CN107922461A - 广谱抗感染肽 - Google Patents
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Abstract
本文提供了抗感染肽及其用途，在一种实施方式中，本文提供了长度为16至26个氨基酸残基，并且包含以下氨基酸序列的肽：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A。所述抗感染肽包含D氨基酸、L氨基酸或其组合。在某些实施方式中，所述抗感染肽是聚乙二醇化的、经修饰以包含亲水性聚合物、是订书钉肽或者是脂化的。本文还提供了包含该抗感染肽的组合物，以及利用该抗感染肽治疗和消毒的方法。本文所提供的抗感染肽对广谱的细菌和病毒有用。
Description
本发明申请主张2015年6月25日提交的美国临时专利申请No.62/184,354的权益，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
本发明申请作为参考引入了标题为“SeqListing_14312_001_228”的文本文件与本发明申请一起提交的序列表，该文本文件于2016年6月22日生成，大小为23,659字节。
1.简介
本文提供了抗感染肽及其用途。这些抗感染肽对细菌和病毒有用。本文还提供了包含所述抗感染肽的组合物。
2.发明背景
抗生素是治疗细菌感染的最常见药物并且是制药工业的重要部分。在美国，每年用于抗生素的支出高达100亿美元以上。全球支出比这一估计值要高得多，并且这些支出中的大部分用于门诊病人药物处方。对于多种不同种类的疾病，存在显著的抗生素开药和过度开药。有时，疾病的原因可能具有低细菌机会，但是医生想要保持谨慎并仍然给患者开出抗生素。这种高频率的抗生素使用是主要的公共卫生问题，这是因为它产生了耐药性细菌。这些是不能被常规抗生素杀死的细菌并且它们可以导致在体内扩散的严重感染。对细菌耐药性，特别是被称为“超级细菌”的多重耐药性菌株存在显著的担心。最大的问题是由这些耐药性细菌所引起的感染不能被常规抗生素治疗。
治疗耐药性细菌感染的市场潜力是非常大的。例如，据估计在欧盟，抗生素-耐药性菌株每年影响了200万的患者。在美国，抗生素耐药性的代价超过每年200亿美元，并且患者需要额外的1至2周的医院护理。在不同的抗生素-耐药性细菌中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)是熟知的并且已鉴别为皮肤和软组织感染，包括急性细菌皮肤和皮肤结构感染(ABSSSI)的主要原因。MRSA易于通过皮肤-至-皮肤接触传播。还显示了对已重新具有活性并发展为革兰氏阳性抗生素的多种药物的耐药性。据估计全世界超过5300万人是MRSA载体。仅在美国，MRSA感染的年度费用超过140亿美元。尽管MRSA皮肤感染仅是一个实例，但是仅因为该病例所产生的数量支持存在来自由多重耐药性菌株所引起的感染的显著人员和经济成本。
重要的是应注意市场需求仍未满足。对于众多公司来说，开发新型抗生素是不太优先考虑的，这是因为治疗时间短并且难以鉴别新的抗生素种类。在1960年代至2011年之间，仅开发并上市了四类新型抗生素。目前，仅有4家大型药物公司具有活跃的研究和开发项目以产生新型抗生素。出于比较，在1980年代，有20家大型公司尝试开发新型抗生素。抗生素研究的减少主要有三个原因。由于已进行了显著研究，因此难以发现新的抗生素种类。还存在多种在柜台上可以买到的常规抗生素，并且公司担心这些药物会产生可能减少由新型抗生素所带来的可能利益的高度竞争。开发新药是非常昂贵和费时的，因此药物应具有专利保护并满足常规抗生素满足不了的需求。另外，难以获得管理机构，包括美国食品和药物管理局(FDA)批准的新型抗生素。
最近，由于超级细菌数目的不断增长，对该问题的关注越来越多。FDA创造了被称为合格感染性疾病产品(QIDP)的新产品种类。该类中的药物具有来自FDA的特殊命名，并且FDA缩短了审批过程并且提高了独有市场的时间(另外多5年)。这些利益为重要的，因为这意味着新型抗生素可以更快达到患者，并且药物公司开发新型抗生素的经济动机更强。一个具体的需求焦点在于治疗急性细菌皮肤和皮肤结构感染，包括常规和抗生素-耐药性菌株。这些感染的日常控制为切开引流，并且如果可以治疗细菌感染，则还可以施用抗生素。由于耐受标准抗生素，在这些病例中使用了一些其他抗生素。表1描述了抗生素，包括它们机制和长期问题。
表1.用于治疗MRSA皮肤感染的抗生素总结
从这些统计能够看出，存在两个主要问题。局部抗生素数量有限，并且所有种类的抗生素具有耐药性菌株快速出现的问题。一种替代选择是膜活性的抗微生物肽，但是这些肽尚未获得广泛应用，这是因为它们生产成本相对昂贵(由于较长的氨基酸序列)并且在90年代存在两次失败的临床试验，这导致已厌恶风险的药物公司继续小分子抗生素。然而，随着耐药性细菌的快速增加，对于新的抗生素种类的需要的认识不断增加，并且一些抗细菌肽种类现已处于早期和晚期临床试验。值得注意的，尽管有用作长期持续疗法同时具有出现耐药性菌株的高障碍的基础的膜干扰前景，但是目前尚无膜-活性抗细菌肽处于临床开发阶段。
病毒治疗面对类似问题，病毒的出现和再次出现快速掩盖了可以开发新型抗病毒药物的速度。该空缺促使开发广谱抗病毒药物，并且包膜病毒的脂质双分子层是关键的抗病毒性。具有靶向病毒包膜的膜活性作用的小分子具有基本上无选择的活性，而抗病毒肽选择性更强，并且具有形成新抗病毒疗法基础的巨大潜力。重要的是，靶向病毒包膜是具有治疗吸引力的，这是因为存在非常高的出现耐药性病毒株的屏障。这是因为包膜不在病毒基因组中编码，而是来源于宿主细胞。已报道了靶向病毒包膜的两种抗病毒肽并且可以用作局部杀微生物剂。然而，这些肽完全缺少抗菌活性。
为了促进抗感染肽的临床开发，重要的是发明对病毒和细菌两者具有广谱活性的肽。在一种优选的实施方式中，为了治疗细菌皮肤感染，具有局部制剂的抗生素将对患者和医生是易于使用的。然而，局部抗生素具有严重的问题，因为细菌可以容易地突变。用于治疗MRSA皮肤感染的其他类型的抗生素需要静脉内施用或者具有可疑的效力。市场需要具有应对这些问题的长期潜力的新型抗生素。理想的抗生素将具有i)局部制剂；ii)出现突变的高屏障，iii)低副作用；iv)高效力；和v)广谱性。通过其他适当的适合治疗性质，这类抗生素可以适合于通过静脉内、腹膜内、皮下、局部、口服、鼻部及其他施用途径治疗人和动物中多种多样的细菌、病毒和真菌感染。
寨卡病毒
对抗感染肽需求不断增长的实例是正在发生的寨卡病毒(ZIKV)流行病，其已公布为全球性突发公共卫生事件(Gulland,BMJ 352,i657(2016)、Lucey and Gostin,JAMA315,865(2016))。尽管在超过半个世纪以前已发现了ZIKV，但是直到最近才将其分类为被忽视的热带病，并且具有有限的地理学范围和少数人感染病例(Faye等人,PLoS Negl TropDis 8,e2636(2014))。在2007年，密克罗尼西亚的雅蒲岛(Yap Island)上超过70％的人群被感染，并且这是非洲或亚洲以外人感染的第一次发作事件(Duffy等人,New EnglandJournal of Medicine 360,2536(2009))。在2016年，ZIKV的全球传播已在至少四个大陆达到流行病水平，并且对由循环株所引起的病原性临床症状的担心不断增加，包括神经学损害，如吉兰-巴雷综合征(Cao-Lormeau等人,The Lancet,(2016))以及ZIKV感染和婴儿中小头畸形增加之间的联系(Mlakar等人,New England Journal of Medicine 374,951(2016))。此外，存在一些可能的传播途径，包括蚊子载体和人血液传播和性传播(Musso等人,Emerging Infectious Diseases 21,359(2015))。考虑到病毒全世界传播步伐的加快，缺少预防或减弱ZIKV感染的对策是主要问题，并且目前尚无批准的疫苗或疗法(Malone等人,PLoS Negl Trop Dis 10,e0004530(2016))。
ZIKV是黃病毒科(flaviviridae)成员并且是与登革热、黄热病、日本脑炎和西尼罗河病毒有关的蚊子传播的黄病毒(Chan等人,Journal of Infection,(2016))。像其他黄病毒一样，ZIKV是包膜正链RNA病毒，其具有约11,000个碱基基因组(Mukhopadhyay等人,Nature Reviews Microbiology 3,13(2005))。RNA基因组与衣壳蛋白一起包装，并且封闭在由嵌入脂质双分子层的包膜(E)糖蛋白、膜(M)蛋白和前体膜(prM)蛋白组成的二十面体壳体内(Lindenbach等人,flaviviridae,p 712–746.Fields Virology 1,(2013))。黄病毒颗粒以三种形式—未成熟(非感染性)、成熟(感染性)或宿主膜-结合状态—存在，并且成熟过程包括从尖锐至光滑表面形态的结构转变。长期已知感染性ZIKV颗粒是球形的，其直径约40-55nm(Dick,Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine andHygiene 46,521(1952))。
最近，使用低温电子显微镜，Sirohi等人显示ZIKV颗粒的结构类似于其他黄病毒，同时注意到ZIKV E蛋白在融合环附近具有不同的高变区，其可能影响对抗体的敏感性(Sirohi等人,Science 352,467(2016))。此外，Kostyuchenko等人报道了ZIKV和其他黄病毒之间的结构类似性，并且还鉴别ZIKV颗粒由于致密结构而显示出特别高的热稳定性(Kostyuchenko等人,Structure of the thermally stable Zika virus.Nature advanceonline publication,doi:10.1038/nature17994(2016))。考虑到ZIKV颗粒的高结构稳定性，已表明使ZIKV颗粒不稳定的治疗药物将是降低疾病结局或限制病毒传播的有用试剂(Kostyuchenko等人,Structure of the thermally stable Zika virus.Nature advanceonline publication,doi:10.1038/nature17994(2016))。的确，Wang and Shi还建议开发直接干扰病毒颗粒的黄病毒进入抑制剂(Wang,ACS Infectious Diseases 1,428(2015))。
朝着该目标，显示黄病毒广泛中和抗体结合至未成熟的病毒颗粒的ZIKV E蛋白并且保护抵抗ZIKV感染，尽管这种保护可以通过补体-依赖性效应因子功能发生(Dai等人,Cell Host&Microbe 19,696(2016))。还报道可以通过暴露于光敏性amotosalen插入剂和紫外线A照射的组合使血浆样品中的ZIKV失活(Aubry等人,Transfusion 56,33(2016))。然而，在预防病毒进入的背景中使ZIKV颗粒不稳定的抗病毒剂的鉴别仍是难以捉摸的，特别是同时具有治疗选择性和广泛适用性的抗病毒剂。在这点上，围绕包膜病毒的脂膜的破环是开发病毒进入抑制剂的新涌现的方法，并且对于鉴别以高选择性和效力实现该目标的膜-活性化合物存在强烈的动力(Vigant等人,Nature Reviews Microbiology 13,426(2015)；Jackman等人,"Nanomedicine for Infectious Disease Applications:Innovation towards Broad‐Spectrum Treatment of Viral Infections,"Small 12,No.9(2016):1133-1139,(2015))。
3.发明概述
在一个方面，本文提供了抗感染肽。在具体的实施方式中，本文所述的抗感染肽具有广谱抗病毒活性和抗菌活性，同时对人细胞系和阴道细菌显示出低细胞毒性。在具体的实施方式中，本文所述的抗感染肽的治疗指数大于10。在另一个具体的实施方式中，所述抗感染肽可溶于水溶液。
在一种实施方式中，本文所述的抗感染肽包括表2A中所述的肽，基本由其组成或由其组成。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含表2A中所述的肽的氨基酸序列。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽包括表2B中所述的肽，基本由其组成或由其组成。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含表2B中所述的肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化的或修饰的以包含亲水聚合物。在某些实施方式中，抗感染肽是订书钉肽(stapled)或脂化的。在一些实施方式中，抗感染肽包含D氨基酸、L氨基酸或它们的组合。
在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ ID NO:12)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ IDNO:12)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽包括表4中所述的肽，基本由其组成或由其组成。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含表4中所述的肽的氨基酸序列。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)。在另一种实施方式中，抗感染肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQID NO:1)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQID NO:2)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQID NO:3)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQID NO:4)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQID NO:5)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDIWTALQSWL(SEQID NO:6)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDILTALQSLL(SEQID NO:7)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQID NO:8)。在另一种实施方式中，抗感染肽由以下氨基酸序列组成：AGSWLRDILTLLQSAL(SEQID NO:9)。
在一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽，并且所述聚乙二醇化肽包含表2A中所述的肽，基本由其组成或由其组成。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽，并且所述聚乙二醇化肽包含表2B中所述的肽，基本由其组成或由其组成。
在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ ID NO:12)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ ID NO:12)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽，并且所述聚乙二醇化肽包含表4中所述的肽，基本由其组成或由其组成。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ IDNO:2)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包含以下氨基酸序列：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括长度为16至26个氨基酸残基并且连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽包括以下氨基酸序列：AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ IDNO:9)。
在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQID NO:5)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化肽并且所述聚乙二醇化肽包括连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
在一些实施方式中，本文所述的聚乙二醇化肽包含分子量范围在500至5000道尔顿的1种、2种或更多种PEG聚合物。在某些实施方式中，所述PEG聚合物是支化的。在其他实施方式中，所述PEG聚合物是非支化的。
在某些实施方式中，所述抗感染肽的氨基酸残基是L氨基酸。在一些实施方式中，所述抗感染肽的氨基酸残基是D氨基酸。在某些实施方式中，所述抗感染肽的氨基酸残基是D和L氨基酸的混合物。
在另一个方面，本文提供了包含本文所述的抗感染肽和载体的组合物。在某些实施方式中，所述组合物包含对抑制微生物生长有效的量的抗感染肽。在一些实施方式中，所述组合物包含对抑制病毒复制有效的量的抗感染肽。在具体的实施方式中，所述载体是水溶液，如蒸馏水。在某些实施方式中，所述组合物是药物组合物并且所述载体是可药用的载体。可以将所述药物组合物配制用于任何施用途径，例如，局部、皮下、静脉内或腹膜内。在具体的实施方式中，将所述药物组合物配制用于局部施用。在另一个具体的实施方式中，将所述药物组合物作为凝胶配制用于局部施用，其中在所述凝胶制剂中所述抗感染肽的有效量为0.1％至5％。
在另一个方面，本文提供了含有包含200mg至300mg本文所述的抗感染肽的冷冻干燥组合物的药瓶。在具体的实施方式中，本文提供了含有药物组合物的药瓶，其中所述药物组合物包含处于1mL水溶液(例如，无菌水)中的200mg至300mg的肽。
在另一个方面，本文提供了抑制微生物生长、复制或感染性的方法，其包括将所述微生物与有效量的本文所述的抗感染肽接触。所述微生物可以是体内、体外或离体的。在具体的实施方式中，本文提供了抑制细菌生长的方法，其包括将所述细菌与有效量的本文中的抗感染肽接触。所述细菌可以是体内、体外或离体的。在另一种具体的实施方式中，本文提供了抑制细胞中病毒复制的方法，其包括将感染了病毒的细胞与有效量的本文所述的抗感染肽接触。所述细胞可以是体内、体外或离体的。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中微生物感染，或者治疗或预防与微生物有关或由微生物引起的疾病的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中微生物感染的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在另一种实施方式中，本文提供了预防受试者中由微生物感染引起的或与之有关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，根据本文所公开的方法施用于受试者的抗感染肽的有效量是每天10mg至300mg肽的剂量。在某些实施方式中，根据本文所公开的方法施用于受试者的抗感染肽的有效量是每天两次10mg至300mg肽的剂量。可以将所述抗感染肽或药物组合物通过任何途径施用于受试者。在具体的实施方式中，将所述抗感染肽皮下、局部、静脉内或腹膜内施用于受试者。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中细菌感染，或者治疗或预防与细菌有关或由细菌引起的疾病的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中细菌感染的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在另一种实施方式中，本文提供了预防受试者中由细菌感染引起的或与之有关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在另一种实施方式中，本文提供了抑制受试者中细菌生长的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，根据本文所公开的方法施用于受试者的抗感染肽的有效量是每天10mg至300mg肽的剂量。在某些实施方式中，根据本文所公开的方法施用于受试者的抗感染肽的有效量是每天两次10mg至300mg肽的剂量。可以将所述抗感染肽或药物组合物通过任何途径施用于受试者。在具体的实施方式中，将所述抗感染肽皮下、局部、静脉内或腹膜内施用于受试者。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中病毒感染，或者治疗或预防与病毒有关或由病毒引起的疾病的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在另一种实施方式中，本文提供了预防受试者中由病毒感染引起的或与之有关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽或者本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，根据本文所公开的方法施用于受试者的抗感染肽的有效量是每天10mg至300mg肽的剂量。在某些实施方式中，根据本文所公开的方法施用于受试者的抗感染肽的有效量为每天两次10mg至300mg肽的剂量。可以将所述抗感染肽或药物组合物通过任何途径施用于受试者。在具体的实施方式中，将所述抗感染肽皮下、局部、静脉内或腹膜内施用于受试者。
在某些实施方式中，微生物为细菌。在一些实施方式中，所述细菌为革兰氏阳性的。所述革兰氏阳性细菌可以是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠球菌(例如，粪肠球菌(Enterococcus faecalis))、链球菌(例如，肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia))、艰难梭菌(Clostridium difficile)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)或炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)。在其他实施方式中，所述细菌为革兰氏阴性的。所述革兰氏阴性细菌可以是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)或流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。在具体的实施方式中，所述细菌为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、万古霉素敏感肠球菌(enterococci)、耐万古霉素肠球菌(enterococci)、青霉素敏感肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、耐青霉素肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、耐环丙沙星或耐克林霉素。
在某些实施方式中，病毒是属于黃病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、反转录病毒科(retroviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)或痘病毒科(poxviridae)的病毒。在具体的实施方式中，病毒是登革热病毒、基孔肯亚病毒、埃博拉病毒、HIV或流感病毒。
在另一个方面，本文提供了包含本文所述的抗感染肽的消毒液或组合物。在另一个方面，本文提供了用于对无生命对象或生物材料消毒的方法，其包括将所述对象与消毒液或组合物接触。在具体的实施方式中，本文提供了用于对无生命对象或生物材料消毒的方法，其包括将所述对象与含有本文所述的抗感染肽的抹布接触。
在另一个方面，本文提供了无生命的表面或生物表面，其包含与抗感染肽的连接或具有抗感染肽的涂层。
3.1术语
4.附图说明
图1A，图1B和图1C。图1A：通过直接裂解病毒颗粒发生的病毒中和，借此预防病毒感染(“病毒进入抑制”)。图1B：在25℃，对缓冲液(虚线)、50v/v％2,2,2-三氟乙醇(TFE)(实线)和POPC脂质囊泡(短划线)中的抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)记录圆二色谱。图1C：摩尔分数分配系数，Kx，表示为抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)的平均囊泡直径的函数(对于n＝3次独立实验，平均值±标准偏差)。在由于最小分配而不能确定分配系数的情况下，ND表示未确定。
图2A，图2B，图2C和图2D。图2A：作为空斑减数测定中肽浓度的函数，抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对ZIKV株FSS13025的中和效率。图2B：作为病毒得率减少测定中肽浓度的函数，抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对ZIKV株FSS13025的中和效率。图2C：用50μM抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)处理后，表示为％活细胞的多个细胞系的细胞存活力。图2D：用50μM抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)处理后，阴道微生物群落细菌生长抑制的评价。实心柱(阴性对照；无肽)，空心柱(使用50μM TSG001处理)、虚线柱(阳性对照；抗生素处理)。
图3A和图3B：QCM-D(图3A)频率和(图3B)能量耗散动力学曲线捕获TSG001(SEQ IDNO:1)、AH(SEQ ID NO:10)或C5A(SEQ ID NO:11)肽和表面-吸附的囊泡(50mol％DOPC和50mol％胆固醇)之间的相互作用。箭头表示肽加入至所吸附的囊泡层的时间点。
5.发明详述
已开发了对多种临床-重要的病毒(例如，寨卡病毒)，包括登革热病毒(DENV)、基孔肯亚病毒、黄热病毒、立谷热病毒和日本脑炎病毒具有有效、广谱抗感染活性的两亲性短肽，其EC50值在0.5-3μM或1-3μM的范围内。惊人地，所述肽还对金黄色葡萄球菌(S.aureus)皮肤细菌(MIC值为(例如)6μM或1.5μM)显示出强抗细菌活性，其抗细菌活性与蜂毒素相当并且具有更有吸引力的治疗谱(低细胞毒性；>50μM)。它还对多种其他医学上重要的细菌有效。作为药物候选，这种肽是特别有吸引力的，这是因为它通过膜-破坏机制起作用，并且出现耐药性细菌和病毒株的屏障高。它是第一个已知的具有有效广谱抗病毒和抗细菌活性的肽。
本文所述的肽是唯一已知具有有效抗病毒和抗细菌活性的肽。竞争者的抗病毒肽具有几乎零抗细菌活性。所述肽靶向多种具有医学和生防重要性的病毒，其包括，但不限于，黃病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、反转录病毒科(retroviridae)和正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员。示例性病毒包括登革热病毒、基孔肯亚病毒、埃博拉病毒、HIV、寨卡病毒和流感病毒。作用机制允许所述肽靶向标准和抗生素-耐药性菌株。与经典抗微生物肽(多数情况下，小于1)相比，所述肽具有优良的治疗指数(通常大于10，这取决于病原体)。与临床中大部分治疗性肽相比，所述肽具有短氨基酸序列(例如，对于Roche上市的抗HIV药物恩夫韦地，16个氨基酸vs.36个氨基酸)。所述肽在水中高度可溶，从而易于配制。竞争者的抗病毒肽是难溶性的并且配制时需要有机溶剂。细菌和病毒具有对该产品(本文所述的抗感染肽)变的耐受的极高屏障(有效地，零)。
5.1抗感染肽
本文提供了抗感染肽(例如，合成肽)。在具体的实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含表2A或表2B中所列的氨基酸序列或由其组成。在具体的实施方式中，本文所提供的抗感染肽基本由表2A或表2B中所列的氨基酸序列组成。
表2A.抗感染肽
表2B.抗感染肽
本领域技术人员将理解，根据氨基酸残基的化学及物理特性，可以将氨基酸分成不同种类。例如，一些氨基酸残基基于它们的侧链分类为亲水性或极性氨基酸，而其他氨基酸分类为疏水性或非极性氨基酸。术语“极性氨基酸”是本领域技术人员已知的术语。通常，“极性氨基酸”是指在生理学pH具有带电或不带电侧链的亲水性氨基酸并且通常是亲水性的，其表示它们具有受水溶液吸引的氨基酸侧链。极性氨基酸的实例包括天冬氨酸、谷氨酸盐/酯、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。疏水性氨基酸是本领域技术人员已知的。通常，疏水性氨基酸可以进一步分类为具有脂肪族侧链或芳香族侧链。脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸是本领域技术人员已知的。通常，脂肪族氨基酸具有含氢和碳原子的侧链。脂肪族氨基酸的实例包括丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸。通常，芳香族氨基酸含有含芳香环的侧链。芳香族氨基酸的实例包括苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸和色氨酸。在一些情况下，氨基酸由于尺寸较小而分类为小氨基酸。小氨基酸的实例包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
本领域技术人员将理解可以用具有类似化学及物理特性的氨基酸置换氨基酸。这些置换通常称为保守性置换。在具体的实施方式中，保守性置换不改变肽的结构或功能，或两者。例如，疏水性氨基酸可被另一种疏水性氨基酸置换，中性亲水性氨基酸可被另一种中性亲水性氨基酸置换，酸性氨基酸可被另一种酸性氨基酸置换，碱性氨基酸可被另一种碱性氨基酸置换，芳香族氨基酸可被另一种芳香族氨基酸置换等。保守氨基酸置换的实例如下表3中所示。
表3
| 原始残基 | 保守性置换 |
| Ala | Ser、Gly、Thr |
| Arg | Lys、Gln、His、Lys |
| Asn | Asp、Gln、His、Lys、Ser、Thr |
| Asp | Asn、Glu |
| Cys | Ser |
| Gln | Arg、ASn、Glu、His、Lys、Met |
| Gly | Ala、Pro |
| His | Asn、Arg、Gln、Tyr |
| Ile | Leu、Val、Met |
| Leu | Ile、Met、Phe、Val |
| Lys | Arg、Asn、Gln、Glu |
| Met | Gln、Ile、Leu、Val |
| Phe | Leu、Trp、Tyr、Met |
| Ser | Ala、Asn、Thr |
| Thr | Ser、Ala、Asn |
| Trp | Phe、Tyr |
| Tyr | His、Phe、Trp |
| Val | Ile、Leu、Met |
在具体的实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含表4中所列的氨基酸序列或者由其组成。
表4.抗感染肽TSG001-TSG009的氨基酸序列。
| 抗感染肽的名称 | 氨基酸序列(SEQ ID NO) |
| TSG001 | SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1) |
| TSG002 | GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2) |
| TSG003 | GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3) |
| TSG004 | GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4) |
| TSG005 | GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5) |
| TSG006 | GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6) |
| TSG007 | GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7) |
| TSG008 | AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8) |
| TSG009 | AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9) |
在一种具体实施方式中，所述抗感染肽包含氨基酸序列SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQID NO:1)或由其组成。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽包含氨基酸序列GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)或由其组成。在具体的实施方式中，所述抗感染肽包含氨基酸序列GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)或由其组成。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽包含氨基酸序列GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)或由其组成。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽包含氨基酸序列GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)或由其组成。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽包含氨基酸序列GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)或由其组成。在具体的实施方式中，所述抗感染肽包含氨基酸序列GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)或由其组成。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽包含氨基酸序列AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或由其组成。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽包含氨基酸序列AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)或由其组成。
在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽基本由表4中所列的氨基酸序列组成。在另一种具体实施方式中，所述抗感染肽基本由氨基酸序列SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQID NO:1)组成。在另一种具体实施方式中，所述抗感染肽基本由氨基酸序列GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)组成。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽基本由氨基酸序列GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)组成。在另一种具体实施方式中，所述抗感染肽基本由氨基酸序列GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)组成。在另一种具体实施方式中，所述抗感染肽基本由氨基酸序列GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)组成。在另一种具体实施方式中，所述抗感染肽基本由氨基酸序列GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)组成。在另一种具体实施方式中，所述抗感染肽基本由氨基酸序列GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)组成。在另一种具体实施方式中，所述抗感染肽基本由氨基酸序列AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)组成。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽基本由氨基酸序列AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ IDNO:9)组成。
在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所公开的肽序列和对第6节中所述的肽的基本结构和功能特征不造成显著影响的其他氨基酸残基(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸残基)。例如，所述其他氨基酸残基对所述肽的EC50和CC50无显著影响，并且保持了第6节中所述的肽的结构，如通过本领域技术人员已知的技术所评价的，如第5.8节和/或第6节中所述。在具体的实施方式中，所述其他氨基酸残基不会将EC50提高超过5倍，并且不会将CC50降低超过5倍。
在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度在16至26个氨基酸残基之间。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为16个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为17个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为18个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为19个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为20个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为21个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为22个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为23个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为24个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为25个氨基酸残基。在一种具体实施方式中，本文所提供的抗感染肽包含本文所述的肽并且长度为26个氨基酸残基。
