包含全长的蛋白质序列，或甚至包括含有HCV多蛋白的两个或多个表位的融合蛋白。用于本发明的表位并不限于具有衍生了它的母体蛋白质部分的确切序列的多肽。实际上，病毒基因组处于恒定流动的状态，且含有几种在隔离种群间具有相对高度易变性的可变结构域。因而，术语“表位”包括与天然序列相同的序列，以及该天然序列的修饰物，如缺失、添加和取代(通常性质保守)。
可使用任何数量的本领域周知的表位作图技术来鉴别包括表位在内的给定多肽的区域。参见，如《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)中的表位作图程序，第66卷(Glenn E.Morris编辑，1996)，Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，通过如同时在固相支持物上合成大量的肽，对应于蛋白质分子的部分的肽，在这些肽仍连接于该支持物时使肽与抗体反应，就可测定各线性表位。这些技术在本领域中是已知的，并在美国专利No.4，708，871；Geysen等(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81：3998-4002；Geysen等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：178-182；Geysen等(1986)，Molec.Immunol.， 23：709-715中有所描述。类似地，通过使用如X-射线结晶学和二维核磁共振法测定氨基酸的空间构象容易地鉴定构象表位。参见如“表位作图流程”，同上。还可使用标准抗原性曲线图和亲水性图(如用从Oxford Molecular Group获得的Omiga 1.0版软件程序计算得到的)来鉴别蛋白质的抗原区域。此计算机程序采用Hopp/Woods方法(Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981)， 78：3824-3828)确定抗原性图谱，并用Kyte-Doolittle技术(Kyte等，J.Mol.Biol.(1982)， 157：105-132)绘制亲水性图。
关于各种HCV表位的描述，可参见Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：10011-10015；Chien等，J.Gastroent.Hepatol.(1993)8：S33-39；Chien等，国际出版物No.WO93/00365；Chien，D.Y.，国际出版物No.WO94/01778；和美国专利6280927和6150087。
本文所用术语“T细胞表位”指肽结构的特征，其能够诱导对该肽结构或相关半抗原的T细胞免疫。T细胞表位通常包含线形肽决定簇，设想其在MHC分子的肽结合夹缝中呈长形构象，(Unanue等，Science(1987) 236：551-557)。多肽向MHC II类相关线形肽决定簇(通常长度为5-14个氨基酸)的转变称为“抗原加工”，该过程是由抗原呈递细胞(APC)完成的。更具体地，T细胞表位是由短肽结构的局部特征限定的，如涉及电荷和疏水性的主要氨基酸序列特性，以及不依赖于整个多肽折叠的某些类型的二级结构，如螺旋结构。另外，据信能够被辅助性T细胞识别的短肽通常是两亲结构，包括疏水端(与MHC分子相互作用)和亲水端(与T细胞受体相互作用)(Margalit等，T细胞表位的计算机预测(Computer Predictionof T-cell Epitopes)， New Generation Vaccines Marcel-Dekker，Inc，主编，G.C.Woodrow等，(1990)109-116页)，并且这些两亲结构有α-螺旋构型(见，例如，Spouge等，J.Immunol.(1987) 138：204-212；Berkower等，J.Immunol.(1986)136：2498-2503)。
因此，可用很多计算机程序容易地预测包括T细胞表位的蛋白区段。(见例如，Margalit等，T细胞表位的计算机预测(Computer Prediction of T-cell Epitopes)，New Generation Vaccines Marcel-Dekker，Inc，主编.G.C.Woodrow等，(1990)109-116页)。这些程序通常将肽的氨基酸序列与已知诱导T细胞应答反应的序列比较，并搜索据信为T细胞表位所需的氨基酸模式。
对HCV抗原(包括体内表达的多肽和编码多肽的多核苷酸)或组合物的“免疫应答反应”是指在对象中发展出针对感兴趣组合物中存在的分子的体液和/或细胞免疫应答反应。为了本发明目的，“体液免疫应答”指抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导。细胞免疫的一个重要方面包括细胞毒性T细胞(“CTLs”)的抗原-特异性应答反应。CTLs对与主要组织相容性复合体(MHC)编码的蛋白质一起呈递并在细胞表面表达的肽抗原有特异性。CTLs有助于诱导和促进细胞内微生物的胞内破坏或感染这些微生物的细胞裂解。CD8+和CD4+T细胞两者都能够杀死HCV感染的细胞。细胞免疫的另一方面包括辅助性T细胞的抗原-特异性反应。辅助性T细胞发挥作用来协助刺激非特异性效应细胞的功能并集中其活性来对抗在其表面展示和MHC分子一起的肽抗原的细胞。“细胞免疫应答”也指由活化的T细胞和/或其它白细胞产生的抗病毒的细胞因子、趋化因子和其它这类分子(包括那些来自于CD4+和CD8+T细胞的分子，包括但不限于IFN-γ和TNF-α)的产生。
引发细胞免疫应答的组合物或疫苗可通过将MHC分子相关抗原呈递到细胞表面来致敏脊椎动物对象。细胞介导的免疫应答直接位于或接近在其表面呈递抗原的细胞。此外，可产生抗原特异性T-淋巴细胞来进一步保护免疫的宿主。
特定抗原刺激细胞介导的免疫应答的能力可通过许多试验测定，例如通过淋巴组织增生(淋巴细胞激活)试验、CTL细胞毒性细胞试验或通过测定对致敏对象中的抗原特异的T-淋巴细胞。这种试验是本领域熟知的。参见，例如Erickson等，J.Immunol.(1993) 151：4189-4199；Doe等，Eur.J.Immunol.(1994) 24：2369-2376。
因此，本文所用免疫应答可以是刺激CTL产生的免疫应答，和/或是刺激辅助性T细胞产生或活化的免疫应答。感兴趣抗原也可引起抗体介导的免疫应答反应。因此，免疫应答可包括下列效果的一种或多种：B细胞产生抗体；和/或抑制子T细胞和/或γδT细胞的活化，这些细胞对感兴趣组合物或疫苗中存在的一种或几种抗原特异。这些应答反应可用于中和传染性和/或介导抗体-补体反应或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)以对宿主保护(即预防)或症状的或缓解(即治疗)。这些反应可用本领域熟知的标准免疫测定和中和试验确定。
“等效抗原决定簇”指来自HCV的不同亚种或株的抗原决定簇，例如HCV株1、2、3等，因为序列变异，这些抗原决定簇不一定完全相同，但是这些决定簇只发生在所述HCV序列的等效位置。通常，等效抗原决定簇的氨基酸序列具有高度的序列同源性，例如当两个序列对比时，具有大于30％的氨基酸序列同源性，较佳地大于40％的氨基酸序列同源性，例如大于60％甚至大于80-90％的同源性。
“编码序列”或“编码”所选多肽的序列，是置于合适的调控序列之下时体外或体内被转录(对DNA而言)和翻译(对mRNA而言)成多肽的核酸分子。编码序列的边界是由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子决定的。转录终止序列可位于编码序列的3’末端。
“核酸”分子或“多核苷酸”可包括双链-和单链序列，包括但不限于，从病毒、原核生物或真核生物mRNA得到的cDNA，从病毒(例如，DNA病毒和逆转录病毒)或原核生物DNA得到的基因组DNA序列，以及(尤其是)合成的DNA序列。该术语也包括含有任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列。
“操作性连接”指元件的排列，其中所述成分的配置使得可行使其正常功能。因此，操作性连接于编码序列的给定启动子在存在合适的转录因子时能实现编码序列的表达。启动子无需与编码序列毗连，只要其能发挥指导该序列表达的作用。因此，例如，如转录的内含子那样，启动子序列和编码序列之间可存在插入的不翻译但转录的序列，该启动子序列仍认为是“操作性连接”于编码序列。
本文的“重组体”用于描述核酸分子，指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作，该多核苷酸不与天然状态下与其相连的多核苷酸的全部或部分相连。本文中术语“重组体”与蛋白或多肽相关时，指由重组多核苷酸的表达而产生的多肽。通常，如下进一步描述的，克隆感兴趣的基因，然后在转化的生物体中表达。宿主生物体在表达条件下表达外源基因以产生蛋白。
“控制元件”指有助于其连接的编码序列表达的多核苷酸序列。该术语包括启动子、转录终止序列、上游调控结构域、聚腺苷酸信号、非翻译区(包括5′-UTRs和3′-UTRs)，合适时还包括前导序列和增强子，它们合起来提供编码序列在宿主细胞中的转录和翻译。
本文所用“启动子”是DNA调控区，其能在宿主细胞中结合RNA聚合酶并启动与其可操作性连接的下游(3′方向)编码序列的转录。出于本发明的目的，启动子序列包括在高于背景的可检测水平启动感兴趣基因转录所需的最少的碱基和元件。在启动子序列中有转录起始位点、以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合区(共有序列)。真核生物启动子通常但并并非总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。
当RNA聚合酶结合启动子序列并将编码序列转录为mRNA(然后被翻译为该编码序列编码的多肽)时，控制序列在细胞中对编码序列“指导转录”。
“表达盒”或“表达构建物”指能指导感兴趣的序列或基因表达的组件。表达盒通常含有控制元件，如可操作性连接于感兴趣的序列或基因(以指导其转录)的如上所述的启动子，并常常含有聚核苷酸序列。在本发明的某些实施方式中，本文所述的表达盒可包含于质粒构建物中。除了表达盒的组分以外，质粒构建物也可含有一个或多个选择标记、允许质粒构建物以单链DNA存在的信号(例如，M13的复制起点)、至少一个多克隆位点、以及“哺乳动物”的复制起点(例如，SV40或腺病毒的复制起点)。
本文所用“转化”指外源多核苷酸插入宿主细胞，与插入所用的方法无关：例如，用直接摄取、转染、感染等来转化。对于具体的转染方法，下面有进一步描述。外源多核苷酸可保持为非整合载体，例如游离基因，或者可整合入宿主基因组。
“宿主细胞”是已被外源DNA序列转化或能够被转化的细胞。
术语“分离的”用于指多肽时，指所示分子与它天然存在于其中的全生物体分开或分离，或者该分子存在于基本不存在相同类型的其它生物大分子的情况下。当术语“分离的”涉及多核苷酸时，指全部或部分缺乏在天然状态下与其相连的序列的核酸分子；或指一序列，虽然以天然状态存在，但连接有异源序列；或与染色体分离的分子。
本文所用术语“纯化”优选指存在至少75重量％，更优选至少85重量％，更优选至少95重量％，最优选至少98重量％的相同类型的生物大分子。
“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分间的百分比同一性。当两个DNA或两个多肽序列在确定的分子长度上表现出至少约50％、优选至少约75％、更优选至少约80-85％、优选至少约90％、最优选至少约95-98％的序列同一性时，这两个序列彼此“显著同源”。如本文所用，显著同源也指表现出与特定的DNA或多肽序列具有完全同一性的序列。
一般，“同一性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷-核苷或氨基酸-氨基酸对应。百分比同一性可通过比对序列、计算两个比对序列间配对的确切数字、除以较短序列长度并将结果乘以100，而直接比较两个分子间序列信息来确定。非常容易获得的计算机程序可用于协助分析，如ALIGN，Dayhoff，M.O.，蛋白质序列和结构集(Atlas of Protein Sequence and Structure)M.O.Dayhoff编，5 Suppl.3：353-358，National biomedical Research Foundation，Washington，DC，它采用了Smith和Waterman的局部同源性算法，Advances inAppl.Math. 2：482-489，1981用于肽分析。确定核苷序列同一性的程序可获自Wisconsin序列分析包，第8版(来自Genetics Computer Group，Madison，WI)例如BESTFIT、FASTA、GAP程序，它们也依赖于Smith和Waterman算法。这些程序使用厂商建议和上述Wisconsin序列分析包中所述缺省参数。例如涉及序列的具体核苷序列的百分比同一性可用Smith和Waterman同源性算法确定，采用六个核苷位置的缺省记录表和缺口罚分(gap penalty)。
另一种在本发明中确定百分比同一性的方法是使用MPSRCH程序包，其版权属于爱丁堡大学，由John F.Collins和Shane.S.Sturrok开发，InteliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)分销。Smith和Waterman算法可用于此程序包，其中在记录表中使用了缺省参数(例如，缺口罚分为12，缺口延伸罚分为1，缺口为6)。从数据中产生的“匹配”值反映了“序列同一性”。其它计算序列间百分比同一性或类似性的适当程序一般在本领域中已知，例如其它对比程序有采用缺省参数的BLAST。例如，可用采用以下缺省参数的BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；滤器(filter)＝无；链＝两者；截止＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详细描述可在NCBI的网站上找到。
另外，可通过在同源区域间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，接着用单链-特异核酸酶消化并确定消化片段大小来确定同源性。显著同源的DNA序列可在Southern杂交实验中鉴定，在例如此具体系统定义的严格条件下。定义适当杂交条件在本领域技术人员的能力范围内。参见例如Sambrook等，同上；《DNA克隆》，同上；《核酸杂交》，同上。
“核酸免疫”指将编码一种或多种所选免疫原的核酸分子引入宿主细胞，以进行所述一种或多种免疫原的体内表达。核酸分子可直接引入接受者，例如通过注射、吸入、口服、鼻内和粘膜施用等；或者可离体引入取自宿主的细胞。后一种情况中，转化的细胞再次引入对象从而在对象中引发抗核酸分子编码的抗原的免疫应答。
本文所用“治疗”指下述的任何情况：(i)感染或再感染的预防，如传统疫苗，(ii)症状的减轻或消除，和(iii)感兴趣病原体的基本或完全清除。可预防性(在感染之前)或治疗性(感染之后)进行治疗。
“脊椎动物对象”指脊索动物亚门的任一成员，包括(不限于)人和其它灵长类，包括非人灵长类，如猩猩和其它猿类和猴类；农畜，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验室动物，如小鼠、大鼠、兔和豚鼠等啮齿类；鸟，包括家养、野生和狩猎野禽，如鸡、火鸡和其它家禽，鸭、鹅等。该术语不指明具体的年龄。所以，包括了成年的和新生的个体。由于所有这些脊椎动物的免疫系统的运作是相似的，所以本发明可用于以上任何的脊椎动物种类。
