JP2005318829A - 抗菌性ペプチド、該抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに該抗菌性ペプチドを含有する抗菌剤、抗菌性医薬、点眼薬及び眼感染症疾患検査薬 - Google Patents

Abstract

【課題】 抗菌性ペプチド、該抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに該抗菌性ペプチドを含有する抗菌剤、抗菌性医薬、点眼薬及び抗菌剤を提供する。
【解決手段】 本発明の抗菌性ペプチドは、ヒト角膜及び結膜分泌アポタンパク質（ＡｐｏＪ）由来の配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列若しくはその改変体を含むペプチド又はその塩である。
ＡＫＬＲＲＥＬＤＥＳＬＱＶＡＥＲＬＴＲＫＹＮＥＬＬ〔配列番号１〕
ＡＫＬＲＲＥＬＤＥＳＬＱＶＡＥＲＬＴＲＫＹ〔配列番号２〕
ＫＦＹＡＲＶＣＲＳＧＳＧＬＶＧＲＱＬＥＥＦＬ〔配列番号３〕
ＧＳＫＹＶＮＫＥＩＱＮＡＶＮＧＶＫＱＩＫＴＬ〔配列番号４〕
【選択図】 なし

Description

この発明は、抗菌性ペプチド、該抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに該抗菌性ペプチドを含有する抗菌剤、抗菌性医薬、点眼薬及び抗菌剤に関する。更に詳しくは、本発明は、ヒト角膜及び結膜分泌アポタンパク質Ｊ（ＡｐｏＪ）由来の配列を含み、黄色ブドウ球菌及びその耐性菌、並びに緑膿菌等に対する抗菌性を有する抗菌性ペプチド、該抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに該抗菌性ペプチドを含有する抗菌剤、抗菌性医薬、点眼薬及び抗菌剤に関する。

昆虫、カブトガニ等の甲殼類からヒトに至るまで、多くの動物では、微生物の侵入及び感染に対して様々な防御系が発達している。ヒト等の哺乳類の場合、この非特異的感染防御機構が破られると、免疫グロブリン及び感作リンパ球等が関与した、いわゆる特異的感染防御機構が働き、微生物に対抗することが知られている。一方、皮膚及び粘膜による微生物の排除、体液及び細胞に含まれる抗菌物質等による防御は、非特異的感染防御機構と呼ばれる。そして、特異的感染防御機構をもたない、昆虫及びカブトガニ等の甲殻類等では、上記の非特異的感染防御機構が発達し、その中の一つとして、数多くの抗菌性ペプチドが報告されている(下記非特許文献１及び２）。

近年、哺乳類における非特異的感染防御機構についての知見が増え、特に、ヒト顆粒球由来の抗菌タンパク質あるいは抗菌性ペプチドの報告がなされ、かかる抗菌タンパク質及び抗菌ペプチドは、ヒトに対して抗原性やアレルギー性を持たず、より安全で生体適合性を要する新しい抗菌物質として注目されている(下記非特許文献１)。また、これらの哺乳類における抗菌性ペプチドは、従来は顆粒球由来に限られていたが、近年、血漿中のアポ蛋白Ｅ及びアポタンパク質ＡＩＩに含まれるある配列のペプチドが抗菌活性をもつことが報告されている（下記非特許文献３及び４、並びに下記特許文献１）。もともとアポタンパク質は血中で体内の脂肪分の運搬を担うタンパク質であり、例えば、細菌の膜の成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）もその疎水度から同時に吸着・運搬すると予想され（下記非特許文献５）、その性質が抗菌活性と結びついているとも考えられる。
その他の抗菌性ペプチドとしては、例えば、下記特許文献２〜４の抗菌性ペプチドが知られている。

Ｈａｎｃｏｃｋ ＲＥＷ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｌａｎｃｅｔ ３４９、４１８〜４２２（１９９７） 平田陸正，ＭＩＮＯＰＨＡＧＥＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＶＩＥＷ ４３〔１〕，１〜１５（１９９８） Ｋｏｊｉｍａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２１，３２７〜３３０（２０００） Ｍｏｔｉｚａｋｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３４２，２１５〜２２１（１９９９） Ｍ Ｙｏｓｈｉｄａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６，１５１〜１６０ 特開２０００−２１７５７９号公報 特開平１０−１４９８号公報 特開平１１−７１３９９号公報 特開２０００−３１９３００号公報

