KR20140068238A

KR20140068238A - 세포 유착을 방지하기 위한 수생 기원의 조성물 및 그것의 사용 방법

Info

Publication number: KR20140068238A
Application number: KR1020147011383A
Authority: KR
Inventors: 아미르 즐로킨; 엘리아후 즐로킨
Original assignee: 텔 하쇼머 메디컬 리서치 인프라스트럭쳐 앤드 서비시스 리미티드．
Priority date: 2007-09-20
Filing date: 2008-09-21
Publication date: 2014-06-05
Also published as: KR101623991B1; WO2009037714A2; EP2197390B1; AU2008300156B2; KR20140068239A; WO2009037714A3; CA2700256C; SG10201701670SA; JP5823692B2; CA2700256A1; KR20100093030A; EP2197390A4; AU2008300156A1; CN101835668A; US20110119774A1; JP2014074077A; EP2197390A2; JP2010540431A; US9737571B2; SG193848A1

Abstract

수생 생물로부터 유래하는 추출물을 포함하는 조성물이 개시된다. 이 조성물은 세포의 표면 유착을 방지할 수 있고, 세포독성 또는 세포증식억제 활성을 갖지 않는다. 또한, 조성물을 포함하는 의료 장치 및 조성물을 사용하여 병리학적 감염을 예방 또는 치료하는 방법이 개시된다.

Description

세포 유착을 방지하기 위한 수생 기원의 조성물 및 그것의 사용 방법{COMPOSITIONS OF AQUATIC ORIGIN FOR PREVENTION OF CELL ADHESION AND METHODS OF USING SAME}

본 발명은 수생 생물의 추출물에 관한 것이며, 더 구체적으로는 세포 유착을 방지하기 위한 그것의 사용에 관한 것이다.

미생물은 자연환경에서 자유롭게 유영하는 개별 세포로서 살면서 증식할 수도 있고(플랑크톤으로서), 또는 표면 및 계면과 밀접히 관련되어 자체-생산 중합체 매트릭스에 둘러싸인 고도로 조직화된 다세포 군집체로서 성장할 수도 있다. 후자의 미생물의 생존방식을 균막이라고 한다. 균막 형성은 예로부터 보호 방식의 성장을 대표하는데, 적대적 환경에서 미생물의 생존을 허용하고, 미생물을 분산시켜 새로운 활동영역에 군락을 이루도록 한다[Hall-Stoodley et al., Nat Rev Microbiol. (2004) 2(2):95-108].

균막의 조성은 복잡하며, 상이한 미생물 종들에서 가변적이고, 환경 조건이 다르면 심지어 동일한 종들에서도 조성이 다양하다. 그렇지만 균막 형성은 자연환경에서 미생물의 일반적인 생존방식이며, 모든 미생물은 균막을 만들 수 있다. 선행 연구는 박테리아 균막 형성이 단백질 프로필에 차이가 있는 다수의 발생 단계를 통해서 진행된다는 것을 밝혀냈는데[Sauer et al., J. Bacteriol. (2002) 184(4): 1140-54], 이것은 표면 유착에서 시작하여 이주와 분할로 이어져 미소군락이 형성되고, 마지막으로 매트릭스 중합체의 발현을 수반하는 성숙으로 끝난다. 각 균막 단계에서 박테리아는 표현형을 나타내며, 플랑크톤 방식으로 성장하는 동일한 군과는 현저히 다른 특성을 지닌다[Sauer et al., J. Bacteriol. (2004) 186(21):7312-26].

균막은 인체의 전신 감염(예를 들어, 원내 감염)의 주요 원인이다. 신체에서 균막은 조직(예를 들어, 내이, 치아, 잇몸, 폐, 심장판막 및 비뇨생식관)과 관련될 수 있다. 인체의 박테리아 감염의 65%는 사실상 균막이라고 추정된다. 이에 더하여, 균막 형성 후, 미생물은 그들의 특성을 때로는 과감하게 변화시키는 경향이 있는데, 이로써 진탕 배양물에서는 일반적으로 유기물을 죽이는 항생제 용량이 이 유기물이 유착된 또는 덩어리진 균막 형태일 때는 같은 미생물에 대해서 전혀 비효과적이게 된다(미국특허 제7189351호).

체내에 도입되거나(예를 들어, 콘택트렌즈, 중심정맥 카테테르, 기계 심장판막 및 페이스메이커), 또는 체내로의 경로를 제공하는 제품과 관련된 주된 우려 중 하나는 미생물 감염 및 항존하는 균막 형성이다. 이런 감염은 항생제로 치료하기가 어렵기 때문에 대부분 장치를 제거해야 하는데, 이것은 환자에게 외상을 입히고 의료 비용을 증가시킨다. 따라서, 이러한 의료 기구에 있어서 현재 기술은 이런 의료 기구 및 장치를 항균성으로 만드는 수단 및 방법을 오랫동안 추구해오고 있다.