II.实施本发明的方式
在详细描述本发明之前，应该理解的是本发明不受具体制剂或方法参数的限制，因为这些参数当然是可变的。也应该理解的是，本文使用的术语仅用于说明本发明的具体实施方案并非限制性的。
虽然很多与本文所述组合物和材料类似或等价的组合物和材料可用于实践本发明，但本文所述的材料和方法最佳。
本发明涉及HCV NS5多肽，所述多肽含有全长HCV NS5a多肽和C末端截短的HCV NS5b多肽的一部分。本发明还涉及融合蛋白和编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白含有截短的NS5多肽和HCV多蛋白的至少一种其它HCV多肽。本发明的蛋白质可用于刺激免疫应答反应，例如体液和/或细胞免疫应答反应，用于例如激活HCV特异性T细胞(即识别这些多肽表位的T细胞)和/或引发辅助性T细胞的产生、和/或刺激抗病毒的细胞因子、趋化因子等的产生。这些融合蛋白对HCV特异性T细胞的活化提供了发展HCV疫苗的体外和体内模型，尤其是鉴定与免疫应答反应相关的HCV多肽表位的模型。这些蛋白也可用于在哺乳动物中产生抗HCV的免疫应答反应，例如CTL反应，和/或引发CD8+和CD4+T细胞以产生抗病毒制剂，用于治疗性或预防性目的。
因此，这些蛋白可用于治疗和/或预防HCV感染。这些蛋白可单独使用或与一种或多种细菌或病毒免疫原组合。这些组合可包括来自相同病原体的多种免疫原、来自不同病原体的多种免疫原或来自相同或不同病原体的多种免疫原。因此，细菌、病毒和/或其它免疫原可与NS5多肽包括在同一组合物中，或可与NS5多肽分开给予同一对象，或甚至与NS5多肽包括在融合蛋白中。如下进一步描述，尤其有用的是NS5多肽和其它HCV免疫原的组合。
而且，本发明的蛋白质也可用作诊断试剂以在生物样品中检测HCV感染。
为了进一步理解本发明，下文提供更详细的描述，涉及融合蛋白用于本发明组合物的融合蛋白、该蛋白的生产、包含该蛋白的组合物以及使用该蛋白的方法。
融合蛋白
HCV菌株基因组含有约9,000-12,000核苷酸的一个开放阅读框，转录为多蛋白。如图1和表1所示，HCV多蛋白裂解后产生至少10个不同的产物，顺序为：NH2-核心(Core)-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。核心多肽在氨基酸位置1-191处(编号相对于HCV-1)(见，Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：2451-2455，HCV-1基因组)。该多肽被进一步加工产生约氨基酸1-173的HCV多肽。包膜多肽，E1和E2，分别在氨基酸位置192-383和384-746处。P7结构域在氨基酸位置747-809处。NS2是具有蛋白水解活性的整合膜蛋白，约位于多蛋白的氨基酸810-1026处。N2与NS3结合(约在氨基酸位置1027-1657处)，裂解NS2-NS3 sissle键，从而产生NS3 N-末端并释放包括丝氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的大的多蛋白。NS3蛋白酶约在氨基酸位置1027-1207处，用于加工剩余的多蛋白。解旋酶活性约在氨基酸位置1193-1657处。NS3释放NS3辅因子(NS4a，约在氨基酸位置1658-1711)、两种蛋白(NS4b，约在氨基酸位置1712-1972；和NS5a，约在氨基酸位置1973-2420)和RNA-依赖的RNA聚合酶(NS5b，约在氨基酸位置2421-3011)。多蛋白成熟的完成开始于NS3丝氨酸蛋白酶催化的在NS3-NS4a连接处的自身催化裂解。
表1
结构域  大致边界*
C(core)  1-191
E1  192-383
E2  384-746
P7  747-809
NS2  810-1026
NS3  1027-1657
NS4a  1658-1711
 NS4b  1712-1972
 NS5a  1973-2420
 NS5b  2421-3011
*编号相对于HCV-1。见，Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：2451-2455。
本发明的融合蛋白包括C末端截短的NS5多肽(本文也称为“NS5t”)。具体地，所述C末端截短的NS5多肽含有全长NS5a多肽和NS5b多肽的N末端部分。C末端截短的多肽可在氨基酸2500和C末端之间的位置被截短(编号相对于全长HCV-1多蛋白)，如在氨基酸2505...2550...2600...2650...2700...2750...2800...2850...2900...2950...2960...2970...2975...2980...2985...2990...2995...3000等之后，编号相对于全长HCV-1序列。显而易见的是，该分子可在2500至3010之间的任何氨基酸处截短，编号相对于全长HCV-1序列。一个尤其优选的NS5多肽是在对应于紧随氨基酸2990之后的氨基酸的氨基酸处截短(编号相对于全长HCV-1多蛋白)，包含对应于氨基酸1973-2990的氨基酸序列(编号相对于全长HCV-1多蛋白)。这种构建物的序列如SEQ ID NO：8(标记为图5A-5E的氨基酸1973-2990)的氨基酸位置1-1018所示。本发明的融合蛋白任选地有N末端甲硫氨酸用于表达。
C末端截短的NS5多肽可单独使用于下述的组合物中，或与衍生自HCV多蛋白各个结构域中的任何结构域的一种或多种HCV免疫原性多肽联用。其它的HCV多肽可分开提供或可在融合蛋白中提供。实际上，融合蛋白可包括HCV多蛋白的所有区域。这些多肽可与NS5多肽衍生自相同的HCV分离物，或来自不同的菌株和分离物，包括各种HCV基因型的任何基因型的分离物，以提供针对多种HCV基因型的增强的保护。此外，可根据要使用含有融合蛋白的疫苗组合的具体地理区域中地方性的、特定病毒进化枝来选择多肽。显而易见的是，本发明的融合蛋白提供了广泛意义上治疗HCV感染的有效工具。
因此，NS5t可包括在融合蛋白中，所述融合蛋白包括NS5t和来自HCV多蛋白的其它结构域的一种或多种免疫原性HCV蛋白，即NS5t与E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4和/或核心多肽组合。这些区域的顺序不必与它们在天然状态下的顺序一样。而且，各区域可来自相同或不同的HCV分离物。本文所述的各种融合蛋白中的各种HCV多肽可以是全长多肽或全长多肽的部分。组成融合蛋白的HCV多肽的部分一般包括至少一个表位，该表位被活化的T细胞上的T细胞受体识别，如2152-HEYPVGSQL-2160(SEQ ID NO：1)和/或2224-AELIEANLLWRQEMG-2238(SEQ ID NO：2)。可用几种方法来鉴定表位。例如，可用某多肽或蛋白的单克隆抗体来进行免疫亲和纯化，从而分离包含上述任意组合的单个多肽或融合蛋白。然后，可通过纯化的蛋白的蛋白水解断裂来制备一系列的短肽(所有这些多肽跨越了整个蛋白序列)，从而筛选分离的蛋白序列。开始时，例如，多个100-mer的多肽，可检测各多肽上是否存在被HCV活化的T细胞上的T细胞受体识别的表位，然后可在已鉴定到的100-mer多肽中检测更小的、重叠的片段，以定位感兴趣的表位。
可用例如51Cr释放试验或淋巴组织增生试验(见实施例)来鉴定被HCV活化的T细胞上的T细胞受体识别的表位。在51Cr释放试验中，可通过将编码表位的多核苷酸克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到靶细胞中，来构建展示所述表位的靶细胞。HCV特异性CD8+T细胞将裂解展示(例如)来自融合蛋白中HCV多蛋白的一个或多个区域的一种或多种表位的靶细胞，但不裂解不展示这种表位的细胞。在淋巴组织增生试验中，当与例如来自融合蛋白中HCV多蛋白的一个或多个区域的一种或多种表位一起培养时，HCV活化的CD4+T细胞将增殖，但在缺少HCV表位肽时则不增殖。
各种HCV多肽在融合蛋白中可以是各种顺序。如果需要，融合蛋白中可存在至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个一种或多种所述的多肽。有多个HCV病毒株，任何这些病毒株的HCV多肽都可用于融合蛋白中。
已确定了很多HCV病毒株和分离物的核酸和氨基酸序列，包括HCV多蛋白的各个区域的核酸和氨基酸序列，包括核心多肽、NS2、p7、E1、E2、NS3、NS4、NS5a、NS5b基因和多肽。例如，分离物HCV J1.1描述于Kubo等，(1989)日本.Nucl.Acids Res.17：10367-10372；Takeuchi等，(1990)Gene 91：287-291；Takeuchi等，(1990)J.Gen.Virol.71：3027-3033；和Takeuchi等，(1990)Nucl.Acids Res.18：4626。两种独立的分离物，HCV-J和BK的完整编码序列分别描述于Kato等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：9524-9528和Takamizawa等，(1991)J.Virol.65：1105-1113。
描述HCV-1分离物的出版物包括Choo等，(1990)Brit.Med.Bull.46：423-441；Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：2451-2455和Han等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：1711-1715。HCV分离物HC-J1和HC-J4描述于Okamoto等，(1991)日本J.Exp.Med.60：167-177。HCV分离物HCT18～，HCT23，Th，HCT27，EC1和EC10描述于Weiner等，(1991)Virol.180：842-848。HCV分离物Pt-1，HCV-K1和HCV-K2描述于Enomoto等，(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.170：1021-1025。HCV分离物A，C，D & E描述于Tsukiyama-Kohara等，(1991)VirusGenes 5：243-254。
如上所述，融合蛋白的各组分可获自相同的HCV病毒株或分离物，或获自不同的HCV病毒株或分离物。例如，NS5多肽可衍生自HCV的第一病毒株，融合蛋白中存在的其它HCV多肽可衍生自HCV的第二病毒株。或者，其它HCV多肽的一种或多种，例如NS2，NS3，NS4，核心多肽，p7，E1和/或E2，如果存在的话，可衍生自HCV的第一株，剩余的HCV多肽可衍生自HCV的第二株。另外，融合蛋白中存在的各HCV多肽可衍生自不同的HCV病毒株。
用于本发明融合蛋白的获自HCV区域的各种HCV表位的描述见例如Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992) 89：10011-10015；Chien等，J.Gastroent.Hepatol.(1993) 8：S33-39；Chien等，国际出版号WO 93/00365；Chien，D.Y.，国际出版号WO94/01778；和美国专利号6,280,927和6,150,087。
例如，融合蛋白可包括C末端截短的NS5多肽和NS3多肽。NS3多肽可被修饰以抑制其蛋白酶活性从而阻止该融合蛋白被进一步断裂(本文也称为“NS3*”)。可缺失NS3蛋白酶结构域的全部或部分来修饰NS3多肽。或者，可在蛋白酶结构域的活性区域进行氨基酸取代来抑制蛋白酶活性。最后，在该结构域的活性区域加入氨基酸从而修饰催化位点，也可起到抑制蛋白酶活性的作用。
如上所述，蛋白酶活性约位于氨基酸1027-1207，编号相对于全长HCV-1多蛋白(见，Choo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991) 88：2451-2455)，图2的氨基酸位置2-182。NS3蛋白酶和活性位点的结构是已知的。见例如，De Francesco等，Antivir.Ther.(1998) 3：99-109；Koch等，Biochemistry(2001) 40：631-640。因此，对天然序列的缺失或修饰通常发生在该分子活性位点处或其附近。具体地，在图2的氨基酸位置1-或2-182、优选1-或2-170、或1-或2-155处修饰或缺失是可得到满意的效果。优选的修饰是对蛋白酶活性位点处催化性三联体(triad)进行修饰，即修饰H，D和/或S残基，以失活蛋白酶。这些残基分别在氨基酸1083、1105和1165，编码相对于全长HCV多蛋白(分别是图2中的氨基酸位置58、80和140)。这些修饰将抑制蛋白水解断裂而保持T细胞表位。一个尤其优选的修饰是用丙氨酸取代Ser-1165。本领域一般技术人员可容易地确定为了破坏蛋白酶活性而要缺失的NS3蛋白酶的部分。可用本领域一般技术人员已知的方法来测定蛋白酶活性的存在与否。
例如，可用下文实施例中所述的方法以及本领域熟知方法的来测定蛋白酶活性是否存在。见例如，Takeshita等，Anal.Biochem.(1997) 247：242-246；Kakiuchi等，J.Biochem.(1997) 122：749-755；Sali等，Biochemistry(1998) 37：3392-3401；Cho等，J.Virol.Meth.(1998) 72：109-115；Cerretani等，Anal.Biochem.(1999)266：192-197；Zhang等，Anal.Biochem.(1999) 270：268-275；Kakiuchi等，J.Virol.Meth.(1999) 80：77-84；Fowler等，J.Biomol.Screen.(2000) 5：153-158；和Kim等，Anal.Biochem.(2000) 284：42-48。
图3表示代表性的修饰的NS3多肽，从N末端删除了NS3蛋白酶结构域，包括了C末端核心多肽的氨基酸1-121。
如上所述，在本发明融合蛋白中包括来自HCV多蛋白核心区域的多肽可能是有利的。该区域在HCV多蛋白的氨基酸1-191处，编号相对于HCV-1。全长蛋白、其片段，如氨基酸1-160，例如氨基酸1-150，1-140，1-130，1-120，例如，氨基酸1-121，1-122，1-123...1-151等、或含有全长蛋白的表位的更小的片段均可用于本发明融合蛋白中，例如在氨基酸10-53，氨基酸10-45，氨基酸67-88，氨基酸120-130发现的那些表位，或在例如以下出版物中鉴定到的任何核心表位：Houghton等，美国专利号5,350,671；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992) 89：10011-10015；Chien等，J. Gastroent.Hepatol.(1993) 8：S33-39；Chien等，国际出版号WO93/00365；Chien，D.Y.，国际出版号WO94/01778；和美国专利号6,280,927和6,150,087。而且，可用HCV多蛋白的核心区域移码而产生的蛋白，如国际出版号WO99/63941中所述。一种尤其理想的用于本发明融合蛋白的核心多肽包括图3的氨基酸1772-1892位置所示的氨基酸序列。该核心多肽包括HCV多蛋白的氨基酸1-121，以及共有氨基酸Arg-9和Thr-11(分别位于图3的1780和1782位)。图5A-5E(SEQ ID NO：7和8)表示代表性融合蛋白的DNA和相应氨基酸序列，所述融合蛋白包括NS5多肽的C末端融合于该核心多肽的C末端截短的NS5多肽。C末端截短的NS5多肽包括HCV多蛋白的氨基酸1973-2990，编号相对于HCV-1(见，Choo等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2451-2455)，(SEQ ID NO：7的氨基酸1-1018)，融合于如上所述包括HCV多蛋白的氨基酸1-121的核心多肽(SEQ ID NO：7的氨基酸1019-1139)。