現在までに見出されている抗菌性物質を抗菌剤として使用することは可能であるが、実際に生体に存在する抗菌性物質を模倣したほうが、より生体に適応した薬剤とすることができると考えられる。例えば、実際に眼に存在する抗菌性物質を模倣すれば、より眼に適応した薬剤とすることが考えられる。そして、生体において、眼の感染症を防御するために、生体の防御機構が機能していることが予想される。しかし、眼における非特異的感染防御機構の研究、即ち、抗菌性タンパク質や抗菌性ペプチドの研究は殆ど進んでいないのが実情である。

本発明は上記実情に鑑みてなされたものであり、ヒト角膜及び結膜分泌アポタンパク質Ｊ（ＡｐｏＪ）由来の配列を含み、黄色ブドウ球菌及びその耐性菌、並びに緑膿菌等に対する抗菌性を有する抗菌性ペプチド、該抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに該抗菌性ペプチドを含有する抗菌剤、抗菌性医薬、点眼薬及び抗菌剤を提供することを目的とする。

本発明は、以下に示す通りである。
〔１〕配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列若しくはその改変体を含むペプチド又はその塩であることを特徴とする抗菌性ペプチド。
〔２〕上記ペプチドは、ヒト角膜及び結膜分泌アポタンパク質Ｊ（ＡｐｏＪ）のアミノ酸配列の一部を有するペプチドである上記〔１〕記載の抗菌性ペプチド。
〔３〕上記ペプチドのアミノ酸残基は２１〜２５０である上記〔１〕又は〔２〕記載の抗菌性ペプチド。
〔４〕上記ペプチドは、上記配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列で示されるペプチド若しくはその改変体又はその塩である上記〔１〕記載の抗菌性ペプチド。
〔５〕上記ペプチドは、ヒト角膜及び結膜分泌アポタンパク質Ｊ（ＡｐｏＪ）由来のペプチドである上記〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載の抗菌性ペプチド。
〔６〕上記改変体は、親水性インデックス又は疎水性インデックスの変化が±２以内の保存的置換体である上記〔１〕乃至〔５〕のいずれかに記載の抗菌性ペプチド。
〔７〕上記改変体は、天然アミノ酸の置換又は挿入がなされた改変体である上記〔１〕乃至〔５〕のいずれかに記載の抗菌性ペプチド。
〔８〕上記改変体は、５アミノ酸以下の置換、挿入又は欠失がなされた改変体である上記〔１〕乃至〔５〕のいずれかに記載の抗菌性ペプチド。
〔９〕上記〔１〕乃至〔８〕のいずれかに記載の抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔１０〕上記〔１〕乃至〔８〕のいずれかに記載の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする抗菌剤。
〔１１〕上記〔１〕乃至〔８〕のいずれかに記載の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする抗菌性医薬。
〔１２〕上記〔１〕乃至〔８〕のいずれかに記載の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする点眼薬。
〔１３〕上記〔１〕乃至〔８〕のいずれかに記載の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする眼感染症疾患検査薬。

本発明の抗菌性ペプチドは、黄色ブドウ球菌及びその耐性菌、並びに緑膿菌等に対する抗菌性を有する。
本抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記構成を有することにより、上記作用効果を奏する本発明の抗菌性ペプチドを容易に得ることができる。
本発明の抗菌剤は、本発明の抗菌性ペプチドを含有することから、抗菌性が要求される様々な用途に適用することができる。
本発明の抗菌性医薬は、本発明の抗菌性ペプチドを含有することから、各種感染症治療に有効であり、また、生体由来の成分であることから、安全性も高い。
本発明の点眼薬は、ヒト角膜及び結膜分泌タンパク質Ｊ（ＡｐｏＪ）由来である本発明の抗菌性ペプチドを含有することから、抗菌性に優れると共に、眼に適応した薬剤とすることができる。
本発明の眼感染症疾患検査薬は、上記構成を有することにより、眼感染症の感染リスクを容易に診断することができる。