在某些实施方式中，抗感染肽包含表2A、表2B或表4中的氨基酸序列，但在N-末端或C-末端缺失了1个、2个、3个、4个或5个连续的氨基酸。在一些实施方式中，所述抗感染肽包含表2A、表2B或表4中的氨基酸序列，但在N-末端缺失了1个、2个、3个、4个或5个连续的氨基酸并且在C-末端缺失了1个、2个、3个、4个或5个连续的氨基酸。
在某些实施方式中，本文所述的抗感染肽(直接或间接)连接至肽标签(例如，HIS-标签或FLAG-标签)。在一些实施方式中，接头序列(例如，1-5个、1-10个或5-10个氨基酸接头，如甘氨酸接头)用于将肽标签连接至本文所述的抗感染肽。在其他实施方式中，肽标签直接连接至抗感染肽。肽标签和抗感染肽之间的连接可以是共价的或非共价的。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的氨基酸残基是L氨基酸。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的氨基酸残基是D氨基酸。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的氨基酸残基是D和L氨基酸的混合物。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的氨基酸序列含有L氨基酸。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的氨基酸序列含有D氨基酸。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的氨基酸序列含有D和L氨基酸的混合物。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽(参见第5.1节、第5.2节和第6节)包含1个、2个或更多个氨基酸衍生物。例如，在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽包含1个、2个或更多个非天然存在的或者非基因编码的氨基酸。非基因编码的氨基酸的非限制性实例包括α-氨基己酸、α-氨基戊酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、2,3-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2-氟苯丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、A-2-噻吩丙氨酸、A-丙氨酸、A-氨基异丁酸、瓜氨酸、环己基丙氨酸、苯基甘氨酸、高精氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、蛋氨酸亚砜、N-乙酰基赖氨酸、N-氨基苯丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、萘基丙氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、青霉胺、吡啶基丙氨酸、叔丁基丙氨酸和叔丁基甘氨酸。
在具体的实施方式中，本文所述的抗感染肽包含1个、2个或更多个修饰的肽键。修饰的肽键的非限制性实例包括-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。
侧链交联是旨在稳定和/或模拟肽螺旋的诸多策略之一。在某些实施方式中，本文所述的抗感染肽是订书钉肽(stapled peptide)。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽包含1个、2个、3个或更多个订书钉。有关订书钉肽以及产生钉书钉肽的方法的描述，参见，例如，美国专利申请公开No.2010/0093086A1和Bird等人,“Hydrocarbon double-stapling remedies the proteolytic instability of a lengthy peptidetherapeutic,”PNAS 107(32):14093-14098(2010)，以上每篇文献作为参考并入本文。
在一些实施方式中，本文所述的抗感染肽是脂化的。在一种具体实施方式中，将1个、2个或更多个脂质或脂肪酸加入至所述肽。有关肽脂化和用于脂化肽的方法的描述，参见，例如，Zhang和Bulaj,“Converting peptides into drug leads by lipidation,”Curr.Med.Chem.19(11):1602-1618(2012)和Ward等人,“Peptide lipidation stabilizesstructure to enhance biological function,”Mol.Metabol.2(4):468-479(2013)，以上每篇文献作为参考并入本文。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽是聚乙二醇化的。有关本文所述的肽的聚乙二醇化的描述，参见第5.2节和第6节。在另一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽(直接或间接)连接至亲水聚合物。有关亲水聚合物的描述，参见第5.2节。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的1种、2种或更多种微生物有效。例如，本文所述的抗感染肽或包含这种抗感染肽的组合物(参见第5.4节)在实现以下结果中的1种、2种或更多种中有效：(i)第5.7节中所述的1种、2种或更多种微生物生长的抑制；(ii)第5.7节中所述的1种、2种或更多种微生物复制的抑制；(iii)杀死第5.7节中所述的1种、2种或更多种微生物；(iv)治疗第5.7节中所述的1种、2种或更多种微生物的感染；(v)预防第5.7节中所述的1种、2种或更多种微生物的感染；(vi)治疗由第5.7节中所述的1种、2种或更多种微生物所引起的或与之有关的疾病；(vii)预防由第5.7节中所述的1种、2种或更多种微生物所引起的或与之有关的疾病；(viii)对无生命表面或生物表面消毒；和/或(viii)对无生命的对象或生物材料消毒。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的1种、2种或更多种病毒科有效。在另一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的1种、2种或更多种病毒有效。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的1种、2种或更多种细菌科有效。在另一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的1种、2种或更多种细菌有效。在另一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的1种、2种或更多种病毒科以及第5.7节中所述的1种、2种或更多种细菌科有效。在另一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的1种、2种或更多种病毒科以及第5.7节中所述的1种、2种或更多种细菌有效。在另一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的1种、2种或更多种病毒以及第5.7节中所述的1种、2种或更多种细菌科有效。在另一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的1种、2种或更多种病毒以及第5.7节中所述的1种、2种或更多种细菌有效。在另一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对阴道微生物群落无效。例如，在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对阴道微生物群落细菌的MIC>50μM。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对阴道微环境的1种、2种或更多种细菌无效。在一种具体实施方式中，所述阴道微环境细菌是詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)。在一种具体实施方式中，所述阴道微环境细菌是卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)。在一种具体实施方式中，所述阴道微环境细菌是嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽是两亲性螺旋结构。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽是弱螺旋的。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽在蒸馏水中具有0.1至0.5的分数螺旋度(fractional helicity)，并且在磷酸盐缓冲盐水中为0.1至0.6。可以使用本领域技术人员已知的或本文所述的任何技术确定分数螺旋度。例如，可以如下所示使用圆二色性：使用1mm路径长度的石英比色皿(Hellma)，在AVIV 420型分光光度计(AVIV Biomedical,Lakewood,NJ,USA)上进行CD实验。以0.5nm步长，4s的平均时间采集光谱数据。在25℃，使用1-nm带宽，从190至260nm记录所有光谱，并对三次扫描求平均值。在向50μM肽添加2.5mM POPC脂质囊泡前后，记录CD光谱。还使用相同仪器设置，仅在缓冲液或仅在脂质体中进行基线扫描，并且从用肽扫描的各个数据中减去这种贡献。校正的光谱用平均残基摩尔椭圆率(Θ)表示，并如下所示计算肽的分数螺旋度(fractionalhelicity)：fH＝([Θ]222–3,000)/(-36,000–3000)，其中[θ]222是222nm下的摩尔椭圆率。参见，例如，J.D.Morrisett,J.S.David,H.J.Pownall,A.M.Gotto Jr,Interaction of anapolipoprotein(apoLP-alanine)with phosphatidylcholine.Biochemistry 12,1290-1299(1973)，该文献并入本文以用于描述确定分数螺旋度的技术。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽在两性离子脂质囊泡中经历了显著的螺旋诱导(helical induction)(例如，升高大于20％)。换言之，其在溶液中(在PBS中)的二级结构状态向插入类脂膜(在PBS中)时其二级结构状态变化时，存在螺旋度提高。如果肽的螺旋度在类脂膜中变得更大，则由于其更稳定，而优选地将其结合至类脂膜。在一种具体实施方式中，抗感染肽在两性离子脂质囊泡中经历了21％至50％或者21％至30％的螺旋诱导提高。在另一个具体的实施方式中，抗感染肽在两性离子脂质囊泡中经历了下表5中所述的螺旋诱导。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽在两性离子脂质囊泡中折叠成α-螺旋状态。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽在两性离子脂质囊泡中具有83％的螺旋度。在一种具体实施方式中，根据圆二色性确定螺旋诱导(参见，例如，第5.8节)。在其他实施方式中，使用蛋白质算法或FTIR光谱确定螺旋诱导。关于FTIR光谱方法的描述，参见，例如，Haris,Parvez I.,and Dennis Chapman."The conformationalanalysis of peptides using Fourier transform IR spectroscopy."Biopolymers37.4(1995):251-263。
表5
不受任何具体理论的束缚，在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽用作膜弯曲度的传感器，其优先对高度弯曲的膜有活性，例如，小包膜病毒。例如，在一种具体实施方式中，所述抗感染肽显示出强烈的向两性离子脂质双分子层中的分配。在一种具体实施方式中，对于直径小于200nm的高弯曲度的两性离子脂质囊泡，本文所述的抗感染肽的脂质-水分配系数(也称为分配常数)为约105。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽具有可忽略的向较大囊泡的分配。可忽略的分配表示脂质-水分配系数小于1×104。在一种具体实施方式中，根据荧光光谱确定肽向两性离子1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)脂质双分子层中的分配(参见，例如，第5.8节)。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽是阳离子的。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的净电荷为+1。例如，TSG001(SEQ ID NO:1)、TSG002(SEQ ID NO:2)、TSG004(SEQ ID NO:4)和TSG005(SEQ ID NO:5)中的每一个的净电荷为+1。在其他的具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的净电荷为0。例如，TSG003(SEQ ID NO:3)、TSG006(SEQ ID NO:6)、TSG007(SEQ ID NO:7)、TSG008(SEQ ID NO:8)和TSG009(SEQ ID NO:9)中的每一个的净电荷为0。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽是表2A、表2B或表4中所述的肽。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽具有低聚集倾向。可以通过280nm波长下的吸光度测量确定聚集倾向，其可以基于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的数目所限定的摩尔消光系数确定肽的摩尔浓度。低聚集倾向(换言之，优良的分散体系)是指肽在水溶液(例如，蒸馏水)中良好复原并且定义为≥60％，其中％定义为通过吸光度量度所测量的实验摩尔量/基于干重和分子量的理论摩尔量×100％。相反，高聚集倾向(换言之，较差的分散体系)定义为<60％，其中％定义为通过吸光度量度所测量的实验摩尔量除以基于肽的干重和分子量计算的理论摩尔量×100％。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的病毒具有本文所述的EC50。本领域技术人员将认识到“EC50”是指获得最大反应一半时所需的活性化合物(例如，本文所述的抗感染肽或组合物)的浓度。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的EC50在0.1μM至20μM之间。在一种具体实施方式中，所述EC50在0.1μM至2.5μM、0.1μM至5μM、0.1μM至10μM、0.1μM至15μM、0.1μM至20μM、1μM至2.5μM、1μM至5μM、1μM至15μM、1μM至15μM或1μM至20μM之间。在一种具体实施方式中，所述EC50小于20μM、小于15μM、小于10μM、小于5μM、小于2.5μM、小于1μM或小于0.1μM。在具体的实施方式中，如第5.8节和/或第6节所述确定EC50。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的病毒具有本文所述的IC50。本领域技术人员将认识到“IC50”是指将给定生物过程或生物过程(例如，细菌或病毒感染)的组分抑制一半所需的活性化合物(例如，本文所述的抗感染肽或组合物)的浓度。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的IC50在0.1μM至20μM之间。在一种具体实施方式中，所述IC50在0.1μM至2.5μM、0.1μM至5μM、0.1μM至10μM、0.1μM至15μM、0.1μM至20μM、1μM至2.5μM、1μM至5μM、1μM至10μM、1μM至15μM或1μM至20μM之间。在具体的实施方式中，本文所述的抗感染肽的IC50小于20μM、小于15μM、小于10μM、小于5μM、小于2.5μM、小于1μM或小于0.1μM。在一种具体实施方式中，如第5.8节和/或第6节所述确定IC50。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽具有本文所述的CC50。本领域技术人员将认识到“CC50”是指对治疗群体中细胞的细胞毒性达到一半时所需的活性化合物(例如，本文所述的抗感染肽或组合物)的浓度。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽在动物细胞(例如，人细胞，如来自细胞系的人细胞)中的CC50在1μM至200μM之间。在一种具体实施方式中，动物细胞(例如，人细胞，如来自细胞系的人细胞)中的CC50在10μM至25μM、10μM至50μM、10μM至100μM、10μM至150μM、10μM至200μM、15μM至25μM、15μM至50μM、15μM至100μM、15μM至150μM、15μM至200μM、25μM至50μM、25μM至100μM、25μM至150μM、25μM至200μM、50μM至75μM、50μM至100μM、50μM至125μM、50μM至150μM、50μM至200μM、75μM,至100μM、75μM至125μM、75μM至150μM、75μM至200μM、125μM至150μM、125μM至200μM或150μM至200μM之间。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽在动物细胞(例如，人细胞，如来自细胞系的人细胞)中的CC50大于10μM、大于25μM、大于50μM、大于75μM、大于100μM、大于125μM或大于150μM。在一种具体实施方式中，如第5.8节和/或第6节所述确定CC50。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽具有本文所述的治疗指数(“TI”)。本领域技术人员将认识到治疗指数是指具有治疗效果所需的活性化合物(例如，本文所述的抗感染肽或组合物)的量与导致毒性的活性化合物(例如，本文所述的抗感染肽或组合物)的量的比较。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的TI在1至150之间。在一种具体实施方式中，所述TI在2至5、2至10、2至15、2至20、20至25、10至25、10至50、10至100、10至125、10至150、25至50、25至100、25至125、25至150、50至75、50至100、50至125、50至150、75至100、75至125或75至150之间。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的TI大于10、大于25、大于50、大于75、大于100或大于125。在具体的实施方式中，本文所述的抗感染肽的TI在1至150之间。在一种具体实施方式中，对血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)的TI在2至5、2至10、2至15、2至20、20至25、10至25、10至50、10至100、10至125、10至150、25至50、25至100、25至125、25至150、50至75、50至100、50至125、50至150、75至100、75至125或75至150之间。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)的TI大于10、大于25、大于50、大于75、大于100或大于125。在一种具体实施方式中，如第5.8节和/或第6节所述来确定TI。
在某些实施方式中，本文所述的抗感染肽作为抗病毒剂对于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)病毒的感染无效。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽作为抗病毒剂对于甲型流感病毒感染无效。在一些实施方式中，本文所述的抗感染肽作为抗病毒剂对于单纯疱疹病毒1(HSV-1)感染无效(例如，Kern等人,Antimicrob AgentsChemother.49(3):1039–1045(2005)中所述的HSV-1感染)。在一些实施方式中，本文所述的抗感染肽作为抗病毒剂对于拉克罗斯脑炎病毒(LACV)感染(例如，LACV H44-71017感染，如GenBank登录号No.DQ380208.1中所述)无效。
在某些实施方式中，本文所述的抗感染肽作为抗病毒剂对于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)病毒的感染是有效的。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽作为抗病毒剂对于甲型流感病毒感染有效。在一些实施方式中，本文所述的抗感染肽作为抗病毒剂对于单纯疱疹病毒1(HSV-1)感染有效(例如，Kern等人,Antimicrob AgentsChemother.49(3):1039–1045(2005)中所述的HSV-1感染)。在一些实施方式中，本文所述的抗感染肽作为抗病毒剂对于拉克罗斯脑炎病毒(LACV)感染(例如，LACV H44-71017感染，如GenBank登录号No.DQ380208.1中所述)有效。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽具有本文所述的血液毒性水平，例如，溶血活性。本领域技术人员将认识到溶血活性(作为(例如)最低溶血浓度(“MHC”)计算)是指使红细胞溶解所需的活性化合物(例如，本文所述的抗感染肽或组合物)的最低浓度。在一种具体实施方式中，所述溶血活性是最低溶血浓度。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MHC在0.5μM至100μM之间。在一种具体实施方式中，所述MHC在0.5μM至10μM、0.5μM至25μM、0.5μM至50μM、0.5μM至100μM、1μM至5μM、1μM至10μM、1μM至25μM、1μM至50μM、1μM至100μM、10μM至15μM、10μM至25μM、10μM至50μM、10μM至100μM、10μM至15μM、20μM至30μM、20μM至50μM、20μM至100μM、50μM至75μM或50μM至100μM之间。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MHC大于2μM、大于5μM、大于10μM、大于25μM、大于50μM或大于75μM。在具体的实施方式中，如第5.8节和/或第6节所述来确定MHC。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽对第5.7节中所述的细菌具有本文所述的最小抑菌浓度(“MIC”)。本领域技术人员将认识到MIC是指防止细菌可见生长所需的活性化合物(例如，本文所述的抗感染肽或组合物)的最小浓度。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MIC在0.1μM至20μM之间。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MIC在0.1μM至2.5μM、0.1μM至5μM、0.1μM至10μM、0.1μM至15μM、0.1μM至20μM、1μM至2.5μM、1μM至5μM、1μM至15μM、1μM至15μM或1μM至20μM之间。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MIC小于20μM、小于15μM、小于10μM、小于5μM、小于2.5μM或小于1μM。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MIC在0.1μg/mL至64μg/mL之间。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MIC在0.1μg/mL至2.5μg/mL、0.1μg/mL至5μg/mL、0.1μg/mL至10μg/mL、0.1μg/mL至15μg/mL、0.1μg/mL至20μg/mL、1μg/mL至2.5μg/mL、1μg/mL至5μg/mL、1μg/mL至15μg/mL、1μg/mL至15μg/mL或1μg/mL至20μg/mL之间。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MIC小于20μg/mL、小于15μg/mL、小于10μg/mL、小于5μg/mL、小于2.5μg/mL或小于1μg/mL。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MIC在20μg/mL至25μg/mL、20μg/mL至30μg/mL、20μg/mL至35μg/mL、20μg/mL至40μg/mL、20μg/mL至45μg/mL、20μg/mL至50μg/mL、20μg/mL至55μg/mL、20μg/mL至60μg/mL或20μg/mL至64μg/mL。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽的MIC小于64μg/mL、小于55μg/mL、小于45μg/mL、小于35μg/mL或小于25μg/mL。在一种具体实施方式中，如第5.8节和/或第6节所述确定MIC。
在一种具体实施方式中，抗感染肽包含表2A、表2B或表4中所述的氨基酸序列并且长度为16至24个氨基酸残基，并且显示出(i)人细胞(例如，来自人细胞系的人细胞，如Caski、HEC1A、Caco-2和ME180，或来自非人细胞系的非人细胞，如Vero、MDCK或MCBK细胞)中CC50在15μM至200μM之间，如通过本领域技术人员已知的或者本文所述的技术所测量的，(ii)对人红细胞的MHC在2μM至100μM之间，如通过本领域技术人员已知的或者本文所述的技术所测量的，和(iii)TI在1至150之间。在一种具体实施方式中，对血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)的TI在2至5、2至10、2至15、2至20、20至25、10至25、10至50、10至100、10至125、10至150、25至50、25至100、25至125、25至150、50至75、50至100、50至125、50至150、75至100、75至125或75至150之间。在另一种具体实施方式中，抗感染肽由表2A、表2B或表4中所述的氨基酸序列组成并且显示出(i)人细胞(例如，来自人细胞系的人细胞，如Caski、HEC1A、Caco-2和ME180，或来自非人细胞系的非人细胞，如Vero、MDCK或MCBK细胞)中CC50在15μM至200μM之间，如通过本领域技术人员已知的或者本文所述的技术所测量的，(ii)对人红细胞的MHC在2μM至100μM之间，如通过本领域技术人员已知的或者本文所述的技术所测量的，和(iii)TI在1至150之间。在一种具体实施方式中，对血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)的TI在2至5、2至10、2至15、2至20、20至25、10至25、10至50、10至100、10至125、10至150、25至50、25至100、25至125、25至150、50至75、50至100、50至125、50至150、75至100、75至125或75至150之间。根据这些实施方式，在某些实施方式中，所述抗感染肽对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，甲氧西林敏感和耐甲氧西林)、肠球菌(enterococci)(例如，万古霉素敏感和耐万古霉素)、链球菌(streptococci)(例如，青霉素敏感和耐青霉素)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)显示出0.1μM至20μM之间的MIC。根据这些实施方式，在某些实施方式中，所述抗感染肽对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，甲氧西林敏感和耐甲氧西林)、肠球菌(enterococci)(例如，万古霉素敏感和耐万古霉素)、链球菌(streptococci)(例如，青霉素敏感和耐青霉素)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)显示出0.1μg/mL至20μg/mL的MIC。
在一种具体的实施方式中，抗感染肽包含表2A、表2B或表4中所述的氨基酸序列并且长度为16至24个氨基酸残基，并且显示出(i)0.1μM至20μM的MIC，如通过本领域技术人员已知的或者本文所述的技术所测量的，和(ii)TI在1至100之间。在具体的实施方式中，针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，甲氧西林敏感和耐甲氧西林)、肠球菌(enterococci)(例如，万古霉素敏感和耐万古霉素)、链球菌(streptococci)(例如，青霉素敏感和耐青霉素)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)的TI在2至5、2至10、2至15、2至20、20至25、10至25、10至50、10至100、10至125、10至150、25至50、25至100、25至125、25至150、50至75或50至100之间。根据这些实施方式，在某些实施方式中，所述抗感染肽对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，甲氧西林敏感和耐甲氧西林)、肠球菌(enterococci)(例如，万古霉素敏感和耐万古霉素)、链球菌(streptococci)(例如，青霉素敏感和耐青霉素)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)显示出0.1μg/mL至20μg/mL之间的MIC。在一种具体实施方式中，抗感染肽由表2A、表2B或表4中所述的氨基酸序列组成并且显示出(i)0.1μM至20μM之间的MIC，如通过本领域技术人员已知的或者本文所述的技术所测量的，和(ii)TI在1至100之间。在一种具体实施方式中，针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，甲氧西林敏感和耐甲氧西林)、肠球菌(enterococci)(例如，万古霉素敏感和耐万古霉素)、链球菌(streptococci)(例如，青霉素敏感和耐青霉素)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的TI在2至5、2至10、2至15、2至20、20至25、10至25、10至50、10至100、10至125、10至150、25至50、25至100、25至125、25至150、50至75或50至100之间。根据这些实施方式，在某些实施方式中，所述抗感染肽对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(例如，甲氧西林敏感和耐甲氧西林)、肠球菌(enterococci)(例如，万古霉素敏感和耐万古霉素)、链球菌(streptococci)(例如，青霉素敏感和耐青霉素)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)显示出0.1μg/mL至20μg/mL之间的MIC。根据这些实施方式，在某些实施方式中，所述抗感染肽显示出2至5、2至10、2至15、2至20、20至25、10至25、10至50、10至100、10至125、10至150、25至50、25至100、25至125、25至150、50至75、50至100、50至125、50至150、75至100、75至125或75至150的对血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)的TI。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽在蒸馏水中是可溶的(例如，高度可溶的)。可以通过本领域技术人员已知的或者本文所述的任何技术确定抗感染肽在蒸馏水中或另一种水溶液中的溶解度(参见，第6节)。在具体的实施方式中，使用本领域技术人员已知的或者本文所述的技术，至少80％、85％、90％或以上的本文所述的抗感染肽在蒸馏水中复原。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽是无免疫原性的或具有低免疫原性。本领域技术人员已知的任何技术可以用于评价抗感染肽的免疫原性。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽通过膜破坏机制起作用。膜破坏机制的实例包括以下中的一种或多种：膜中孔的形成、膜溶解、膜流动性损伤、涂覆膜表面和导致膜中致病性蛋白质或糖的膜结构或功能的形态变化的任何过程。可以通过物理和/或化学过程发生这些过程。
在一种具体实施方式中，所述抗感染肽是第6节中所述的抗感染肽。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽是如第5.2节所述聚乙二醇化的或修饰的。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽是如第5.3节所述合成的。在具体的实施方式中，将所述抗感染肽配制为第5.4节中所述的组合物的一部分。在一种具体实施方式中，在第5.5节中所述的方法中使用所述抗感染肽。在一种具体实施方式中，第5.8节中所述的测定中使用所述抗感染肽。在一种具体实施方式中，所述抗感染肽是第5.9中所述的试剂盒的组分。
在一些实施方式中，本文所述的抗感染肽是多聚体化的。所述多聚体可以包含2个、3个或更多个抗感染肽。
在一种实施方式中，抗感染肽是表2A中所述的肽。在一种实施方式中，抗感染肽是表2B中所述的肽。在一种实施方式中，抗感染肽是表4中所述的肽。
在一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是分离的。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是合成的。
5.2聚乙二醇化的抗感染肽
在一种具体实施方式中，用聚乙二醇(PEG)聚合物修饰本文所述的抗感染肽(参见第5.1节和第6节)(如本文所使用的术语“抗感染肽“包括第5.1节和第6节中所述的肽及其聚乙二醇化的形式)。例如，在一种具体实施方式中，将本文所述的抗感染肽连接至1种、2种或更多种PEG聚合物。在一种具体实施方式中，将本文所述的抗感染肽连接至1个、2个或更多个PEG聚合物，其中所述肽包含表2A和表2B中所述的氨基酸序列，基本由其组成或由其组成。在一种具体实施方式中，将本文所述的抗感染肽连接至1种、2种或更多种PEG聚合物，其中所述肽包含表4中所述的氨基酸序列，基本由其组成或由其组成。在某些实施方式中，将PEG聚合物共价连接至肽。在其他实施方式中，将PEG聚合物非共价连接至肽。在一种具体实施方式中，将PEG聚合物直接连接至肽。在其他实施方式中，将PEG聚合物间接连接至肽。在一种具体实施方式中，PEG聚合物的分子量范围为500至1,000道尔顿、500至2,000道尔顿、500至3,000道尔顿、500至4,000道尔顿或500至5,000道尔顿。在具体的实施方式中，PEG聚合物的分子量范围为1,000至5,000道尔顿、2,000至5,000道尔顿、3,000至5,000道尔顿或4,000至5,000道尔顿。在另一种实施方式中，PEG聚合物的分子量范围为500至5,000道尔顿。所述PEG聚合物可以是支化、非支化或叉状的。在某些实施方式中，1种、2种或更多种PEG聚合物是支化的。在一些实施方式中，1种、2种或更多种PEG聚合物是非支化的。在某些实施方式中，1种、2种或更多种PEG聚合物是叉状的。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽含有一个PEG单体。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽含有寡聚化的PEG(PEG聚合物)。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽含有2个至数百个PEG单体。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽含有1-5、5-10、10-15、15-20、10-20、20-25、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100或100-200个PEG单元。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽含有24个PEG单体。在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽含有两种PEG聚合物，其中每种PEG聚合物包含12个PEG单体。
本文所述的抗感染肽可以在(例如)所述肽的N-末端、所述肽的C-末端、所述肽中的赖氨酸残基或者所述肽中的精氨酸残基处连接至1种、2种或更多种PEG聚合物。在一种具体实施方式中，所述1种、2种或更多种PEG聚合物连接至所述肽的N-末端。在另一种具体实施方式中，所述1种、2种或更多种PEG聚合物连接至所述肽的C-末端。在另一种具体实施方式中，所述1种、2种或更多种PEG聚合物连接至所述肽中的赖氨酸残基。在另一种具体实施方式中，所述1种、2种或更多种PEG聚合物连接至所述肽中的精氨酸残基。在某些实施方式中，本文所述的抗感染肽在所述肽的N-末端、所述肽的C-末端、所述肽中的赖氨酸残基和/或所述肽中的精氨酸残基中的两处或更多处连接至两种或更多种PEG聚合物。
在一种具体实施方式中，包含SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的24-单元的PEG聚合物。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的24-单元的PEG聚合物。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的24-单元的PEG聚合物。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的24-单元的PEG聚合物。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的24-单元的PEG聚合物。
在一种具体实施方式中，包含SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的两个12-单元的PEG聚合物。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的两个12-单元的PEG聚合物。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的两个12-单元的PEG聚合物。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的两个12-单元的PEG聚合物。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)、基本由其组成或由其组成的抗感染肽包含在所述抗感染肽的N-末端附接的两个12-单元的PEG聚合物。如本文所使用的，“PEG12”是指具有12个PEG单体单元的PEG聚合物。