如果存在核心多肽，它可存在于融合蛋白的N末端、C末端和/或中部。尤其优选的是C末端的核心多肽，因为它允许与某些下文进一步描述的佐剂如ISCOM形成复合物。
其它可用于HCV融合蛋白中的多肽包括衍生自多蛋白多个区域中的任何区域的T细胞表位。在这方面，已知E1、E2、p7和NS2含有人T细胞表位(CD4+和CD8+)，并包括这些表位中的一种或多种以用于增加疫苗效力和增加抗多种HCV基因型的保护水平。而且，多拷贝的特定的、保守T细胞表位也可用于融合蛋白中，例如不同基因型的表位的组合。
例如，来自HCV E1和/或E2区的多肽可用在本发明的融合蛋白中。E2作为多个种类存在(Spaete等，Virol.(1992) 188：819-830；Selby等，J.Virol.(1996)70：5177-5182；Grakoui等，J.Virol.(1993) 67：1385-1395；Tomei等，J.Virol.(1993)67：4017-4026)，剪切和蛋白水解可发生在E2多肽的N末端和C末端。因此，本文所用E2多肽可包括HCV多蛋白的氨基酸405-661，例如，400、401、402...至661，以及多肽如383或384-661，383或384-715，383或84-746，383或384-749或383或384-809，或383或384至661-809之间的任何C末端，编号相对于全长HCV-1多蛋白。同样，本文所用E1多肽可包括HCV多蛋白的氨基酸192-326、192-330、192-333、192-360、192-363、192-383、或192至326-383之间的任何C末端。
包括表位的E1和/或E2的免疫原性片段也可用于本发明融合蛋白中。例如，E1多肽的片段可包括该分子的约5个氨基酸至几乎全长的氨基酸，例如E1多肽的6，10，25，50，75，100，125，150，175，185或更多个氨基酸，或所述数字之间的任何整数。类似地，E2多肽的片段可包括E2多肽的6，10，25，50，75，100，150，200，250，300，或350个氨基酸，或所述数字之间的任何整数。
例如，衍生自E2高可变区如跨越氨基酸384-410或390-410的区域的表位也包括在融合蛋白中。可掺入E2多肽序列的尤其有效的E2表位包括衍生自该区域的共有序列，例如共有序列Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn，其代表HCVI型基因组的氨基酸390-410的共有序列。E1和E2的其它表位是已知的，描述于，例如，Chien等，国际出版号WO93/00365。
而且，E1和/或E2多肽可缺乏跨膜结构域的全部或部分。对E1而言，通常约在氨基酸370或氨基酸数字更大处(编号相对于HCV-1多蛋白)终止的多肽将保留在ER中，因此不分泌到培养基中。对E2而言，约在氨基酸731或氨基酸数字更大处终止的多肽(编号也相对于HCV-1多蛋白)将被ER保留而不分泌。(见，例如，国际出版号WO96/04301，1996年2月15日出版)。应注意，这些氨基酸位置不是绝对的，在一定程度上可变。因此，本发明考虑使用保留跨膜结合结构域的E1和/或E2多肽，以及缺乏跨膜结合结构域的全部或部分的多肽，包括约在氨基酸369或数字更小处终止的E1多肽，和约在氨基酸730或数字更小处终止的E2多肽。此外，C末端截短可延伸到跨膜结构域之外直至N末端。因此，例如，本发明也考虑发生在低于如氨基酸360处的E1截短，和发生在低于如氨基酸715处的E2截短。唯一必须保证的是截短的E1和E2多肽保留了实现其预设目的的功能。然而，尤其优选的截短的E1构建物不延伸过约氨基酸300。最优选的是在氨基酸360处终止。优选的截短的E2构建物是C末端截短不超过约氨基酸715的构建物。尤其优选的E2截短是在氨基酸715-730的任何氨基酸例如氨基酸725之后截短的分子。
在某些优选实施方式中，融合蛋白包括HCV的修饰的NS3、NS4(NS4a和NS4b)、C末端截短的NS5，和任选的核心多肽(NS3*NS4NS5t或NS3*NS4NS5tCore融合蛋白，表位也称为“NS3*45t”和“NS3*45tCore”)。这些区域的顺序不一定和它们在天然HCV多蛋白中的顺序一样。因此，例如核心多肽可在融合蛋白的N-和/或C-末端。在尤其优选的实施方式中，NS5t包括氨基酸1973-2990，编号相对于全长HCV-1多蛋白，NS3*分子包括通常在氨基酸1165处发现的Ser至Ala的取代，这些区域从N末端至C末端的顺序为：NS3*NS4NS5t。该融合蛋白可在该分子的C末端包括核心多肽。如果存在的话，核心多肽优选包括图3氨基酸位置1772-1892所示氨基酸序列。该核心多肽包括HCV多蛋白的氨基酸1-121，以及共有氨基酸Arg-9和Thr-11(分别在图3的氨基酸1780和1782)。
在另一个优选的实施方式中，上文刚刚描述的融合蛋白包括位于NS3*之前的N末端的E2多肽。优选地，该E2多肽是C末端截短的多肽，并且包括氨基酸384-715，编号相对于全长HCV-1多蛋白。该融合蛋白还可任选地包括上述核心多肽。
如果需要，融合蛋白或这些蛋白质的独立组分也可含有其它氨基酸序列，例如氨基酸接头或信号序列，以及可用于蛋白纯化的配体，例如谷胱甘肽-S-转移酶和葡萄球菌蛋白A。
编码融合蛋白的多核苷酸
多核苷酸含有的核苷酸少于整个HCV基因组，或多核苷酸可含有上述带有C末端截短的NS5结构域的整个多蛋白序列。多核苷酸可以是RNA或单链-或双链DNA。优选地，多核苷酸被分离成不含有其它组分，例如蛋白质和脂类。这些多核苷酸编码上述的融合蛋白，因此含有编码NS5t和来自HCV多蛋白的不同区域的至少一种其它HCV多肽(例如衍生自NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，核心蛋白等的多肽)的编码序列。本发明的多核苷酸也可含有其它核苷酸序列，例如编码接头、信号序列、用于蛋白纯化的配体(例如谷胱甘肽-S-转移酶和葡萄球菌蛋白A)的序列。
为有助于表达产量，将多蛋白分裂成多个表达片段可能是有利的。这些片段可与上述的组合物组合使用。或者，这些片段可连在一起依次表达。因此，例如，NS3*NS4可表达为一个构建物，NS5tCore可表达为另一构建物，这两种蛋白按顺序融合或分开加入到组合中。类似地，E2NS3*NS4可表达为一个构建物，NS5tCore可表达为另一构建物。应理解，上述组合只是代表性的，融合蛋白的任何组合都可独立地表达。
编码各种HCV多肽的多核苷酸可分离自基因组文库，所述基因组文库衍生自存在于如HCV感染个体的血浆、血清或肝匀浆的核酸序列，或在实验室中合成，例如，用自动合成仪合成。扩增方法例如PCR可用于从编码某多核苷酸的HCV基因组DNA或cDNA扩增所述多核苷酸。
多核苷酸可包括这些天然存在或天然条件下不存在的人工序列的多肽的编码序列。可用标准分子生物学技术将这些核苷酸连接起来形成编码融合蛋白的编码序列。可将编码这些蛋白的多核苷酸引入表达载体中，表达载体可在合适的表达系统中表达。本领域有很多细菌、酵母、哺乳动物和昆虫表达系统，可采用任何的这些表达系统。任选地，可将编码这些蛋白的多核苷酸转化到不含细胞的翻译系统中。本领域熟知这类方法。也可用固相蛋白质合成来构建蛋白。
采用标准的基因递送方法，可将本发明的表达构建物，包括所需的融合蛋白或包括这些融合蛋白的单独组分的单独的表达构建物，用于核酸免疫，以刺激细胞免疫应答反应。基因递送的方法是本领域已知的。见，例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466。可将基因直接递送到脊椎动物对象中，或者，离体递送到衍生自对象的细胞中，然后将细胞再植入到该对象中。例如，构建物可作为质粒DNA递送，例如包含在质粒例如pBR322、pUC或ColE1中。
此外，本发明的表达盒在递送至这些细胞之前可包装在脂质体中。一般使用能稳定结合或截获和保留核酸的脂质体来实现脂质包囊化。浓缩的DNA与脂质制剂之比可变，但通常在约1∶1(mg DNA∶微摩尔脂质)或更多脂质。使用脂质体作为递送核酸的载体的综述，参见，Hug和Sleight，Biochim.Biophys.Acta.(1991)1097： 1-17；Straubinger等，《酶学方法》(Methods of Enzymology)，(1983)，第101卷，512-527页。
用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(带正电)、阴离子(带负电)和中性制剂，特别优选阳离子脂质体。阳离子脂质体可容易地获得。例如脂质体N[1-2，3-二油酰氧基]丙基]-N，N，N-三乙基铵(DOTMA)以商品名Lipofectin来源于GIBCOBRL，Grand Island，NY。(也参见，Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84：7413-7416)。其它市售可得的脂质包括(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它阳离子脂质体可用本领域熟知的技术从易得的材料制备。参见，例如描述DOTAP(1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基氨基)丙烷)脂质体合成的Szoka等，Proe.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75：4194-4198；PCT国际公布号WO90/11092。用本领域已知的各种方法制备各种脂质体-核酸复合物。见，例如，Straubinger等，METHODS OF IMMUNOLOGY(1983)，第101卷，pp.512-527；Szoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978) 75：4194-4198；Papahadjopoulos等，Biochim.Biophys.Acta(1975) 394：483；Wilson等，Cell(1979) 17：77)；Deamer和Bangham，Biochim.Biophys.Acta(1976) 443：629；Ostro等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1977) 76：836；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979) 76：3348)；Enoch和Strittmatter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76：145)；Fraley等，J.Biol.Chem.(1980) 255：10431；Szoka和Papahadjopoulos，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978) 75：145；以及Schaefer-Ridder等，Science(1982)215：166。
DNA也可在与Papahadjopoulos等，Biochem.Biophys.Acta.(1975)394：483-491所述类似的蜗形脂质组合物中递送。也见美国专利号4,663,161和4,871,488。
已经开发了许多将基因输送到哺乳动物细胞的基于病毒的系统。例如，逆转录病毒是基因输送系统的一个便捷平台，如鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、莫罗尼氏小鼠白血病毒和鲁斯氏肉瘤病毒。可将所选基因插入载体并用本领域已知的技术包装入逆转录病毒。然后分离重组病毒并将在体内或离体将其输送到受试者细胞。已经描述过许多逆转录病毒系统(美国专利No.5,219,740；Miller& Rosman，BioTechniques(1989)7：980-990；Miller，A.D.，Human GeneTherapy(1990)1：5-14；Scarpa等，Virology(1991)180：849-852；Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：8033-8037；和Boris-Lawrie & Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.(1993)3：102-109。简言之，可用很多逆转录病毒，包括例如B、C和D型逆转录病毒以及泡沫病毒(spumaviruses)和慢病毒如FIV，HIV，HIV-1，HIV-2和SIV(见RNA Tumor Viruses，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，1985)，来容易地构建本发明的逆转录病毒基因递送载体。这些逆转录病毒可容易地获自保藏或储藏机构例如美国模式培养物保藏中心(″ATCC″；10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)，或用一般可获得的技术从已知来源分离。
许多腺病毒载体也已被描述，如腺病毒2型和5型载体。与被整合入宿主基因组的逆转录病毒不同，腺病毒保留在染色体外，因此可使与插入诱变有关的风险最小(Haj-Ahmad和Graham，J.Virol.(1986)57：267-274；Bett等，J.Virol.(1993)67：5911-5921；Mittereder等，Human Gene Therapy(1994) 5：717-729；Seth等，J.Virol.(1994)68：933-940：Barr等，Gene Therapy(1994)1：51-58；Berkner，K.L.BioTechniques(1988)6：616-629；和Rich等，Human Gene Therapy(1993)4：461-476)。
分子偶联载体，如Michael等[J.Biol.Chem.(1993)268：6866-6869]和Wagner等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6099-6103]所述的腺病毒嵌合载体也可用于基因输送。
α病毒属的成员，例如但不限于衍生自Sindbis和Semliki Forest病毒、VEE的载体，也可用作病毒载体以递送感兴趣的基因。关于可用于实施本发明方法的Sindbis-病毒衍生的载体的描述，可见Dubensky等，J.Virol.(1996) 70：508-519；和国际公开号WO95/07995和WO96/17072。