（１）抗菌性ペプチド
本発明の抗菌性ペプチドは、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列若しくはその改変体を含むペプチド又はその塩であることを特徴とする。本発明の抗菌性ペプチドは、従来は知られていなかった眼における非特異的感染防御機構を担う物質として、優れた抗菌性を発揮する。また、本発明の抗菌性ペプチドは、ヒト角膜及び結膜分泌アポタンパク質Ｊ（ＡｐｏＪ）（以下、単に「ＡｐｏＪ」という。）由来のアミノ配列であることから、ヒトに対して親和性があり、抗原性を有さず、安全性が高い。
尚、配列番号１〜４のアミノ酸配列（１文字表記）を以下に記す。
〔配列番号１〕
ＡＫＬＲＲＥＬＤＥＳＬＱＶＡＥＲＬＴＲＫＹＮＥＬＬ
〔配列番号２〕
ＡＫＬＲＲＥＬＤＥＳＬＱＶＡＥＲＬＴＲＫＹ
〔配列番号３〕
ＫＦＹＡＲＶＣＲＳＧＳＧＬＶＧＲＱＬＥＥＦＬ
〔配列番号４〕
ＧＳＫＹＶＮＫＥＩＱＮＡＶＮＧＶＫＱＩＫＴＬ

本発明の配列番号１〜４のペプチドは、ＡｐｏＪ由来の配列である。ＡｐｏＪは、脊椎動物にみられる糖タンパク質の一種で、様々な組織で発現していることが知られているが、正確な機能は明らかにされていない。ＡｐｏＪは、細胞、細胞膜及び疎水性のタンパク質と結合することが示唆されており、プログラムされた細胞死とも関連があるとされている。そして、配列番号１のペプチドは、ＡｐｏＪの３２１〜３４５番目の領域のペプチド（２５残基）であり、配列番号２のペプチドは、ＡｐｏＪの３２１〜３４１番目の領域のペプチド（２１残基）であり、配列番号３のペプチドは、ＡｐｏＪの１２３〜１４４番目の領域のペプチド（２２残基）であり、配列番号４のペプチドは、ＡｐｏＪの３８〜５９番目の領域のペプチド（２２残基）である。

本発明の抗菌性ペプチドは、特に黄色ブドウ球菌及びその耐性菌（ＭＲＳＡ等）、並びに緑膿菌等に対する抗菌性に優れる。

本発明の抗菌性ペプチドは、アンモニウム塩（アルキルまたはアリールアンモニウム塩を含む）、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、チオ硫酸塩、炭酸塩及び重炭酸塩等の無機塩や、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、スルホン酸塩、チオスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、エチルスルホン酸塩及びベンゼンスルホン酸塩等の有機酸塩、又はアルキル若しくはアリールアンモニウム塩等の有機アミン塩等の、製薬工業上及び薬理学上許容される塩を付加したペプチド等とすることができる。

本発明の抗菌性ペプチドは、配列番号１〜４のペプチドを少なくとも一部含んでいればよい。例えば、本発明の抗菌性ペプチドは、配列番号１〜４のうちの１種のみでもよく、あるいは、配列番号１〜４の２種以上を含んでもよい。また、本発明の抗菌性ペプチドは、本発明の抗菌性ペプチドは、配列番号１〜４のペプチドでもよいが、配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、本発明の抗菌性ペプチドは、ＡｐｏＪのアミノ酸配列の一部を有するペプチドとすることができる。本発明の抗菌性ペプチドとして、配列番号１〜４のペプチド以外のアミノ酸配列を含む場合、本発明の抗菌性ペプチドのアミノ酸数には特に限定はない。通常、本発明の抗菌性ペプチドのアミノ酸数は２１以上、好ましくは２１〜２５０、更に好ましくは２１〜１００、より好ましくは２１〜７５、更に好ましくは２１〜５０、特に好ましくは２１〜４０である。