이전 보고서들은 해양 환경에 존재하는 많은 연체 해양 무척추 동물들, 예를 들어 해면[Amade et al., Mar. Biol. (1987) 94:271-275; Wilsanand et al., Ind. J. Mar. Sci. (1999) 28:274-279], 피낭류[Wahl et al., Mar. Ecol. Prog. Ser. (1994) 110:45-57], 및 연산호류[Aceret et al. Comp. Biochem. Phys. (1998) 120: 121-126; Kelman et al., Mar. Ecol. Prog. Ser. (1998) 169:87-95]가 항균 및 항진균 활성을 나타내는 2차 대사산물을 생산한다고 제시하였다[Harder et al., FEMS Microbiology Ecology (2003) 43(3):337-347]. 또한, 말미잘(예를 들어, Actinia equina)은 이퀴나톡신이라고 명명된, 액티노포린 과에 속하는 독성의 기공-형성 펩티드를 생산하다고 알려져 있다[Kristan et al., J. Biol. Chem. (2004) 279(45): 46509-17]. 이퀴나톡신(즉, 이퀴나톡신 1, 2 및 3)은 말미잘 Actinia equine의 촉수와 몸통으로부터 아세톤 침전, Sephadex G-50, CM-셀룰로오스 및 CM-Sephadex 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다[Macek P. and Lebez D., Toxicon. (1988) 26 (5):441-51]. 이런 독성 단백질들은 다른 작은 항균 펩티드와 유사하게 표적 세포막에 환상면체 단백질-지질 기공을 형성함으로써 진핵세포를 녹여 죽인다[Anderluh et al., J. Biol. Chem. (2003) 278(46):45216-45223].

해양-수생 식물 및 동물들은 매우 다양하며 풍부한 균막 형태의 잠재적 유해 미생물에 계속 노출되고, 해양 생활이 항균 펩티드를 생산한다고 알려져 있으므로, 균막 형성을 방해하는 광범한 자연 인자들도 바다 속에 존재할 가능성이 있다.

미국공개공보 제20070098745호는 리프 피시 마이크로플로라(reef fish micro flora)를 사용하여 균막 형성을 방지하는 수단을 개시한다. 본 발명은 건강한 산호 리프 피시(예를 들어, Sparisoma ninidae 및 Lutjanus purpureus)의 상피 점막면에서 분리된 박테리아로부터 유래하는 균막방지 물질을 설명한다. 상기 박테리아 분리주는 균막 형성을 방지하는 신호 또는 독소를 생산한다.

균막 및 이들의 유해한 효과의 압도적인 우세로 인해, 신규의 균막방지제를 식별하는 것의 필요성이 여전히 광범위하게 인식되고 있으며, 이것은 매우 유리할 것이다.

한 양태에 따라서, 유기물의 표면 유착을 방지하거나 감소시키고, 세포독성 또는 세포증식억제 활성이 없는, 수생 생물로부터 유래하는 활성제를 포함하는 조성물이 제공된다.

하기 설명된 본 발명의 구체예의 다른 특징에 따라서, 활성제는 실질적으로 전체 수생 생물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 활성제는 수생 생물의 균질물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 활성제는 수생 생물로부터 유래하는 분리된 추출물을 포함한다.

또 다른 특징에 따라서, 분리된 추출물은 조 추출물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 분리된 추출물은 극성 추출물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 극성 추출물의 극성 용매는 아세토니트릴을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 활성제는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 폴리펩티드는 19863 Da, 9926 Da, 8261 Da 및 3655 Da으로 구성되는 군으로부터 선택된 피크 질량을 특징으로 한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 활성제는 적어도 하나의 다당류를 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 활성제의 활성은 동결건조 후 보존된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 수생 생물은 고착(sessile) 생물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 수생 생물은 어류를 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 어류는 뱀장어 및 메기로 구성되는 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 고착 생물은 고착 유자포(Cnidarian) 동물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 고착 유자포 동물은 산호, 말미잘, 바다조름, 수생 유충, 관 거주 말미잘(tube-dwelling anemone) 및 히드로충으로 구성된 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 고착 유자포 동물은 말미잘을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 말미잘은 Actinia equine을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 말미잘은 Aiptasia pulchella을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 고착 유자포 동물은 히드로충을 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 히드로충은 Chlorohydra viridissima 및 Hydra vulgaris로 구성되는 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 극성 추출물은 말미잘의 촉수 조직 또는 에커라지(acrorhagi) 조직으로부터 유래한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 말미잘은 Actinia equine이다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, Actinia equine로부터의 극성 추출물은 전체 조성물 중 약 1 내지 약 10%(v/v)의 범위로 아세토니트릴을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, Actinia equine로부터의 극성 추출물은 전체 조성물 중 약 40 내지 약 60%(v/v)의 범위로 아세토니트릴을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 극성 추출물은 Aiptasia pulchella로부터 유래한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, Aiptasia pulchella로부터의 극성 추출물은 약 8-12% 아세토니트릴, 약 16-20% 아세토니트릴, 약 22-26% 아세토니트릴 및 약 26-30% 아세토니트릴로 구성되는 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 유기물은 단세포 생물이다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 조성물은 또한 세포의 응집을 억제할 수 있다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 단세포 생물이 균막에 포함된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 단세포 생물은 박테리아, 진균, 원생동물 및 고세균(archaea)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 진균은 효모를 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 표면은 직물, 섬유, 폼, 필름, 콘크리트, 석조물, 유리, 금속 및 플라스틱으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 표면은 생물학적 조직을 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 생물학적 조직은 포유류 조직을 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 포유류 조직은 피부를 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 본 조성물의 제형은 스프레이, 젤, 도료 및 크림으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