也可用其它载体，包括但不限于腺病毒相关病毒载体、猿猴病毒40和细胞巨化病毒。也可用细菌载体，例如沙门氏菌(Salmonella ssp.)，小肠结肠炎耶尔森(氏)菌(Yersinia enterocolitica)，志贺氏杆菌(Shigella spp.)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，分枝杆菌(Mycobacterium)菌株BCG和单核球增多性李斯特菌(Listeriamonocytogene)。也可用微型染色体如MC和MC1、噬菌体、粘粒(插入噬菌体λcos位点的质粒)和复制子(在细胞中可在它们自己的控制下进行复制的遗传元件)。
表达构建物也可包囊入、吸附入颗粒载体或与之相结合。这种载体将多个拷贝的所选分子呈递给免疫系统，并促进分子在局部淋巴节中的捕获和保留。这些颗粒可由巨嗜细胞吞噬并能通过细胞因子释放来增强抗原呈递。颗粒载体的例子包括来源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物以及来源于聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)(称为PLG)的微粒。见，例如，Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10：362-368；和McGee等，J.Microencap.(1996)。
很多其它的方法可用于递送表达构建物到细胞中。这些方法包括DEAE葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、多聚赖氨酸-或多聚鸟氨酸介导的转染，或用其它不溶性无机盐沉淀，例如磷酸锶、硅酸铝包括膨润土和高岭土、氧化铬、硅酸镁、滑石等。其它可用于转染的方法包括电穿孔、超声波、原生质体融合、脂质体、拟肽递送或显微注射。见，例如，Sambrook等，同上，描述了转化感兴趣细胞的技术；和Felgner，P.L.，Advanced Drug Delivery Reviews(1990) 5：163-187，关于可用于基因转移的递送系统的综述。用电穿孔递送DNA的一种尤其有效的方法描述于国际出版号WO/0045823。
此外，采用颗粒载体如金或钨的生物递送系统在递送本发明的表达构建物时尤其有用。用待递送的构建物涂覆颗粒，一般在减压下用“基因枪”的弹药排放(gunpowder discharge)将颗粒加速到高速。关于这种技术的描述以及有用的设备，参见，例如，美国专利号4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,179,022；5,371,015；和5,478,744。
含有融合蛋白或多核苷酸的组合物
本发明还提供包含融合蛋白或多核苷酸的组合物。如上所述，这些组合物可用于刺激免疫应答反应。这些组合物可包含一种或多种融合蛋白，只要其中的一种融合蛋白包含如上所述C末端截短的NS5。本发明的组合物也可包含药学上可接受的载体。载体本身不应该诱导产生对宿主有害的抗体。药学上可接受的载体是本领域熟知的。这些载体包括但不限于，大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖，例如乳胶官能化的琼脂糖(sepharose)，琼脂糖(agarose)，纤维素，纤维素珠等，聚乳酸，聚乙醇酸，多聚氨基酸例如多聚谷氨酸、多聚赖氨酸等，氨基酸共聚物，和灭活的病毒颗粒。
药学上可接受的盐也可用于本发明组合物中，例如矿物质盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐，以及有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。尤其有用的蛋白质底物是血清白蛋白、钥孔戚血蓝素、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风毒素和其它本领域熟知的其它蛋白质。本发明的组合物也可含有单独的或组合的液体或赋形剂，例如水、盐水、甘油、葡萄糖、乙醇等，以及湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂等物质。本发明的蛋白质或多核苷酸也可吸收到、或陷入脂质体和颗粒载体例如PLG中，或与其结合。脂质体和其它颗粒载体如上所述。
如果需要，可在组合物中包括提高对淋巴细胞的免疫原呈递的共刺激分子，例如B7-1或B7-2，或细胞因子、淋巴因子和趋化因子，包括但不限于细胞因子如IL-2、修饰的IL-2(cys125变为ser125)、GM-CSF、IL-12、γ-干扰素、IP-10、MIP1β、FLP-3、病毒唑和RANTES。任选地，可在组合物中包含佐剂。可用的佐剂包括但不限于(1)铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳剂(有或没有其它的特定免疫刺激物，例如胞壁酰肽(见下)或细菌细胞壁组分)，例如(a)MF59(PCTPubl.No.WO90/14837)，含有5％鲨烯，0.5％TWEEN 80，和0.5％SPAN 85(任选地含有各种量的MTP-PE)，用微流化器如Model 110Y微流化器(Microfluidics，Newton，MA)将其配制到亚微米颗粒中，(b)SAF，含有10％鲨烯，0.4％TWEEN 80，5％普卢兰尼克(pluronic)-嵌段聚合物L121，和thr-MDP(见下)，微流化成亚微米乳液或涡旋以产生大颗粒尺寸的乳液，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)，(RibiImmunochem，Hamilton，MT)，含有2％鲨烯，0.2％TWEEN 80，和选自以下的细菌细胞壁组分的一种或多种：单磷酸类脂A(MPL)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和细胞膜骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；(3)可使用皂苷佐剂，例如QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或由其产生的颗粒，例如ISCOMs(免疫刺激复合物)，ISCOMs可不含其它的去污剂(见，例如，国际出版号WO00/07621)；(4)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素，例如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12等(见，例如，国际出版号WO99/44636)，干扰素，例如γ干扰素，巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素例如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)，或大肠杆菌不耐热(LT)的去毒突变体，尤其是LT-K63(其中赖氨酸取代野生型氨基酸第63位)、LT-R72(其中精氨酸取代野生型氨基酸第72位)、CT-S109(其中丝氨酸取代野生型氨基酸第109位)、和PT-K9/G129(其中赖氨酸取代野生型氨基酸第9位，甘氨酸取代第129位)(见，例如，国际公开号W093/13202和W092/19265)；(7)单磷酸类脂A(MPL)或3-O-脱酰MPL(3dMPL)(见，例如，GB 2220221；EPA0689454)，任选地基本不含有明矾(见，例如，国际出版号WO00/56358)；(8)3dMPL和例如QS21和/或水包油乳剂的组合(见，例如，EPA 0835318；EPA0735898；EPA 0761231)；(9)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(见，例如，国际出版号WO99/52549)；(10)免疫刺激寡核苷酸如CpG寡核苷酸，或皂苷和免疫刺激寡核苷酸，如CpG寡核苷酸(见，例如，国际出版号WO00/62800)；(11)免疫刺激物和金属盐颗粒(见，例如，国际出版号WO00/23105)；(12)皂苷和水包油乳剂(见，例如，国际出版号WO99/11241；(13)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+甾醇)(见，例如，国际出版号WO 98/57659)；(14)MPL衍生物RC529；和(15)作为免疫刺激物增强组合物的有效性的其它物质。优选明矾和MF59。
如上所述，胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷酰胺(thr-MDP)，-乙酰基-去甲(nor)胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(CGP 11637，称为去甲-MDP)，N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)，等等。
而且，融合蛋白可吸入到或陷入ISCOM中。典型的ISCOMs是通过组合胆固醇、皂苷、磷脂和免疫原而形成的。一般，免疫原(通常具有疏水区)溶于去污剂中，加入反应混合物中，从而形成掺有免疫原的ISCOMs。ISCOM基质组合物形成的方式相同，但没有病毒蛋白。具有高的正电荷的蛋白质可静电结合在ISCOM颗粒中，而非通过疏水作用。关于皂苷和ISCOM以及形成ISCOM的方法的更详细综述，参见Barr等，(1998)Adv.Drug Delivery Reviews 32：247-271(1998)。
用标准技术制备用于本发明的ISCOM，这些技术是本领域熟知的，描述于例如，美国专利号4,981,684，5,178,860，5,679,354和6,027,732；欧洲公开号EPA109,942；180,564和231,039；Coulter等，(1998)Vaccine 16：1243。通常，术语“ISCOM”指在糖苷如三萜式皂苷(具体是Quil A)和含有疏水区的抗原之间形成的免疫原性复合物。见，例如，欧洲公开号EPA 109,942和180,564。在该实施方式中，HCV融合蛋白(通常具有疏水区)溶于去污剂中，然后加入反应混合物中，从而形成掺有融合蛋白的ISCOM。可用显示出两亲特性的HCV多肽容易地制备HCV多肽ISCOM。然而，缺少所需的疏水性的蛋白或肽在与具有疏水氨基酸、脂肪酸基、烷基等的肽偶联之后可掺入到免疫原性复合物中。
如欧洲公开号EPA 231,039中所述，形成基础的ISCOM结构(称为基质或ISCOMATRIX)不一定需要存在抗原，基础的ISCOM结构可形成自甾醇如胆固醇，磷脂如磷脂酰乙醇胺，以及糖苷如Quil A。因此，感兴趣的HCV融合蛋白不掺入到基质中，而是存在于基质外部上，例如，通过静电相互作用吸收到基质。例如带有高正电荷的HCV融合蛋白可静电结合到ISCOM颗粒上，而不是通过疏水作用力结合。关于皂苷和ISCOM以及形成ISCOM的方法的更详细综述，参见Barr等，(1998)Adv.Drug Delivery Reviews 32：247-271(1998)。
可将溶解的甾醇、糖苷和(任选的)磷脂混合在一起，制备ISCOM基质。如果不用磷脂，则形成二维结构。见，例如，欧洲公开号EPA 231,039。术语“ISCOM基质”指三维和二维的结构。使用的糖苷一般是具有两亲特性的糖苷，在其分子中包含疏水和亲水区。优选使用皂苷，如从Quillaja saponaria Molina(肥皂草)中获得的皂苷提取物和Quil A。其它优选的皂苷是来自七叶树(Aesculus hippocastanum)的七叶皂甙(Patt等，(1960)Arzneimittelforschung 10：273-275)以及来自Gypsophillastruthium的sapoalbin(Vochten等，(1968)J.Pharm.Belg. 42：213-226)。
为了制备ISCOM，所用的糖苷浓度至少为形成胶束的临界浓度。对Quil A而言，该浓度约为0.03重量％。用于制备ISCOM的甾醇可以是动物或植物来源的已知甾醇，例如胆固醇、羊毛甾醇、光甾醇、豆甾醇和谷甾醇。合适的磷脂包括磷酸卵磷脂和磷脂酰乙醇胺。一般，糖苷(尤其是当糖苷为Quil A时)∶甾醇(尤其是当甾醇为胆固醇时)∶磷脂的摩尔比例是1∶1∶0-1，±20％优选不超过±10％。这相当于Quil A∶胆固醇的重量比约为5∶1。
也可存在增溶剂，例如可以是去污剂、尿素或胍。一般，非离子、离子或两性离子去污剂或胆酸基去污剂如去氧胆酸钠、胆酸盐和CTAB(溴化十六烷基三甲基铵)可用于此目的。合适的去污剂的例子包括但不限于，辛基葡糖苷、壬基N-甲基葡萄糖胺或癸酰基N-甲基葡萄糖胺、烷基苯基聚氧乙烯醚如具有9-10个氧乙烯基团的聚乙二醇p-异辛基-苯基醚(商品名为TRITON X-100RTM)、酰基聚氧乙烯酯如酰基聚氧乙烯山梨聚糖(sorbitane)酯(商品名为TWEEN 20TM、TWEEN 80TM等)。形成ISCOM时通常去除增溶剂，如通过超滤、透析、超离心或色谱层析，然而，在某些方法中不需要该步骤。(见，例如，美国专利号4,981,684)。
一般，糖苷例如QuilA与HCV融合蛋白的重量比范围为5∶1-0.5∶1。优选重量比约为3∶1-1∶1，更优选该比例为2∶1。
一旦ISCOM形成，可如本文所述将其配制到组合物中并给予动物。如果需要，可将获得的免疫原性复合物的溶液冻干，然后用前重建。
包含上述蛋白质和多核苷酸的NS5融合蛋白和组合物可与其它HCV免疫原性蛋白和/或包含其它HCV免疫原性蛋白的组合物联用。例如，NS5融合蛋白可与衍生自表1所述的HCV多蛋白的一个或多个区域的各种HCV免疫原性蛋白的任何蛋白联用。与本发明融合蛋白和/或包含NS5融合蛋白的组合物联用的一个具体的HCV抗原是HCV E1E2抗原。HCV E1E2抗原是已知的，它包括HCV E1和HCV E2的复合物，任选地含有p7区的部分或全部，如PCT公开号WO 03/002065所述的HCVE1E2复合物。如上所述，其它的HCV免疫原性可与赋形剂、佐剂、免疫刺激分子等一起提供在组合物中。例如，E1E2复合物可提供在含有亚微米水包油乳剂如MF59和/或含有免疫刺激核酸序列(ISS)如CpY、CpR和非甲基化CpG基序(胞嘧啶和其后的鸟嘌呤，由磷酸键连接)的寡核苷酸的组合物中。这些组合物的详细描述见PCT公开号WO 03/002065。
因此，显而易见的是，本发明的组合物可与很多免疫刺激物一起给药，并且通常包含佐剂。这些与本发明组合物一起使用的免疫刺激物和佐剂包括但不限于，上述描述的任何物质以及下述物质的一种或多种。
A.含有矿物质的组合物
适合用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐类，如铝盐和钙盐。本发明包括以下矿物盐类，如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等(例如可见《疫苗设计：亚单位和佐剂研究》(Vaccine design：thesubunit and adjuvant approach)第8和9章，(1995)Powell和Newman.ISBN0-306-44867-X.)，或者不同矿物质的混合物(如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选磷酸盐过量)，所述化合物可以采取任何合适形式(如胶状、晶体、无定形等)，优选被矿物质吸附。含有矿物质的组合物可被制成金属盐颗粒。参见WO 00/23105。