本発明の抗菌性ペプチドは、抗菌性を有する限り、配列番号１〜４のペプチドの改変体でもよい。上記「改変体」とは、アミノ酸の付加、欠失、置換、挿入、又は修飾を含む、改変されたペプチドをいう。上記修飾としては、例えば、一重又は多重の、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル基、脂肪基）等が挙げられる。また、上記置換、付加、又は挿入されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸であってもよいが、天然のアミノ酸であることが好ましい。更に、上記置換、欠失、付加、又は挿入は、通常５アミノ酸以下、好ましくは４アミノ酸以下、更に好ましくは３アミノ酸以下、より好ましくは２アミノ酸以下、特に好ましくは１アミノ酸の置換、欠失、付加、又は挿入である。

上記の改変体を得る場合、アミノ酸の疎水性インデックスを考慮することができる（Ｋｙｔｅ．Ｊ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与することが認められ、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、細胞膜分子、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原等）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性及び電荷の性質に基づく疎水性インデックスを割り当てられる。例えば、：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。

また、親水性に基づいて、このようなアミノ酸の置換が効果的に行われることも当該分野において知られている。例えば、米国特許第４５５４１０１号には、その隣接した親水性により支配されるような蛋白質の最も局所的な平均親水性が、タンパク質の生物学的特性に関連することが記載されている。米国特許第４５５４１０１号に記載されるように、以下の親水性インデックスがアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。

あるアミノ酸を、同様の疎水性インデックス又は親水性インデックスを有する他のアミノ酸により置換しても、そして依然として同様の生物学的活性を有するタンパク質（例えば、依然として生物学的機能的に等価なタンパク質）を生じさせることができることは、当該分野で周知である。よって、この疎水性インデックス及び親水性インデックスに基づいて、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列で示されるペプチドの改変体を容易に設計することができる。本発明の抗菌性ペプチドでは、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列で示されるペプチドについて、疎水性インデックスが±２以内であるアミノ酸置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸置換がより好ましく、±０．５以内のアミノ酸置換が更に好ましい。また、本発明の抗菌性ペプチドでは、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列で示されるペプチドについて、親水性インデックスが±２以内であるアミノ酸置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸置換がより好ましく、±０．５以内のアミノ酸置換が更に好ましい。
上記インデックスに基づく例示的な置換としては、例えば、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン及びイソロイシン等が挙げられる。

本発明の抗菌性ペプチドを得る方法には特に限定はない。例えば、本発明の抗菌性ペプチドは、固相合成法等の化学合成法を用いて製造することができる。また、本発明の抗菌性ペプチドは、ＡｐｏＪ由来のペプチドでもよいことから、例えば、ＡｐｏＪについて、適宜加水分解した後、分離抽出することにより得ることもできる。更に、本発明の抗菌性ペプチドは、遺伝子工学による手法を用いて生成することもできる。例えば、本発明の抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクター等を用いて宿主微生物又は宿主細胞内に導入し、当該宿主微生物又は宿主細胞を培養等することにより、上記ポリヌクレオチドを発現させることにより得ることもできる。この場合、上記宿主微生物及び宿主細胞の種類には特に限定はない。上記宿主微生物としては、大腸菌や枯草菌等の放線菌等が挙げられる。上記宿主細胞としては、例えば、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞等の真核生物由来の細胞等が挙げられる。

（２）ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗菌性ペプチドをコードすることを特徴とする。尚、本発明のポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション用プローブや、あるいはＰＣＲ用プライマーのように、直接翻訳されて本発明の抗菌性ペプチドを産生する用途以外の用途に使用するものも含む。

本発明のポリヌクレオチドの塩基配列及び塩基数は、本発明の抗菌性ペプチドをコードする限り特に限定はない。本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１〜４のアミノ酸配列と、当業者に周知の遺伝暗号に基づいて、当業者であれば適宜選択することができる。