在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽，其中所述肽的长度为16至24个氨基酸残基并且包含表2A和表2B中所述的氨基酸序列。在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽，其中所述肽由表2A或表2B中所述的氨基酸序列组成。在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽，其中所述肽的长度为16至24个氨基酸残基并且包含表4中所述的氨基酸序列。在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽，其中所述肽由表4中所述的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，所述肽在C-末端酰胺化。
在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽-NH2，其中所述肽的长度为16至24个氨基酸残基并且包含表2A和表2B中所述的氨基酸序列。在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽-NH2，其中所述肽由表2A或表2B中所述的氨基酸序列组成。在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽-NH2，其中所述肽的长度为16至24个氨基酸残基并且包含表4中所述的氨基酸序列。在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽-NH2，其中所述肽由表4中所述的氨基酸序列组成。在某些实施方式中，所述肽在C-末端酰胺化。
在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽-COOH，其中所述肽的长度为16至24个氨基酸残基并且包含表2A和表2B中所述的氨基酸序列。在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽-COOH，其中所述肽由表2A或表2B中所述的氨基酸序列组成。在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽-COOH，其中所述肽的长度为16至24个氨基酸残基并且包含表4中所述的氨基酸序列。在一种具体实施方式中，聚乙二醇化肽包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽-COOH，其中所述肽由表4中所述的氨基酸序列组成。
在某些实施方式中，将亲水聚合物加入至抗感染肽。亲水聚合物可以(直接或间接)连接至抗感染肽。在一种具体实施方式中，接头(例如，1-5、5-10或1-10个氨基酸接头，如甘氨酸接头)用于将亲水聚合物连接至抗感染肽。亲水聚合物可以共价或非共价连接至抗感染肽。亲水聚合物可以是基本上非结构化的亲水性氨基酸聚合物，它是PEG的功能类似物。亲水聚合物的实例包括XTEN(Amunix；它的长度为864个氨基酸并且由6种氨基酸(A、E、G、P、S和T)组成、PAS(XL-Protein GmbH；由仅有3种小的不带电的氨基酸，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的更受限制的组组成的无规卷曲聚合物)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)、二乙烯基醚-马来酸酐(DIVEMA)、聚噁唑啉、聚磷酸盐、聚磷腈和常规PEG(例如，羟基-PEG)的衍生物。在某些实施方式中，2个、3个或更多个亲水聚合物连接至抗感染肽。亲水聚合物可以在C-末端、N-末端或C-末端和N-末端两者处连接至所述肽。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加提高了所述肽的体内半衰期，如通过本领域技术人员已知的技术所评价的。参见，例如，Bird,Gregory H.等人,"Hydrocarbon double-stapling remedies the proteolytic instability of a lengthy peptidetherapeutic."Proceedings of the National Academy of Sciences 107.32(2010):14093-14098，以上文献作为参考并入本文以用于描述评价肽的半衰期的技术。例如，可以对一非人动物(例如，小鼠)施用一定浓度的抗感染肽，并且可以向另一同种的非人动物(例如，小鼠)施用聚乙二醇化的或包含亲水聚合物的相同的抗感染肽。在所述肽施用后的不同时间点，可以从每种动物吸取血液并且可以通过(例如)液相色谱/质谱(LC/MS)评价在每个点来自每种动物的血液中的肽浓度。
在某些实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节中)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加将所述肽的体内半衰期提高了2至5倍，2至10倍，2至20倍，2至25倍，2至50倍，2至75倍或2至100倍，如通过本领域技术人员已知的技术所评价的。在一些实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节中)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加将所述肽的体内半衰期提高了5至10倍，5至20倍，5至25倍，5至50倍，5至75倍或5至100倍，如通过本领域技术人员已知的技术所评价的。在某些实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节中)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加将所述肽的体内半衰期提高了10至20倍，10至25倍，10至50倍，10至75倍或10至100倍，如通过本领域技术人员已知的技术所评价的。在一些实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节中)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加将所述肽的体内半衰期提高了25倍至50倍，25至75倍或25至100倍，如通过本领域技术人员已知的技术所评价的。在某些实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节中)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加将所述肽的体内半衰期提高了50至75倍或2至100倍，如通过本领域技术人员已知的技术所评价的。
在一种具体实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加未将所述肽对包膜病毒(例如，血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)、埃博拉病毒和/或马伯格氏病毒)的EC50提高大于2至5倍，2至10倍，2至20倍，2至25倍，2至50倍或2至75倍，如通过本领域技术人员已知的或本文所述的技术所评价的。在一些具体实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加未将所述肽对包膜病毒(例如，血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)、埃博拉病毒和/或马伯格氏病毒)的EC50提高大于5至10倍，5至20倍，5至25倍，5至50倍或5至75倍，如通过本领域技术人员已知的或本文所述的技术所评价的。在某些具体实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加未将所述肽对包膜病毒(例如，血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)、埃博拉病毒和/或马伯格氏病毒)的EC50提高大于10至20倍，2至25倍，10至50倍或10至75倍，如通过本领域技术人员已知的或本文所述的技术所评价的。在一些具体实施方式中，本文所述的抗感染肽(例如，第5.1节和第6节)的PEG化或者亲水聚合物向本文所述的抗感染肽的添加未将所述肽对包膜病毒(例如，血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)、埃博拉病毒和/或马伯格氏病毒)的EC50提高大于25至50倍或25至75倍，如通过本领域技术人员已知的或本文所述的技术所评价的。
在一种具体实施方式中，包含SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、基本由其组成或由其组成的肽的PEG化将所述肽对包膜病毒(例如，血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)、埃博拉病毒和/或马伯格氏病毒)的EC50提高了使用本文所述的或者本领域技术人员已知的测定在第6节中所述的大致的量。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、基本由其组成或由其组成的肽的PEG化将所述肽对包膜病毒(例如，血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)、埃博拉病毒和/或马伯格氏病毒)的EC50提高了使用本文所述的或者本领域技术人员已知的测定在第6节中所述的大致量。
在一种具体实施方式中，包含SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、基本由其组成或由其组成的肽的亲水聚合物的加入将所述肽对包膜病毒(例如，血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)、埃博拉病毒和/或马伯格氏病毒)的EC50提高了使用本文所述的或者本领域技术人员已知的测定在第6节中所述的大致量。在另一种具体实施方式中，包含GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、基本由其组成或由其组成的肽的亲水聚合物的加入将所述肽对包膜病毒(例如，血清1型登革热(例如，血清1型登革热PRS41393)、血清2型登革热(例如，血清2型登革热新几内亚C株)、血清3型登革热(例如，血清3型登革热H87)、血清4型登革热(例如，血清4型登革热H241)、基孔肯亚病毒(例如，基孔肯亚病毒181/25)、黄热病毒(例如，黄热病毒17D)和日本脑炎病毒(例如，日本脑炎病毒14-14-2)、埃博拉病毒和/或马伯格氏病毒)的EC50提高了使用本文所述的或者本领域技术人员已知的测定在第6节中所述的大致量。
如本文所使用的，当与数字组合使用时，术语“约”或“大约”是指所指数字的1％、5％或10％之内的任何数字。在某些实施方式中，术语“约”或“大约”是指所列举的确切数值。
本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节或第6节)可以通过本领域中已知的用于肽PEG化的任何方法或者通过本文所述的任何方法(参见，例如，第6节)连接至1种、2种或更多种PEG聚合物。可以使用本领域技术人员已知的技术将本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节和第6节)连接至1种、2种或更多种亲水聚合物。除非另外说明，否则本文所提供的方法涵盖了本领域技术范围内的分子生物学、微生物学、基因分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和相关领域中的常规方法。
在一种具体实施方式中，通过本领域技术人员已知的或者本文所述的任何技术使第5.1节中所述的抗感染肽聚乙二醇化。在另一种具体实施方式中，通过本领域技术人员已知的或者本文所述的任何技术使第6节中所述的抗感染肽聚乙二醇化。在另一种具体实施方式中，如第5.3节中所述合成所述聚乙二醇化的抗感染肽。在一种具体实施方式中，将所述聚乙二醇化的抗感染肽配制为例如第5.4节中所述的组合物的一部分。在一种具体实施方式中，在第5.5节中所述的方法中使用所述聚乙二醇化的抗感染肽。在一种具体实施方式中，在第5.8节中所述的测定中使用所述聚乙二醇化的抗感染肽。在一种具体实施方式中，所述聚乙二醇化的抗感染肽是5.9中所述的试剂盒的组分。
在一种具体实施方式中，将连接至1种、2种或更多种亲水聚合物的抗感染肽配制为例如第5.4节中所述的组合物的一部分。在一种具体实施方式中，在第5.5节中所述的方法中使用连接至1种、2种或更多种亲水聚合物的抗感染肽。在一种具体实施方式中，在第5.8节中所述的测定中使用连接至1种、2种或更多种亲水聚合物的抗感染肽。在一种具体实施方式中，连接至1种、2种或更多种亲水聚合物的抗感染肽是第5.9节中所述的试剂盒的组分。
在一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是分离的。在另一种实施方式中，本文所述的抗感染肽是合成的。
5.3抗感染肽的合成
可以通过本领域中已知的用于肽合成的任何方法，具体地，通过化学合成或重组表达技术，或者通过本文所述的任何方法(参见，例如，第6节)产生本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)。除非另外说明，否则本文所提供的方法涵盖了本领域技术范围内的分子生物学、微生物学、基因分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和相关领域中的常规方法。在本文引用的参考文献中描述了并且在文献中充分解释了这些技术。参见，例如，Maniatis等人(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等人(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel 等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987以及每年更新版)；Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1987以及每年更新版)Gait(主编)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；Eckstein(主编)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press；Birren等人(主编)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
在一种具体实施方式中，通过合成产生本文所述的抗感染肽。可以使用常规逐步溶液或固相合成制备本文所述的抗感染肽(参见，例如，Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins,Williams等人主编,1997,CRC Press,Boca RatonFla.，以及其中引用的参考文献；Solid Phase Peptide Synthesis:A PracticalApproach,Atherton&Sheppard,主编,1989,IRL Press,Oxford,England，以及其中引用的参考文献)。
作为另外一种选择，可以通过片段缩合法制备本文所述的抗感染肽，如在以下文献中所述的，例如：Liu等人,1996,Tetrahedron Lett.37(7):933-936；Baca等人,1995,J.Am.Chem.Soc.117:1881-1887；Tam等人,1995,Int.J.Peptide Protein Res.45:209-216；Schnolzer and Kent,1992,Science 256:221-225；Liu and Tam,1994,J.Am.Chem.Soc.116(10):4149-4153；Liu and Tam,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6584-6588；Yamashiro and Li,1988,Int.J.Peptide Protein Res.31:322-334。在Nakagawa et al.,1985,J.Am.Chem.Soc.107:7087-7092中描述了对于合成本文所述的抗感染肽有用的其他方法。
在一种具体实施方式中，通过标准F-moc固相合成产生抗感染肽。例如，通过标准F-moc固相合成产生并通过反相高效液相色谱纯化所述抗感染肽。通过MALDI质谱确定纯化肽的分子量。将冷冻干燥的肽样品保持在-20℃以用于长期储存。通过在室温下将肽溶解在去离子水中制备贮液浓度2mg/mL的等份，然后在-20℃储存直至使用。如通过280nm下的吸光度测量所确定的，通过考虑氨基酸序列中存在的每种芳香族色氨酸残基的摩尔消光系数，估计溶液中肽的摩尔浓度。
通过在适当合成步骤中向所述抗感染肽链添加接头，可以合成包含接头的抗感染肽。适合的保护方案和化学性质是熟知的，并且将对本领域技术人员显而易见。
在某些实施方式中，抗感染肽是重组产生的。在一种具体实施方式中，本文提供了编码本文所述的抗感染肽的核酸序列(例如，第5.1节和第6节中)。由于遗传密码的简并性，本文涵盖了编码本文所述的抗感染肽的任何核酸。在一种特定的实施方式中，本文提供了编码表2A和表2B中所列的抗感染肽的核酸序列。在另一种实施方式中，本文提供了编码表4中所列的抗感染肽的核酸序列。在具体的实施方式中，本文提供了编码第6节中所述的抗感染肽的核酸序列。
如本文所使用的，术语“核酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。所述核酸可以是单链或双链的。
本文还提供了能够杂交至编码抗感染肽的核酸序列的核酸序列。在某些实施方式中，本文提供了能够杂交至编码抗感染肽的核酸片段的核酸。在其他实施方式中，本文提供了能够杂交至编码抗感染肽的全长核酸的核酸。核酸杂交条件的一般参数可见于Sambrook等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第二版),1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989)和在Ausubel等人,Current Protocolsin Molecular Biology,2卷,Current Protocols Publishing,New York(1994)中。杂交可以在高严格性条件、中严格性条件或低严格性条件下进行。本领域技术人员将理解低、中和高严格性条件随相互作用的多种因素而定并且还取决于所讨论的核酸。例如，高严格性条件可以包括所述核酸熔融温度5℃内的温度，低盐浓度(例如，小于250mM)和高共溶剂浓度(例如，1-20％的共溶剂，例如，DMSO)。另一方面，低严格性条件可以包括低于所述核酸熔融温度超过10℃的温度、高盐浓度(例如，大于1000mM)和不存在共溶剂。
在一些实施方式中，分离编码抗感染肽的核酸序列。在某些实施方式中，“分离的”核酸序列是指与核酸天然来源中存在的其他核酸分子分离的核酸分子。换言之，分离的核酸序列可以包含天然中与之无关的异源核酸。在其他实施方式中，“分离的”核酸序列(如cDNA分子)在通过重组技术产生时可以基本不含其他细胞材料或培养基，或在化学合成时基本不含化学前体或其他化学物质。术语“基本不含细胞材料”包括其中核酸序列与从中分离或重组产生该核酸序列的细胞的细胞组分相分离的核酸序列制备物。因此，基本不含细胞材料的所述核酸序列包括具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的其他核酸的核酸序列制备物。术语“基本不含培养基”包括其中培养基占制备物体积的小于约50％、20％、10％或5％的核酸序列制备物。术语“基本不含化学前体或其他化学物质”包括其中所述核酸序列与参与所述核酸序列合成的化学前体或其他化学物质分离的制备物。在具体的实施方式中，除所关心的核酸序列之外，这些核酸序列的制备物具有小于约50％、30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或化合物。
本文提供了载体，包括表达载体，其含有编码本文所述的抗感染肽的核酸序列。在具体的实施方式中，所述载体是能够指导编码本文所述的抗感染肽的核酸序列表达的表达载体。表达载体的非限制性实例包括，但不限于，质粒和病毒载体，如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒和杆状病毒。表达载体还可以无限制地包括转基因动物和非哺乳动物细胞/生物体，例如，经过工程化改造以实施哺乳动物N-连接的糖基化的哺乳动物细胞/生物体。
表达载体包含编码本文所述的抗感染肽的核酸序列并且处于适合于宿主细胞中核酸表达的形式。在一种具体实施方式中，表达载体包括根据用于表达的宿主细胞所选择的一种或多种调控序列，其可操作性地连接至要表达的核酸。在表达载体内，“可操作性地连接”旨在表示所关注的核酸序列以允许核酸序列表达的方式连接至调控序列(例如，在体外转录/翻译系统中或者当将所述载体引入宿主细胞时，在宿主细胞中)。调控序列包括启动子、增强子及其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列包括指导核酸序列在多种类型宿主细胞中组成型表达的那些、指导核酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些(例如，组织-特异性调控序列)和指导核酸序列一旦受到特定试剂刺激而表达的那些(例如，诱导型调控序列)。本领域技术人员将理解表达载体的设计可以取决于以下因素，如要转化的宿主细胞的选择、所期望的蛋白表达水平等。术语“宿主细胞”旨在包括用核酸序列转化或转染的特定受试者细胞和该细胞的子代或潜在子代。由于在随后的传代或在核酸序列向宿主细胞基因组的整合中可能发生的突变或环境影响，这种细胞的子代可能与用所述核酸序列转化或转染的亲代细胞不相同。在具体的实施方式中，所述宿主细胞是细胞系。
表达载体可以设计用于利用原核(例如，大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体，参见，例如，Treanor等人,2007,JAMA,297(14):1577-1582，该文献以其全部内容作为参考并入本文)、酵母细胞、植物细胞、藻类、鸟类或哺乳动物细胞)表达本文所述的抗感染肽。酵母宿主细胞的实例包括，但不限于，裂殖酵母(S.pombe)和酿酒酵母(S.cerevisiae)。鸟类细胞的实例包括，但不限于，EB66细胞。哺乳动物宿主细胞的实例包括，但不限于，Crucell Per.C6细胞、Vero细胞、CHO细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或WI38细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是骨髓瘤细胞，例如，NS0细胞、45.6TG1.7细胞、AF-2克隆9B5细胞、AF-2克隆9B5细胞、J558L细胞、MOPC 315细胞、MPC-11细胞、NCI-H929细胞、NP细胞、NS0/1细胞、P3NS1Ag4细胞、P3/NS1/1-Ag4-1细胞、P3U1细胞、P3X63Ag8细胞、P3X63Ag8.653细胞、P3X63Ag8U.1细胞、RPMI 8226细胞、Sp20-Ag14细胞、U266B1细胞、X63AG8.653细胞、Y3.Ag.1.2.3细胞和YO细胞。昆虫细胞的非限制性实例包括Sf9、Sf21、粉纹夜蛾(trichoplusia ni)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)。在一种特定的实施方式中，哺乳动物细胞培养系统(例如，中华仓鼠卵巢细胞或乳仓鼠肾细胞)用于抗感染肽的表达。在另一种实施方式中，植物细胞培养系统用于抗感染肽的表达。对于使用植物细胞培养系统生产蛋白质的植物细胞和方法，参见，例如，美国专利No.7,504,560；6,770,799；6,551,820；6,136,320；6,034,298；5,914,935；5,612,487；和5,484,719以及美国专利申请公开No.2009/0208477、2009/0082548、2009/0053762、2008/0038232、2007/0275014和2006/0204487。包含编码本文所述的抗感染肽的核酸序列的宿主细胞可以是分离的，即，所述细胞在受试者身体之外。在某些实施方式中，将所述宿主细胞工程设计以表达编码本文所述的抗感染肽的核酸序列。在具体的实施方式中，所述宿主细胞是来自细胞系的细胞。
可以通过常规转化或转染技术将表达载体引入宿主细胞。这些技术包括，但不限于，磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染和电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的适合的方法可见于Sambrook等人,1989,Molecular Cloning-A LaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor Press,New York和其他实验室手册。在某些实施方式中，用含有编码抗感染肽的核酸序列的表达载体瞬时转染宿主细胞。在其他实施方式中，用含有编码抗感染肽的核酸序列的表达载体稳定转染宿主细胞。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知基于所使用的表达载体和转染技术，仅有一小部分细胞可以将外源DNA整合到它们的基因组中。为了鉴别和选择这些整合体，通常将编码可选择标志物(例如，对于抗生素抗性)的核酸序列与所关心的核酸序列一起引入宿主细胞。可选择标志物的实例包括赋予药物抗性的那些，如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。可以通过药物选择鉴别用所引入的核酸序列稳定转染的细胞(例如，引入可选择标志物基因的细胞存活，而其他细胞死亡)。
作为使用宿主细胞的抗感染肽的重组表达的替代，可以使用(例如)T7启动子调控序列和T7聚合酶体外转录和转化含有编码抗感染肽的核酸序列的表达载体。在具体的实施方式中，偶联的转录/翻译系统，如Promega TNT，或者包含转录和翻译所必需的组分的细胞裂解液或细胞提取物可以用于产生抗感染肽。
一旦产生抗感染肽，则可以通过本领域中已知的用于蛋白分离或纯化的任何方法对其进行分离或纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲合色谱，具体地通过对特异性抗原的亲合力，通过蛋白A和尺寸排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度或者通过用于蛋白分离或纯化的任何其他标准技术。
因此，本文提供了产生抗感染肽的方法。在一种实施方式中，所述方法包括在适合的培养基中培养含有编码抗感染肽的核酸序列的宿主细胞，从而产生所述肽。在一些实施方式中，所述方法还包括从培养基或宿主细胞分离所述肽。
5.4组合物
本文提供了包含有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)的组合物(例如，药物组合物)。本文还提供了包含有效量的本文所述的抗感染肽(参见第5.1节、第5.2节和第6节)和载体或稀释剂的组合物。在一种具体实施方式中，所述载体是水溶液。在一种具体实施方式中，所述水溶液是无菌水。在另一种具体实施方式中，所述水溶液是蒸馏水。在一种具体实施方式中，所述载体是可药用的载体。本文还提供了包含有效量的本文所述的抗感染肽(参见第5.1节、第5.2节和第6节)和媒介物的组合物。在另一种实施方式中，本文提供了包含有效量的抗感染肽和可药用的载体或媒介物的组合物，其中可药用的载体或媒介物可以包括赋形剂、稀释剂或它们的组合。在一种实施方式中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含2种、3种或更多种本文所述的抗感染肽。
在一种具体实施方式中，本文所述的组合物用于在本文所述的方法(参见第5.5节)中使用。例如，抗感染肽可以施用于受试者或者在体外细胞培养测定中单独或作为组合物的组分使用。所述受试者抗感染肽可以配制用于以任何方便的方式施用以用于人或兽医学中的使用或者用于本文所述方法的体内、离体或体外使用。
所述药物组合物的配制将基于对受试者的施用途径而不同。本文所述的抗感染肽可以口服、皮内、肌内、腹膜内、透皮、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、脑内、阴道内、经皮、直肠、粘膜施用，通过吸入或局部施用于耳、鼻、眼或皮肤。施用方式由保健医师决定，并且可以部分取决于医疗条件的场所或者细菌或病毒感染的类型。
例如，所述抗感染肽可以以常规制剂形式口服或肠胃外施用于患者，所述常规制剂形式如胶囊、片剂、微胶囊、颗粒剂、锭剂、粉剂、丸剂、注射剂、栓剂、混悬剂和糖浆。可以通过使用常规有机或无机添加剂的常用方法制备适合的制剂，所述添加剂如赋形剂(例如，蔗糖、葡萄糖、乳糖、纤维素、山梨糖醇、滑石、甘露糖醇、磷酸钙、淀粉或碳酸钙)、粘结剂(例如，纤维素、羟甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯吡咯烷酮、阿拉伯树胶、明胶、聚乙二醇、淀粉或蔗糖)、崩解剂(例如，淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素、磷酸钙、碳酸氢钠或柠檬酸钙)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、轻质无水硅酸或月桂基硫酸钠)、调味剂(例如，柠檬酸、甘氨酸、薄荷脑或橙味粉末)、防腐剂(例如，苯甲酸钠、羟苯甲酯、亚硫酸氢钠或羟苯丙酯)、稳定剂(例如，柠檬酸、乙酸或柠檬酸钠)、助悬剂(例如，甲基纤维素、硬脂酸铝或聚乙烯吡咯烷酮)、分散剂(例如，羟丙基甲基纤维素)、稀释剂(例如，水)和底蜡(例如，可可脂、聚乙二醇或白凡士林)。在一种实施方式中，本文提供了含有抗感染肽而无其他载体、赋形剂或媒介物的胶囊。
在另一个实例中，对于局部施用，所述组合物可以包含处于水溶液中的抗感染肽，其包括以下中的1种、2种或更多种或组合：5wt％或以下(0.5至5％之间)的羟乙基纤维素、5wt％或以下(0.5至5％之间)的甘油和3wt％或以下(0.3至3％之间)的PEG。在另一个实例中，将所述局部施用组合物配制为用于局部杀微生物剂的常规凝胶制剂。在另一个实例中，将所述组合物配制为凝胶、胶囊、片剂、薄膜或阴道内环。
在某些实施方式中，将抗感染肽在混悬液中配制，如脂质体、胶束、纳米颗粒或聚电解质混悬液。在一些实施方式中，抗感染肽非共价或共价连接至脂质体、胶束、纳米颗粒或聚电解质的表面。所述连接可以是直接的或通过柔性链(例如，PEG间隔物链)。
在一种具体实施方式中，本文提供的组合物的pH为4至7.5、4.5至7.5、5至7.5、5.5至7.5、6至7.5或6.5至7.5。在另一种具体实施方式中，本文提供的组合物的pH为约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7或约7.5。
在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对抑制微生物生长有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对抑制微生物生长有效的量的抗感染肽和载体。在具体的实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的微生物生长相比，对将微生物生长抑制至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍或1,000倍有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的微生物生长相比，对将微生物生长抑制2倍至5倍之间、2倍至10倍之间、2倍至20倍之间、5倍至100倍之间、10倍至50倍之间、10倍至100倍之间或100倍至1,000倍之间有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，受抑制的微生物生长是第5.7节中所述的微生物生长。
在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对抑制病毒生长有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对抑制病毒生长有效的量的抗感染肽和载体。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的病毒生长相比，对将病毒生长抑制至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍或1,000倍有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的病毒生长相比，对将病毒生长抑制2倍至5倍之间、2倍至10倍之间、2倍至20倍之间、5倍至100倍之间、10倍至50倍之间、10倍至100倍之间或100倍至1,000倍之间有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，受抑制的病毒生长是第5.7节中所述的病毒生长。
在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对抑制病毒复制有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对抑制病毒复制有效的量的抗感染肽和载体。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的病毒复制相比，对将病毒复制抑制至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍或1,000倍有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的病毒复制相比，对将病毒复制抑制2倍至5倍之间、2倍至10倍之间、2倍至20倍之间、5倍至100倍之间、10倍至50倍之间、10倍至100倍之间或100倍至1,000倍之间有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的病毒复制相比，对将病毒复制抑制至少1log或以上，约2log或以上，约3log或以上，约4log或以上，约5log或以上，约6log或以上，约7log或以上，约8log或以上，约9log或以上，约10log或以上，1至3log，1至5log，1至8log，1至9log，2至10log，2至5log，2至7log，2log至8log，2至9log，2至10log，3至5log，3至7log，3至8log，3至9log，4至6log，4至8log，4至9log，5至6log，5至7log，5至8log，5至9log，6至7log，6至8log，6至9log，7至8log，7至9log或8至9log有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的病毒复制相比，对将病毒复制生长抑制0.5log至2.5log、1log至3log、2log至4log、3log至5log、4log至6log、5log至7log、6log至8log、7log至9log或8log至10log有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，受抑制的病毒复制是第5.7节中所述的病毒复制。
在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对杀死病毒有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对杀死病毒有效的量的抗感染肽和载体。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对杀死群体中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的病毒有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对杀死群体中10％至20％，10％至30％，10％至40％，10％至50％，10％至60％，10％至70％，10％至80％，10％至90％或10％至100％的病毒有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对杀死群体中10％至40％，20％至60％，30％至50％，40％至60％，50％至70％，60％至80％，70％至90％，90％至95％，90％至98％或90％至100％的病毒有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，所述病毒是第5.7节中所述的病毒。
在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对抑制细菌生长有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，所述组合物包含对抑制细菌生长有效的量的抗感染肽和载体。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的细菌生长相比，对将细菌生长抑制至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍或1,000倍有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的细菌生长相比，对将细菌生长抑制2倍至5倍之间、2倍至10倍之间、2倍至20倍之间、5倍至100倍之间、10倍至50倍之间、10倍至100倍之间或100倍至1,000倍之间有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，受抑制的细菌生长是第5.7节中所述的细菌生长。
在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对抑制细菌复制有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对抑制细菌复制有效的量的抗感染肽和载体。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的细菌复制相比，对将细菌复制抑制至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍或1,000倍有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含与不存在所述组合物的情况下的细菌复制相比，对将细菌复制抑制2倍至5倍之间、2倍至10倍之间、2倍至20倍之间、5倍至100倍之间、10倍至50倍之间、10倍至100倍之间或100倍至1,000倍之间有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，受抑制的细菌复制是第5.7节中所述的细菌复制。