铝盐可包括在本发明组合物中，Al3+剂量为0.2-1.0毫克/剂。在一个实施方式中，用于本发明的铝基佐剂是明矾(磷酸铝钾(AlK(SO4)2))，或明矾衍生物，如将磷酸盐缓冲液中的抗原与明矾混合、然后用碱(如氨水或氢氧化钠)滴定和沉淀而原位形成的明矾衍生物。
可用于本发明疫苗组合物中的另一个铝基佐剂是氢氧化铝佐剂(Al(OH)3)或晶体氧氢氧化铝(AlOOH)，这是一种非常好的吸附剂，表面积约为500m2/g。或者，提供磷酸铝佐剂(AIPO4)或羟基磷酸铝(aluminum hydroxyphosphate)，后者在氢氧化铝佐剂的一些或全部氢氧基处含有磷酸基团。本文提供的优选的磷酸铝佐剂是无定形的、可溶于酸性、碱性和中性介质中的佐剂。
在另一个实施方式中，用于本发明的佐剂包含磷酸铝和氢氧化铝。在该实施方式的更详细实施方式中，佐剂中磷酸铝的量大于氢氧化铝的量，如磷酸铝和氢氧化铝的重量比为2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1或大于9∶1。更具体地，铝盐存在的量可以是0.4-1.0毫克/疫苗剂量，或0.4-0.8毫克/疫苗剂量，或0.5-0.7毫克/疫苗剂量，或约0.6毫克/疫苗剂量。
一般，优选的铝基佐剂，或多个铝基佐剂的比例，如磷酸铝与氢氧化铝的比例，是通过最优化分子之间的静电吸引从而使佐剂在所需的pH时抗原带有相反电荷来选择的。例如，在pH7.4时磷酸铝佐剂(iep＝4)吸附溶菌酶，但不吸收白蛋白。如果白蛋白是靶抗原，则应该选择氢氧化铝佐剂(iep 11.4)。或者用磷酸盐预处理氢氧化铝降低其等电点，使其成为碱性更强的抗原的优选佐剂。
B.油性乳剂
适合用作本发明佐剂的油性乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂。特别优选的佐剂是亚微米水包油乳剂。用在这里的优选的亚微米水包油乳剂是任选地含有不同量的MTP-PE的鲨烯/水乳剂，如一种亚微米水包油乳剂，其中含有4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％w/v Tween 80TM(聚氧乙烯山梨糖单油酸酯)和/或0.25-1.0％Span 85TM(去水山梨糖醇三油酸酯)，以及任选的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)，例如称为“MF59”的亚微米水包油乳剂(WO 90/14837；美国专利6,299,884和6,451,325，它们被全文纳入本文作为参考；和Ott等，“MF59—设计和评价安全且有效的人类疫苗佐剂”(MF59—Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines)，选自《疫苗设计：亚单位和佐剂研究》(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)Plenum Press，New York，1995，277-296)。MF59含有4-5％w/v鲨烯(例如4.3％)、0.25-0.5％w/vTween 80TM和0.5％w/v Span 85TM，并任选含有不同量的MTP-PE，用微量流化器如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE的含量约为0-500μg/剂，更优选0-250μg/剂，最优选为0-100μg/剂。术语“MF59-0”在这里表示不含MTP-PE的上述亚微米水包油乳剂，而术语MF59-MTP表示含有MTP-PE的制剂。例如，“MF59-100”含有100μg MTP-PE/剂，如此类推。这里使用的另一种亚微米水包油乳剂MF69含有4.3％w/v鲨烯、0.25％w/v Tween 80TM和0.75％w/v Span 85TM，并任选含有MTP-PE。另一种亚微米水包油乳剂是MF75，也称为SAF，含有10％鲨烯、0.4％Tween 80TM、5％普卢兰尼克嵌段聚合物L121以及thr-MDP，也被微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP表示含有MTP的制剂，例如100-400μg MTP-PE/剂。
用于本发明组合物的亚微米水包油乳剂及其制造方法，以及免疫刺激剂(如胞壁酰肽)的详细描述在WO 90/14837以及美国专利Nos.6,299,884和6,451,325。
完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可被用作本发明的佐剂。
C.皂苷制剂
皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是一种在许多植物种类的树皮、叶、茎、根甚至花中发现的甾醇苷和三萜苷的异源组。来自Quillaia saponaria Molina树树皮的皂苷已经被广泛研究作为佐剂。皂苷也可通过通过商业途径获自丽花菝葜(Smilax ornata)(sarsaprilla)、满天星(Gypsophilla paniculata)(brides veil))和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，如QS21，以及液体制剂，如ISCOM。
已用高效薄层色谱(HP-LC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化了皂苷组合物。使用这些技术得到的具体的纯化组分已经被鉴定，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选所述皂苷是QS21。一种制造QS21的方法揭示于美国专利No.5,057,540。皂苷制剂中也可含有固醇，如胆固醇(参见PCT公开号WO 96/33739)。
皂苷和胆固醇的组合可用来形成被称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常还含有磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可用于ISCOM。优选ISCOM包括Quil A、QHA和QHC中的一种或多种。ISCOM还描述在EP0109942、WO 96/11711和WO 96/33739。任选地，ISCOM可不含其它去污剂。参见WO00/07621。
为了解皂苷基佐剂的制造可参见Barr等，“ISCOM和其它皂苷基佐剂”(ISCOMs and other皂苷based adjuvants”，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32：247-271。也可参见sjolander等，“口服皂苷和ISCOM疫苗的摄取和佐剂活性”(Uptake and adjuvant activity of orally delivered皂苷and ISCOM vaccines”，Advanced Drug Delivery Reviews(1998) 32：321-338。
D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可被用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种病毒蛋白质，并任选与磷脂组合或配制。它们通常是非致病和不复制的，且通常不含任何天然病毒基因组。这种病毒蛋白质可通过重组制造或从完整病毒分离。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白质包括以下来源的蛋白质：流感病毒(如HA或NA)，乙肝病毒(如核心蛋白或衣壳蛋白)，戊型肝炎病毒，麻疹病毒，辛德比斯病毒，轮状病毒，口蹄疫病毒，逆转录病毒，诺瓦克病毒，人乳头瘤病毒，HIV，RNA噬菌体，Qβ噬菌体(如外被蛋白)，GA噬菌体，fr噬菌体，AP205噬菌体，以及Ty(如逆转录转座子Ty蛋白p1)。VLP还被叙述在以下文献中：WO03/024480，WO 03/024481，以及Niikura等，“作为口服疫苗载体的嵌合重组戊型肝炎病毒样颗粒呈递外源表位”(Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-LikeParticles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting Foreign Epitopes)，Virology(2002)293：273-280；Lenz等，“乳头瘤病毒样颗粒诱导树突细胞极性激活”(Papillomarivurs-Like Particles Induce Acute Activation of Dendritic Cells)，Journalof Immunology(2001)5246-5355；Pinto等，“用重组HPV-16 L1病毒样颗粒免疫的健康志愿者对人乳头瘤病毒(HPV)-16 L1的细胞免疫应答”(Cellular ImmuneResponses to Human Papillomavirus(HPV)-16 L1 Healthy Volunteers Immunized withRecombinant HPV-16 L1 Virus-Like Particles)，Journal of Infectious Diseases(2003)188：327-338；和Gerber等，“人乳头瘤病毒病毒样颗粒当与大肠杆菌不耐热肠毒素突变体R192G或CpG共同施用时是有效的口服免疫原”(Human PapillomavrisuVirus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens when Coadministered withEscherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG)，Journal ofVirology(2001) 75(10)：4752-4760。病毒体还叙述在，例如，Gluck等，“将来开发疫苗的新技术平台”(New Technology Platforms in the Development of Vaccines for theFuture)，Vaccine(2002) 20：B10-B16。在鼻内三价INFLEXALTM产品(Mischler &Metcalfe(2002)Vaccine 20，增刊5：B17-23)和INFLUVAC PLUSTM产品中，免疫增强的重建的流感病毒体(IRIV)用作亚基抗原递送系统。
E.细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如：
(1)肠道细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物
这种衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3-O-脱酰单磷酰脂质A和4、5或6个酰化链的混合。优选的3-O-脱酰单磷酰脂质A的“小颗粒”形式揭示在EP 0 689 454。3dMPL的这种“小颗粒”足够小以至能通过0.22微米无菌过滤膜(参见EP 0 689 454)。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨烷基氨基葡萄糖苷磷酸衍生物，例如RC-529。见Johnson等，(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：2273-2278。
(2)脂质A衍生物
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。OM-174描述于，例如，Meraldi等，“一种新的有可能用于人类的佐剂OM-174与合成的柏格鼠疟原虫环孢子蛋白的C-末端片段242-310一起施用后诱导保护性应答”(OM-174，a New Adjuvant with a Potential for Human Use，Induces a Protective Response withAdministered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310 from thecircumsporozoite protein of Plasmodium berghei)，Vaccine(2003) 21：2485-2491；和Pajak等，“OM-174佐剂在体内诱导鼠树突细胞的迁移和成熟”(The AdjuvantOM-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cells in vivo”，Vaccine(2003) 21：836-842。
(3)免疫刺激寡核苷酸
适合用作本发明佐剂的免疫刺激寡核苷酸包括含有CpG基序(一段含有未甲基化的胞嘧啶之后是鸟嘌呤并通过磷酸键连接的序列)的核苷酸序列。已证明含有回文序列或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸具有免疫刺激活性。
CpG可包括核苷修饰/类似物，如硫代磷酸脂修饰，并可以是双链或单链的。任选地，鸟苷可被其类似物如2’-脱氧-7-脱氮鸟苷替代。例如可参见Kandimalla等[“趋异合成的核苷酸基序识别模式：设计和建立具有不同细胞因子诱导特性的强效免疫调节性寡脱氧核糖核酸制剂”(Divergent synthetic nucleotide motif recognitionpattern：design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles)，Nucleic Acids Research(2003) 31(9)：2393-2400]；WO 02/26757和WO 99/62923叙述了可能的类似物例子。CpG寡核苷酸的佐剂功效还描述在Krieg，“CpG基序：细菌提取物中的活性成分？”(CpG motifs：the active ingredient in bacterial extracts？)，Nature Medicine(2003)9(7)：831-835；McCluskie等，“在小鼠中通过肠胃外和粘膜用乙肝表面抗原和CpGDNA加强免疫的策略”(Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategiesin mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA)，FEMS Immunology andMedical Microbiology(2002) 32：179-185；WO 98/40100；美国专利No.6,207,646；美国专利No.6,239,116和美国专利No.6,429,199。