本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子工学的手法により、宿主内で発現させることにより、本発明の抗菌性ペプチドを産生する他、遺伝子工学を利用した種々の技術及び処置に使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを単独で、又は他の遺伝子と組合せて使用して、適当なベクターに組み込む等の方法により、遺伝子治療等の抗菌作用を必要とする医学的処置に適用することができる。また、本発明のポリヌクレオチドを、他の生物のＤＮＡに組み込むことにより形質転換を行い、当該生物に抗菌性を付与することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法又はアグロバクテリウム法等の公知の手段により、植物細胞に導入して形質転換を行い、次いで植物体を再生させることにより、本発明の抗菌性ペプチドが発現した抗菌性を有する植物体を得ることができる。

（３）抗菌剤
本発明の抗菌剤は、本発明の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする。
本発明の抗菌性ペプチドの含有量について特に限定はなく、用途等に応じて種々の範囲とすることができるが、２５０μＭ以上であることが望ましい。また、本発明の抗菌剤組成物において、本発明の抗菌性ペプチドは、ペプチド又はその塩の形態で含有されていてもよく、あるいは適当な担体に保持された状態で含有されていてもよい。この場合、本発明の抗菌性ペプチドは、上記担体とイオン結合により保持されていてもよく、あるいは共有結合により保持されていてもよい。

本発明の抗菌剤の形態については特に限定はなく、必要に応じて種々の形態とすることができる。本発明の抗菌剤の形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、粉末剤及び顆粒剤等の固形剤、水、エタノール、プロピレングリコール等の水系溶媒等に溶解又は懸濁させて調製した溶液剤、懸濁液及び乳剤等の液剤、噴霧用液剤、マイクロカプセル、その他の周知の剤型が挙げられる。

本発明の抗菌剤は、本発明の抗菌性ペプチドを必須とするが、抗菌性を奏する限り、その他の物質を含んでいてもよい。例えば、製造における計量を容易にするために、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、トウモロコシ澱粉及びジャガイモ澱粉等の増量剤等を添加することができる。また、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム及びポリエチレングリコール等の滑沢剤、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリジン等の結合剤、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩、及びグリコール酸デンプンナトリウム等の崩壊剤、発泡剤、色素、甘味料、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩などの湿潤剤、及び一般に非毒性及び医薬的処方に用いられる薬学的に非活性な物質を含んでいてもよい。その他の薬効成分を含んでいてもよい。

本発明の抗菌剤の用途には特に限定はない。本発明の抗菌剤は、医薬品としてのみならず、食品、飼料、化粧品等のように人若しくは動物の体内に摂取され、又は体表面に適用される製品、その他一般に細菌の増殖を防止又は抑制することが望まれるあらゆる製品に配合して使用することができ、また、本発明の抗菌剤により、それらの製品又は原料素材を処理することができる。例えば、本発明の抗菌剤は、一般に微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品に添加、配合、噴霧、付着、被覆、含浸等を行うことにより、微生物の増殖の防止、抑制が望まれるあらゆる物品の処理に用いることができる。

本発明の抗菌剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品等の内用剤及び外用剤の他、口腔内殺菌剤、食品、病院・台所・洗濯等の衛生用途の除菌剤、園芸植物用抗菌剤、コンタクトレンズに組み込まれる薬剤、コンタクトレンズの保存剤、洗浄剤、防腐剤、殺虫剤等に利用できる。また、飲料、食品、飼料等に添加する添加剤として利用することもできる。

また、本発明の抗菌剤は、抗菌性が要求される種々の材料（例えば、プラスチック、繊維、紙、木、金属、ガラス等）に担持させることにより、当該材料に抗菌性を付与することができる。例えば、本発明の抗菌剤は、日用品に抗菌性を与えるために、コーティング成分として使用することができる。上記日用品の例としては、食器、家具、楽器、書籍、事務用品、容器、電機製品、情報機器、眼鏡、種々のカード、電話機、靴、衣類、寝具、住宅、園芸用品、輸送用機械、玩具等が挙げられる。その他、本発明の抗菌剤は、医療用具の抗菌成分として使用され得る。医療用具の例としては、ガーゼ、包帯、人工心臓及び人工腎臓等の人工臓器、血液浄化器、体外透析器、体外循環治療システム、カテーテル及びチューブ等の手術用器具、コンタクトレンズ及び人工歯機能性器具等が挙げられる。例えば、これらの医療用具を構成する部材（繊維吸着材等）に本発明の抗菌剤を担持させることができる。更に、本発明の抗菌剤は、環境関連分野においても使用することができる。例えば、水（河川、湖沼、生活排水、工場排水等）及び大気の浄化装置のフィルターやろ過膜に本発明の抗菌剤を担持させることにより、浄化の際の殺菌を行うことができる。