在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对杀死细菌有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，所述组合物包含对杀死细菌有效的量的抗感染肽和载体。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对杀死群体中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的细菌有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对杀死群体中10％至20％，10％至30％，10％至40％，10％至50％，10％至60％，10％至70％，10％至80％，10％至90％或10％至100％的细菌有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，本文所述的组合物包含对杀死群体中10％至40％，20％至60％，30％至50％，40％至60％，50％至70％，60％至80％，70％至90％，90％至95％，90％至98％或90％至100％的细菌有效的量的抗感染肽。在一种具体实施方式中，所述细菌是第5.7节中所述的细菌。
在一种具体实施方式中，将药物组合物配制用于局部施用。在一种具体实施方式中，配制用于局部施用的药物组合物是凝胶制剂。在一种具体实施方式中，所述凝胶制剂中抗感染肽的有效量在0.1％至5％之间。在具体的实施方式中，将药物组合物配制用作阴道内环。在一种具体实施方式中，配制用于局部施用的药物组合物在第5.5节中所述的预防性治疗方法中使用。在一种具体实施方式中，配制用于局部施用的药物组合物在第5.5节中所述的治疗性治疗方法中使用。
在一种具体实施方式中，将药物组合物配制用于全身施用。在具体的实施方式中，配制用于全身施用的药物组合物是冻干粉(powder)或饼(cake)。在一种具体实施方式中，所述冻干粉或饼包含10mg至300mg之间的所述抗感染肽。在一种具体实施方式中，所述冻干粉或饼包含10mg至100mg，50至150mg，100至200mg，150mg至250mg或200mg至300mg之间的所述抗感染肽。在一种具体实施方式中，所述冻干粉或饼包含200mg至300mg之间的所述抗感染肽。在一种具体实施方式中，将所述冻干粉或饼在1mL水溶液中再悬浮。在一种具体实施方式中，将所述药物组合物每天一次施用于受试者。在一种具体实施方式中，将所述组合物每天两次施用于受试者。在一种具体实施方式中，配制用于全身施用的抗感染肽在第5.5节中所述的预防性治疗方法中使用。在一种具体实施方式中，配制用于全身施用的抗感染肽在第5.5节中所述的治疗性治疗方法中使用。
在一种具体实施方式中，所述组合物是包含本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)的消毒溶液。在一种具体实施方式中，所述消毒溶液配制用于对无生命对象消毒。当所述消毒溶液配制用于对无生命对象消毒时，所述消毒溶液可以是抹布或喷雾。在另一种实施方式中，所述组合物配制用于对生物材料或非生物材料消毒。生物材料包括，但不限于，生物流体(例如，血液)、血液组分、组织、器官和细胞培养物。生物表面包括皮肤(例如，手、准备用于手术的位点等)。当消毒生物表面时，本文所述的抗感染肽可以以配制为局部乳膏剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、液体、固体、去污剂或肥皂的形式施用。
在一种具体实施方式中，所述消毒溶液配制用于消毒受试者，例如，第5.6节中所述的受试者。当所述消毒溶液配制用于消毒受试者时，所述消毒溶液可以是手部或身体清洗液、伤口敷料、凝胶、洗剂、乳膏剂、软膏剂、手术擦洗液或者可以喷雾至皮肤、创伤或表面的喷雾。在具体的实施方式中，所述消毒制剂是水基或甘油基的。
根据需要，含有抗感染肽的消毒组合物可以包括一种或多种其他化合物，但前提条件是这些其他化合物不显著不利地影响所述肽的抗病毒和/或抗细菌活性。例如，这些化合物可以是抗微生物(例如，抗细菌、抗真菌)剂以提高对微生物的消毒。
在某些实施方式中，将本文所述的抗感染肽涂覆至无生命表面(例如，医疗装置)或者生物表面的表面。可以通过共价或非共价方法，将本文所述的抗感染肽直接或间接涂覆至所述表面。
在一种具体实施方式中，所述消毒溶液用于在本文所述的方法中使用(参见第5.5节)。
5.5使用方法
在一个方面，本文提供了抑制微生物生长、复制或感染性的方法，其包括将所述微生物与本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)接触。在一种实施方式中，本文提供了抑制微生物生长、复制或感染性的方法，其包括将所述微生物与有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或者本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)接触。在具体的实施方式中，所述微生物是体外或离体的。在其他具体的实施方式中，所述微生物是体内的。在另一种具体实施方式中，所述微生物是第5.7节或第6节中所述的微生物。
在另一个方面，本文提供了抑制细菌生长的方法，其包括将所述细菌与本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)接触。在一种实施方式中，本文提供了抑制细菌生长的方法，其包括将所述细胞与有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或者本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)接触。在一种具体实施方式中，所述细菌是体外或离体的。在其他具体的实施方式中，所述细菌是体内的。在另一种具体实施方式中，所述细菌是第5.7节或第6节中所述的细菌。在某些实施方式中，细菌生长的抑制导致细菌数目相对于所述细菌不与所述肽或组合物接触时所得的细菌数目减少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或以上。在一些实施方式中，细菌生长的抑制导致细菌数目相对于所述细菌不与所述肽或组合物接触时所得的细菌数目减少1log、2log、3log、4log、5log、6log、7log、8log、9log、10log或以上。
在另一个方面，本文提供了抑制细胞中细菌生长的方法，其包括将所述细胞与本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)接触。在用细菌感染前或者用细菌感染后，可以接触所述细胞。在一种实施方式中，本文提供了抑制细胞中细菌生长的方法，其包括将细菌感染的细胞与有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或者本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)接触。在具体的实施方式中，所述细胞是体外或离体的。在其他的具体实施方式中，所述细胞是体内的。在另一种具体实施方式中，所述细菌是第5.7节或第6节中所述的细菌。在某些实施方式中，细菌生长的抑制导致细菌数目相对于所述细胞不与所述肽或组合物接触时所得的细菌数目减少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或以上。在一些实施方式中，细菌生长的抑制导致细菌数目相对于所述细胞不与所述肽或组合物接触时所得的细菌数目减少1log、2log、3log、4log、5log、6log、7log、8log、9log、10log或以上。
在另一个方面，本文提供了抑制细胞中病毒复制的方法，其包括将所述细胞与本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)接触。在用病毒感染前或者用病毒感染后，可以接触所述细胞。在一种实施方式中，本文提供了抑制细胞中病毒复制的方法，其包括将感染了病毒的细胞与有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或者本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)接触。在具体的实施方式中，所述细胞是体外或离体的。在其他具体的实施方式中，所述细胞是体内的。在另一种具体实施方式中，所述病毒是第5.7节或第6节中所述的病毒。在某些实施方式中，病毒复制的抑制导致病毒颗粒相对于所述细胞不与所述肽或组合物接触时所得的病毒颗粒数目减少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或以上。在一些实施方式中，相对于所述细胞不与所述肽或其组合物接触时病毒颗粒的数目，病毒复制减少了1log、2log、3log、4log、5log、6log、7log、8log、9log、10log或以上。在另一个方面，本文提供了使用本文所述的抗感染肽或其组合物的预防和治疗方法。在一种具体实施方式中，预防性地使用本文所述的抗感染肽或包含它的组合物。在另一种具体实施方式中，治疗性地使用本文所述的抗感染肽或包含它的组合物。
在另一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中微生物感染或者由微生物感染所引起的或与之有关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中微生物感染的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在另一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中由微生物感染所引起的或与之有关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种具体实施方式中，所述微生物是第5.7节或第6节中所述的微生物。在另一种具体实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在具体的实施方式中，使用本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合对微生物感染或由微生物感染引起的或与之有关的疾病的治疗导致产生了有益或治疗效果。在具体的实施方式中，使用本文所述的抗感染肽或其组合或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合对微生物感染或由微生物感染引起的或与之有关的疾病的治疗导致产生了以下效果中的1种、2种、3种、4种、5种或更多种：(i)微生物感染或由微生物感染所引起的或与之有关的疾病或症状的严重程度的减轻或改善；(ii)微生物感染或由微生物感染所引起的或与之有关的疾病或症状的持续时间缩短；(iii)微生物感染或由微生物感染所引起的或与之有关的疾病或症状的消退；(iv)微生物颗粒/滴度降低；(v)与微生物感染或由微生物感染所引起的或与之有关的疾病有关的器官衰竭的降低；(vi)受试者住院减少；(vii)住院时间缩短；(viii)受试者存活率增加；(ix)微生物感染或由微生物感染所引起的或与之有关的疾病或症状的消除；(x)微生物感染或由微生物感染所引起的或与之有关的疾病或症状发展的抑制；(xi)微生物从细胞、组织、器官或受试者向另一个细胞、组织、器官或受试者扩散的防止；和/或(xii)另一种疗法治疗效果的提高或改善。
在另一个方面，本文提供了预防受试者中由微生物感染引起的或与之有关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了预防受试者中由微生物感染引起的或与之有关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在具体的实施方式中，所述微生物是第5.7节或第6节中所述的微生物。在具体的实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在一种具体实施方式中，为预防由微生物感染引起的或与之有关的疾病，本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合向受试者的施用导致产生了一种或多种预防/有益效果。在一种具体实施方式中，为预防由微生物感染引起的或与之有关的疾病，本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合向受试者的施用导致产生了1种、2种或更多种或全部下列效果：(i)由微生物感染引起的或与之有关的疾病或其症状的出现或发生的抑制；(ii)由微生物感染引起的或与之有关的疾病或与之有关的症状的复发的抑制；和(iii)微生物感染和/或复制的降低或抑制。
在另一个方面，本文提供了抑制受试者中细菌生长的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了抑制受试者中细菌生长的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种具体实施方式中，所述细菌是第5.7节或第6节中所述的细菌。在另一种具体实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中细菌感染的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中细菌感染的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种具体实施方式中，所述细菌是第5.7节或第6节中所述的细菌。在另一种具体实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中疾病的方法，所述疾病是由细菌感染引起的或与之相关，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中疾病的方法，所述疾病是由细菌感染引起的或与之有关，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种具体实施方式中，所述细菌是第5.7节或第6节中所述的细菌。在另一种具体实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在一种具体实施方式中，使用本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合对细菌感染或由细菌感染引起的或与之有关的疾病的治疗导致产生了有益或治疗效果。在一种具体实施方式中，使用本文所述的抗感染肽或其组合或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合对细菌感染或由细菌感染引起的或与之有关的疾病的治疗导致产生了以下效果中的1种、2种、3种、4种、5种或更多种：(i)细菌感染或由细菌感染所引起的或与之有关的疾病或症状的严重程度的减轻或改善；(ii)细菌感染或由细菌感染所引起的或与之有关的疾病或症状的持续时间缩短；(iii)细菌感染或由细菌感染所引起的或与之有关的疾病或症状的消退；(iv)细菌数/滴度降低；(v)与细菌感染或由细菌感染所引起的或与之有关的疾病有关的器官衰竭的降低；(vi)受试者住院减少；(vii)住院时间缩短；(viii)受试者存活率增加；(ix)细菌感染或由细菌感染所引起的或与之有关的疾病或症状的消除；(x)细菌感染或由细菌感染所引起的或与之有关的疾病或症状发展的抑制；(xi)细菌从细胞、组织、器官或受试者向另一个细胞、组织、器官或受试者扩散的防止；和/或(xii)另一种疗法治疗效果的提高或改善。
在另一个方面，本文提供了预防受试者中疾病的方法，所述疾病是由细菌感染引起的或与之相关，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了预防受试者中疾病的方法，所述疾病是由细菌感染引起的或与之有关，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种具体实施方式中，所述细菌是第5.7节或第6节中所述的细菌。在另一种具体实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在一种具体实施方式中，为预防由细菌感染引起的或与之有关的疾病，本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合向受试者的施用导致产生了一种或多种预防/有益效果。在一种具体实施方式中，为预防由细菌感染引起的或与之有关的疾病，本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合向受试者的施用导致产生了1种、2种或更多种或全部下列效果：(i)由细菌感染引起的或与之有关的疾病或其症状的出现或发生的抑制；(ii)由细菌感染引起的或与之有关的疾病或与之有关的症状的复发的抑制；和(iii)细菌感染和/或复制的降低或抑制。
在另一个方面，本文提供了抑制受试者中病毒复制的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了抑制受试者中病毒复制的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种具体实施方式中，所述病毒是第5.7节或第6节中所述的病毒。在另一种具体实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4)。在一种具体实施方式中，所述病毒是第5.7节或第6节中所述的病毒。在另一种具体实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中疾病的方法，所述疾病是由病毒感染引起的或与之相关，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中疾病的方法，所述疾病是由病毒感染引起的或与之有关，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在具体的实施方式中，所述病毒是第5.7节或第6节中所述的病毒。在另一种具体实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在一种具体实施方式中，使用本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合对病毒感染或由病毒感染引起的或与之有关的疾病的治疗导致产生了有益或治疗效果。在一种具体实施方式中，使用本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合对病毒感染或由病毒感染引起的或与之有关的疾病的治疗导致产生了以下效果中的1种、2种、3种、4种、5种或更多种：(i)病毒感染或由病毒感染所引起的或与之有关的疾病或症状的严重程度的减轻或改善；(ii)病毒感染或由病毒感染所引起的或与之有关的疾病或症状的持续时间缩短；(iii)病毒感染或由病毒感染所引起的或与之有关的疾病或症状的消退；(iv)病毒数/滴度降低；(v)与病毒感染或由病毒感染所引起的或与之有关的疾病有关的器官衰竭的降低；(vi)受试者住院减少；(vii)住院时间缩短；(viii)受试者存活率增加；(ix)病毒感染或由病毒感染所引起的或与之有关的疾病或症状的消除；(x)病毒感染或由病毒感染所引起的或与之有关的疾病或症状发展的抑制；(xi)病毒从细胞、组织、器官或受试者向另一个细胞、组织、器官或受试者扩散的防止；和/或(xii)另一种疗法治疗效果的提高或改善。
在另一个方面，本文提供了预防受试者中疾病的方法，所述疾病是由病毒感染引起的或与之相关，其包括向所述受试者施用本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在一种实施方式中，本文提供了预防受试者中疾病的方法，所述疾病是由病毒感染引起的或与之有关，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)。在具体的实施方式中，所述病毒是第5.7或第6节中所述的病毒。在另一种具体实施方式中，所述受试者是第5.6节中所述的受试者。
在具体的实施方式中，为预防由病毒感染引起的或与之有关的疾病，本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合向受试者的施用导致产生了一种或多种预防/有益效果。在具体的实施方式中，为预防由病毒感染引起的或与之有关的疾病，本文所述的抗感染肽或其组合物或者本文所述的抗感染肽和另一种疗法的组合向受试者的施用导致产生了1种、2种或更多种或全部下列效果：(i)由病毒感染引起的或与之有关的疾病或其症状的出现或发生的抑制；(ii)由病毒感染引起的或与之有关的疾病或者与之有关的症状的复发的抑制；和(iii)病毒感染和/或复制的降低或抑制。
可以通过多种途径将本文所述的抗感染肽或本文所述的组合物递送至受试者。这些途径包括，但不限于，鼻内、气管内、口服、皮内、肌内、腹膜内、透皮、静脉内、结膜和皮下途径。在一些实施方式中，将本文所述的抗感染肽或本文所述的组合物局部施用于受试者，例如，施用于受试者皮肤。在具体的实施方式中，将本文所述的抗感染肽或本文所述的组合物鼻内施用于受试者。在某些实施方式中，肌内施用本文所述的抗感染肽或本文所述的组合物。在一些实施方式中，将本文所述的抗感染肽或本文所述的组合物皮下施用于受试者。在某些实施方式中，将本文所述的抗感染肽或本文所述的组合物腹膜内施用于受试者。
在本文所述的感染或疾病的治疗和/或预防中将有效的本文所述的抗感染肽或组合物的量将取决于一些因素，包括(例如)所述疾病的性质。要使用的精确剂量还将取决于施用途径，以及感染或者由感染引起或与之相关的疾病的严重程度。例如，基于施用方式、目标位点、患者的生理状态(包括年龄、体重、健康)、患者是人还是动物、所施用的其他药物治疗以及治疗是预防还是治疗性的，有效剂量还可以是不同的。
在具体的实施方式中，施用于受试者的抗感染肽或其组合物的“有效量”是指足以实现以下效果中的1种、2种、3种、4种或更多种的所述抗感染肽或组合物的量：(i)微生物、细菌或病毒感染、由它们所引起的或与之有关的疾病或症状的严重程度的减轻或改善；(ii)微生物、细菌或病毒感染、由它们所引起的或与之有关的疾病或症状的持续时间缩短；(iii)预防微生物、细菌或病毒感染、由它们所引起的或与之有关的疾病或症状发展；(iv)导致微生物、细菌或病毒感染、由它们所引起的或与之有关的疾病或症状消退；(v)预防微生物、细菌或病毒感染、由它们所引起的或与之有关的疾病或症状的出现或发生；(vi)预防微生物、细菌或病毒感染、由它们所引起的或与之有关的疾病或症状复发；(vii)降低或预防微生物、细菌或病毒从一个细胞向另一个细胞、一个组织向另一个组织或者一个器官向另一个器官的扩散；(viii)预防或降低微生物、细菌或病毒从一个受试者向另一个受试者扩散；(ix)降低与微生物、细菌或病毒感染有关的器官衰竭；(x)受试者住院减少；(xi)缩短住院时间；(xii)提高具有微生物、细菌或病毒感染或者由它们所引起的或与之有关的疾病的受试者的存活；(xiii)消除微生物、细菌或病毒感染或者由它们所引起的或与之相关的疾病；(xiv)抑制或降低微生物复制；(xv)降低微生物、细菌或病毒数/滴度；和/或(xvi)提高或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
在某些实施方式中，所述有效量不导致对由微生物感染引起的或与之有关的疾病的完全保护，但是与未治疗的微生物感染受试者相比，导致微生物滴度降低或数目减少。在某些实施方式中，相对于未治疗的微生物感染受试者，所述有效量导致微生物滴度/数目减少0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1,000倍或以上。在一些实施方式中，相对于未治疗的微生物感染受试者，所述有效量导致微生物滴度/数目减少约1log或以上，约2log或以上，约3log或以上，约4log或以上，约5log或以上，约6log或以上，约7log或以上，约8log或以上，约9log或以上，约10log或以上，1至3log，1至5log，1至8log，1至9log，2至10log，2至5log，2至7log，2log至8log，2至9log，2至10log，3至5log，3至7log，3至8log，3至9log，4至6log，4至8log，4至9log，5至6log，5至7log，5至8log，5至9log，6至7log，6至8log，6至9log，7至8log，7至9log或8至9log。微生物滴度、数目或总负担减少的益处包括，但不限于，感染症状不太严重，感染症状较少和由所述感染所引起的或与之有关的疾病时间缩短。
在某些实施方式中，所述有效量不导致对由细菌感染引起的或与之有关的疾病的完全保护，但是与未治疗的细菌感染受试者相比，导致细菌滴度降低或数目减少。在某些实施方式中，相对于未治疗的细菌感染受试者，所述有效量导致细菌滴度/数目减少0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1,000倍或以上。在一些实施方式中，相对于未治疗的细菌感染受试者，所述有效量导致细菌滴度/数目减少约1log或以上，约2log或以上，约3log或以上，约4log或以上，约5log或以上，约6log或以上，约7log或以上，约8log或以上，约9log或以上，约10log或以上，1至3log，1至5log，1至8log，1至9log，2至10log，2至5log，2至7log，2log至8log，2至9log，2至10log，3至5log，3至7log，3至8log，3至9log，4至6log，4至8log，4至9log，5至6log，5至7log，5至8log，5至9log，6至7log，6至8log，6至9log，7至8log，7至9log或8至9log。细菌滴度、数目或总负担减少的益处包括，但不限于，感染症状不太严重，感染症状较少和由所述感染所引起的或与之有关的疾病时间缩短。
在某些实施方式中，所述有效量不导致对由病毒感染引起的或与之有关的疾病的完全保护，但是与未治疗的病毒感染受试者相比，导致病毒滴度降低或数目减少。在某些实施方式中，相对于未治疗的病毒感染受试者，所述有效量导致病毒滴度/数目减少0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1,000倍或以上。在一些实施方式中，相对于未治疗的病毒感染受试者，所述有效量导致病毒滴度/数目减少约1log或以上，约2log或以上，约3log或以上，约4log或以上，约5log或以上，约6log或以上，约7log或以上，约8log或以上，约9log或以上，约10log或以上，1至3log，1至5log，1至8log，1至9log，2至10log，2至5log，2至7log，2log至8log，2至9log，2至10log，3至5log，3至7log，3至8log，3至9log，4至6log，4至8log，4至9log，5至6log，5至7log，5至8log，5至9log，6至7log，6至8log，6至9log，7至8log，7至9log或8至9log。病毒滴度、数目或总负担减少的益处包括(但不限于)感染症状不太严重，感染症状较少和由所述感染所引起的或与之有关的疾病时间缩短。
在一些实施方式中，对受试者施用10mg至300mg单位剂量的本文所述的抗感染肽，每天施用1次、2次或3次以治疗微生物、细菌或病毒感染，或由微生物、细菌或病毒感染所引起的或与之有关的疾病。在某些实施方式中，对受试者施用10mg至50mg、10mg至100mg、10mg至150mg、10mg至150mg、10mg至200mg或10mg至250mg单位剂量的本文所述的抗感染肽，每天施用1次、2次或3次以治疗微生物、细菌或病毒感染，或由微生物、细菌或病毒感染所引起的或与之有关的疾病。在一些实施方式中，对受试者施用50mg至100mg、50mg至150mg、50mg至150mg、50mg至200mg、50mg至250mg或50mg至300mg单位剂量的本文所述的抗感染肽，每天施用1次、2次或3次以治疗微生物、细菌或病毒感染，或由微生物、细菌或病毒感染所引起的或与之有关的疾病。在某些实施方式中，对受试者施用100mg至150mg、100mg至150mg、100mg至200mg、100mg至250mg或100mg至300mg单位剂量的本文所述的抗感染肽，每天施用1次、2次或3次以治疗微生物、细菌或病毒感染，或由微生物、细菌或病毒感染所引起的或与之有关的疾病。
在一些实施方式中，对受试者施用10mg至300mg单位剂量的本文所述的抗感染肽，每天施用1次、2次或3次以预防由微生物、细菌或病毒感染所引起的或与之有关的疾病。在某些实施方式中，对受试者施用10mg至50mg、10mg至100mg、10mg至150mg、10mg至150mg、10mg至200mg、10mg至250mg单位剂量的本文所述的抗感染肽，每天施用1次、2次或3次以预防由微生物、细菌或病毒感染所引起的或与之有关的疾病。在一些实施方式中，对受试者施用50mg至100mg、50mg至150mg、50mg至150mg、50mg至200mg、50mg至250mg或50mg至300mg单位剂量的本文所述的抗感染肽，每天施用1次、2次或3次以预防由微生物、细菌或病毒感染所引起的或与之有关的疾病。在某些实施方式中，对受试者施用100mg至150mg、100mg至150mg、100mg至200mg、100mg至250mg或100mg至300mg单位剂量的本文所述抗感染肽，每天施用1次、2次或3次以预防由微生物、细菌或病毒感染所引起的或与之有关的疾病。
5.5.1灭菌和消毒使用
在另一个方面，本文提供了消毒生物表面或生物材料的方法，其包括将所述表面或材料与本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)接触。例如，在具体的实施方式中，本文提供了消毒生物材料的方法，其包括将所述生物流体与本文所述的传染性肽或其组合物接触。示例性生物材料包括：全血；抗凝血全血(AWB)；得自AWB的浓集红细胞；得自AWB的富血小板血浆(PRP)；得自AWB或PRP的血小板浓缩物(PC)；得自AWB或PRP的血浆；分离自血浆并在生理性液体中再悬浮的红血球；分离自血浆并在生理性液体中再悬浮的血小板；其他血液制品；和非血细胞。在一个实例中，消毒生物材料的方法包括将所述抗感染肽或其组合物与生物材料(例如，血液产品)或生物表面接触(例如，合并或混合)一定时间段。在一些实施方式中，将所述抗感染肽固定在固体载体或半固体上并且所述生物材料是在所述固体载体上或中通过的生物流体。在某些实施方式中，所述方法还包括在使用所述生物材料或生物表面之前，用(例如)缓冲漂洗液清洗所述生物材料或生物表面以除去过量的抗感染肽。
在某些实施方式中，将抗感染肽固定在无生命表面(例如，医疗装置)或者生物表面上。可以通过共价或非共价方式固定所述肽。所述固定可以通过接头或直接固定。
在一种实施方式中，将本文所述的抗感染肽中的一个或多个用作美容产品或者个人卫生产品中的添加剂。在另一种实施方式中，将本文所述的抗感染肽中的一个或多个用作软膏剂或乳膏剂中的添加剂。在另一种实施方式中，将本文所述的抗感染肽中的一个或多个用作肥皂的添加剂。
在具体的实施方式中，将本文所述的抗感染肽或其组合物用作功能营养物(例如，饮料增补剂)。在另一种具体的实施方式中，将本文所述的抗感染肽或其组合物用作食品增补剂(例如，乳链菌肽)。在一种具体实施方式中，将所述抗感染肽或包含它的组合物用作护肤产品。
在另一种实施方式中，在细胞培养或其他实验室技术中使用本文所述的抗感染肽或其组合物。
在另一个方面，本文提供了用于消毒无生命对象(例如，无生命表面或者其他非生物表面，如工作台面、医疗器材(例如，医疗装置等))的方法，其包括将所述对象与本文所述的组合物(参见第5.4节)接触。例如，在具体的实施方式中，本文提供了用于消毒无生命对象(例如，无生命表面或者其他非生物表面，如工作台面、医疗器材(例如，医疗装置等))的方法，其包括将所述对象与本文所述的抗感染肽或其组合物接触一定时间段。在某些实施方式中，所述方法还包括在使用所述对象之前，用(例如)缓冲漂洗液清洗所述无生命对象以除去过量的抗感染肽。
医疗装置的实例包括医生、护士、医学技术人员，如采集血液或血液制品的人或者牙科医生所使用的那些(并且照此“医疗装置”表示涵盖“牙科装置”)。术语“医疗装置”旨在表示在检查、清洗动物或人体和/或从动物或人体采集流体或者动物或人体的医学干预中使用的任何工具。这些工具无限制地包括手术器械，如(但不限于)探针、手术刀、夹、钳、针，用于除去唾液或血液的吸引装置，包括所有的吸嘴、密封、管、过滤器、其中的容器和贮器、内窥镜、光学纤维、换能器、电线、手术环和管路内和管路外的管(in-line and out-linetubing)以及在递送至个体前和/或位于个体采集位点的血液或血液制品将通过的过滤器。这些医疗装置还可以用作用于抗感染肽固定化的固体载体，如以上所讨论的。
在一种实施方式中，将本文所述的抗感染肽中的一个或多个用作家庭或工业清洗产品中的添加剂。
还考虑了用于降低水或水容器的微生物污染(如在游泳池、热水浴缸、极可意浴缸、浴室和漩涡浴、空调和加湿器中所发现的)的方法，其包括将所述水或水容器与具有本文所公开的抗感染肽的组合物接触一定时间段。
使用本文所公开的抗感染肽完成消毒的足够的时间段取决于肽和要消毒材料的选择。还可以理解对于消毒有用的抗感染肽的浓度和时间段是相互依赖的。在某些实施方式中，用于消毒的组合物不适合于施用于受试者，例如，人受试者。在其中所述组合物将不施用于受试者的那些实例中，组合物可以包含对于在受试者中的使用将是不可接受的高浓度的抗感染肽浓度，并且所述抗感染肽制剂可以是不适合在受试者中使用的抗感染肽。例如，在其中其不旨在施用于受试者的情况中用作消毒剂的组合物可以包含表面活性剂(例如，去污剂)、防腐剂、溶剂(例如，DMSO)、消毒剂、提供香味的化合物或者通过任何途径不适合施用于受试者，例如，人的其他化合物。
在某些实施方式中，存在于用于消毒的组合物中的抗感染肽的量是足以破坏细菌培养中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的第5.7节或第6节中所述的细菌的膜的量。在一些实施方式中，存在于用于消毒的组合物中的抗感染肽的量是足以破坏细胞培养中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的第5.7节或第6节中所述的病毒包膜的量。在某些实施方式中，存在于用于消毒的组合物中的抗感染肽的量是足以破坏细菌培养中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的第5.7节或第6节中所述的细菌的膜和破坏细胞培养中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的第5.7节中所述的病毒包膜的量。
在某些实施方式中，存在于用于消毒的组合物中的抗感染肽的量是足以杀死细菌培养中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的第5.7节或第6节中所述的细菌的量。在一些实施方式中，存在于用于消毒的组合物中的抗感染肽的量是足以杀死细胞培养中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的第5.7节或第6节中所述的病毒的量。在某些实施方式中，存在于用于消毒的组合物中的抗感染肽的量是足以杀死细菌培养中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的第5.7节或第6节中所述的细菌和杀死细胞培养中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的第5.7节中所述的病毒的量。
将选择所使用的适合的温度以适合于要消毒/灭菌的材料。例如，当所述材料是生物材料，如血液或其组分时，所述血液或其组分可以在20℃或以上、25℃或以上或30℃或以上的温度下与抗感染肽接触。还可以如本文之前所述调节pH和渗透压，只要这些条件与维持要消毒/灭菌的材料的存活力一致。
5.5.2组合疗法
在多个实施方式中，可以将本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或者包含这种抗感染肽的本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)与一种或多种其他疗法(例如，抗病毒剂、抗细菌剂或免疫调节疗法)组合施用于受试者。在一些实施方式中，可以将本文所述的组合物(例如，药物组合物)与一种或多种疗法组合施用于受试者。所述一种或多种其他疗法在感染性疾病(例如，由病毒或细菌感染所引起的或与之有关的疾病)的治疗或预防中可以是有益的或者可以改善与感染性疾病(例如，由病毒或细菌感染所引起的或与之有关的疾病)有关的症状或病况。在一些实施方式中，所述一种或多种其他疗法是止痛药、抗发烧药物治疗或者减轻或帮助呼吸的疗法。如在两种或更多种疗法的施用的背景中所使用的术语“组合”不限制一种疗法相对于另一种疗法施用的顺序。例如，本文所述的抗感染肽或其组合物可以在向受试者施用另一种疗法之前、同时或之后施用。在某些实施方式中，相隔小于5分钟、相隔小于30分钟、相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1至约2小时、相隔约2至约3小时、相隔约3至约4小时、相隔约4至约5小时、相隔约5至约6小时、相隔约6至约7小时、相隔约7至约8小时、相隔约8至约9小时、相隔约9至约10小时、相隔约10至约11小时、相隔约11至约12小时、相隔约12至约18小时、相隔约18至约24小时、相隔约24至约36小时、相隔约36至约48小时、相隔约48至约52小时、相隔约52至约60小时、相隔约60至约72小时、相隔约72至约84小时、相隔约84至约96小时或相隔约96至约120小时施用所述疗法。在具体的实施方式中，在相同患者访问内施用两种或更多种疗法。
在一些实施方式中，组合疗法包括本文所述的两种或更多种不同的抗感染肽(例如，在第5.1节、第5.2节和第6节中)的施用。
5.6患者群体
如本文所使用的，当在本文所述的抗感染肽或其组合物的施用的背景中使用时，术语“受试者”和“患者”可互换地用于表示动物。在某些实施方式中，受试者是鸟。在一些实施方式中，受试者为哺乳动物，其包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、母牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如，猴子、黑猩猩和人)。在某些实施方式中，受试者是非人动物。在一些实施方式中，受试者为农畜(例如，驴、母牛、猪、马、山羊或绵羊)或宠物(例如，狗或猫)。在一些实施方式中，受试者是狗。在某些实施方式中，受试者是猫。在一些实施方式中，受试者是马。在某些实施方式中，动物受试者是母牛。在具体的实施方式中，受试者是人。
在某些实施方式中，可以将本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和第6节)或者本文所述的组合物(参见，例如，第5.4节)施用于未经治疗的受试者(navesubject)，即不具有第5.7节或第6节中所述的感染剂所引起的疾病或者尚未并且目前没有被第5.7节中所述的感染剂所感染的受试者。在一种实施方式中，将本文所述的抗感染肽或组合物施用于具有被第5.7节或第6节中所述的感染剂感染的风险的未经治疗的受试者。还可以将本文所述的抗感染肽或组合物施用于被和/或已被第5.7节或第6节中所述的感染剂感染的受试者。
在某些实施方式中，将本文所述的抗感染肽或组合物施用于已诊断为被第5.7节或第6节中所述的感染剂感染的患者。在一些实施方式中，在显示出症状或者症状变严重之前(例如，在患者需要住院治疗之前)，将本文所述的抗感染肽或组合物施用于被第5.7节或第6节中所述的感染剂感染的患者。
5.7微生物