CpG序列可定向TLR9，如GTCGTT或TTCGTT基序。见Kandimalla等，“Toll样受体9：通过新的合成CpG DNA调节鉴定和细胞因子诱导”(Toll-likereceptor 9：modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic CpGDNAs)，Biochemical Society Transactions(2003) 31(第3部分)：654-658。CpG序列可特异于诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或者它可能更加特异于诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN叙述于Blackwell等，“CpG-A诱导的单核细胞IFN-γ-可诱导蛋白质由浆细胞样树突细胞衍生的IFN-α调节”(CpG-A-Induced Monocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulatedby Plasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha)，J.Immunol.(2003) 170(8)：4061-4068；Krieg，“CpG A-Z”(From A to Z on CpG)，TRENDS inImmunology(2002) 23(2)：64-65和WO 01/95935。优选所述CpG是CpG-A ODN。
优选CpG寡核苷酸是构建的以使5’末端可被受体识别。任选地，两个CpG寡核苷酸序列可在它们的3’末端相连以形成“免疫子(immunomer)”。参见例如Kandimalla等，“影响免疫刺激活性的CpG寡核苷酸的二级结构”(Secondarystructures in CpG oligonucleotides affec timmunostimulatory activity)，BBRC(2003)306：948-953；Kandimalla等，“Toll样受体9：通过新的合成CpG DNA调节鉴定和细胞因子诱导”，Biochemical Society Transactions(2003) 31(第3部分)：664-658；Bhagat等，“CpG五-和六脱氧核糖核酸是有效的免疫调制剂”(CpG penta-andhexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents)BBRC(2003)300：853-861和WO 03/035836。
(40)ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物
细菌ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选所述蛋白质衍生自大肠杆菌(即大肠杆菌不耐热肠毒素“LT)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。WO 95/17211描述了使用脱毒ADP核糖基化毒素作为粘膜佐剂，WO 98/42375描述了将其作为肠胃外佐剂。优选佐剂是脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LTR192G。可在以下参考资料中找到将ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72，用作佐剂，这些参考文献内容纳入本文作为参考：Beignon等，“大肠杆菌不耐热肠毒素的LTR72突变体共施用于Bare皮肤后增强肽抗原激发CD4+T细胞及分泌γ干扰素的能力”(The LTR72 Mutant of Heat-LabileEnterotoxin of Escherichia coli Enahnces the Ability of Peptide Antigen to Elicit CD4+T and Secrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin)，Infection andImmunity(2002) 70(6)：3012-3019；Pizza等，“粘膜疫苗：作为粘膜佐剂的LT和CT的无毒衍生物”(Mucosal vaccines：non-toxic derivatives of LT and CT as mucosaladjuvants)，Vaccine(2001) 19：2534-2541；Pizza等，“LTK63和LTR72，两种将进行临床试验的粘膜佐剂”(LTK63 and LTR72，two mucosal adjuvants ready for clinicaltrials)Int.J.Med.Microbiol(2000) 290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等，“用细菌ADP核糖基化外毒素、亚单位和无关佐剂经皮免疫”(Transcutaneous Immunizationwith Bacterial ADP-Ribosylating Exotoxins，Subunits and Unrelated Adjuvants)，Infection and Immunity(2000) 68(9)：5306-5313；Ryan等，“大肠杆菌不耐热毒素的突变体作为经鼻输送无细胞百日咳疫苗的有效粘膜佐剂：无毒AB复合体的不同作用以及在Th1和Th2细胞上的酶活性”(Mutants of Escherichia coli Heat-Labile ToxinAct as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular PertussisVaccine：Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity onTh1 and Th2 Cells)Infection and Immunity(1999) 67(12)：6270-6280；Partidos等，“大肠杆菌不耐热肠毒素及其定点突变体LTK63增强对鼻内共免疫合成肽的增殖反应和细胞毒T细胞反应”(Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli and its site-directedmutant LTK63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasallyco-immunized synthetic peptides)，Immunol.Lett.(1999) 67(3)：209-216；Peppoloni等，“大肠杆菌不耐热肠毒素突变体是鼻内输送疫苗安全有效的佐剂”(Mutants ofthe Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasaldelivery of vaccines)，Vaccines(2003)2(2)：285-293；和Pine等，(2002)“用流感疫苗和大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒突变体(LTK63)鼻内免疫”(Intranasalimmunization with influenza vaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxinfrom Escherichia coli(LTK63))J.Control Release(2002)85(1-3)：263-270。氨基酸替代优选基于ADP核糖基化毒素A和B亚单位的序列对比，参见Domenighini等，Mol.Microbiol(1995) 15(6)：1165-1167，该文献被全文纳入作为参考。
F.生物粘附剂和粘膜粘着剂
生物粘附剂和粘膜粘着剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘附剂包括酯化的透明质酸微球体(Singh等，(2001)J.Cont.Rele.70：267-276)或粘膜粘着剂，如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。脱乙酰壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂。例如，WO99/27960。
G.微粒
微粒也可被用作本发明的佐剂。由生物可降解的无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟丁酸、正聚酯类、聚酐、聚己酸内酯等)与聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即直径为约100nm-150μm，更优选约200nm-30μm，最优选约500nm-10μm的颗粒)是优选的，可任选进行处理以使其表面带有负电荷(如用SDS处理)或正电荷(如用阳离子去污剂，如CTAB处理)。
H.脂质体
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述在美国专利No.6,090,406，美国专利No.5,916,588和EP 0 626 169。
I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚类和聚氧乙烯酯类。WO99/52549。这类制剂还包括与辛苯聚醇混合的聚氧乙烯失水山梨醇酯表面活性剂(WO01/21207)，以及与至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯聚醇混合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
J.聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂描述于，例如，Andrianov等，“通过凝聚聚磷腈水溶液来制备水凝胶微球体”(Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueouspolyphophazene solutions)，Biomaterials(1998) 19(1-3)：109-115；和Payne等，“从聚磷腈基质释放蛋白质”(Protein Release from Polyphosphazene Matrices)，Adv.Drug.Delivery Review(1998) 31(3)：185-196。
K.胞壁酰肽
适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-1-丙氨酰-d-异谷氨酰氨酰基-1-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)。
L.咪唑并喹诺酮化合物
适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物，进一步描述于Stanley，“咪喹莫特和咪唑并喹诺酮类的作用机制和治疗潜能”(Imiquimod and the imidazoquinolones：mechanism of action and theraDeuticpotential)Clin Exp Dermatol(2002) 27(7)：571-577；以及Jones，“瑞喹莫德3M”(Resiquimod 3M)，Curr Opin Investig Drugs(2003) 4(2)：214-218；和美国专利号4,689,338，5,389,640，5,268,376，4,929,624，5,266,575，5,352,784，5,494,916，5,482,936，5,346,905，5,395,937，5,238,944，和5,525,612。
M.缩氨硫脲化合物
缩氨硫脲化合物的例子及其配制、制备方法以及筛选适于在本发明组合物中用作佐剂的化合物的方法可参见WO04/60308。缩氨硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面尤其有效。
N.色胺酮化合物
色胺酮化合物的例子及其配制、制备方法以及筛选适于在本发明组合物中用作佐剂的化合物的方法可参见WO04/64759。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面尤其有效。
Q.人免疫调节剂
适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括各种细胞因子，如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)，干扰素(例如干扰素-γ)，巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
本发明组合物还包括上述一种或多种佐剂类型的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明：
(1)皂苷和水包油乳剂(WO99/11241)；
(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO 94/00153)；
(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；
(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(WO98/57659)；
(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合(见欧洲专利申请0835318，0735898和0761231)；
(6)SAF，含有10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％普卢兰尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，经微流化制成亚微米乳剂或剧烈搅拌形成较大颗粒乳剂。
(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，含有2％鲨烯、0.2％Tween 80以及选自单磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁组分，较佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；和
(8)一种或多种矿物盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dPML)。
(9)一种或多种矿物盐(如铝盐)+免疫刺激寡核苷酸(如包括CpG基序的核苷酸序列)。
铝盐和MF59是可注射疫苗的优选佐剂。细菌毒素和生物粘附剂是用于粘膜递送给药的疫苗如鼻部疫苗的优选佐剂。
制备HCV特异性抗体的方法
可用HCV融合蛋白来产生HCV特异性多克隆抗体和单克隆抗体。HCV特异性多克隆抗体和单克隆抗体特异性结合于HCV抗原。可将融合蛋白给予哺乳动物如小鼠、家兔、山羊或马来产生多克隆抗体。收集被免疫动物的血清，通过如硫酸铵沉淀然后层析(优选亲和层析)从血浆中收集抗体。制备和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。
可容易地制备针对融合蛋白中存在的HCV特异性表位的单克隆抗体。可将用HCV融合蛋白免疫的哺乳动物如小鼠的正常B细胞与如HAT-敏感性小鼠骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞。可用RIA或ELISA鉴定产生HCV特异性抗体的杂交瘤细胞，并在半固体琼脂上克隆以分离这些细胞或用有限稀释来分离。用另一轮筛选来分离产生HCV特异性抗体的克隆。