（４）抗菌性医薬、点眼薬及び眼感染症疾患検査薬
本発明の抗菌性医薬、点眼薬及び眼感染症疾患検査薬は、本発明の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする。

本発明の抗菌性医薬及び点眼薬中の本発明の抗菌性ペプチドの含有量について特に限定はなく、用途等に応じて種々の範囲とすることができるが、２５０μＭ以上であることが望ましい。また、本発明の抗菌剤組成物において、本発明の抗菌性ペプチドは、ペプチド又はその塩の形態で含有されていてもよく、あるいは適当な担体に保持された状態で含有されていてもよい。

本発明の抗菌性医薬は、主にヒトの疾患の治療に用いられるが、ヒト以外の動物の疾患の治療にも用いることができる。

本発明の抗菌性医薬の形態については特に限定はなく、必要に応じて種々の形態とすることができる。本発明の抗菌性医薬の形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、粉末剤及び顆粒剤等の固形剤、水、エタノール、プロピレングリコール等の水系溶媒等に溶解又は懸濁させて調製した溶液剤、懸濁液及び乳剤等の液剤、噴霧用液剤、マイクロカプセル、その他の周知の剤型が挙げられる。また、本発明の抗菌性医薬は、固形状、液状等として経口投与等により摂取する他、通常のペプチド系医薬の投与に使用されている静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは鼻内投与等を採用することができる。更に、本発明の抗菌性医薬は、内用剤でもよく、外用剤でもよい。その他、点眼薬、点鼻薬、注射剤等とすることができる。上記のように、本発明の抗菌性ペプチドは、ＡｐｏＪ由来のアミノ酸配列を有することから、本発明の抗菌性医薬は、より眼に適応した薬剤とすることができるので、点眼薬として用いることが好ましい。

本発明の抗菌性医薬は、本発明の抗菌性ペプチドを必須とするが、抗菌性を奏する限り、その他の物質を含んでいてもよい。例えば、上述の本発明の抗菌剤の項で列挙したその他の物質を添加することができる。また、本発明の抗菌性医薬は、本発明の抗菌性ペプチド以外のその他の薬効成分を含んでいてもよい。

本発明の眼感染症疾患検査薬に含まれている本発明の抗菌性ペプチドは、ＡｐｏＪ由来のアミノ酸配列を有する。
眼は外部環境に晒される器官であり、常に感染症の危険性を有している。特に、加齢により涙の量が減少したり、あるいは、最近利用者が急増しているコンタクトレンズの使用により従来の抗菌力が低下している状態では、眼感染症のリスクが大きい。そこで、本発明の眼感染症疾患検査薬により、例えば、涙中の抗菌性物質を定量すれば、眼感染症のリスクを容易に診断することができる。

本発明の眼感染症疾患検査薬の形態については特に限定はなく、測定診断方法等に応じて種々の形態とすることができる。抗体捕捉法による測定診断に用いる場合、本発明の眼感染症疾患検査薬の形態としては、例えば、本発明の抗菌性ペプチド又はＡｐｏＪをエピトープとして有する抗体とする形態が挙げられる。
本発明の眼感染症疾患検査薬による測定診断方法としては、例えば、抗体捕捉法、酵素活性測定法、飛行時間型質量分析法等を含む免疫、生化学的方法等が挙げられる。