在一种具体实施方式中，本文所述的微生物是细菌。在一种具体实施方式中，所述细菌是革兰氏阳性的。在具体的实施方式中，所述革兰氏阳性细菌是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，ATCC 29213)、肠球菌(enterococci)、链球菌(streptococci)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(例如，ATCC 14575)、艰难梭菌(Clostridum difficile)(例如，ATCC 700057)或痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)(例如，ATCC 11827)。在一种具体实施方式中，所述肠球菌(enterococci)是粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(例如，ATCC 29212)。在具体的实施方式中，所述链球菌(streptococci)是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(例如，ATCC 49619)。在一种具体实施方式中，所述细菌是革兰氏阴性的。在一种具体实施方式中，所述革兰氏阴性细菌是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(例如，ATCC 27853)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)(例如，ATCC 25238)或流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(例如，ATCC10211)。在一种具体实施方式中，所述细菌为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、万古霉素敏感肠球菌(enterococci)、耐万古霉素肠球菌(enterococci)、青霉素敏感肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、耐青霉素肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、耐环丙沙星细菌或耐克林霉素细菌。
在一种具体实施方式中，所述细菌的平均粒径在50nm至1,200nm之间。在一种具体实施方式中，细菌的平均粒径为50nm至200nm、50nm至300nm、50nm至400nm、50nm至500nm、50nm至600nm、50nm至700nm、50nm至800nm、50nm至900nm、50nm至1,000nm、50nm至1,100nm或50nm至1,200nm之间。在一种具体实施方式中，细菌的平均粒径为50nm至1,200nm、100nm至1,200nm、200nm至1,200nm、300nm至1,200nm、400nm至1,200nm、500nm至1,200nm、600nm至1,200nm、700nm至1,200nm、800nm至1,200nm、900nm至1,200nm或1,000nm至1,200nm之间。在一种具体实施方式中，细菌的平均粒径为50nm至300nm、100nm至500nm、300nm至700nm、500nm至900nm或700nm至1,200nm之间。在一种具体实施方式中，细菌的平均粒径为50nm至2,000nm、100nm至2,000nm、200nm至2,000nm、300nm至2,000nm、400nm至2,000nm、500nm至2,000nm、600nm至2,000nm、700nm至2,000nm、800nm至2,000nm、900nm至2,000nm、1,000nm至2,000nm、1,200nm至2,000nm、1,500nm至2,000nm或1,750nm至2,000nm之间。在一种具体实施方式中，细菌的平均粒径为50nm至300nm、100nm至500nm、300nm至700nm、500nm至900nm或700nm至1,200nm之间。在具体的实施方式中，所述平均粒径为长轴的平均直径。
在具体的实施方式中，本文所述的微生物是病毒。在具体的实施方式中，所述病毒是属于黃病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、反转录病毒科(retroviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)或沙粒病毒科(arenaviridae)的病毒。在具体的实施方式中，所述病毒为登革热病毒(DENV)、基孔肯亚病毒(CHIKV)、埃博拉病毒(EBOV)、人类免疫缺陷性病毒1(HIV-1)或流感病毒。在具体的实施方式中，属于黃病毒科(flaviviridae)的病毒为DENV。在具体的实施方式中，所述DENV为血清1型(DENV-1)。在具体的实施方式中，所述DENV-1为DENV-1PRS41393(对于所述病毒的描述，参见，例如，Warfield,Kelly L.,等人,"Inhibition of endoplasmicreticulum glucosidases is required for in vitro and in vivo dengue antiviralactivity by the iminosugar uv-4."Antiviral research 129(2016):93-98)。在具体的实施方式中，所述DENV为血清2型(DENV-2)。在具体的实施方式中，所述DENV-1为DENV-2新几内亚C株(参见，例如，ATCC No.VR-1584)。在具体的实施方式中，所述DENV为血清3型(DENV-3)。在具体的实施方式中，所述DENV-3为DENV-3H37(参见，例如，GenBank登录号No.M93130)。在具体的实施方式中，所述DENV为血清4型(DENV-4)。在具体的实施方式中，所述DENV-4为DENV-4H24(参见，例如，GenBank登录号No.AY947539)。在具体的实施方式中，属于黃病毒科(flaviviridae)的病毒为黄热病毒(YFV)。在具体的实施方式中，所述YFV为YFV17D(参见，例如，GenBank登录号No.X03700和Rice,Charles M.,等人,"Nucleotidesequence of yellow fever virus:implications for flavivirus gene expressionand evolution."Science 229.4715(1985):726-733)。在具体的实施方式中，属于黃病毒科(flaviviridae)的病毒为日本脑炎病毒(JEV)。在具体的实施方式中，所述JEV为JEV 14-14-2(参见，例如，GenBank登录号No.JN604986)。在具体的实施方式中，属于黃病毒科(flaviviridae)的病毒为寨卡病毒(ZIKV)。在具体的实施方式中，所述ZIKV为ZIKV FSS13025(参见，例如，GenBank登录号No.JN860885和Haddow,Andrew D.,等人,"Geneticcharacterization of Zika virus strains:geographic expansion of the Asianlineage."PLoS Negl Trop Dis 6.2(2012):e1477)。在具体的实施方式中，属于披膜病毒科(togaviridae)的病毒为CHIKV。在具体的实施方式中，CHIKV为CHIKV 181/25(参见，例如，GenBank登录号No.L37661)。在具体的实施方式中，属于披膜病毒科(togaviridae)的病毒为委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)。在具体的实施方式中，所述VEEV为VEEV TC-83(参见，例如，GenBank登录号No.L01443)。
在具体的实施方式中，属于丝状病毒科(filoviridae)的病毒为EBOV或马伯格氏病毒(MARV)。在具体的实施方式中，属于反转录病毒科(retroviridae)的病毒为HIV-1。在具体的实施方式中，所述HIV-1为HIV-1BaL(参见，例如，GenBank登录号：DQ318211)。在具体的实施方式中，所述HIV-1为HIV-1RF(参见，例如，Otto MJ,Garber S,Winslow D,Reid CD,Aldrich P,Jadhav PK,Patterson CE,Hoge CN,Cheng YS.In vitro isolation andidentification of HIV variants with reduced sensitivity to C-2symmetricalinhibitors of HIV-1protease.Proc Natl Acad Sci USA 90:7543-7547,1993)。在具体的实施方式中，属于沙粒病毒科(arenaviridae)的病毒为胡宁病毒。在具体的实施方式中，所述JUNV为JUNV Candid#1。对于胡宁病毒的描述，参见，例如，Emonet,Sebastien F.等人,"Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinantpathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus,thecausative agent of Argentine hemorrhagic fever disease."Journal of virology85.4(2011):1473-1483。在具体的实施方式中，属于布尼亚病毒科(bunyaviridae)的病毒为立谷热病毒(RVFV)。在具体的实施方式中，所述RVFV为RVFV MP12(参见，例如，GenBank登录号No.DQ380208.1)。在具体的实施方式中，属于痘病毒科(poxviridae)的病毒为牛痘病毒(VACV)。在具体的实施方式中，所述VACV为VACV NYCBH(参见，例如，Monath,Thomas P.,等人,"ACAM2000clonal Vero cell culture vaccinia virus(New York City Board ofHealth strain)–a second-generation smallpox vaccine for biological defense."International journal of infectious diseases 8(2004):31-44)。
在具体的实施方式中，所述病毒为平均粒径在25nm至200nm之间的包膜病毒。在具体的实施方式中，所述病毒为平均粒径在25nm至75nm、50nm至100nm、75nm至125nm、100nm至150nm、125nm至175nm或150nm至200nm之间的包膜病毒。在具体的实施方式中，所述病毒为平均粒径在25nm至75nm、25nm至100nm、25nm至125nm、25nm至150nm、25nm至175nm或25nm至200nm之间的包膜病毒。在具体的实施方式中，所述病毒为平均粒径在25nm至200n m、50nm至200nm、75nm至200nm、100nm至200nm、125nm至200nm、150nm至200nm或175nm至200nm之间的包膜病毒。在具体的实施方式中，所述病毒为平均粒径小于25nm、小于50nm、小于75nm、小于100nm、小于125nm、小于150nm或小于175nm的包膜病毒。
在具体的实施方式中，所述细菌为第6节中所述的细菌。
在具体的实施方式中，所述病毒为第6节中所述的病毒。
5.8测定
本文还提供了与本文所述的抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.1节和/或第6节)和/或本文所述的抗感染肽的使用方法(参见，例如，第5.5节)组合使用的测定。对于可以结合本文所述的抗感染肽使用的测定，还参见第6节。在具体的实施方式中，本文所述的抗感染肽具有低EC50、IC50和MIC和高CC50和MHC。
5.8.1 EC50
可以使用本领域技术人员已知的或者本文所述的任何技术(参见，例如，第6节)确定本文所述的抗感染肽的EC50。使用未处理的感染细胞作为0％效力，未感染的细胞作为100％效力的50％效力浓度(EC50)(XLfit 5.4；方程205)。它是4-PL曲线拟合。
5.8.2 MIC
可以使用本领域技术人员已知的或者本文所述的任何技术(参见，例如，第6节)确定本文所述的抗感染肽的MIC。将MIC记录为抑制生物可见生长的药物的最低浓度。它可以目视(例如，在培养期后在琼脂平板上的菌落生长)或者通过吸光度测量确定。
5.8.3治疗指数
可以使用本领域技术人员已知的或者本文所述的任何技术(参见，例如，第6节)确定本文所述的抗感染肽的治疗指数。可以通过CC50/EC50的比值计算本文所述的抗感染肽的治疗指数。对于计算CC50/EC50比值的方法，参见，例如，第6节。在具体的实施方式中，本文所述的抗感染肽的TI大于10。
5.8.4圆二色谱
可以通过圆二色(CD)谱评价本文所述的抗感染肽的螺旋度。可以使用本领域技术人员已知的或者本文所述的任何技术(参见，例如，第6节)实施圆二色谱。
可以使用路径长度1mm的比色皿(例如，石英比色皿)(例如，Hellma的比色皿)，在分光光度计(例如，AVIV 420型分光光度计(AVIV Biomedical,Lakewood,NJ,USA))上实施CD实验。以(例如)0.5nm步长和(例如)4s的平均时间采集光谱数据。例如，在25℃，使用1-nm带宽，从190至260nm记录所有光谱，并对三次扫描求平均值。可以在向50μM肽添加2.5mMPOPC脂质囊泡前后，记录CD光谱。还可以使用相同仪器设置，仅在缓冲液或仅在脂质体中进行基线扫描，并且可以从用肽扫描的各个数据中减去这种贡献。校正的光谱可以用平均残基摩尔椭圆率(Θ)表示，并如下所示计算肽的分数螺旋度(J.D.Morrisett,J.S.David,H.J.Pownall,A.M.Gotto Jr,Interaction of an apolipoprotein(apoLP-alanine)with phosphatidylcholine.Biochemistry 12,1290-1299(1973))：fH＝([Θ]222–3,000)/(-36,000–3000)，其中[Θ]222是222nm时的摩尔椭圆率。
可以如第6节所述实施CD。
5.8.5细胞致病作用(CPE)测定
可以根据技术人员已知的或者本文所述的任何方法(参见，例如，第6节)确定本文所述的抗感染肽的抗病毒活性。
例如，可以通过以特定浓度(例如，10,000个细胞/孔)在板(例如，96-孔板)中接种细胞(例如，Vero细胞)并孵育特定时间段(例如，过夜)来确定CPE。将所述肽在无血清的培养基(例如，MEM)中顺序稀释(例如，2-倍顺序稀释)并将病毒制备为0.1的最终感染复数(MOI)。在感染细胞前，将肽稀释液与病毒孵育特定时间段(例如，在37℃孵育1小时)。添加补充有2％FBS(以及Pen/Strep和L-gln)的培养基(例如，MEM)至1％的最终FBS浓度。在特定时间段(例如，5天)后，将细胞固定并用0.1％结晶紫在5％戊二醛中的溶液染色。在540nm确定光密度并使用未处理的感染细胞作为0％效力，未感染的细胞作为100％效力，将所述光密度用于计算50％效力浓度(EC50)(XLfit 5.4；方程205)。
可以如第6节所述实施CPE测定。
5.8.6 IC50
可以通过技术人员已知的或本文所述的任何方法确定本文所述的抗感染肽的IC50。
例如，将细胞(例如，Vero细胞)以特定浓度(例如，1×105个细胞/孔)接种在板(例如，24-孔板)中并孵育过夜。第二天，制备所述肽的连续稀释(例如，6个两倍连续稀释)。将肽稀释液与病毒孵育特定时间段(例如，在37℃孵育1小时)。在除去接种物后，感染细胞特定时间段(例如，1小时)。加入新鲜培养基并将细胞在(例如)37℃孵育3天。收获上清液，清除细胞碎片，并且可以在-80℃储存。将所述细胞以特定浓度(例如，1×105个细胞)每孔接种在板(例如，24-孔板)中并孵育过夜。第二天，制备所述上清液的连续稀释(例如，4个10倍连续稀释)。将细胞用稀释液感染特定时间段(例如，在37℃感染1小时)。除去接种物，并加入0.8％的甲基纤维素。4-10天后，根据病毒，使用结晶紫分析板的空斑。使用4-PL曲线拟合，基于空斑数目相对于仅病毒样品计算IC50。
可以如第6节所述确定IC50。
5.8.7细胞毒性测定
可以通过技术人员已知的或本文所述的任何方法确定CC50。例如，可以如下所述使用CellTiter-Glo试剂盒(Promega#G7570)在Vero细胞中实施细胞毒性测定：(i)在培养基(例如，MEM)(补充有1％FBS，1×青霉素/链霉素，1×L-gln)中制备抗感染肽的连续稀释；(ii)将一定量的细胞(例如，1×104个Vero细胞(ATCC#CCL-81)接种在板中(例如，黑壁96-孔板)并在无血清的培养基(例如，MEM)中与稀释液孵育特定时间段(例如，在最终浓度的2倍孵育1小时)；(iii)然后，加入补充培养基(例如，MEM)至最终浓度并将细胞孵育特定时间段(例如，3、6或9天)；和(iv)如生产商的规程中所述，通过荧光素酶活性确定细胞存活。
可以对与阴道和直肠隔室有关的细胞实施细胞毒性测定，并且可以通过技术人员已知的或本文所述的任何方法实施细胞毒性测定。例如，将Ca Ski、HEC1A和Caco-2细胞以细胞浓度密度(例如，5×104个细胞/孔)在特定总体积(例如，200μL)中加入至孔(例如，96-孔平底板)中特定时间段(例如，加入化合物之前24小时)；将所述肽浓度连续稀释(例如，以2倍浓度连续稀释)并在除去培养基后，以特定体积(例如，200μL)加入至接种的细胞，重复三次；将所述板孵育特定时间段(例如，在37℃/5％CO2孵育24小时)；孵育后，用无添加剂的培养基(例如，RPMI-1640)清洗细胞3次；然后，对于每个指定细胞系，将特定体积(例如，200微升(200μL))的完全培养基加入所述板并使其在37℃/5％CO2下孵育特定时间段(例如，另外24小时)；和使用四唑染料XTT评价细胞毒性。
使用线性回归分析确定CC50值(细胞存活力50％减少)。
在具体的实施方式中，在人细胞或细胞系中确定CC50。可以用于评价本文所述的抗感染肽的CC50的人细胞系的非限制性实例为CaSki(ATCC CRL-1550)、HEC1A(ATCC HTB-112)、ME180(ATCC HTB-33)和Caco-2(ATCCHTB-37)细胞。在具体的实施方式中，在人周围血单核细胞中确定CC50。在具体的实施方式中，在MT-2细胞中确定CC50，所述细胞可以通过将正常人脐带白细胞与白血病T细胞共培养制备。在具体的实施方式中，在非人细胞中确定CC50。可以用于评价本文所述的抗感染肽的CC50的非人细胞系的非限制性实例为Vero(例如，Vero E6细胞，ATTC CRL-1586)、Madin Darby狗肾细胞(MDCK，ATCC CCL-34)和C6/36(ATCC CRL-1660)细胞。
可以如第6节所述确定CC50。
5.8.8溶血测定
可以根据技术人员已知的或本文所述的任何方法实施本文所述的抗感染肽的溶血活性。可以如第6节所述确定溶血活性。
例如，可以使用从Oren等人修改的方法测量对人红细胞的溶胞活性(Z.Oren,Y.Shai,Selective lysis of bacteria but not mammalian cells by diastereomersof melittin:structure-function study.Biochemistry 36,1826-1835(1997))。具体地，与磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液漂洗和清洗新鲜人红细胞(hRBC)3次，以900g离心10分钟，并且以8.0％(v/v)的红细胞浓度在PBS缓冲液中再悬浮。将在10mM PBS缓冲液中再悬浮的等体积的肽加入至hRBCs以实现总体积100μL，4％(v/v)hRBC的最终浓度，并将其边温和搅拌边在37℃孵育1小时。一旦孵育，将样品在1500g离心5分钟。通过在540nm对上清液的吸光度测量来测量血红蛋白释放。通过将hRBC分别悬浮在PBS和1wt％TritonX中获得0％溶血和100％溶血的对照。根据下式计算溶血百分率：溶血百分比＝[[Abs肽-Abs阴性对照]/[Abs阳性对照-Abs阴性对照]×100％，其中Abs为吸光度值(a.u.)。CC50值定义为50％溶血。
5.8.9细菌存活力测试
可以通过技术人员已知的或本文所述的任何方法确定用本文所述的抗感染肽处理的细菌的存活力。可以如第6节所述确定细菌的存活力。
例如，细菌可以在允许其生长的培养基(例如，MRS培养基(Becton Dickinson目录号#288130))中生长。不同的细菌具有不同的生长要求，并且当评价细菌存活力时，应考虑这些要求。可以制备细菌保存菌种并在溶液(例如，15％的甘油)中在-80℃保存。可以通过在一定体积(例如，1L)的去离子水中溶解一定重量的适当粉剂(例如，55克)来制备肉汤(例如，MRS肉汤)。沸腾肉汤以完全溶解所述粉剂并在特定温度(例如，121℃/17.5psi)灭菌特定时间段(例如，15分钟)。在灭菌后，可以将所述肉汤在使用前在特定温度(例如，4℃)储存。从保存菌种(例如，甘油保存菌种)使用每个菌株的环(例如，10μL环)接种肉汤(例如，MRS肉汤)，并将培养物孵育(例如，好氧或厌氧(例如，使用GasPak EZ厌氧容器系统袋(BD，目录号#260678))特定时间段(例如，在37℃孵育24小时)。使用相同程序，可以将所得培养物用于制备新鲜生长的贮液。最终孵育后，将细菌密度在肉汤(例如，MRS肉汤)中调节至特定水平(例如，0.06)的OD625。制备所述测试试剂的连续稀释(例如，6个连续半对数稀释)并将其以特定体积(例如，100μL)加入至孔(例如，96-孔圆底板)中，重复三次。作为测定对照，以最高测试浓度(例如，1.25U/mL/1.25μg/mL)制备对照试剂(例如，青霉素/链霉素溶液)的连续稀释(例如，6个连续2倍稀释)，并将其加入孔(例如，96-孔圆底板)中，重复三次。将每个具有调节密度(例如，如上所述)的细菌培养物加入至所述板的适当的孔中。如上所述，将所述培养物孵育(例如，好氧或厌氧)特定时间段(例如，24小时)，并且使用分光光度计(例如，Spectramax 340PC384(Molecular Devices))在特定波长(例如，490nm)通过分光光度法评价细菌生长。
5.8.10活菌计数测定和集落形成单位确定
可以使用活菌计数测定以确定集落形成单位(CFU)，从而确定抗感染肽抑制细菌生长的能力。可以通过本领域技术人员已知的或本文所述的任何测定确定CFU数。例如，为了实施活菌计数测定和确定集落形成单位，使从过夜培养接种的细菌在培养基(例如，LB培养基)中生长至对数生长中期。将在10mM磷酸盐缓冲液(PB)中再悬浮的特定浓度的细菌(例如，特定体积(例如，100μL的细菌(1.9×107CFU/mL))与相等体积的肽(例如，10μM)在特定温度(例如，37℃)孵育特定时间段(例如，3小时)。将孵育混合物的连续稀释在琼脂平板(例如，MH琼脂平板)上铺板，然后在特定温度(例如，37℃)孵育特定时间段(例如，过夜)并确定CFU。可以通过将所述细菌和肽在10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再悬浮来分析生理盐(150mMNaCl)的影响。
5.9试剂盒
本文提供了包含本文所提供的填充了本文所述的组合物(例如，药物组合物)的一种或多种成分，如本文所述的一种或多种抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和/或第6节)的一个或多个容器的药物包或试剂盒。在一种实施方式中，试剂盒在一个或多个容器中包含了本文所述的一种或多种抗感染肽(参见，例如，第5.1节、第5.2节和/或第6节)或其组合物(参见，例如，第5.4节)。在具体的实施方式中，所述试剂盒包含使用抗感染肽或其组合物的说明书。在另一种具体实施方式中，试剂盒中包含了以管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府部门所规定的形式的报告书，该报告书反映了用于人施用的生产、使用或销售部门的批准。
在具体的实施方式中，所述试剂盒包含第一药瓶，所述药瓶含有包含200mg至300mg本文所述的抗感染肽的冷冻干燥组合物。
在具体的实施方式中，所述试剂盒包含第一药瓶和第二药瓶，所述第一药瓶含有包含200mg至300mg本文所述的抗感染肽的冷冻干燥组合物，所述第二药瓶含有1mL水溶液。在具体的实施方式中，所述水溶液是无菌水。
在具体的实施方式中，所述试剂盒包含第一药瓶和第二药瓶，所述第一药瓶含有包含200mg至300mg本文所述的抗感染肽的药物组合物，所述第二药瓶含有1mL水溶液。在具体的实施方式中，所述水溶液是无菌水。
可以在上述方法中使用本文所涵盖的试剂盒(参见，例如，第5.5节、第5.7节和第6节)。
6.实施例
6.1实施例1：广谱抗感染肽
表6.抗感染肽的氨基酸序列。
表7.抗感染肽P1(另外称为TSG001)(SEQ ID NO:1)的抗菌谱。MIC表示最小抑菌浓度。
| 生物名称 | MIC(μM) | 治疗指数 |
| 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MSSA) | 2 | 20 |
| 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MSSA) | 4 | 10 |
| 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MSSA) | 2 | 20 |
| 粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(VSE) | 2 | 20 |
| 粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(VRE) | 4 | 10 |
| 粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(VRE) | 2 | 20 |
| 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(PSSP) | 8 | 5 |
| 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(PRSP) | 8 | 5 |
| 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) | 4 | 10 |
| 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) | 8 | 5 |
| 唾液链球菌(Streptococcus salivarius) | 4 | 10 |
| 炭疽芽孢杆菌Sterne株(Bacillus anthracis Sterne) | 1 | 39 |
| 耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) | 16 | 2 |
| 流感嗜血菌(Haemophilus influenzae) | 4 | 10 |
| 卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis) | 1 | 78 |
| 艰难梭菌(Clostridium difficile) | 16 | 2 |
| 痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes) | 8 | 5 |
表8.对BSL-4水平病毒的抗病毒活性。测试了埃博拉病毒和马伯格氏病毒。TSG1和TSG2分别表示TSG001(SEQ ID NO:1)和TSG002(SEQ ID NO:2)肽。所述值是EC50值(μM)。X…X符号是指聚乙二醇化形式。TSG001肽的聚乙二醇化形式保留了可接受水平的高抗病毒活性。
| EBOV | MARV | |
| TSG1(SEQ ID NO:1) | 0.934 | 0.637 |
| TSG2(SEQ ID NO:2) | 1.015 | 0.922 |
| TSG X1X | 13.45 | 14.35 |
| TSG X2X | 29.91 | 44.34 |
表9.对标准人细胞系的细胞毒性。所述值是CC50值(μM)。N/D＝未确定。
表10.对BSL-2水平病毒的抗病毒活性。所述值为EC50值(μM)。1h是指其中病毒与指定肽预孵育1小时的样品。0h是指其中在感染后直接将肽/对照加入至细胞的样品。
1h：病毒与肽预孵育1h
0h：感染后直接加入肽/对照
表11.对BSL-2水平病毒的抗病毒活性。所述值为EC50值(μM)。
1h：病毒与肽预孵育1h
0h：感染后直接加入肽/对照
6.1.1抗感染肽的毒性
为了确定Vero细胞中肽在第3天、第6天和第8天的毒性(表9)，将细胞接种在黑壁96-孔板中并孵育过夜。第二天，制备测试样品的连续稀释。从细胞中吸出生长培养基并加入所述化合物的稀释液。将仅与培养基孵育的细胞用作对照。在第3天、第6天和第8天后，吸出培养基(每天一组板)，并使用Promega的CelltiterGlo试剂盒将细胞裂解以评价ATP含量。将所得荧光素酶发光性定量并使用4-PL曲线拟合用于计算CC50。用作对照的AH肽具有以下氨基酸序列SGSWLRDVWDWICTVLTDFKTWLQSKL(SEQ ID NO:10)。用作对照的C5A肽具有以下氨基酸序列SWLRDIWDWICEVLSDFK(SEQ ID NO:11)。
6.1.2抗感染肽的抗病毒活性
为了确定所述肽的抗病毒活性(表10和表11)，在96-孔板中接种Vero细胞并孵育过夜。第二天，在培养基中制备测试样品的连续稀释。对所有肽评价了两种条件：(1)将病毒与肽稀释液预孵育；和(2)感染后立即加入肽稀释液。如下所述实施预孵育条件：(i)在培养基中制备肽稀释液并在37℃与病毒孵育1小时；(ii)同时孵育对照抑制剂和仅培养基；和(iii)用预孵育混合物感染Vero细胞，并孵育病毒-特异的时间。如下所述实施无预孵育条件：(i)用病毒感染Vero细胞1小时；(ii)在培养基中制备肽稀释液并加入至感染的细胞；(iii)同时孵育对照抑制剂和仅培养基；和(iv)在37℃将细胞孵育病毒-特异的时间。孵育后，然后将细胞固定并用结晶紫/戊二醛溶液染色。确定光密度，并且使用未感染(仅细胞)对照作为0％CPE，无化合物的对照(仅病毒)作为100％CPE，使用OD的4-PL曲线拟合计算EC50。孵育时间如下所示：CHIKV 181/25：3天；DENV-1PRS41393：5天；DENV-2新几内亚C株：5天；DENV-3H87：5天；DENV-4H241：5天；JEV 14-14-2：10天；JUNV Candid#1：8天；LACV H44-71017：4天；RVFV MP12：4天；VACV NYCBH：4天；VEEV TC-83：3天；和YFV 17D：6天。测量细胞毒性的天数如下所示：CHIKV 181/25：3天；DENV-1PRS41393：6天；DENV-2新几内亚C株：6天；DENV-3H87：6天；DENV-4H241：6天；JEV 14-14-2：8天；JUNV Candid#1：8天；LACV H44-71017：3天；RVFV MP12：3天；VACV NYCBH：3天；VEEV TC-83：3天；和YFV 17D：6天。
6.1.3抗感染肽的抗细菌活性
表7提供了抗感染肽P1(SEQ ID NO:1)的抗菌谱的总结。总的来说，抗感染肽P1(在本文中还称为“TSG001”)对包括耐药性分离株在内的革兰氏阳性好氧菌(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肠球菌(enterococci)、链球菌(streptococci)和炭疽芽胞杆菌(B.anthracis))、苛求性革兰氏阴性呼吸病原体(流感嗜血杆菌(H.influenzae)和卡他微球菌(M.catarrhalis))、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)以及所评价的革兰氏阴性厌氧菌(艰难梭菌(C.difficile)和痤疮丙酸杆菌(P.acnes))有活性。抗感染肽P1(SEQ ID NO:1)对革兰氏阴性好氧菌(大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))无活性。
作为干粉提供抗感染肽P1并在-20℃储存。测定当天在水中配制2,560μg/mL的储液。一旦将适当的溶剂加入至比较药物中，则将储液在室温下静置约1小时以自动灭菌，然后等份并在-80℃冷冻。测定当天，从-80℃移除测试板中最高浓度40倍的比较药物的冷冻储液的新鲜等份，融化并用于测试。测试生物先前得自美国模式培养物保藏所(ATCC)和临床实验室。一旦接收，将分离株在适合的条件下在适合于每种生物的琼脂培养基上划线。将含有厌氧生物的板在Bactron II厌氧室(Sheldon Manufacturing Inc.,Cornelius,OR)中在35℃厌氧孵育48小时。将好氧生物在35℃孵育18-24小时。将从这些生长平板上收获的菌落在含有冷冻保护剂的适当培养基中再悬浮。然后，将每个混悬液等份在-80℃冷冻。测定前，将所述生物融化并在适当的琼脂平板上继代培养并如上所述孵育。
作为测试分离株的一部分包含以下质量控制分离株：艰难梭菌(Clostridiumdifficile)ATCC 700057、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC 29212、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853和肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC 49619。对于厌氧生物，在BBL布氏肉汤(BRU；Becton Dickinson；Sparks,MD；批号No.2311123)中进行敏感性测试。BRU肉汤添加了维生素K1(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO；批号No.MKBNS958V)、氯高铁血红素(Sigma-Aldrich；批号No.SLBD8813V)和5％裂解马血(Cleveland Scientific；Bath,OH；批号No.222808)。厌氧生物的琼脂平板为添加的布氏琼脂平板(Remel,Lenexa,KS；批号No.484569)。
对于好氧生物，除流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)外，用于MIC测定的培养基为Mueller-Hinton肉汤(MHB II-Becton Dickinson；批号No.4293655)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)在嗜血菌属(Haemophilus)测试培养基(HTM；Teknova；Hollister,CA；批号No.H580025K1401)中测试。对于链球菌(streptococci)，MHB II添加了3％的裂解马血(Cleveland Scientific；批号No.222808)。除流感嗜血杆菌(H.influenzae)外，用于好氧生物的琼脂平板为胰蛋白酶大豆琼脂加5％绵羊血(Remel；批号No.629110)，流感嗜血杆菌(H.influenzae)在巧克力琼脂(Becton Dickinson，批号No.4260888)上划线。
使用CLSI肉汤微稀释程序，制备MIC测定平板(参见，例如，Jorgensen,James H.,and John D.Turnidge."Susceptibility test methods:dilution and disk diffusionmethods."Manual of Clinical Microbiology,第11版,American Society ofMicrobiology,2015.1253-1273)。将自动液体处理器(Biomek 2000和Biomek FX,BeckmanCoulter,Fullerton CA)用于连续稀释和液体转移。在标准96-孔微稀释板(Costar 3795)的2-12列中所有的孔中填充150μL适当的溶剂。将300μL每种测试药物(40×)加入至所述板的列1的每个孔中。将该板用于制备药物“母板”，其提供了用于重复“子板”的连续药物稀释。将Biomek 2000用于完成母板中通过列11的连续转移。列12的孔中不含药物，其代表生物生长对照孔。如上所述，使用Multidrop 384向子板中加载每孔185μL的测试媒介。在Biomek FX仪上完成子板，其在单一步骤中从母板的每个孔中将5μL药物溶液转移至每个子板的每个相应孔中。
将含有培养基和药物的厌氧菌子板转移到Bactron II厌氧菌室中，并在接种前使其减少1小时。根据CLSI法，制备每个生物的标准化接种物(参见，例如，Jorgensen,JamesH.,and John D.Turnidge."Susceptibility test methods:dilution and diskdiffusion methods."Manual of Clinical Microbiology,第11版,American Society ofMicrobiology,2015.1253-1273)。将混悬液制备为等于0.5McFarland标准品。将混悬液在适合于所述生物的肉汤中另外稀释。在厌氧条件下，手动从低至高药物浓度，用10μL标准化接种物接种厌氧板，从而导致产生了约1×105个集落形成单位/mL。子板的孔最终含有185μL肉汤、5μL药物溶液和10μL细菌接种物。对于每个测定，出于评价药物在测试培养基中的溶解度的目的，制备了一个额外的包含药物溶液(无接种物)的培养基板。将厌氧菌板3个堆叠在一起，用盖覆盖上层板，将其置于BD GasPak EZ厌氧菌容器系统中并在35℃孵育46-48小时。
将好氧菌的接种物分散到按宽度划分的无菌贮器中(Beckman Coulter)并将Biomek 2000用于接种所述板。将子板逆向置于Biomek 2000工作面上，从而从低至高药物浓度进行接种。Biomek 2000将10μL好氧培养标准化接种物递送至每个孔中。这些接种在子板中获得了约5×105个集落形成单位/mL的最终细胞浓度。子板的孔最终含有185μL肉汤、5μL药物溶液和10μL细菌接种物。对于每个测试培养基，出于评价药物在测试培养基中的溶解度的目的，制备了一个额外的包含药物溶液的板(未接种的溶解度对照板)。将需氧菌板3-4个堆叠在一起，用盖覆盖上层板，置于塑料袋中，并且除耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)外在35℃孵育约20小时，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孵育48小时。使用板观察器从底部观察所述微板，并将MIC读取和记录为抑制生物可见生长的最低药物浓度。观察未接种的溶解度对照板的药物沉淀迹象。
6.2实施例2：抗感染肽
6.2.1抗感染肽溶血谱的分析
使用从Shai等人(Oren,Z.；Shai,Y.Biochemistry 1997,36,1826-1835)修改的方法，测量了肽对人红细胞的溶血活性。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗和清洗新鲜人红细胞(hRBCs)3次，以900g离心10分钟，并且将所得的浓集血细胞在PBS中再悬浮至8.0％(v/v)的红细胞浓度。将在10mM磷酸盐缓冲液中再悬浮的等体积的肽加入至hRBCs以实现总体积100μL，4％(v/v)hRBC的最终浓度，并将其边温和搅拌边在37℃孵育1小时。孵育后，将样品在1500g离心5分钟。通过在540nm对上清液的吸光度测量来测量血红蛋白释放。通过分别将hRBC悬浮在PBS和1％Triton X中获得0％溶血和100％溶血的对照。根据下式计算溶血百分比：溶血％＝[Abs肽-Abs阴性对照]/[Abs阳性对照-Abs阴性对照]×100。
最小溶血浓度(MHC)定义为生产10％溶血所需的最小肽浓度。
表12.抗感染肽TSG001-TSG009(SEQ ID NO:1-9)和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)的溶血数据。根据最优选的溶血谱对抗感染肽排名(即相对于溶血谱，排名1为最优选的肽，这是因为它的MHC值最大)。