针对HCV表位的单克隆或多克隆抗体对于检测样品(例如HCV感染的人的血清样品)中HCV或HCV抗原的存在尤其有用。HCV抗原的免疫检测可利用一种抗体或几种抗体。HCV抗原的免疫检测可利用，例如针对HCV表位的单克隆抗体，针对一种HCV多肽的表位的单克隆抗体的组合，针对不同HCV多肽的表位的单克隆抗体，针对相同HCV抗原的多克隆抗体，针对不同HCV抗原的多克隆抗体，或单克隆和多克隆抗体的组合。免疫检测方法可基于如竞争、直接反应、或三明治型试验(例如用标记的抗体)。标记可以是例如荧光、化学发光或放射性。
多克隆或单克隆抗体可进一步用于通过免疫亲和柱来分离HCV颗粒或抗原。可通过例如吸附或共价连接等使抗体保持其免疫选择活性的方法将抗体固定在固体支持物上。任选地，可包括间隔基团，从而使抗体的抗原结合位点可被接近。然后，固定的抗体可用于结合生物样品例如血液或血浆中的HCV颗粒或抗原。通过例如pH的变化从柱基质上回收结合的HCV颗粒或抗原。
HCV-特异性T细胞
被上述有或没有核心多肽的、体内或体外表达的融合蛋白(包括NS3*NS4NS5t融合蛋白或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白)以及本文所述的任何其它的各种融合蛋白活化的HCV特异性T细胞，优选识别HCV多肽如NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a或NS5b多肽的表位，包括这些多肽的一种或多种与NS5t的融合蛋白(有或没有核心多肽)的表位。HCV特异性T细胞可以是CD8+或CD4+。
HCV特异性CD8+T细胞可以是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，它可以杀伤展示与I类MHC分子复合的上述任何表位的HCV感染细胞。可用51Cr释放试验(见实施例)来检测HCV特异性CD8+T细胞。51Cr释放试验检测HCV特异性CD8+T细胞裂解靶细胞的能力，所述靶细胞展示这些表位的一种或多种。表达抗病毒剂如IFN-γ的HCV特异性CD8+T细胞也在本文考虑范围之内，这些细胞也可用免疫方法检测，优选在用一种或多种HCV多肽(例如但不限于E2，NS3，NS4，NS5a，或NS5b多肽，见实施例)体外刺激之后针对IFN-γ或类似细胞因子进行的细胞内染色。
被上述有或没有核心多肽、体内或体外表达的融合蛋白(例如但不限于NS3*NS4NS5t融合蛋白或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白)活化的HCV特异性CD4+细胞，优选识别HCV多肽(例如但不限于NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a或NS5b多肽)的表位，包括HCV多肽的有或没有核心多肽的融合蛋白(例如NS3*NS4NS5t或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白)的表位，所述表位结合在HCV感染的细胞的II类MHC分子上，并且HCV特异性CD4+细胞响应于刺激而增殖。
可用淋巴组织增生试验(见实施例)来检测HCV特异性CD4+细胞。淋巴组织增生试验检测HCV特异性CD4+细胞响应于例如NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a，和/或NS5b表位而增殖的能力。
活化HCV特异性T细胞的方法
可用HCV融合蛋白或多核苷酸体外或体内活化HCV特异性T细胞。活化HCV特异性T细胞可尤其用于提供模型系统以优化对HCV的CTL应答反应，和提供针对HCV感染的预防性和治疗性治疗。对于体外活化，优选通过质粒或病毒载体例如如上所述的腺病毒载体将蛋白递送到T细胞。
T细胞的多克隆群体可衍生感染了HCV的哺乳动物的血液，优选来自外周淋巴器官，如淋巴结、脾或胸腺。优选的哺乳动物包括小鼠、猩猩、狒狒和人。HCV用于在哺乳动物中扩增活化的HCV特异性T细胞的数目。然后，可加入上述有或没有核心多肽的HCV融合蛋白，例如但不限于HCV NS3*NS4NS5t融合蛋白或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白，体外重新刺激衍生自哺乳动物的HCV特异性T细胞。然后检测HCV特异性T细胞的(尤其是)增殖、IFN-γ的产生、以及体外裂解展示HCV表位的靶细胞的能力。
在淋巴组织增生试验(实施例6)中，当与HCV多肽，例如但不限于NS3，NS4，NS5a，NS5b，NS3NS4NS5，或E2NS3NS4NS5表位多肽一起培养时，HCV-活化的CD4+T细胞增殖，但是在缺少表位多肽时不增殖。因此，可用淋巴组织增生试验来鉴定被HCV特异性CD4+T细胞识别的特定HCV表位，例如NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a，NS5b以及这些表位的融合，例如但不限于NS3NS4NS5和E2NS3NS4NS5表位。
类似地，可在用上述融合蛋白体外刺激后检测HCV特异性CD4+和/或CD8+T细胞中的IFN-γ，来鉴定(例如)对刺激CD4+和/或CD8+T细胞产生IFN-γ特别有效的融合蛋白表位，例如但不限于NS2，p7，E1，E2，NS3，NS4，NS5a，NS5b的表位，或这些表位的融合蛋白，例如但不限于NS3NS4NS5和E2NS3NS4NS5表位(见实施例5)。
另外，51Cr释放试验可用于测定对HCV的CTL应答反应的水平。见Cooper等，Immunity 10：439-449。例如，可从HCV感染的哺乳动物肝中衍生HCV特异性CD8+T细胞。可在51Cr释放试验中检测这些T细胞对抗展示如E2NS3NS4NS5或NS3NS4NS5表位的靶细胞能力。可构建几个表达不同NS3NS4NS5或E2NS3NS4NS5表位的靶细胞群，从而各靶细胞群展示不同的NS3NS4NS5或E2NS3NS4NS5表位。可用这些靶细胞群的每一个来检测HCV特异性CD8+细胞。51Cr释放试验的结果可用于确定NS3NS4NS5或E2NS3NS4NS5的哪些表位产生了对HCV最强的CTL应答反应。然后可用获自51Cr释放试验的信息，构建含有产生最强的CTL应答反应的有或没有核心多肽的NS3*NS4NS5t融合蛋白或E2NS3*NS4NS5t融合蛋白。
如上所述的HCV融合蛋白或编码这些融合蛋白的多核苷酸可给予哺乳动物，如小鼠、狒狒、猩猩或人，以刺激体液和/或细胞免疫反应，例如体内活化HCV特异性T细胞。可用本领域已知的任何方法给药，包括胃肠外、鼻内、肌肉内或皮下注射，包括用如上所述的生物冲击枪(“基因枪”)。
优选地，将HCV多核苷酸注射到活化的T细胞。除了构建和修饰的简单性所带来的实际益处之外，注射多核苷酸还使融合蛋白在宿主内合成。因此，这些免疫原以原始的翻译后修饰、结构和构象被宿主免疫系统呈递。优选多核苷酸肌肉内注射到大哺乳动物体内，如人中，剂量为0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，5或10mg/kg。
以与采用的具体组合物相容的方式给予包含HCV融合蛋白或多核苷酸的本发明组合物，给予的量如(尤其是)51Cr释放试验、淋巴组织增生试验或对IFN-γ进行细胞内染色所检测，足以有效活化HCV-特异性T细胞。这些蛋白和/或多核苷酸可给予未感染HCV的哺乳动物，或给予感染HCV的哺乳动物。组合物中多核苷酸或融合蛋白的具体剂量依赖于很多因素，包括但不限于，将要给予组合物的哺乳动物的种类、年龄和总体状况，以及给予组合物的方式。仅用常规试验就可容易地确定本发明组合物的有效量。可用上述体外和体内模型鉴定合适剂量。下述实施例中所用多核苷酸的量为体内或体外优化HCV特异性T细胞的活化提供了一般性指导。一般，将0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，5或10mg有或没有核心多肽的HCV融合蛋白或多核苷酸给予大的哺乳动物，如狒狒、猩猩或人。如果需要，也可在组合物之前、之后或同时给予共刺激分子或佐剂。
可通过改变剂量、给药途径或加强方案来增强由递送本发明组合物所产生的哺乳动物免疫应答反应，包括HCV特异性T细胞的活化。可用单剂量方案给予本发明组合物，或优选以多剂量方案给予，其中初次免疫接种过程包括1-10个独立剂量，然后在后续的保持和/或加强免疫反应所需的时间间隔中给予其它剂量，例如，在1-4个月给予第二剂，如果需要，可在几个月之后给予后续一剂或多剂。
III.实验
下文是实施本发明的具体实施方式的例子。提供这些实施例仅用于阐释的目的，不意于以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员很容易理解，根据本发明公开的内容，本发明可用很多方式实施。
已努力确保所用数字(例如，数目、温度等)的精确性，但当然允许一些实验误差和偏差。
实施例1
NS5Core和NS5tCore多核苷酸和多肽的产生
下面实施例中的NS5t代表C末端截短的NS5分子，其包括对应于氨基酸1973-2990的氨基酸，编号相对于全长HCV-1多蛋白。
用标准重组技术制备编码NS5t的多核苷酸，将该构建物与编码核心多肽的多核苷酸融合，所述核心多肽包括全长多蛋白的氨基酸1-121，如图3的氨基酸1772-1892，以产生NS5tCore121。
克隆NS5tCore121多核苷酸并在酿酒酵母中表达。具体地说，将NS5Core蛋白遗传工程化以用酵母表达载体pBS24.1在酿酒酵母中表达。该载体含有2μ的在酵母中自主复制的序列以及作为可选择标记的酵母基因leu2d和URA3。该表达载体中还有β-内酰胺酶基因和在细菌中复制质粒所需的ColE1复制起点，以及α-因子终止子。重组蛋白的表达在杂合启动子ADH2/GAPDH控制之下。
在ADH2/GAPDH启动子和HCV-1 NS5a的接合处使用具有HindIII-EcoNI限制性末端的合成寡核苷酸(27bp)。从pd.Δns3ns5Pjcore121RT(描述于PCT公开号WO01/38360)中凝胶纯化编码NS5a和部分NS5b的2893bp的EcoNI-NdeI限制性片段。在截短的NS5b和核心多肽的结合处使用具有NdeI和NotI末端的合成寡核苷酸(205bp)。从pT7Blue2.HCV121(描述于PCT公开号WO 01/38360)中凝胶纯化编码核心多肽121的318bp的NotI-SalI限制性片段。将编码NS5tCore121的整个3442bp的HindIII-SalI多核苷酸亚克隆入pSP72(Promeg a，Madison，WI)HindIII-SalI载体，并验证序列。然后，将NS5tCore121多核苷酸与ADH2/GAPDH启动予连接到pBS24.1酵母表达载体中。
用酵母表达质粒转化酿酒酵母AD3株系(matα，leu2，trp1，ura3-52，prb-1122，pep4-3，prc1-407，cir°，trp+，：DM15[GAP/ADR])，培养基中葡萄糖耗竭后检测单个转化子的表达。用玻璃珠裂解细胞团块。等份的可溶和不可溶的组分在SDS样品缓冲液+50mM DTT中煮沸，在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上跑胶，并用考马斯蓝染色。玻璃珠裂解后在不溶性组分中检测到样品中的重组蛋白。
在25℃和30℃比较NS5tCore121和NS5Core121(一种包含全长NS5序列(氨基酸1973-3011，编号相对于全长HCV-1多蛋白)的构建物)的表达。如图4A和4B所示，包含NS5t的构建物表达量大于包含全长NS5序列的构建物。
实施例2
NS3*NS4NS5t和NS3*NS4NS5tCore多核苷酸和多肽的产生
以下实施例中的NS3*代表修饰的NS3分子，其中丙氨酸取代了通常在氨基酸位置1165处发现的丝氨酸，编号相对于全长HCV-1多蛋白序列。
从HCV分离编码NS3NS4(约为氨基酸1027-1972，编号相当于HCV1)(本文也称为“NS34”)的多核苷酸。将编码氨基酸1165处的Ser的编码序列突变为Ala的编码序列，将该分子的NS3部分突变，从而使得到的分子缺乏NS3蛋白酶活性。该构建物与实施例1所述的编码NS5tCore121的多核苷酸融合，产生NS3*NS4NS5tCore121。或者，该分子与NS5t融合产生NS3*NS4NS5t。将这些构建物克隆到质粒、疫苗病毒和腺病毒载体中。另外，将这些构建物插入到重组表达载体中，转化宿主细胞产生NS3*NS4NS5tCore121和NS3*NS4NS5t融合蛋白。
如下所述测定蛋白酶活性。将NS4A肽(KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK)和感兴趣的融合蛋白稀释在90μl反应缓冲液(25mM Tris，pH7.5，0.15M NaCl，0.5mMEDTA，10％甘油，0.05n-十二烷基B-D-麦芽糖苷，5mM DTT)中，室温混合30分钟。将90μl的混合物加到微滴定板中(Costar，Inc.，Corning，NY)，加入10μl HCV底物(AnaSpec，Inc.，San Jose CA)。混合该板并在Fluostar板读数仪上读数。结果表示为相对荧光单位(RFU)/分钟。
实施例3
E2NS3*NS4NS5t和E2NS3*NS4NS5tCore多核苷酸和多肽的产生
下列实施例中的E2代表包括氨基酸384-715(编号相对于全长HCV-1多蛋白)的C末端截短的E2分子。用美国专利号6,121,020和6,326,171所述的方法制备编码截短的E2分子的多核苷酸。如实施例2所述制备编码NS3*NS4NS5tCore121或NS3*NS4NS5t的多核苷酸。将构建物融合以产生E2NS3*NS4NS5tCore121和E2NS3*NS4NS5t。将构建物克隆到质粒、疫苗病毒和腺病毒载体中。另外，将构建物插入到重组表达载体中，转化宿主细胞以产生E2NS3*NS4NS5tCore121和E2NS3*NS4NS5t融合蛋白。如上所述测定蛋白酶活性。
实施例4
在免疫接种的动物中引发HCV特异性CTL
如下所述，用如上所述制备的HCV融合蛋白：NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121和E2NS3*NS4NS5t产生HCV融合蛋白-ISCOM。将所需的融合蛋白和预先制备的ISCOMATRIX(空ISCOMs)混合，利用离子相互作用力以使融合蛋白和佐剂之间的连接最强，如此制备融合蛋白-ISCOM。基本如Coulter等，(1998)Vaccine 16：1243所述制备ISCOMATRIX。
麻醉下免疫恒河猴。将动物分为两组。在第0月，第一组用2×108噬菌斑形成单位(pfu)(1×108皮内注射，1×108通过划痕感染)的rVVC/E1感染。该组作为引发CTL的阳性对照。在第0、1、2和6个月，在左四头肌肌肉内(IM)注射，用25-100μg吸附到ISCOM上的如上所述的HCV融合多肽免疫第二组的动物。如Paliard等，(2000) AIDS Res.Hum.Retroviruses 16：273中所述，用标准的51Cr释放试验检测细胞毒活性。
实施例5
用融合多核苷酸免疫
在一种免疫接种操作方法中，通过肌肉内注射到胫骨前肌中，用50-250μg编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的质粒DNA免疫动物。6周后用107pfu编码NS5a(腹膜内)、NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的疫苗病毒(VV)、或50-250μg质粒对照(肌肉内)进行加强免疫。