（１）抗菌性ペプチドのスクリーニング及び調製
ＡｐｏＪのどの部分が抗菌活性をもつか絞り込むためにとった方法は、以前に小島らが、血漿中のアポタンパク質Ｅの配列から、抗菌活性のある部分を予想・検証した方法と同じ方法を採用した（上記非特許文献３参照）。即ち、顆粒球由来の抗菌性ペプチドは、必要条件として、カチオン性両親媒性αヘリックス構造をもつという知見を利用した。具体的には、既知のＡｐｏＪ内の連続する２０〜３０のアミノ酸配列のそれぞれについて、疎水モーメント（１００度の疎水モーメント角）と平均疎水度を計算し（Zhong L, Putnam RL, Johnson WJ, and Rao AG. Design and synthesis of amphipathic antimicrobial peptides. Int J Pept Protein Res 1995; 45:337-47.）、〔１〕疎水モーメントが大きく、平均疎水度が高い（両親媒性αヘリックスの）配列をリストアップし、その中で、〔２〕Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓを多く含むカチオン性の配列をその候補とした。更に、ここでは、アポタンパク質Ｅ由来の抗菌性ペプチドの実験やその他のグループの報告（上記非特許文献３等参照）を参考にし、〔３〕抗菌活性を持つペプチドのアミノ酸長は２０残基以上が必要であることも考慮に入れた。

その結果、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドＡ、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドＢ、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドＣ、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドＤを候補として選んだ。例えば、ペプチドＡは、その疎水モーメントが０．３８２、平均疎水度が０．３９９である。一方、アポタンパク質Ｅ由来の抗菌性ペプチド（３０残基）では、疎水モーメントが０．４、平均疎水度が０．４２）であり、上記ペプチドＡは、このアポタンパク質Ｅ由来の抗菌性ペプチドに近い両親媒性αヘリックスの性質を有するが、ややカチオン性に劣る性質を有する。

配列番号１〜４のアミノ酸配列を有するペプチドＡ〜Ｄは、公知のペプチド合成法として常用される固相法の一つであるＦｍｏｃ法によって得られたもの（５ｍｇ）を、株式会社島津製作所より購入して使用した（純度９０％、「島津評論」Ｖｏｌ．５０ Ｎｏ．１〔１９９３．４〕 １〜１０頁参照）。

（２）抗菌試験１
上記（１）で調製したペプチドＡ〜Ｄを滅菌精製水に溶解し、５０００μg／ｍｌのサンプルを調製した。各サンプルに、滅菌生理食塩水に浮遊させたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：臨床分離株、徳島大学薬学部微生物薬品化学教室より入手）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ０１：徳島大学薬学部微生物薬品化学教室より入手、ＡＴＣＣ１５６９２と同じ性質を有する。）をそれぞれ混合し、最終菌濃度（理論値）が１０^３、１０^４、１０^５、１０^６ＣＦＵ／ｍｌ、最終サンプル濃度が１０００μg／ｍｌになるように、シリコン処理したマイクロチューブに取った。そして、３７℃で２時間反応させた後、各サンプルを最終菌濃度を１０^３、１０^４、ＣＦＵ／ｍｌとしたものはそのまま、１０^５、１０^６ＣＦＵ／ｍｌとしたものは滅菌生理食塩水でそれぞれ１０倍、１００倍1希釈してミューラー・ヒントン寒天培地（ミューラー・ヒントン・ブロス：ベクトン・ディッキンソン製、寒天：和光純薬製）に塗抹し、更に３５℃で２４時間培養した後の各サンプルの菌の発育状況を調べた。その結果を表１に示す。

（３）抗菌試験２
上記（１）で調製したペプチドＡ〜Ｄを滅菌精製水に溶解し、５０００μg／ｍｌのサンプルを調製した。各サンプルを滅菌生理食塩水で２倍段階希釈して３１２．５、６２５、１２５０、２５００、５０００μg／ｍｌのサンプルとした。各サンプルに滅菌生理食塩水に浮遊させたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：臨床分離株、徳島大学薬学部微生物薬品化学教室より入手）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ０１：徳島大学薬学部微生物薬品化学教室より入手、ＡＴＣＣ１５６９２と同じ性質を有する。）をそれぞれ混合し、最終菌濃度（理論値）が１０^４ＣＦＵ／ｍｌ、最終サンプル濃度が６２．５、１２５、２５０、５００、１０００μg／ｍｌになるように、シリコン処理したマイクロチューブに取った。そして、３７℃で２時間反応させた後、各サンプルをミューラー・ヒントン寒天培地（ミューラー・ヒントン・ブロス：ベクトン・ディッキンソン製、寒天：和光純薬製）に塗抹し、更に３５℃で２４時間培養した後の各サンプルの菌の発育状況を調べた。その結果を表２に示す。