表12中所提供的数据显示抗感染肽TSG001-TSG005(SEQ ID NO:1-5)具有优良的溶血活性谱。
6.2.2抗感染肽的抗病毒活性分析
(a)材料和方法
在由病毒引起的Vero细胞中的细胞致病作用(CPE)的细胞-基抑制测定中测试了所述肽对测试病毒的抗病毒活性。将细胞以10,000个细胞/孔接种到96-孔板中并孵育过夜。将肽在无血清MEM中2-倍顺序稀释并将病毒制备用于0.1的最终感染复数(MOI)。在感染细胞前，将所述肽稀释液与病毒在37℃孵育1小时。加入添加了2％FBS(以及Pen/Strep和L-gln)的MEM至1％的最终FBS浓度。5天后，将细胞固定并用0.1％结晶紫在5％戊二醛中的溶液染色。在540nm确定光密度并使用未处理的感染细胞作为0％效力，未感染的细胞作为100％效力，将所述光密度用于计算50％效力浓度(EC50)(XLfit 5.4；方程205)。
对于DENV，将DENV(DENV-1(PRS41393)、DENV-2(新几内亚C株)、DENV-3(H87)或DENV-4(H241))在昆虫(C6/36；ATCC#CRL-1660)和Vero细胞之间顺序通过；用于所述实验的DENV来源于在33℃生长的C6/36细胞。
用于所述实验的JEV(14-14-2)、CHIKV(181/25)和YFV(17D)在37℃在Vero细胞中生长。
(b)结果
抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006对DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4、CHIKV和YFV感染显示出抗感染活性(参见下表13-19)。TSG001、TSG002、TSG004和TSG006对JEV显示出抗感染活性(参见下表19)。
表13.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)对DENV-1的抗病毒活性。根据最优选的抗-DENV-1活性对所述抗感染肽排名(即，相对于抗-DENV-1活性，排名1为最优选的肽，因为它具有最低的EC50值)。
表14.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)对DENV-2的抗病毒活性。根据最优选的抗-DENV-2活性对所述抗感染肽排名(即，相对于抗-DENV-1活性，排名1为最优选的肽，因为它具有最低的EC50值)。
| 抗感染肽 | EC50(μM) | 排名 |
| TSG006(SEQ ID NO:6) | 0.67 | 1 |
| TSG002(SEQ ID NO:2) | 1.68 | 2 |
| TSG003(SEQ ID NO:3) | 1.73 | 3 |
| TSG001(SEQ ID NO:1) | 1.95 | 4 |
| TSG004(SEQ ID NO:4) | 6.26 | 5 |
| 比较肽 | EC50(μM) | 排名 |
| AH(SEQ ID NO:10) | 0.18 | N/A |
| C5A(SEQ ID NO:11) | 0.34 | N/A |
表15.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)对DENV-3的抗病毒活性。根据最优选的抗-DENV-3活性对所述抗感染肽排名(即，相对于抗-DENV-3活性，排名1为最优选的肽，因为它具有最低的EC50值)。
| 抗感染肽 | EC50(μM) | 排名 |
| TSG006(SEQ ID NO:6) | 1.49 | 1 |
| TSG003(SEQ ID NO:3) | 1.73 | 2 |
| TSG001(SEQ ID NO:1) | 1.90 | 3 |
| TSG002(SEQ ID NO:2) | 2.65 | 4 |
| TSG004(SEQ ID NO:4) | 6.14 | 5 |
| 比较肽 | EC50(μM) | 排名 |
| C5A(SEQ ID NO:11) | 1.93 | N/A |
| AH(SEQ ID NO:10) | 7.22 | N/A |
表16.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)对DENV-4的抗病毒活性。根据最优选的抗-DENV-4活性对所述抗感染肽排名(即，相对于抗-DENV-4活性，排名1为最优选的肽，因为它具有最低的EC50值)。
| 抗感染肽 | EC50(μM) | 排名 |
| TSG006(SEQ ID NO:6) | 1.50 | 1 |
| TSG001(SEQ ID NO:1) | 1.64 | 2 |
| TSG002(SEQ ID NO:2) | 1.88 | 3 |
| TSG003(SEQ ID NO:3) | 1.91 | 4 |
| TSG004(SEQ ID NO:4) | 7.21 | 5 |
| 比较肽 | EC50(μM) | 排名 |
| C5A(SEQ ID NO:11) | 1.31 | N/A |
| AH(SEQ ID NO:10) | 3.46 | N/A |
表17.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)对CHIKV的抗病毒活性。根据最优选的抗CHIKV活性对所述抗感染肽排名(即，相对于抗CHIKV活性，排名1为最优选的肽，因为它具有最低的EC50值)。
| 抗感染肽 | EC50(μM) | 排名 |
| TSG003(SEQ ID NO:3) | 2.18 | 1 |
| TSG001(SEQ ID NO:1) | 2.52 | 2 |
| TSG002(SEQ ID NO:2) | 3.41 | 3 |
| TSG006(SEQ ID NO:6) | 3.44 | 4 |
| TSG004(SEQ ID NO:4) | 7.69 | 5 |
| 比较肽 | EC50(μM) | 排名 |
| C5A(SEQ ID NO:11) | 3.09 | N/A |
| AH(SEQ ID NO:10) | 6.01 | N/A |
表18.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)对YFV的抗病毒活性。根据最优选的抗YFV活性对所述抗感染肽排名(即，相对于抗YFV活性，排名1为最优选的肽，因为它具有最低的EC50值)。
| 抗感染肽 | EC50(μM) | 排名 |
| TSG006(SEQ ID NO:6) | 0.79 | 1 |
| TSG001(SEQ ID NO:1) | 1.53 | 2 |
| TSG003(SEQ ID NO:3) | 2.14 | 3 |
| TSG002(SEQ ID NO:2) | 2.18 | 4 |
| TSG004(SEQ ID NO:4) | 7.99 | 5 |
| 比较肽 | EC50(μM) | 排名 |
| C5A(SEQ ID NO:11) | 0.29 | N/A |
| AH(SEQ ID NO:10) | 21.72 | N/A |
表19.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)对JEV的抗病毒活性。根据最优选的抗JEV活性对所述抗感染肽排名(即，相对于抗JEV活性，排名1为最优选的肽，因为它具有最低的EC50值)。
| 抗感染肽 | EC50(μM) | 排名 |
| TSG006(SEQ ID NO:6) | 1.63 | 1 |
| TSG001(SEQ ID NO:1) | 2.01 | 2 |
| TSG002(SEQ ID NO:2) | 2.40 | 3 |
| TSG004(SEQ ID NO:4) | 4.68 | 4 |
| TSG003(SEQ ID NO:3) | >18.75 | 5 |
| 比较肽 | EC50(μM) | 排名 |
| C5A(SEQ ID NO:11) | 0.47 | N/A |
| AH(SEQ ID NO:10) | 0.54 | N/A |
6.2.3抗感染肽的细胞毒性谱的分析
使用CellTiter-Glo试剂盒(Promega#G7570)在Vero细胞中确定所述肽的细胞毒性作用。在MEM(补充有1％FBS、1×青霉素/链霉素、1×L-gln)中制备所述肽的连续稀释。将在黑壁96-孔板中接种的1×104个Vero细胞(ATCC#CCL-81)在无血清的MEM中在2倍最终浓度与稀释液孵育1小时。然后，加入补充的MEM至最终浓度，并将细胞分别孵育3、6和9天。如生产商的规程所述，通过荧光素酶活性确定细胞存活。
表20.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)在Vero细胞中的细胞毒性数据。根据最优选的细胞毒性谱对抗感染肽排名(即相对于细胞毒性，排名1为最优选的肽，因为它的CC50值最大)。
| 抗感染肽 | CC50(μM) | 排名 |
| TSG001(SEQ ID NO:1) | 153.39 | 1 |
| TSG004(SEQ ID NO:4) | 114.48 | 2 |
| TSG003(SEQ ID NO:3) | 38.63 | 3 |
| TSG006(SEQ ID NO:6) | 17.45 | 4 |
| TSG002(SEQ ID NO:2) | 16.13 | 5 |
| 比较肽 | EC50(μM) | 排名 |
| AH(SEQ ID NO:10) | 127.46 | N/A |
| C5A(SEQ ID NO:11) | 28.99 | N/A |
表20中提供的数据表明抗感染肽TSG001、TSG003和TSG004具有优良的细胞毒性谱。
6.2.4抗感染肽的治疗指数分析
基于CC50/EC50比值，对每个病毒株确定每个肽的治疗指数。在7个病毒株的组中，计算平均治疗指数以对所述肽排名。在所有情况下，TSG001(SEQID NO:1)具有最好的治疗指数。
表21.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)对指定病毒的治疗指数。
表22.抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006和比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)的平均治疗指数。根据最优选的治疗指数对抗感染肽排名(即相对于治疗指数，排名1为最优选的肽，因为它的治疗指数最大)。
| 抗感染肽 | 平均治疗指数 | 排名 |
| TSG001(SEQ ID NO:1) | 80.79 | 1 |
| TSG004(SEQ ID NO:4) | 17.13 | 2 |
| TSG003(SEQ ID NO:3) | 16.31 | 3 |
| TSG006(SEQ ID NO:6) | 14.18 | 4 |
| TSG002(SEQ ID NO:2) | 7.65 | 5 |
| 比较肽 | 平均治疗指数 | 排名 |
| AH(SEQ ID NO:10) | 153.67* | N/A |
| C5A(SEQ ID NO:11) | 48.29 | N/A |
*不同黄病毒中，AH肽的治疗指数差异较大。作为对比，TSG001(SEQ
ID NO:1)更可靠，其在所有测试的黄病毒中具有稳定的活性。
表21和表22中提供的数据表明抗感染肽TSG001、TSG002、TSG003、TSG004和TSG006具有优良的治疗谱。
6.2.5肽修饰
使用与如上所述的那些相同的方法(参见第6.2.3(a)节)，评价了TSG001和TSG002的聚乙二醇化形式(分别标记为TSGX1X和TSGX2X)对相同病毒组的抗病毒活性。
TSGX1X为NH2-PEG12-酰胺-PEG12-SGSWLRDVWTWLQSKL-NH2(聚乙二醇化的TSG001(SEQ ID NO:1))。
TSGX2X为NH2-PEG12-酰胺-PEG12-GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ IDNO:2)-NH2(聚乙二醇化的TSG002(SEQ ID NO:2))。
使用常规固相肽合成，在N-末端顺序连接两个PEG12构件[Fmoc-PEG12-OH]。所述肽的分子量为每个3160.7Da，其中PEG链为1217.44Da。
在下表23中报告了EC50值，并且其表明TSG00X1X和TSG00X2X保持了对DENV和JEV株的强抗病毒活性，同时对CHKV和YFV的抗病毒活性降低。
表23.抗感染肽的EC50值。
6.2.6对丝状病毒的抗病毒活性
在疾病控制中心的分类系统中，埃博拉病毒(EBOV)和马伯格氏病毒(MARV)是A类生物战试剂。仍然恐惧可以出于生物恐怖目的分离和培养这些病毒。对这两种病毒测试了TSG001和TSG002的聚乙二醇化和非聚乙二醇化形式的抗病毒活性。具体地，在96孔板中以40,000个细胞/孔的密度将Vero E6细胞铺板。将测试试剂与病毒在37℃孵育1小时(最终MOI＝0.1-0.5)。将所述病毒和化合物混合物转移到细胞，并在孵育箱中放置48小时。然后，将感染的细胞在10％缓冲的福尔马林中固定，并且使用Pierce Super Signal ELISA pico化学发光底物试剂盒(Thermo Scientific,Rockford,IL)实施细胞-基ELISA测定以确定病毒抑制％。用PBS清洗细胞3次，并封闭1小时。然后，添加封闭液中的稀释的第一抗体2小时，并用PBS再次清洗细胞3次。然后，添加封闭液中的稀释的第二抗体(HRP-缀合的山羊抗小鼠抗体)1小时。通过在常规酶标仪上读取发光性来测量病毒的量。
在下表24中报告EC50值，并且其表明未聚乙二醇化肽具有有效的抗病毒活性。
表24.抗感染肽对丝状病毒的抗病毒活性
6.3实施例3.聚乙二醇化的抗感染肽对多种病毒的抑制作用
本实施例描述了使用细胞致病作用(CPE)-基EC50测定，两种抗感染肽对以下病毒的抗病毒活性：YFV 17D、VACV NYCBH、VEEV TC-83、LACV H44-71017、RVFV MP12、DENV血清1至4型、JEV 14-14-2、流感A/加利福尼亚株/07/2009病毒(H1N1)和CHIKV 181/25。
为了实施CPE-基EC50测定，将细胞接种到96-孔板中并孵育过夜。第二天，在培养基中制备测试样品的连续稀释。评价了两种条件：(1)将病毒与肽稀释液(TSGX1X和TSGX2X)预孵育；和(2)感染后立即加入肽稀释液(仅TSGX1X)。TSGX1X是指NH2-PEG12-酰胺-PEG12-SGSWLRDVWTWLQSKL-COOH(聚乙二醇化的TSG001(SEQ ID NO:1))。TSGX2X是指NH2-PEG12-酰胺-PEG12-GSSWLRDVWTWLQSKL-COOH(聚乙二醇化的TSG002(SEQ ID NO:2))。对于预孵育条件：(i)在培养基中制备抗感染肽稀释液并与病毒在37℃(对于流感病毒，在35℃)孵育1h；(ii)同时孵育对照抑制剂和仅培养基；和(iii)用预孵育混合物感染细胞并孵育病毒-特异的时间。对于无预孵育条件：(i)用病毒感染细胞1小时；(ii)在培养基中制备肽稀释液并加入至感染的细胞；(iii)同时孵育对照抑制剂和仅培养基；和(iv)将细胞在37℃(对于MDCK细胞，在35℃)孵育病毒-特异的时间。孵育后，然后将细胞固定并用结晶紫/戊二醛溶液染色。确定光密度，并且使用未感染(仅细胞)对照作为0％CPE，无化合物的对照(仅病毒)作为100％CPE，使用OD的4-PL曲线拟合计算EC50。
为了实施细胞毒性测定(CC50)，将细胞接种到黑壁96-孔板中并孵育过夜。第二天，制备抗感染肽的连续稀释。从细胞中吸出生长培养基并加入所述化合物的稀释液。将仅与培养基孵育的细胞用作对照。在第3、6和8(对于MDCK，7)天后，吸出培养基(每天一组板)，并使用Promega的CelltiterGlo试剂盒将细胞裂解以评价ATP含量。将所得荧光素酶发光性定量并使用4-PL曲线拟合用于计算CC50。并非对所有孵育时间评价细胞毒性。表25和26提供了评价细胞毒性的天数的总结。表27提供了CC50数据。表28提供了在预孵育条件下每种肽对每种病毒的效力的总结。表29提供了在预孵育条件下每种肽对每种病毒的效力的总结。
表25.孵育和细胞毒性的时间点。
| 孵育时间 | 细胞毒性日 |
| 3、4 | 3 |
| 5、6、7 | 6 |
| 8+ | 8 |
表26.孵育时间(天)和确定细胞毒性的相应天数。
表27.在多个时间点和指定细胞系中测试每种肽的细胞毒性。值为CC50(μM)。
| 第3天 | 第6天 | 第8天 | 第7天 | |
| Vero | Vero | Vero | MDCK | |
| TSGX1X | 20.88 | 21.17 | 37.43 | >200 |
| TSGX2X | 29.28 | 37.87 | 60.74 | >75 |
| 西多福韦 | >375 | N/D | N/D | N/D |
| 6-氮尿苷 | 3.83 | N/D | N/D | N/D |
| VEEV抑制剂 | >50 | N/D | N/D | N/D |
| 利巴韦林 | 576.6 | >750 | >750 | N/D |
| 扎那米韦 | N/D | N/D | N/D | >375 |
表28.预孵育条件下每种肽对每种病毒的效力总结。所提供的值为EC50(μM)。N/D＝未进行。
总的来说，TSGX1X和TSGX2X对CHIKV、DENV、JEV、RVFV、VACV和YFV的感染有效。
表29.无预孵育条件下每种肽对每种病毒的效力总结。所提供的值为EC50(μM)。N/D＝未进行。
总的来说，TSGX1X对CHIKV、DENV、JEV、RVFV、VACV和YFV的感染有效。
6.4实施例4.测试制品TSG001对HSV-1和甲型流感病毒(H1N1&H3N2)的抗病毒活性 的确定
本实施例描述了CPE测定中抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对以下病毒的抗病毒活性：HSV-1、甲型流感/香港/1/1968病毒(H3N2)、甲型流感/加利福尼亚/07/2009病毒(H1N1)，并且描述了所述肽在Vero细胞中孵育第3天和在MDCK细胞中孵育第6天的细胞毒性。
为了实施CPE-基EC50测定，将细胞接种到96-孔板中并孵育过夜。第二天，在培养基中制备测试制品的连续稀释并将其与病毒在37℃(HSV-1)或35℃(H3N2和H1N1)孵育1小时。同时对照抑制剂和仅培养基。用预孵育的混合物感染Vero细胞，并孵育病毒-特异的时间(HSV-1：3天；H3N2和H1N1：6天)。孵育后，然后将细胞固定并用结晶紫/戊二醛溶液染色。确定光密度，并且使用未感染(仅细胞)对照作为0％CPE，无化合物的对照(仅病毒)作为100％CPE，使用4-PL曲线拟合OD来计算EC50。
为了实施细胞毒性测定，将细胞接种到黑壁96-孔板中并孵育过夜。第二天，制备测试制品的连续稀释。从细胞中吸出生长培养基并加入所述化合物的稀释液。将仅与培养基孵育的细胞用作对照。在第3(Vero)和7(MDCK)天后，吸出培养基，并使用Promega的CelltiterGlo试剂盒将细胞裂解以评价ATP含量。将所得荧光素酶发光性定量并使用4-PL曲线拟合用于计算CC50。
下表30提供了结果。用于每种病毒的EC50和CC50的起始浓度为200μM。抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对HSV-1和甲型流感病毒感染具有高EC50。表30.抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对HSV-1和甲型流感病毒的效力和细胞毒性数据。ND＝未确定
6.5实施例5：抗感染肽对ZIKV的抗病毒活性
6.5.1在第4天通过空斑减数中和测定确定抗感染肽对ZIKV的抗病毒活性
本实施例描述了两种抗感染肽在空斑减数中和测定中对ZIKV的抗病毒活性。本实施例还描述了所述肽在Vero细胞中在第4天的细胞毒性。
将Vero细胞以1×105个细胞/孔接种到24-孔板中并孵育过夜。第二天，从20μM开始，制备所述肽的11个2倍连续稀释。将ZIKV FSS 13025稀释至～150PFU。在37℃，将肽稀释液与病毒孵育1小时。
在37℃，用肽-病毒混合物感染细胞1小时。除去接种物，并加入2mL补充有1％FBS的在培养基中的0.8％(w/v)的甲基纤维素(Fisher Scientific)。4天后，固定板并通过结晶紫染色分析空斑。简要地，用固定液(5％戊二醛(Sigma Aldrich)在DPBS中的溶液)固定细胞，然后用0.1％结晶紫(SigmaAldrich)在固定液中的溶液染色。使用4-PL曲线拟合，基于空斑数目相对于仅病毒样品计算IC50。
在测试细胞中，每种测试的抗感染肽显示出抗ZIKV活性和优良的细胞毒性，特别是L-异构体(表31)。
表31.抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)L-和D-异构体形式对ZIKV的IC50和CC50数据。
| 抗感染肽 | IC50(μM) | CC50(μM) |
| TSG001L-异构体(SEQ ID NO:1) | 1.01 | >20 |
| TSG001D-异构体(SEQ ID NO:1) | 0.49 | 11.65 |
6.5.2在第3天通过得率减少测定确定抗感染肽对ZIKV的抗病毒活性
通过将Vero细胞接种至24-孔板并将其孵育过夜来实施得率减小中和测定。第二天，从20μM开始，制备所述抗感染肽的6个2倍连续稀释。将ZIKVFSS 13025稀释至～150个空斑形成单位(PFU)。在37℃，将测试稀释液与病毒孵育1小时。除去接种物后，将细胞感染1小时。加入新鲜培养基并将细胞在37℃孵育3天。收获上清液，清除细胞碎片，并在-80℃储存。
为了确定病毒滴度，将细胞用所述混合物在37℃感染1小时。除去接种物，并加入0.8％的甲基纤维素。4天后，对板分析空斑。使用4-PL曲线拟合，基于空斑数目相对于仅病毒样品计算IC50。
在测试细胞中，每种测试的抗感染肽显示出抗ZIKV活性和优良的细胞毒性，特别是L-异构体(表32)。
表32.抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)L-和D-异构体形式对ZIKV的IC50和CC50数据。
| IC50(μM) | CC50(μM) | |
| TSG001L-异构体(SEQ ID NO:1) | 1.148 | >20 |
| TSG001D-异构体(SEQ ID NO:1) | 0.646 | 11.65 |
6.5.3抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)的抗ZIKV活性
寨卡病毒(ZIKV)流行病是全球性突发公共卫生事件，并且目前尚无已批准的疗法。设计了有效终止ZIKV感染的膜曲率感应肽。抑制浓度不影响对人体健康重要的哺乳动物或细菌细胞系的存活力。这些结果表明病毒包膜靶向是抗ZIKV的有效抗病毒策略，并且可以在预防和治疗应用中使用。
在本实施例中描述了基于病毒包膜靶向，新设计的对ZIKV具有有效抗病毒活性的短两亲性肽。受赋予膜曲率感应性质的较长的病毒-编码的氨基酸序列的启发(Cho等人,ACS Chemical Biology 4,1061(2009)；Jackman等人,Small 11,2372(2015)；Jackman等人,Journal of the American Chemical Society,(2016))，本发明设计的假定序列(P1：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1))仅具有16个氨基酸，并且比临床批准的37个氨基酸长度的HIV进入抑制剂T-20/恩夫韦地略短(Lalezari等人,New England Journal of Medicine348,2175(2003))(图1A)。圆二色谱实验表明所述膜-结合肽在两性离子脂质囊泡中经历了显著的螺旋诱导(提高27％)，折叠成更有活性的α-螺旋状态(83％的螺旋度)(图1B)。荧光光谱实验表明含色氨酸的肽对两性离子脂质双分子层具有强分配，其对直径小于200nm的高曲率囊泡的脂质-水分配系数为约105(Melo等人,Nature Reviews Microbiology 7,245(2009))，并因此在该范围内的结合-折叠平衡有利于活性结合状态(Krauson等人,Journalof the American Chemical Society 137,16144(2015))(图1C)。另一方面，所述肽显示出可忽略的向较大囊泡的分配，这表明所述肽起到膜曲率感应器的作用并且优选地对高弯曲度膜，如小的包膜病毒具有活性。重要地，在细胞致病作用测定中所述肽对一组蚊传播的包膜病毒的抗病毒效力的功能筛选显示出强抑制。对于所有四种登革热病毒血清型以及日本脑炎、黄热病和基孔肯亚病毒，获得50％细胞致病作用抑制的肽浓度小于3μM(EC50)(表33)。总的来说，所述肽对包膜病毒的广谱抑制活性以及它的膜曲率-选择性提供了评价其对ZIKV的抗病毒活性以及相应作用机制的动力。
表33.抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)的抗病毒活性
| 病毒 | EC50(μM) |
| 登革热-1PRS41393 | 2.04 |
| 登革热-2新几内亚C株 | 1.95 |
| 登革热-3H87 | 1.90 |
| 登革热-4H241 | 1.64 |
| 黄热病17D | 1.53 |
| 日本脑炎SA 14-14-2 | 2.01 |
| 基孔肯亚病毒181/25 | 2.52 |
使用ZIKV FSS13025株进行抗病毒测试，所述病毒株属于亚种系并且分离自柬埔寨2010年病毒爆发中的儿科患者(Haddow等人,PLoS Negl Trop Dis 6,e1477(2012))。实施空斑减数测定(PRNT)以确定所述肽在Vero细胞中对ZIKV感染的中和活性，所述Vero细胞来源于非洲绿猴的肾细胞。所述肽(TSG001，SEQ ID NO:1)以浓度-依赖性关系对ZIKV强烈抑制，并且50％空斑减数中和滴度(PRNT50)值为1.0μM(图2A)。得率减少实验进一步验证了抗病毒活性，并且将病毒得率减少50％的肽浓度(IC50)确定为1.1μM(图2B)。还对Vero细胞和一些哺乳动物细胞系，包括红细胞、上皮细胞和子宫内膜细胞系进行了细胞毒性实验(图2C)。在50μM的最高测试浓度，对所有测试细胞系观察到了最低细胞毒性，这与膜曲率选择性一致并且指示了高治疗指数。此外，还研究了肽处理对有助于阴道微环境天然防御的一些重要乳杆菌细菌菌种存活力的影响(Fernández-Romero等人,Advanced Drug DeliveryReviews 92,27(2015))(图2D)。此外，对测试细菌菌种存在最小毒性，从而支持所述肽非常适合于杀微生物应用。总的来说，所述结果表明相对于相关哺乳动物和细菌细胞系，所述肽选择性靶向ZIKV颗粒。
本研究中的发现首次提供了膜-活性剂可以减弱ZIKV颗粒感染性的证据，并且这种抗病毒活性以高度靶向的方式发生，且对对于人体健康重要的相关哺乳动物和细菌细胞系具有低毒性。尽管人源化抗体和疫苗的开发仍将是ZIKV治疗选择的长期发展的重要目标，但是包膜-靶向试剂代表了在药物混合物中协同作用的补充方法，并且由于病毒包膜来源于宿主细胞膜，因此对于该类药物的耐药性病毒株的出现可能存在更高的屏障。在N-末端连接了24-单元聚乙二醇(PEG)链的肽类似物保留了中和活性，借此支持开发具有更长半衰期和对蛋白水解降解作用具有更大耐受性的治疗有效制剂的潜力(Roberts等人,Advanced Drug Delivery Reviews 64,116(2012))。此外，对于局部杀微生物应用，膜-活性肽受到了不断增长的关注，其对于HIV保护具有长持久性和稳固的离体表现(Denton等人,Journal of virology 85,7582(2011)；Maskiewicz等人,Antimicrobial Agents andChemotherapy 56,3336(2012)；Veazey等人,Antimicrobial Agents and Chemotherapy60,693(2016))，并且在本研究中所表明的所述肽破坏ZIKV包膜的能力将对于这些应用是有用的。
总的来说，本实施例表明通过靶向病毒包膜对ZIKV颗粒的破环代表了对ZIKV感染有效的抑制策略。尽管将理解ZIKV颗粒比其他黄病毒具有更强的热稳定性和更致密的结构，但是已鉴别它们的病毒包膜对膜-活性化合物的处理仍是脆弱的。具有选择性靶向(例如，膜曲率敏感性)的膜-活性进入抑制剂可以成为ZIKV预防措施的重要部分，并对其他出现和再度出现的包膜病毒提供广谱、快速的反应。
6.6实施例6：体外细胞-基测定中TSG001的抗HIV活性和细胞毒性评价
本实施例描述评价了化合物TSG001在人周围血单核细胞(PBMCs)中的HIV-1BaL抑制、HIV-1杀病毒活性和对与阴道和直肠环境有关的细胞以正常阴道菌群乳杆菌的毒性。
6.6.1材料和方法
人PBMCs：从得自Biological Specialty Corporation(Colmar,PA)的血液分离确定对HIV和HBV为血清反应阴性的新鲜PBMCs。
细胞系：在毒性评价中使用的Ca Ski(ATCC CRL-1550)、HEC1A(ATCCHTB-112)、ME180(ATCC HTB-33)和Caco-2(ATCC HTB-37)细胞系得自美国模式培养物保藏所(ATCC)，Manassas,VA。在HIV-1杀病毒测定中使用的MT-2细胞得自AIDS Research and ReferenceProgram(Rockville,MD)。如供应商所建议的增殖细胞并在液氮中保存。
细菌：詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)(ATCC 25258)，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)(ATCC 33820)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(ATCC 11975)得自ATCC。将每个菌株在MRS培养基(Becton Dickinson目录号#288130)中生长，其允许兼性厌氧生长条件，如ATCC所指明的。制备了细菌保藏菌种并将其在15％的甘油中在-80℃保存。
病毒：在HIV-1抑制测定中使用的HIV-1BaL和HIV-1RF得自AIDS Research andReference Program(Rockville,MD)。将病毒保存在-80℃。为了制备浓缩的HIV-1RF，将病毒混合物在4℃以1000RPM离心15分钟。将上清液转移到适合的塑料管中并在4℃以32,500×g(15,000+/-200RPMs)离心90分钟。倒掉上清液并将病毒颗粒在一定量的无酚红的完全RPMI 1640培养基部分中(例如，200分之一)中再悬浮。将所有再悬浮的颗粒混合，以等份置于冷冻药瓶中并在-80℃保存直至使用。
组织培养基：表34中提供了所使用的组织培养基的内容物。
表34.培养基组成
人PBMC的分离：白细胞去除的人供体血液得自Biological SpecialtyCorporation(Colmar,PA)。用达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Lonza，目录号#17-512F)清洗白细胞去除的血细胞两次。清洗后，用DPBS 1:1稀释所述细胞并在50mL尖底离心管中相对于15mL Ficoll-Hypaque密度梯度分层。以600×g将所述管离心30分钟。从所得界面轻轻吸出含有PBMCs的梯度内的条带。通过低速离心，用DPBS清洗分离的细胞3次。在最终清洗后，通过台盼蓝染料拒染对细胞计数，在组织培养基(补充有15％FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、2μg/mL PHA-P(Sigma Aldrich，目录号#L1932)、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640)中以1×106个细胞/毫升再悬浮，并在37℃/5％CO2下孵育48-72小时。在该孵育后，通过离心收集PBMCs并在组织培养基(补充有15％FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和3.6ng/mL重组人IL-2的RPMI 1640)中再悬浮。然后，通过每3天用新鲜的含有IL-2的组织培养基更换一半培养体积来维持培养直至使用。
(a)人PBMCs中HIV-1US/92/727活性的评价
用通过PHA-P诱导增殖72小时的PBMCs进行测定。将来自三个供体的PHA-P刺激的PBMCs混合在一起以最大程度减小当使用来自单个供体的细胞所发生的差异度。通过离心收集PBMCs，在新鲜组织培养基中以1×106个细胞/毫升再悬浮并以50μL/孔在96孔圆底微量滴定板的内孔中铺板。以半对数增量稀释测试化合物，并将100μL含有每个化合物浓度的培养基转移到含有所述细胞的圆底96-孔板的所指定的孔中，重复三次。将所述化合物加入孔中后立即加入50μL预先确定的病毒稀释液。在5％CO2/37℃下培养7天后，如下所述，通过测量组织培养上清液中无细胞HIV-1RT活性定量HIV-1的复制。如下所述，使用四唑染料XTT评价细胞毒性。
反转录酶(RT)活性测定：使用标准放射性掺入聚合测定，测量细胞上清液中的反转录酶活性。以1Ci/mL购买氚化胸苷三磷酸(TTP)，并且每个酶反应使用1μL。分别以0.5mg/mL和1.7单位/mL的浓度从保持在-20℃的储液制备聚rA和寡聚dT。每天制备新鲜的RT反应缓冲液，并且所述缓冲液由125μL 1M EGTA、125μL dH2O、125μL 20％Triton X-100、50μL1M Tris(pH7.4)、50μL 1M DTT和40μL 1M MgCl2组成。对于每个反应，将1μL TTP、4μL dH2O、2.5μL rAdT和2.5μL反应缓冲液混合。将10微升(10μL)该反应混合物与15μL含有病毒的上清液一同置于圆底微量滴定板中。将板在37℃在加湿的孵育箱中孵育60至90分钟。孵育后，将10μL的反应体积点在处于适当板形式的DEAE滤层(Perkin Elmer，目录号#1450-522)上，在柠檬酸(15mM)钠(150mM)缓冲液(Invitrogen，目录号#15557-036)中清洗5次，每次5分钟，在去离子水(ImQuest)中清洗2次，每次1分钟，在70％试剂洒精(Fisher，目录号#L-7168)中清洗2次，每次1分钟，然后风干。将所述干燥的滤层置于塑料套管中，将4mL Opti-Fluor O(Perkin Elmer，目录号#1205-440)闪烁液加入至每个套管。使用Wallac1450Microbeta Trilux液体闪烁计数器定量掺入的放射性。
对于细胞存活力和化合物细胞毒性的XTT染色：通过测量四唑染料XTT((2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯氨基)羰基]-2H-四唑氢氧化物)的减少获得了报告为测试材料的TC50值的细胞毒性。在代谢活性细胞中，线粒体酶NADPH氧化酶将XTT(Sigma-Aldrich，目录号#X4626-500mg)代谢为可溶性甲产物。每天在无添加剂的RPMI-1640中作为贮液制备1mg/mL的XTT溶液。在DPBS中制备0.15mg/mL的吩嗪硫酸甲酯(PMS,Sigma-Aldrich，目录号#P9625-1G)溶液并在不透光的容器中在-20℃物理保存。通过向每mLXTT溶液加入40μL PMS，在使用前立即制备XTT/PMS贮液。将50μL(50μL)XTT/PMS加入至所述板的每个孔中，并将板在37℃，5％CO2中孵育4小时。已根据经验确定4小时孵育在XTT染料减少的线性响应范围内，并对每个测定具有指定的细胞数。用粘合性板盖密封所述板并翻转几次以混合所述可溶性甲瓒产物，通过Molecular Devices SpectraMax Plus 384型96孔板形式分光光度计确定450nm(650nm的参考波长)下的吸光度。
数据分析：Microsoft Excel 2010用于分析和绘制数据图。提供了EC50(病毒复制50％抑制)、TC50(细胞存活力50％减少)和治疗指数(TI，TC50/EC50)。使用线性回归分析确定EC值和TC值。
(b)正常阴道菌群乳杆菌的抑制
通过在1升去离子水中溶解55克粉剂制备MRS肉汤。将肉汤煮沸以完全溶解所述粉剂并在121℃/17.5psi灭菌15分钟。灭菌后，在使用前将所述肉汤在4℃保存。从甘油保存菌种中使用每个菌株(詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)或嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus))10μL环接种MRS肉汤，并使用GasPak EZ厌氧容器系统袋(BD，目录号#260678)在厌氧罐中在37℃厌氧孵育所述培养物24小时。使用相同程序，将所得培养物用于制备新鲜生长的贮液。最终孵育后，将细菌密度在MRS肉汤中调节至OD625为0.06。制备了所述化合物的6个连续半对数稀释，并将其以100μL的体积加入至96-孔圆底板中，重复三次。作为测定对照，分别以1.25U/mL和1.25μg/mL的严格测试制备青霉素/链霉素溶液的6个连续2倍稀释，并将其加入至96-孔圆底板中，重复三次。将如上所述调节密度的每个乳杆菌培养物加入至所述板的适当的孔中。如上所述，将所述培养物厌氧孵育24小时，并使用Spectramax 340PC384(Molecular Devices)在490nm通过分光光度法评价细菌生长。
数据分析：将通过Spectramax酶标仪产生的原始数据转移到电子数据表(Microsoft Excel)中，在此使用线性回归分析来确定导致细菌生长50％减少的测试化合物的浓度。
(c)对阴道和直肠隔室相关的细胞的细胞毒性评价
在加入化合物之前24小时，以5.0×104个细胞/孔的密度，以200μL的总体积，将ME180、Ca Ski、HEC1A和Caco-2细胞加入至96孔平底板中。将每个化合物的6个浓度顺序log(壬苯醇醚-9对照(在本文中称为“N9”))或1:2(TSG001)稀释，并在除去所述培养基后，以200μL的体积加入所述接种的细胞，重复三次。将所述板在37℃/5％CO2下孵育24小时。孵育后，用无添加剂的RPMI-1640清洗细胞三次。然后，对于每个指定的细胞系，将200微升(200μL)完全培养基加入至所述板并使其在37℃/5％CO2下孵育另外24小时。如上所述，使用四唑染料XTT评价细胞毒性。
数据分析：Microsoft Excel 2010用于分析和绘制数据图。提供了TC50(细胞存活力50％减少)。使用线性回归分析确定TC50值。附录中通过数据图示提供了毒性的原始数据，其总结了各个化合物的毒性。
以1×104个细胞/孔的密度，100μL的体积，将MT-2细胞加入至96孔平底板。在RPMI-1640测定培养基中制备化合物TSG001和对照化合物壬苯醇醚-9(N-9)的6个浓度，并且在37℃/5％CO2下，将每个浓度95μL与浓缩的HIV-1RF病毒贮液混合1小时以获得6至7log的病毒活性(5μL 100×病毒贮液)。对于毒性评价，将95μL化合物与5μL RPMI-1640测定培养基混合。对于病毒对照，将95μL培养基与5μL 100×病毒贮液混合。在1小时暴露期结束后，进行6个连续10倍稀释。将100微升(100μL)连续稀释转移到具有预接种的MT2细胞的板中。将每个稀释液铺板，重复四次。将评价化合物毒性的样品铺板，重复两次。在37℃/5％CO2下，将板孵育7天。在显微镜下观察它们并在第3天和第6天对病毒-引起的细胞致病作用和试剂-引起的细胞毒性打分。
6.6.2结果
(a)TSG001在人PBMC中对HIV-1的效力和毒性评价
评价了抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)在人PBMCs中的抗HIV-1活性，并且确定它对嗜CCR-5的HIV-1US/92/727的EC50为3.47μM。TSG001对PBMC具有毒性，其TC50为31.0μM，其所得的治疗指数(TI)为8.93。同时评价AZT，并且AZT的EC50为0.0029μM。表35中提供了这些数据。表35.人PBMCs中TSG001(SEQ ID NO:1)对HIV-1US/92/727的效力和毒性。