在另一种免疫接种操作方法中，用编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的1010腺病毒颗粒肌肉内注射到动物的胫骨前肌。6周后用107pfu的VV-NS5a腹膜内加强注射，或用编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的1010腺病毒颗粒肌肉内加强注射。
实施例6
HCV特异性CD8+T细胞的活化
51Cr释放试验.51Cr释放试验用于检测HCV特异性T细胞裂解展示NS5a表位的靶细胞的能力。从被免疫动物中收集脾细胞。在IL-2存在下，用来自HCV-NS5a的CTL表位多肽p214K9(2152-HEYPVGSQL-2160；SEQ ID NO：1)体外重刺激这些细胞6天。然后，如Weiss(1980)J.Biol.Chem.255：9912-9917所述，用标准51Cr释放试验检测脾细胞对表达I类MHC分子但不表达II类MHC分子的肽敏化靶细胞(L929)的细胞毒活性。检测效应器(T细胞)与靶(B细胞)的比例为60∶1、20∶1和7∶1。对于各效应器与靶的比例，计算特异性裂解百分比(percent specific lysis)。
实施例7
表达IFN-γ的HCV特异性CD8+T细胞的活化
干扰素-γ(IFN-γ)的细胞内染色.干扰素-γ(IFN-γ)的细胞内染色用于鉴定体外受NS5a表位p214K9刺激后分泌IFN-γ的CD8+T细胞。在IL-2和莫能菌素下，体外用p214K9或非特异性肽重刺激单个被免疫动物的脾细胞6-12小时。然后对细胞表面的CD8和细胞内的IFN-γ染色，并用流式细胞术分析。然后计算IFN-γ阳性的CD8+T百分比。
实施例8
HCV特异性CD4+T细胞的增殖
淋巴组织增生试验.用磁珠将富集的被免疫动物的脾细胞中的CD8+T耗竭，然后一式三份与p222D、HCV NS5a的NS5a表位肽(2224-AELIEANLLWRQEMG-2238；SEQ ID NO：2)、或仅与培养基一起培养。72小时后，用1μCi/细胞的3H-胸苷脉冲细胞，6-8小时后收获细胞。收获后检测掺入的放射性。计算平均cpm。
实施例9
融合DNA疫苗制剂引发CTL的能力
通过电穿孔递送(关于这种递送技术，参见例如，国际出版号WO/0045823)，用10-250μg编码上述NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的质粒DNA免疫动物，或用PLG连接的编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t(见下)的DNA免疫动物，或用编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的DNA免疫动物。免疫接种6周后，用编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的质粒DNA加强注射。
PLG递送的DNA.聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)聚合物获自Boehringer Ingelheim，U.S.A。PLG聚合物是RG505，其共聚物比例为50/50，分子量为65kDa(生产商提供的数据)。用改良的溶剂蒸发过程，基本上如Singh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97：811-816所述，制备带有吸附的DNA的阳离子微粒。简言之，用IKA匀浆器高速下用1ml PBS在二氯甲烷中乳化10ml 5％w/v聚合物溶液。然后将初级乳液加到含有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.5％w/v)的50ml蒸馏水中。上述操作形成了w/o/w乳液，室温下6000rpm搅拌该乳液12小时，使二氯甲烷蒸发。10,000g离心用蒸馏水洗涤产生的微粒两次，然后冻干。制备、洗涤和收集之后，100mg阳离子微粒在1mg/ml DNA乳液中4℃孵育6小时，使DNA构建物吸附到微粒上。然后离心分离微粒，团块用TE缓冲液洗涤，微粒冻干。
用上面实施例所述的51Cr释放试验或细胞内染色来检测CTL活性和IFN-γ表达。
实施例10
免疫接种途径和编码融合蛋白的复制子颗粒SINCR(DC+)
如Polo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96：4598-4603所述制备α病毒复制子颗粒，例如SINCR(DC+)。如上所述用编码NS3*45tCore的5×106IU SINCR(DC+)复制子颗粒肌肉内(IM)注射动物，或在尾根部(BoT)和足垫(FP)皮下注射(S/C)，或2/3的DNA用IM递送，1/3的DNA用BoT途径递送。免疫接种后，如上所述用疫苗病毒进行加强注射。如上面实施例所述用细胞内染色检测IFN-γ表达。
实施例11
α病毒复制子引发，然后进行各种加强免疫方案
如Polo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96：4598-4603所述制备α病毒复制子颗粒，例如SINCR(DC+)。通过肌肉内注射到胫骨前肌，用1.5×106IU编码如上所述融合蛋白的SINCR(DC+)复制子颗粒免疫引发动物，然后在第6周如下所述进行加强免疫：10-100μg编码NS5a、NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的质粒DNA，或1010编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的腺病毒颗粒，或1.5×106IU编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的SINCR(DC+)复制子颗粒，或107pfu编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的疫苗病毒。如上所述细胞内染色检测IFN-γ表达。
实施例12
表达NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的α病毒
如Polo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96：4598-4603所述制备α病毒复制子颗粒，例如SINCR(DC+)和SINCR(LP)。通过组合递送途径(2/3 IM和1/3 S/C)以及仅通过S/C途径用1×102-1×106IU编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的SINCR(DC+)复制子免疫动物，或通过组合递送途径(2/3 IM和1/3 S/C)以及仅通过S/C途径用1×102-1×106IU编码NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的SINCR(LP)复制子颗粒免疫动物。免疫接种后第6周用107pfu编码NS5a、NS3*NS4NS5tCore121、NS3*NS4NS5t、E2NS3*NS4NS5tCore121或E2NS3*NS4NS5t的疫苗病毒加强注射。如实施例5所述细胞内染色检测IFN-γ表达。
因此，公开了C末端截短的HCV NS5以及包含C末端截短的HCV NS5的融合多肽。虽然详细描述了本发明的优选实施方式，但应理解可进行各种显而易见的变化而不偏离本发明的精神以及权利要求书所限定的本发明范围。

Claims (36)

1.一种C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽含有全长NS5a多肽和NS5b多肽的N末端部分。
2.如权利要求1所述C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽在氨基酸2500和C末端之间的位置被截短，编号相对于全长HCV-1多蛋白。
3.如权利要求1所述C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽在氨基酸2900和C末端之间的位置被截短，编号相对于全长HCV-1多蛋白。
4.如权利要求3所述C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽在对应于紧随氨基酸2990之后的氨基酸的氨基酸处被截短，编号相对于全长HCV-1多蛋白。
5.如权利要求4所述C末端截短的NS5多肽，其特征在于，所述多肽由对应于氨基酸1973-2990的氨基酸序列组成，编号相对于全长HCV-1多蛋白。
6.一种免疫原性融合蛋白，其含有权利要求1-5中任一项所述C末端截短的NS5多肽，和衍生自HCV多蛋白除NS5区域之外的区域的至少一种多肽。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白还含有修饰的NS3多肽，该修饰的NS3多肽含有对应于His-1083、Asp-1105和/或Ser-1165的氨基酸取代，编号相对于全长HCV-1多蛋白，从而当所述修饰的NS3多肽存在于HCV融合蛋白中时，蛋白酶活性被抑制。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述修饰的NS3多肽包含对应于Ser-1165的氨基酸的丙氨酸取代，编号相对于全长HCV-1多蛋白。
9.如权利要求6-8中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白包含修饰的NS3多肽、NS4多肽和任选的HCV核心多肽。
10.如权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽含有C末端截短。
11.如权利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽由图3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列组成。
10.如权利要求6-11中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，还含有E2多肽。
11.如权利要求10所述的融合蛋白，其特征在于，所述E2多肽是C末端截短的E2多肽，其由对应于氨基酸384-715的氨基酸序列组成，编号相对于全长HCV-1多蛋白。
12.如权利要求6-11中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，存在于所述融合蛋白中的各多肽衍生自相同的HCV分离物。
13.如权利要求6-11中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，存在于所述融合蛋白中的至少一种多肽与C末端截短的NS5多肽衍生自不同的分离物。
14.一种免疫原性融合蛋白，其在氨基末端至羧基末端方向基本由以下多肽组成：
(a)修饰的NS3多肽，其含有在对应于Ser-1165的氨基酸处的丙氨酸取代从而抑制蛋白酶活性，编号相对于全长HCV-1多蛋白；
(b)NS4多肽；
(c)C末端截短的NS5多肽，其中所述NS5多肽由对应于氨基酸1973-2990的氨基酸序列组成，编号相对于全长HCV-1多蛋白；和
(d)任选地，HCV核心多肽。
15.如权利要求14所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有HCV核心多肽。
16.如权利要求15所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽含有C末端截短。
17.如权利要求16所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽由图3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列组成。
18.一种免疫原性融合蛋白，其在氨基末端至羧基末端方向基本由以下多肽组成：
(a)C末端截短的E2多肽，由对应于氨基酸384-715的氨基酸序列组成，编号相对于全长HCV-1多蛋白；
(b)修饰的NS3多肽，含有在对应于Ser-1165的氨基酸处的丙氨酸取代从而抑制蛋白酶活性，编号相对于全长HCV-1多蛋白；
(c)NS4多肽；
(d)C末端截短的NS5多肽，其中所述NS5多肽由对应于氨基酸1973-2990的氨基酸序列组成，编号相对于全长HCV-1多蛋白；和
(e)任选地，HCV核心多肽。
19.如权利要求18所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有HCV核心多肽。
20.如权利要求19所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽含有C末端截短。
21.如权利要求20所述的融合蛋白，其特征在于，所述核心多肽由图3的氨基酸位置1772-1892所示的氨基酸序列组成。
22.一种组合物，其含有如权利要求1-5中任一项所述C末端截短的NS5多肽以及药学上可接受的赋形剂。
23.一种组合物，其含有如权利要求6-21中任一项所述的免疫原性融合蛋白以及药学上可接受的赋形剂。
24.如权利要求22或23所述的组合物，还含有另外的HCV免疫原性多肽。
25.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述另外的HCV免疫原性多肽包含E1E2复合物。
26.一种在脊椎动物对象中刺激细胞免疫应答反应的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的如权利要求22-25中任一项所述的组合物。
27.如权利要求22-25中任一项所述的组合物在用于在脊椎动物对象中刺激细胞免疫应答反应的方法中的应用。
28.如权利要求1-5中任一项所述C末端截短的NS5多肽或如权利要求6-21中任一项所述的免疫原性融合蛋白在制备用于在脊椎动物对象中刺激细胞免疫应答反应的药物中的应用。
29.一种制备组合物的方法，所述方法包括将如权利要求1-5任一项所述C末端截短的NS5多肽或如权利要求6-21中任一项所述的免疫原性融合蛋白与药学上可接受的赋形剂混合。
30.一种多核苷酸，其含有编码如权利要求1-5任一项所述C末端截短的NS5多肽的编码序列、或编码如权利要求6-21中任一项所述的免疫原性融合蛋白的编码序列。
31.一种重组载体，其含有：
(a)如权利要求30所述的多核苷酸；和
(b)与所述多核苷酸可操作性连接的至少一种控制元件，从而所述编码序列能够在宿主细胞中被转录和翻译。
32.含有权利要求31所述重组载体的宿主细胞。
33.一种制备免疫原性C末端截短的NS5多肽或含有所述多肽的免疫原性融合蛋白的方法，所述方法包括在产生所述蛋白的条件下培养如权利要求32所述的宿主细胞群。
34.一种增强HCV NS5多肽的产量的方法，所述方法包括在产生所述蛋白的条件下培养如权利要求32所述的宿主细胞群，其中与相同条件下产生的全长NS5多肽相比，所述蛋白的产量更大。
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