（４）実施例の結果
表１より、本発明のペプチドＡ及びＢは１．１×１０^２〜２．３×１０^５ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して、ペプチドＣは１．１×１０^２〜２．８×１０^３ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して、ペプチドＤは１．１×１０^２〜１．９×１０^４ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して、１０００μｇ／ｍｌで抗菌作用を示した。同様に、１．２×１０^３〜６．９×１０^５ＣＦＵ／ｍｌの緑膿菌に対しても、本発明のペプチドＡ〜Ｄは、１０００μｇ／ｍｌで抗菌作用を示した。
また、表２より、ペプチドＡ〜Ｄは、２．２×１０^３ＣＦＵ／ｍｌのＭＲＳＡに対して１０００μg／ｍｌで抗菌作用を示した。同様に、ペプチドＡ及びＢは、４．９×１０^３ＣＦＵ／ｍｌの緑膿菌に対して５００μg／ｍｌ以上で抗菌作用を示し、ペプチドＣ及びＤは、４．９×１０^３ＣＦＵ／ｍｌの緑膿菌に対して１０００μg／ｍｌで抗菌作用を示した。

尚、本発明においては、前記具体的実施例に示すものに限られず、目的、用途に応じて本発明の範囲内で種々変更した実施例とすることができる。

本発明の抗菌剤は、本発明の抗菌性ペプチドを含有することから、抗菌性が要求される様々な用途、例えば食品等の添加剤や抗菌性材料の原料として適用することができる。
本抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明の抗菌性ペプチドの産生及び遺伝子治療や形質転換等に適用することができる。
本発明の抗菌性医薬は、本発明の抗菌性ペプチドを含有することから、各種感染症治療に適用することができる。
本発明の点眼薬は、眼感染症に適用することができる。
本発明の眼感染症疾患検査薬は、眼感染症の診断に適用することができる。

本実施例で使用した抗菌性ペプチドＡ。

本実施例で使用した抗菌性ペプチドＢ。

本実施例で使用した抗菌性ペプチドＣ。

本実施例で使用した抗菌性ペプチドＤ。

Claims (13)

1. 配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列若しくはその改変体を含むペプチド又はその塩であることを特徴とする抗菌性ペプチド。
2. 上記ペプチドは、ヒト角膜及び結膜分泌アポタンパク質（ＡｐｏＪ）のアミノ酸配列の一部を有するペプチドである請求項１記載の抗菌性ペプチド。
3. 上記ペプチドのアミノ酸残基は２１〜２５０である請求項１又は２記載の抗菌性ペプチド。
4. 上記ペプチドは、上記配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列で示されるペプチド若しくはその改変体又はその塩である請求項１記載の抗菌性ペプチド。
5. 上記ペプチドは、ヒト角膜及び結膜分泌アポタンパク質Ｊ（ＡｐｏＪ）由来のペプチドである請求項１乃至４のいずれかに記載の抗菌性ペプチド。
6. 上記改変体は、親水性インデックス又は疎水性インデックスの変化が±２以内の保存的置換体である請求項１乃至５のいずれかに記載の抗菌性ペプチド。
7. 上記改変体は、天然アミノ酸の置換又は挿入がなされた改変体である請求項１乃至５のいずれかに記載の抗菌性ペプチド。
8. 上記改変体は、５アミノ酸以下の置換、挿入、付加又は欠失がなされた改変体である請求項１乃至５のいずれかに記載の抗菌性ペプチド。
9. 請求項１乃至８のいずれかに記載の抗菌性ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
10. 請求項１乃至８のいずれかに記載の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする抗菌剤。
11. 請求項１乃至８のいずれかに記載の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする抗菌性医薬。
12. 請求項１乃至８のいずれかに記載の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする点眼薬。
13. 請求項１乃至８のいずれかに記載の抗菌性ペプチドを含有することを特徴とする眼感染症疾患検査薬。