| TC50(μM) | EC50(μM) | TI | |
| AZT | >1.0 | 0.00292 | >342.5 |
| TSG001(SEQ ID NO:1) | 31.0 | 3.47 | 8.93 |
(b)阴道和直肠环境的代表性细胞系评价
评价了抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对阴道和直肠环境的代表性细胞的毒性。将所述化合物暴露于细胞24小时，然后在添加后48小时评价细胞的细胞致病作用(CPE)。发现抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对Ca Ski、HEC1A和Caco-2在高达所评价的最高浓度(50μM)是无毒的。抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对ME180细胞有毒，其TC50值为37.0μM。同时评价了壬苯醇醚-9(N-9)，并且在每个细胞系中，在预期的浓度下它是有毒的。表36中提供了这些数据。
表36.阴道和直肠环境的代表性细胞中TSG001(SEQ ID NO:1)的细胞毒性评价。
(c)TSG001对正常阴道菌群乳杆菌的毒性评价
评价了抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对三株乳杆菌，包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、詹氏乳杆菌(L.jensenii)和脆弱乳杆菌(L.crispatus)的毒性，并且发现在高达所评价的最高浓度(50μM)对所有三个菌株是无毒的。同时评价了作为阳性对照的青霉素/链霉素溶液，并且在预期浓度下所述溶液是有活性的。将去离子水用作阴性对照。表37中提供了这些数据。
表37.TSG001(SEQ ID NO:1)对正常菌群乳杆菌的毒性评价
(d)TSG001对MT-2细胞中HIV-1RF的杀病毒活性评价
将6个浓度的抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)与HIV-1RF孵育1小时，然后以连续10倍增量稀释并暴露于MT-2细胞。在暴露于病毒后的第3和6天，用“+”或“-”对细胞中是否存在合胞体打分。在所评价的每个浓度确定TCID50。在第3天，病毒对照的TCID50为5.3。在50μM至0.15μM的浓度，TSG001(SEQ ID NO:1)的TCID50在3.9至5.8的范围内。病毒滴度的最大log减少为50μM时的1.4。在第6天，病毒对照的TCID50为6.5。在50μM至0.15μM的浓度下，TSG001(SEQ ID NO:1)的TCID50在5.0至>6.6的范围内。病毒滴度的最大log减少为50μM时的1.5log减少。同时评价N-9，并且N-9具有如所期望的病毒滴度减少水平。表38中提供了这些数据。
表38.TSG001(SEQ ID NO:1)在MT-2细胞中的HIV-1RF杀病毒活性评价
6.6.3结论
发现抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)在人PBMCs中具有活性，当在杀病毒测定中对HIV-1RF评价时，其EC50值为3.47μM，并且在50μM时获得病毒滴度的1.5Log减少。在比所限定的EC50值高约10-倍的浓度，抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对PBMCs和ME180细胞有毒。在高达50μM的所评价的最高浓度下，TSG001对上皮细胞Ca Ski、HEC1A和Caco-2或者对正常阴道菌群乳杆菌无毒。
6.7实施例7：TSG001、环丙沙星和克林霉素对所评价的细菌的体外活性
本实施例描述了抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对多个细菌种和株的抗细菌活性。
6.7.1材料和方法
以下显示了有关各个药物批次的具体信息。一旦将适当的溶剂加入至比较药物中，则将储液在室温下静置约1小时以自动灭菌，然后等份并在-80℃冷冻。测定当天，从-80℃移除测试板中最高浓度40倍的比较药物的冷冻储液的新鲜等份，融化并用于测试。
表39.本实施例中使用的化合物。
(a)生物
测试生物得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)和临床实验室。一旦接收，将分离株在适合的条件下在适合于每种生物的琼脂培养基上划线。将含有厌氧生物的板在Bactron II厌氧室(Sheldon Manufacturing Inc.,Cornelius,OR)中在35℃厌氧孵育48小时。将好氧生物在35℃孵育18-24小时。将从这些生长平板上收获的菌落在含有冷冻保护剂的适当培养基中再悬浮。然后，将每个混悬液等份在-80℃冷冻。测定前，将所述生物融化并在适当的琼脂平板上继代培养并如上所述孵育。
作为测试分离株的一部分包含了以下质量控制分离株：艰难梭菌(Clostridiumdifficile)ATCC 700057、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC 29212、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853和肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC 49619。
(b)测试培养基
对于厌氧生物，在BBL布氏肉汤(BRU；Becton Dickinson；Sparks,MD；批号No.2311123)中进行敏感性测试。BRU肉汤添加了维生素K1(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO；批号No.MKBNS958V)、氯高铁血红素(Sigma-Aldrich；批号No.SLBD8813V)和5％裂解马血(Cleveland Scientific；Bath,OH；批号No.222808)。厌氧生物的琼脂平板为添加的布氏琼脂平板(Remel,Lenexa,KS；批号No.484569)。
对于好氧生物，除流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)外，用于MIC测定的培养基为Mueller-Hinton肉汤(MHB II-Becton Dickinson；批号No.4293655)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)在嗜血菌属(Haemophilus)测试培养基(HTM；Teknova；Hollister,CA；批号No.H580025K1401)中测试。对于链球菌(streptococci)，MHB II添加了3％的裂解马血(Cleveland Scientific；批号No.222808)。除流感嗜血杆菌(H.influenzae)外，用于好氧生物的琼脂平板为胰蛋白酶大豆琼脂加5％绵羊血(Remel；批号No.629110)，流感嗜血杆菌(H.influenzae)在巧克力琼脂(Becton Dickinson，批号No.4260888)上划线。
(c)MIC测定方法
使用CLSI肉汤微稀释程序，制备MIC测定平板(参见，例如，Jorgensen,James H.,and John D.Turnidge."Susceptibility test methods:dilution and disk diffusionmethods."Manual of Clinical Microbiology,第11版,American Society ofMicrobiology,2015.1253-1273)。自动液体处理器(Biomek 2000and Biomek FX,BeckmanCoulter,Fullerton CA)用于进行连续稀释和液体转移。在标准96-孔微稀释板(Costar3795)的2-12列中所有的孔中填充150μL适当的溶剂。将300μL每种测试药物(40×)加入至所述板的列1的每个孔中。将该板用于制备药物“母板”，其提供了用于重复“子板”的连续药物稀释。将Biomek 2000用于完成母板中通过列11的连续转移。列12的孔中不含药物，其代表生物生长对照孔。
如上所述，使用Multidrop 384向子板中加载每孔185μL的测试培养基。在BiomekFX仪上完成子板，其在单一步骤中从母板的每个孔中将5μL药物溶液转移至每个子板的每个相应孔中。
将含有培养基和药物的厌氧菌子板转移到Bactron II厌氧菌室中，并在接种前使其减少1小时。
根据CLSI法，制备每个生物的标准化接种物(参见，例如，Jorgensen,James H.和John D.Turnidge."Susceptibility test methods:dilution and disk diffusionmethods."Manual of Clinical Microbiology,第11版,American Society ofMicrobiology,2015.1253-1273)。将混悬液制备为等于0.5McFarland标准品。将混悬液在适合于所述生物的肉汤中另外稀释。在厌氧条件下，手动从低至高药物浓度，用10μL标准化接种物接种厌氧板，从而导致产生了约1×105个集落形成单位/mL。子板的孔最终含有185μL肉汤、5μL药物溶液和10μL细菌接种物。对于每个测定，出于评价药物在测试培养基中的溶解度的目的，制备了一个额外的包含药物溶液(无接种物)的培养基板。将厌氧菌板3个堆叠在一起，用盖覆盖上层板，将其置于BD GasPak EZ厌氧菌容器系统中并在35℃孵育46-48小时。
将好氧菌的接种物分散到按宽度划分的无菌贮器中(Beckman Coulter)并将Biomek 2000用于接种所述板。将子板逆向置于Biomek 2000工作面上，从而从低至高药物浓度进行接种。Biomek 2000将10μL好氧培养标准化接种物递送至每个孔中。这些接种在子板中获得了约5×105个集落形成单位/mL的最终细胞浓度。子板的孔最终含有185μL肉汤、5μL药物溶液和10μL细菌接种物。对于每个测试培养基，出于评价药物在测试培养基中的溶解度的目的，制备了一个额外的包含药物溶液的板(未接种的溶解度对照板)。将需氧菌板3-4个堆叠在一起，用盖覆盖上层板，置于塑料袋中，并且除耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)外在35℃孵育约20小时，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孵育48小时。值得注意的，将相同的金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 29213的接种物用于接种含有MHB II的板，并且MHB II补充有10％人血清。
使用板观察器从底部观察所述微板，并将MIC读取和记录为抑制生物可见生长的最低药物浓度。观察未接种的溶解度对照板的药物沉淀迹象。
6.7.2结果
表40-42显示了体外敏感性测试结果。对质量控制生物和它们各自的质量控制抗生素所获得的MIC值的评价显示它们均在CLSI所建立的范围内(参见，例如，Jorgensen,James H.,和John D.Turnidge."Susceptibility test methods:dilution and diskdiffusion methods."Manual of Clinical Microbiology,第11版,American Society ofMicrobiology,2015.1253-1273)。对于克林霉素和艰难梭菌(C.difficile)ATCC 700057，肉汤微稀释MIC是低于琼脂稀释测试的可接受范围的一种稀释。这种沉淀不防碍解释MIC终点，但是在其中观察到沉淀的情况下，这些孔中药物的溶解浓度可能受影响。
抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对所评价的好氧革兰氏阳性细菌分离株(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肠球菌(enterococci)、链球菌(streptococci)和炭疽芽胞杆菌(B.anthracis))具有活性，其MIC在2-16μg/mL的范围内。对MRSA、VRE、PRSP以及耐环丙沙星和耐克林霉素分离株维持了这种活性。
对所评价的好氧革兰氏阴性分离株(大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、卡他微球菌(M.catarrhalis)和流感嗜血杆菌(H.influenzae))，抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)仅对苛求分离株有活性，其对卡他微球菌(M.catarrhalis)的MIC为1μg/mL，对流感嗜血杆菌(H.influenzae)的MIC为8μg/mL。抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))无活性(MIC>64μg/mL)。
对所测试的单独的分枝杆菌(mycobacterium)分离株(耻垢分枝杆菌(M.smegmatis))，对抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)观察到一些活性，其MIC为32μg/mL。抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)还对所评价的革兰氏阳性厌氧分离株艰难梭菌(C.difficile)(MIC为32μg/mL)和痤疮丙酸杆菌(P.acnes)(MIC为16μg/mL)有活性。
表40.抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)、环丙沙星和克林霉素对所评价的细菌的体外活性。MSSA是指甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。MRSA是指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。VSE是指万古霉素敏感肠球菌(enterococci)VRE是指耐万古霉素肠球菌(enterococci)。PSSP是指青霉素敏感肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
表41.抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)、环丙沙星和克林霉素对所评价的细菌的体外活性。PRSP是指耐青霉素肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
1孵育48小时后确定MIC
表42.抗感染肽P1(SEQ ID NO:1)、环丙沙星和克林霉素对所评价的细菌的体外活性。
1孵育48小时后确定MIC
2在括号中显示了克林霉素的琼脂稀释CLSI QC范围
总的来说，抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对包括耐药性分离株在内的革兰氏阳性好氧菌(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肠球菌(enterococci)、链球菌(streptococci)和炭疽芽胞杆菌(B.anthracis))、苛求性革兰氏阴性呼吸病原体(流感嗜血杆菌(H.influenzae)和卡他微球菌(M.catarrhalis))、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)以及所评价的革兰氏阴性厌氧菌(艰难梭菌(C.difficile)和痤疮丙酸杆菌(P.acnes))有活性。抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)对革兰氏阴性好氧菌(大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))无活性。
6.8实施例8：抗感染肽对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗细菌活 性
测试了抗感染肽TSG001-TSG009(SEQ ID NOS:1-9)以及比较肽AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)对多种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗细菌活性(表43)。出于该目的，将金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC 25923)(美国模式培养物保藏所，Manassas,VA)在LB肉汤中在37℃培养过夜。将过夜培养的混悬液在新鲜LB肉汤中接种并在好氧条件下培养直至OD600的值达到约0.5(指数生长期)。通过在1,500×g离心10分钟收获细菌细胞，用PB或PBS清洗3次，在用于实验的适当溶液中再悬浮。将细菌细胞混悬液稀释至OD600的值为0.1，对于金黄色葡萄球菌(S.aureus)，其对应于1×107CFU/mL。在实验之前，然后将细菌细胞用PB或PBS 1:10稀释。在PB或PBS溶液中确定测试化合物的最小抑菌浓度(MIC)值。对于PB和PBS的情况，通过MH琼脂平板法确定MIC。首先，在96孔微量滴定板中进行测试化合物溶液在PB或PBS中的两倍连续稀释。所述测试化合物的浓度范围在0.3μM至100μM之间，其体积为50μL。然后，将50μL在PB或PBS中混悬的金黄色葡萄球菌(S.aureus)(1×106CFU/mL)加入至每个孔中，其最终细胞密度为5×105CFU/mL。将样品在37℃孵育3小时，然后在MH琼脂平板上划线。将所述板在37℃孵育过夜，并基于抑制菌落生长的最低测试化合物浓度记录MIC值。PB定义为10mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2，PBS为常规磷酸盐缓冲盐水。
基于MIC值，所述抗感染肽是有效的抗菌剂，而AH和C5A肽未显示出抗细菌活性。尽管大部分膜-活性肽对盐条件敏感，但是所述抗感染肽在PB和PBS条件中具有相同的MIC值。
表43.对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗细菌活性。MIC是指平均抑制浓度(μM)。
6.9实施例9：抗感染肽的圆二色谱
抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)的圆二色谱实验表明所述膜-结合肽在两性离子脂质囊泡中经历了显著的螺旋诱导(提高27％)，折叠成更有活性的α-螺旋状态(83％的螺旋度)(图1B)。作为对比，AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)肽的CD测量缺少膜-结合状态的螺旋诱导。AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)肽两者在缓冲液和50％TFE中均具有高分数螺旋度(在两种环境中≈87％)。与抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)相反，AH(SEQID NO:10)肽维持了类似的高螺旋度性质(≈84％)，而C5A(SEQ ID NO:11)肽显示螺旋度显著减少(≈64％)。C5A(SEQ ID NO:11)肽中结构的变化与上述荧光光谱测量一致，其表示脂膜调控C5A肽的二级结构。重要地，本研究中CD测量清楚显示膜结合对抗感染肽TSG001(SEQID NO:1)、AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)肽的二级结构具有略微不同的作用。在这三种肽中，仅对抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)观察到最有利的螺旋诱导作用。
螺旋诱导排名(较大的正螺旋诱导对膜活性是优选的)：(1)抗感染肽TSG001(SEQID NO:1)：+27％螺旋诱导；(2)AH(SEQ ID NO:10)：-3％螺旋诱导；和(3)C5A(SEQ ID NO:11)：-23％螺旋诱导。
方法：使用1mm路径长度的石英比色皿(Hellma)，在AVIV 420型分光光度计(AVIVBiomedical,Lakewood,NJ,USA)上进行CD实验。以0.5nm步长，4s的平均时间采集光谱数据。在25℃，使用1-nm带宽，从190至260nm记录所有光谱，并对三次扫描求平均值。在将2.5mM1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)脂质囊泡加入至50μM肽之前和之后，记录CD光谱。还使用相同仪器设置，仅在缓冲液或仅在脂质体中进行基线扫描，并且从用肽扫描的各个数据中减去这种贡献。校正的光谱用平均残基摩尔椭圆率(Θ)表示，并如下所示计算肽的分数螺旋度：fH＝([Θ]222–3,000)/(-36,000–3000)，其中[Θ]222是222nm时的摩尔椭圆率。
6.10实施例10：抗感染肽的膜分配数据
为了确定囊泡尺寸对膜分配的影响，实施了内源色氨酸荧光光谱以计算作为囊泡尺寸函数的每种肽的摩尔分数分配系数。对每种肽，作为囊泡尺寸的函数提供摩尔分数分配系数Kx(平均值±标准偏差，n＝3次独立实验)。在由于最小分配而无法确定分配系数的情况下，ND表示未确定。囊泡尺寸报告为平均囊泡直径(dia.)，其通过对囊泡混悬液的动态光散射测量确定。
表44.膜分配系数(Kx×105)
方法：在Cary Eclipse荧光分光光度计(Varian,Inc.,Australia)上实施荧光光谱实验。使用0.1cm路径长度比色皿和5mm狭缝宽度进行所有测量。使用280nm的激发光并在300至400nm之间扫描发射光来测量色氨酸荧光。使用用单层POPC脂质囊泡滴定高达150μM(10μM阶梯递增)的在10mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2中的5μM肽测量发射光谱。对于每个滴定点，通过缓冲液中所述肽的荧光强度(I0)将所述肽在最大发射波长(λmax)的荧光强度(I)归一化。基于实验数据对以下方程：I/I0＝1+(Imax–1)(Kx[L]/Kx[L]+[W])的拟合确定摩尔分数分配系数(Kx)，其中Imax是肽-脂质结合饱和之后的强度，[L]是摩尔脂质浓度，[W]是水的摩尔浓度(55.3M)。
与AH(SEQ ID NO:10)肽类似，抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)、TSG002(SEQ IDNO:2)、TSG004(SEQ ID NO:4)和TSG005(SEQ ID NO:5)对膜曲率敏感。
与C5A(SEQ ID NO:11)肽类似，抗感染肽TSG003(SEQ ID NO:3)和TSG006(SEQ IDNO:6)对膜曲率不敏感。
基于定量值，抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)保持了与AH(SEQ ID NO:10)肽最类似的膜曲率敏感性质。具体地，荧光光谱实验表明含有色氨酸的抗感染肽TSG001(SEQ IDNO:1)肽向两性离子脂质双分子层强分配，对于直径小于200nm的高曲率囊泡，其脂质-水分配常数为约105，并因此在该范围内的结合-折叠平衡有利于活性结合状态。另一方面，所述肽显示出可忽略的向较大囊泡的分配，这表明所述肽起到膜曲率感应器的作用并且优选地对高弯曲度膜，如小的包膜病毒具有活性。
6.11实施例11：抗感染肽的石英晶体微天平-耗散(QCM-D)测量
为了表征所述肽的囊泡-破坏能力，使用了包含在金表面上吸附的脂质囊泡层的表面-敏感性测量方法。通过挤出法制备了具有受控膜组成(50mol％1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱和50mol％胆固醇)以及尺寸(如通过动态光散射测量所确定的，≈80nm的直径)的囊泡，然后将其沉积在基底上(图3A和图3B)。所述囊泡吸附并形成密堆积层。QCM-D技术是测量振动氧化钛-涂覆的石英晶体的共振频率和能量耗散的声传感器技术。当吸附质附接在金-涂覆的传感器表面上时，存在石英晶体的频率(Δf)和能量耗散(ΔD)改变，可以作为时间函数追踪这些改变，并且它们分别对应于吸附质的声学质量和粘弹性质。
首先，检验抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)、AH(SEQ ID NO:10)和C5A(SEQ ID NO:11)与表面-吸附的由DOPC脂质和胆固醇组成的囊泡之间的相互作用。将挤出的囊泡(≈80nm直径)在金基底上沉积至几乎饱和。相应的QCM-D吸附动力学与紧密堆积的吸附的囊泡层的形成一致(Δf≈180Hz和ΔD≈10×10-6)。然后，在t＝40分钟加入所述肽(参见，图3A和图3B中的箭头)，并导致囊泡破裂。通过所吸附的囊泡层的结构转变解释囊泡破裂程度，如通过净Δf正改变和ΔD负改变所表示的。
破裂时间定义为从初始肽附接直至大部分吸附的囊泡破裂的时间段(与基线相比，Δf>70Hz)。破裂时间报告为平均值±标准偏差，n＝3次独立实验。基于破裂时间，根据囊泡破裂速度对所述肽排名，其中抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)明显显示出最快速的囊泡破裂，这与其螺旋诱导一致。
相对于它们囊泡破裂速度排名，对所述肽排名(由于模拟病毒包膜组成的小脂质囊泡较快速破裂，1是最优选的)：(1)抗感染肽TSG001(SEQ ID NO:1)：5.9±2.3min；(2)AH(SEQ ID NO:10)：14.7±3.5min；和(3)C5A(SEQ ID NO:11)：15.9±2.8min。
方法：在Q-Sense E4仪(Biolin Scientific,Gothenburg,Sweden)上进行QCM-D实验。在一些泛音时收集实验数据(n＝3、5、7、9)，并且作为时间函数监控频率(Δf)和能量耗散(ΔD)变化。所报告的测量值来自于第三泛音(n＝3)并因此归一化(Δfn＝3/3)。在具有金涂层的QCM-D传感器晶体(Biolin Scientific)上进行所有测量。用1％w/w十二烷基硫酸钠(SDS)溶液清洗基底，然后用水和乙醇顺序漂洗。在用氮气气流温和干燥后，在实验前立即对所述晶体进行氧等离子体处理(Harrick Plasma,Ithaca,NY,USA)～1分钟。
6.12肽的溶解度
在蒸馏水中评价肽的溶解度。将冷冻干燥的肽在蒸馏水中复原为2mg/mL的浓度。通过所述肽的质量浓度和摩尔质量确定理论摩尔质量。通过280nm吸光度测量确定实验摩尔质量。表45中描述了TSG001、AH和C5A的结果。基本上，C5A不易溶于水并且需要DMSO增溶。
表45
在本说明书中引用的所有专利公开、专利和专利申请如具体并且单独指明每个专利公开或专利申请作为参考并入的一样作为参考并入本文。尽管出于使理解清楚的目的已经通过例证说明和实施例详细说明了上述发明，对本领域那些技术人员显而易见的是根据本发明的教导在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下可以进行某些改变和修饰。
序列表
<110> 南洋理工大学（Nanyang Technological University）
<120> 广谱抗感染肽
<130> 14312-001-228
<140> TBA
<141> 与此同日
<150> 62/184,354
<151> 2015-06-25
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽 - TSG001
<400> 1
Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽 - TSG002
<400> 2
Gly Ser Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽 - TSG003
<400> 3
Gly Ser Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Thr Trp Leu Gln Ser Ala Leu
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽 - TSG004
<400> 4
Gly Ser Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Thr Lys Leu Gln Ser Trp Leu
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽 - TSG005
<400> 5
Gly Ser Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Thr Lys Leu Gln Ser Trp Leu
1 5 10 15
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽 - TSG006
<400> 6
Gly Ser Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Thr Ala Leu Gln Ser Trp Leu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽 - TSG007
<400> 7
Gly Ser Ser Trp Leu Arg Asp Ile Leu Thr Ala Leu Gln Ser Leu Leu
1 5 10 15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽 - TSG008
<400> 8
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<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽 - TSG009
<400> 9
Ala Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Leu Thr Leu Leu Gln Ser Ala Leu
1 5 10 15
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AH肽
<400> 10
Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu
1 5 10 15
Thr Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu
20 25
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C5A肽
<400> 11
Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp
1 5 10 15
Phe Lys
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ser、Gly或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ser或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val或Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp、Lys、Ala或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Lys、Leu或Ala
<400> 12
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ser或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Lys或Ala
<400> 13
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ser或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ser或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val或Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp或Ala
<220>
<221> misc_feature
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<400> 15
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ser或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val或Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Lys或Ala
<400> 16
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ser或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val或Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Lys或Ala
<400> 17
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Gly、Pro或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ala、Ser、Gly或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Tyr或Phe
<400> 18
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ser或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val或Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp、Lys或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp或Lys
<400> 19
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C5A肽的C-末端
<400> 20
Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu
1 5
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa为小氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为具有脂肪族侧链的疏水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为疏水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa为亲水性氨基酸或极性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa为亲水性氨基酸或极性氨基酸
<400> 21
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa为小氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为具有脂肪族侧链的疏水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为疏水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa为亲水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa为亲水性氨基酸
<400> 22
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为疏水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
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<400> 23
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa为小氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为具有脂肪族侧链的疏水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为疏水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa为亲水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa为极性氨基酸
<400> 24
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa为小氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为具有脂肪族侧链的疏水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为疏水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa为极性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa为亲水性氨基酸
<400> 25
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa为丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸的保守氨基酸置换
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa为色氨酸、赖氨酸、丙氨酸或亮氨酸的保守氨基酸置换
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa为色氨酸、赖氨酸、丙氨酸或亮氨酸的保守氨基酸置换
<400> 26
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr、His、Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<400> 27
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr、His、Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Lys、Tyr、Arg、His、Asn、Gln、Ser或Thr
<400> 28
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr、His、Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Ile、Leu、Val或Thr
<400> 29
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr、His、Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Lys、Tyr、Arg、His、Asn、Gln、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<400> 30
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr、His、Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Lys、Tyr、Arg、His、Asn、Gln、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Lys、Tyr、Arg、His、Asn、Gln、Ser或Thr
<400> 31
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr、His、Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Lys、Tyr、Arg、His、Asn、Gln、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Ile、Leu、Val或Thr
<400> 32
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr、His、Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Ile、Leu、Val或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<400> 33
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr、His、Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Ile、Leu、Val或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Lys、Tyr、Trp、Arg、His、Asn、Gln、Ser或Thr
<400> 34
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr、His、Ala、Ile、Leu、Pro或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Ile、Leu、Val或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Ile、Leu、Val或Thr
<400> 35
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Gly、Pro或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp、Tyr或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Lys、Arg、Gln、Glu或Asn
<400> 36
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Ser、Thr、Ala或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Gly、Pro或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Trp、Tyr或Phe
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Lys、Arg、Gln、Glu或Asn
<400> 37
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa = Gly、Pro或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Lys、Arg、Gln、Glu或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Tyr或Phe
<400> 38
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Ser、Thr、Ala或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Gly、Pro或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Lys、Arg、Gln、Glu或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Tyr或Phe
<400> 39
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
<210> 40
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗感染肽共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Ser、Thr、Ala或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Gly、Pro或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Val、Ile、Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp、Phe、Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ala、Ser、Gly或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Trp、Tyr或Phe
<400> 40
Xaa Xaa Ser Trp Leu Arg Asp Xaa Xaa Thr Xaa Leu Gln Ser Xaa Leu
1 5 10 15
Claims (122)
1.长度为16至26个氨基酸残基的肽，其包含以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ IDNO:12)。
2.根据权利要求1所述的肽，其包含以下氨基酸序列：
a.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)；
b.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)；
c.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)；
d.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)；
e.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)；或
f.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
3.根据权利要求1所述的肽，其包含以下氨基酸序列：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)、GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
4.根据权利要求1所述的肽，其包含以下氨基酸序列：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)或GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)。
5.根据权利要求1所述的肽，其包含以下氨基酸序列：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
6.由以下氨基酸序列组成的肽：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ ID NO:12)。
7.根据权利要求6所述的肽，其由以下氨基酸序列组成：
a.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)；
b.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)；
c.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)；
d.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)；
e.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)；或
f.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
8.根据权利要求6所述的肽，其由以下氨基酸序列组成：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ IDNO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)、GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
9.根据权利要求6所述的肽，其包含以下氨基酸序列：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)或GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)。
10.根据权利要求6所述的肽，其由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ IDNO:5)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸残基是L氨基酸。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸残基是D氨基酸。
13.根据权利要求1-5中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸残基是D和L氨基酸的混合物。
14.根据权利要求6-10中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列含有L氨基酸。
15.根据权利要求6-10中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列含有D氨基酸。
16.根据权利要求6-10中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列含有D和L氨基酸的混合物。
17.长度为16至26个氨基酸残基的肽，其包含以下氨基酸序列：
a.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是A、C、G、P、S、T；X2是A、C、G、P、S、T；X3是A、I、L、P或V；X4是W、F、Y、H、A、I、L、P或V；X5是W、F、Y或H；并且X6是W、F、Y或H(SEQ ID NO:27)；
b.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是A、C、G、P、S、T；X2是A、C、G、P、S、T；X3是A、I、L、P或V；X4是W、F、Y、H、A、I、L、P或V；X5是W、F、Y或H；并且X6是K、Y、R、H、N、Q、S,或T(SEQ ID NO:28)；
c.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是A、C、G、P、S、T；X2是A、C、G、P、S、T；X3是A、I、L、P或V；X4是W、F、Y、H、A、I、L、P或V；X5是W、F、Y或H；并且X6是A、C、G、P、S、I、L、V或T(SEQ ID NO:29)；
d.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是A、C、G、P、S、T；X2是A、C、G、P、S、T；X3是A、I、L、P或V；X4是W、F、Y、H、A、I、L、P或V；X5是K、Y、R、H、N、Q、S,或T；并且X6是W、F、Y或H(SEQ ID NO:30)；
e.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是A、C、G、P、S、T；X2是A、C、G、P、S、T；X3是A、I、L、P或V；X4是W、F、Y、H、A、I、L、P或V；X5是K、Y、R、H、N、Q、S,或T；并且X6是K、Y、R、H、N、Q、S,或T(SEQ IDNO:31)；
f.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是A、C、G、P、S、T；X2是A、C、G、P、S、T；X3是A、I、L、P或V；X4是W、F、Y、H、A、I、L、P或V；X5是K、Y、R、H、N、Q、S,或T；并且X6是A、C、G、P、S、I、L、V或T(SEQ IDNO:32)；
g.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是A、C、G、P、S、T；X2是A、C、G、P、S、T；X3是A、I、L、P或V；X4是W、F、Y、H、A、I、L、P或V；X5是A、C、G、P、S、I、L、V或T；并且X6是W、F、Y或H(SEQ ID NO:33)；
h.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是A、C、G、P、S、T；X2是A、C、G、P、S、T；X3是A、I、L、P或V；X4是W、F、Y、H、A、I、L、P或V；X5是A、C、G、P、S、I、L、V或T；并且X6是K、Y、R、H、N、Q、S,或T(SEQ IDNO:34)；
i.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是A、C、G、P、S、T；X2是A、C、G、P、S、T；X3是A、I、L、P或V；X4是W、F、Y、H、A、I、L、P或V；X5是A、C、G、P、S、I、L、V或T；并且X6是A、C、G、P、S、I、L、V或T(SEQID NO:35)；
j.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是G、P,或A；X2是G、P,或A；X3是V、I、L或M；X4是W、F、Y或H；X5是W、Y,或F；X6是K、R、Q、E或N(SEQ ID NO:36)；
k.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、T、A或Q；X2是G、P,或A；X3是V、I、L或M；X4是W、F、Y或H；X5是W、Y,或F；并且X6是K、R、Q、E或N(SEQ ID NO:37)；
l.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是G、P,或A；X2是G、P,或A；X3是V、I、L或M；X4是W、F、Y或H；X5是K、R、Q、E或N；并且X6是W、Y,或F(SEQ ID NO:38)；
m.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、T、A或Q；X2是G、P,或A；and X3是V、I、L或M；X4是W、F、Y或H；X5是K、R、Q、E或N；并且X6是W、Y,或F(SEQ ID NO:39)；
n.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、T、A或Q；X2是G、P,或A；X3是V、I、L或M；X4是W、F、Y或H；X5是A、S、G或T；并且X6是W、Y,或F(SEQ ID NO:40)；或
o.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是G、P,或A；X2是G、P,或A；X3是V、I、L或M；X4是W、F、Y或H；X5是A、S、G或T；和X6是W、Y或F(SEQ ID NO:18)。
18.聚乙二醇化肽，其包含连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的长度为16至26个氨基酸残基的肽，其中，所述肽包含以下氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ ID NO:12)。
19.根据权利要求18所述的聚乙二醇化肽，其包含以下氨基酸序列：
a.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)；
b.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)；
c.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)；
d.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)；
e.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)；或
f.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
20.根据权利要求18所述的聚乙二醇化肽，其包含以下氨基酸序列：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)、GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
21.根据权利要求18所述的聚乙二醇化肽，其包含以下氨基酸序列：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)或GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)。
22.根据权利要求18所述的聚乙二醇化肽，其包含以下氨基酸序列：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
23.聚乙二醇化肽，其包含连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的肽，其中，所述肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ ID NO:12)。
24.根据权利要求23所述的聚乙二醇化肽，其由以下氨基酸序列组成：
a.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)；
b.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)；
c.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)；
d.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)；
e.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)；或
f.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
25.根据权利要求23所述的聚乙二醇化肽，其由以下氨基酸序列组成：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)、GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
26.根据权利要求23所述的聚乙二醇化肽，其由以下氨基酸序列组成：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)或GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)。
27.根据权利要求23所述的聚乙二醇化肽，其由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
28.根据权利要求18-22中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述1个、2个或更多个PEG聚合物连接至所述肽的N-末端。
29.根据权利要求18-22中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述1个、2个或更多个PEG聚合物连接至所述肽的C-末端。
30.根据权利要求23-27中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述1个、2或更多个PEG聚合物连接至所述肽的N-末端。
31.根据权利要求23-27中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述1个、2个或更多个PEG聚合物连接至所述肽的C-末端。
32.聚乙二醇化肽，其包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽，其中，所述肽的长度为16至26个氨基酸残基并且包含氨基酸序列：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ ID NO:12)。
33.根据权利要求32所述的聚乙二醇化肽，所述肽包含以下氨基酸序列：
a.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)；
b.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)；
c.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)；
d.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)；
e.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)；或
f.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
34.根据权利要求32所述的聚乙二醇化肽，所述肽包含以下氨基酸序列：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)、GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
35.根据权a利要求32所述的聚乙二醇化肽，所述肽包含以下氨基酸序列：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)或GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)。
36.根据权利要求32所述的聚乙二醇化肽，所述肽包含以下氨基酸序列：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
37.聚乙二醇化肽，其包含以下结构：NH2-PEG12-酰胺-PEG12-肽，其中，所述肽由以下氨基酸序列组成：X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S、G或A；X2是S或G；X3是V或I；X4是W或L；X5是W、K、A或L；并且X6是W、K、L或A(SEQ ID NO:12)。
38.根据权利要求37所述的聚乙二醇化肽，所述肽由以下氨基酸序列组成：
a.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W或K；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:13)；
b.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V；X4是W；X5是W；并且X6是K或A(SEQ ID NO:14)；
c.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:15)；
d.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:16)；
e.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W或A；并且X6是W、K或A(SEQ ID NO:17)；或
f.X1X2SWLRDX3X4TX5LQSX6L，其中X1是S或G；X2是S或G；X3是V或I；X4是W；X5是W、K或A；并且X6是W或K(SEQ ID NO:19)。
39.根据权利要求37所述的聚乙二醇化肽，所述肽由以下氨基酸序列组成：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)、GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
40.根据权利要求37所述的聚乙二醇化肽，所述肽由以下氨基酸序列组成：SGSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:1)、GSSWLRDVWTWLQSKL(SEQ ID NO:2)、GSSWLRDVWTWLQSAL(SEQ ID NO:3)、GSSWLRDVWTKLQSWL(SEQ ID NO:4)或GSSWLRDIWTALQSWL(SEQ ID NO:6)。
41.根据权利要求37所述的聚乙二醇化肽，所述肽由以下氨基酸序列组成：GSSWLRDIWTKLQSWL(SEQ ID NO:5)、GSSWLRDILTALQSLL(SEQ ID NO:7)、AGSWLRDIWTWLQSAL(SEQ ID NO:8)或AGSWLRDILTLLQSAL(SEQ ID NO:9)。
42.根据权利要求18-22、28、29或32-36中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述氨基酸残基是L氨基酸。
43.根据权利要求18-22、28、29或32-36中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述氨基酸残基是D氨基酸。
44.根据权利要求18-22、28、29或32-36中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述氨基酸残基是D和L氨基酸的混合物。
45.根据权利要求23-27、30、31或37-41中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述氨基酸序列含有L氨基酸。
46.根据权利要求23-27、30、31或37-41中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述氨基酸序列含有D氨基酸。
47.根据权利要求23-27、30、31或37-41中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述氨基酸序列含有D和L氨基酸的混合物。
48.根据权利要求18-47中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，每一种PEG聚合物的分子量范围为500至5000道尔顿。
49.根据权利要求18-48中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述1个、2个或更多个PEG聚合物是支化的。
50.根据权利要求18-48中任一项所述的聚乙二醇化肽，其中，所述1个、2个或更多个PEG聚合物是非支化的。
51.包含连接至1个、2个或更多个聚乙二醇(PEG)聚合物的根据权利要求17所述的肽的聚乙二醇化肽。
52.包含根据权利要求1-17中任一项所述的肽和载体的组合物。
53.包含根据权利要求18-51中任一项所述的聚乙二醇化肽和载体的组合物。
54.包含对抑制微生物生长有效的量的根据权利要求1-17中任一项所述的肽和载体的组合物。
55.包含对抑制病毒复制有效的量的根据权利要求1-17中任一项所述的肽和载体的组合物。
56.包含对抑制微生物生长有效的量的根据权利要求18-51中任一项所述的聚乙二醇化肽和载体的组合物。
57.包含对抑制病毒复制有效的量的根据权利要求18-51中任一项所述的聚乙二醇化肽和载体的组合物。
58.根据权利要求52-57中任一项所述的组合物，其中，所述载体是水溶液。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中，所述水溶液是无菌水。
60.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的肽和可药用的载体。
61.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求18-51中任一项所述的聚乙二醇化肽和可药用的载体。
62.根据权利要求60或61所述的药物组合物，其中，所述可药用的载体是水溶液。
63.根据权利要求62所述的药物组合物，其中，所述水溶液是无菌水。
64.根据权利要求60或61所述的药物组合物，其中，将所述组合物配制用于局部施用。
65.根据权利要求64所述的药物组合物，其中，所述组合物是凝胶制剂。
66.根据权利要求65所述的药物组合物，其中，所述有效量是所述凝胶制剂中0.1％至5％的肽。
67.根据权利要求60或61所述的药物组合物，其中，将所述组合物配制用于皮下、静脉内或腹膜内施用。
68.含有冻干组合物的药瓶，所述冻干组合物包含200mg至300mg根据权利要求1-51中任一项所述的肽。
69.含有药物组合物的药瓶，其中，所述药物组合物包含200mg至300mg溶于1mL水溶液中的根据权利要求1-51中任一项所述的肽。
70.根据权利要求69所述的药瓶，其中，所述水溶液是无菌水。
71.消毒溶液，其包含根据权利要求1-17中任一项所述的肽。
72.消毒溶液，其包含根据权利要求18-51中任一项所述的聚乙二醇化肽。
73.抑制微生物的生长、复制或感染性的方法，包括将所述微生物与有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的肽接触。
74.抑制微生物的生长、复制或感染性的方法，其包括将所述微生物与有效量的根据权利要求18-51中任一项所述的聚乙二醇化肽接触。
75.抑制细菌生长的方法，其包括将所述细菌与有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的肽接触。
76.抑制细菌生长的方法，其包括将所述细菌与有效量的根据权利要求18-51中任一项所述的聚乙二醇化肽接触。
77.抑制细胞中病毒复制的方法，其包括将感染了病毒的细胞与有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的肽接触。
78.抑制细胞中病毒复制的方法，其包括将所述细胞与有效量的根据权利要求18-51中任一项所述的聚乙二醇化肽接触。
79.根据权利要求77或78所述的方法，其中，所述细胞是体内、体外或离体的。
80.治疗受试者中微生物感染的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求60-67中任一项所述的药物组合物。
81.预防受试者中由微生物感染引起的或与之有关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求60-67中任一项所述的药物组合物。
82.根据权利要求74、80或81所述的方法，其中，所述微生物是细菌。
83.根据权利要求82所述的方法，其中，所述细菌是革兰氏阳性细菌。
84.根据权利要求83所述的方法，其中，所述革兰氏阳性细菌是金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌、艰难梭菌、痤疮丙酸杆菌或炭疽芽孢杆菌。
85.根据权利要求82所述的方法，其中，所述细菌是革兰氏阴性细菌。
86.根据权利要求85所述的方法，其中，所述革兰氏阴性细菌是铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌或流感嗜血菌。
87.根据权利要求82所述的方法，其中，所述细菌为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、万古霉素敏感肠球菌、耐万古霉素肠球菌、青霉素敏感肺炎链球菌、耐青霉素肺炎链球菌、耐环丙沙星细菌或耐克林霉素细菌。
88.根据权利要求75或76所述的方法，其中，所述受抑制的细菌生长是革兰氏阳性细菌生长。
89.根据权利要求88所述的方法，其中，所述革兰氏阳性细菌生长是金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌、艰难梭菌、痤疮丙酸杆菌或炭疽芽孢杆菌的生长。
90.根据权利要求75或76所述的方法，其中，所述受抑制的细菌生长是革兰氏阴性细菌生长。
91.根据权利要求90所述的方法，其中，所述革兰氏阴性细菌生长是铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌或流感嗜血菌的细菌生长。
92.根据权利要求75或76所述的方法，其中，所述受抑制的细菌生长为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、万古霉素敏感肠球菌、耐万古霉素肠球菌、青霉素敏感肺炎链球菌、耐青霉素肺炎链球菌、耐环丙沙星细菌或耐克林霉素细菌的生长。
93.根据权利要求84或89所述的方法，其中，所述肠球菌是粪肠球菌。
94.根据权利要求84或89所述的方法，其中，所述链球菌是肺炎链球菌。
95.根据权利要求77或78所述的方法，其中，所述受抑制的病毒复制是属于黃病毒科、披膜病毒科、丝状病毒科、沙粒病毒科、痘病毒科、布尼亚病毒科或反转录病毒科的病毒的复制。
96.根据权利要求77或78所述的方法，其中，所述受抑制的病毒复制是登革热病毒、基孔肯亚病毒、埃博拉病毒、HIV或流感病毒的复制。
97.抑制受试者中细菌生长的方法，其包括向所述受试者施用包含有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的肽的药物组合物。
98.治疗受试者中细菌感染的方法，其包括向所述受试者施用包含有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的肽的药物组合物。
99.治疗受试者中的由细菌感染引起的或与之相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用包含有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的肽的药物组合物。
100.预防受试者中的由细菌感染引起的或与之相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用包含有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的肽的药物组合物。
101.根据权利要求97、98、99或100所述的方法，其中，所述细菌感染是革兰氏阳性感染。
102.根据权利要求101所述的方法，其中，所述革兰氏阳性感染是金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌、艰难梭菌、痤疮丙酸杆菌或炭疽芽孢杆菌感染。
103.根据权利要求97、98、99或100所述的方法，其中，所述细菌感染是革兰氏阴性感染。
104.根据权利要求103所述的方法，其中，所述革兰氏阴性感染是铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌或流感嗜血菌感染。
105.根据权利要求97、98、99或100所述的方法，其中，所述细菌感染是甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、万古霉素敏感肠球菌、耐万古霉素肠球菌、青霉素敏感肺炎链球菌、耐青霉素肺炎链球菌、耐环丙沙星细菌或耐克林霉素细菌感染。
106.根据权利要求102所述的方法，其中，所述肠球菌是粪肠球菌。
107.根据权利要求102所述的方法，其中，所述链球菌是肺炎链球菌。
108.抑制受试者中病毒复制的方法，其包括向所述受试者施用包含有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的肽的药物组合物。
109.治疗受试者中病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用包含有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的肽的药物组合物。
110.治疗受试者中的由病毒感染引起的或与之相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用包含有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的肽的药物组合物。
111.预防受试者中的由病毒感染引起的或与之相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用包含有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的肽的药物组合物。
112.根据权利要求108、109、110或111所述的方法，其中，所述病毒感染是属于黃病毒科、披膜病毒科、丝状病毒科、痘病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科或反转录病毒科的病毒的感染。
113.根据权利要求108、109、110或111所述的方法，其中，所述病毒感染是登革热病毒、基孔肯亚病毒、埃博拉病毒、HIV或流感病毒感染。
114.根据权利要求97-113中任一项所述的方法，其中，所述有效量是每天10mg至300mg剂量的肽。
115.根据权利要求97-113中任一项所述的方法，其中，所述有效量是每天两次10mg至300mg剂量的肽。
116.根据权利要求97-115中任一项所述的方法，其中，将所述组合物皮下施用于所述受试者。
117.根据权利要求97-115中任一项所述的方法，其中，将所述组合物静脉内或腹膜内施用于所述受试者。
118.根据权利要求97-115中任一项所述的方法，其中，将所述组合物局部施用于所述受试者。
119.根据权利要求80-118中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人。
120.用于对无生命的对象或生物材料进行消毒的方法，其包括将所述对象与根据权利要求52-59所述的组合物接触。
121.用于对无生命的对象或生物材料进行消毒的方法，其包括使所述对象与含有根据权利要求1-51中任一项所述的肽的抹布接触。
122.无生命的表面或生物表面，其包含与根据权利要求1-51中任一项所述的抗感染肽的连接或具有根据权利要求1-51中任一项所述的抗感染肽的涂层。
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