다른 양태에 따라서, 단세포 생물의 표면 유착을 방지하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 단세포 생물을, 단세포 생물의 표면 유착을 방지할 수 있는 수생 생물로부터 유래하는 활성제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 활성제는 세포독성 또는 세포증식억제 활성을 갖지 않는다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 활성제는 조 추출물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 활성제는 극성 추출물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 활성제는 실질적으로 전체 수생 생물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 극성 추출물은 적어도 하나의 분리된 폴리펩티드를 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 분리된 폴리펩티드는 이퀴나톡신을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 극성 추출물은 적어도 하나의 분리된 다당류를 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 유기물의 유착 방지는 시험관내에서 행해진다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 유기물의 유착 방지는 생체외에서 행해진다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 유기물의 유착 방지는 생체내에서 행해진다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 단세포 생물은 박테리아, 진균, 원생동물 및 고세균으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 표면은 직물, 섬유, 폼, 필름, 콘크린트, 석조물, 유리, 금속 및 플라스틱으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 표면은 조직이다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 조직은 포유류 조직을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 포유류 조직은 피부를 포함한다.

다른 양태에 따라서, 단세포 생물의 표면 유착을 방지할 수 있는, 수생 생물로부터 유래하는 활성제와 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 본 조성물의 제형은 스프레이, 크림 및 젤로 구성되는 군으로부터 선택된다.

또 다른 양태에 따라서, 필요한 피험자에게 병원균 감염을 예방 또는 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 제약 조성물의 치료적 유효량을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이로써 병원균 감염이 치료 또는 예방된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 치료는 생체내에서 행해진다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 치료는 생체외에서 행해진다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 병원균 감염의 병원성 유기물은 균막 내에서 또는 균막 위에서 성장할 수 있다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 병원균 감염은 박테리아 감염을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 박테리아 감염은 그람 양성 박테리아를 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 그람 양성 박테리아는 Staphylococcus aureus이다.

*설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 박테리아 감염은 그람 음성 박테리아를 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 그람 음성 박테리아는 Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa 및 Escherichia coli로 구성되는 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 병원균 감염의 병원성 유기물은 항생제 내성이다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 병원균 감염은 진균 감염, 원생동물 감염, 박테리아 감염 및 고세균 감염으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

추가 양태에 따라서, 균막방지 조성물을 식별하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 수생 생물로부터의 복수의 조성물을 균막 형성 박테리아와 접촉시키는 단계, 복수의 조성물의 존재하에 균막 형성 박테리아의 균막 활성을 분석하는 단계, 및 복수의 조성물로부터 정해진 역치 이상의 균막방지 활성을 갖는 적어도 하나의 조성물을 식별하는 단계를 포함하며, 이로써 균막방지 조성물이 식별된다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 수생 생물은 고착 생물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 수생 생물을 어류를 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 고착 생물은 고착 유자포 동물을 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 고착 유자포 동물은 산호, 말미잘, 바다조름, 수생 유충, 관 거주 말미잘 및 히드로충으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 수생 생물의 복수의 조성물은 조 추출물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 조 추출물은 촉수 조직으로부터 유래한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 조 추출물은 에커라지 조직으로부터 유래한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 수생 생물의 복수의 조성물은 극성 추출물을 포함한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 극성 추출물은 촉수 조직으로부터 유래한다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 촉수 조직은 Actinia equine로부터 유래한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 균막 형성 박테리아는 그람 양성 박테리아를 포함한다.

설명된 구체예의 다른 특징에 따라서, 균막 형성 박테리아는 그람 음성 박테리아를 포함한다.

다른 추가 양태에 따라서, 본원에 설명된 조성물 중 어느 것을 포함하는 의료 장치가 제공된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 의료 장치는 체내 장치이다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 의료 장치는 체외 장치이다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 조성물이 장치의 표면에 코팅된다.

설명된 구체예의 또 다른 특징에 따라서, 조성물이 의료 장치의 중합체 매트릭스 안에 혼입된다.

다른 추가 양태에 따라서, 이식 의료 장치에 대한 세포 유착을 방지하기 위한 본 발명의 조성물의 사용이 제공된다.

다른 추가 양태에 따라서, 의료 기기에 대한 세포 유착을 방지하기 위한 본 발명의 조성물의 사용이 제공된다.

다른 추가 양태에 따라서, 수면 밑 표면의 균막 형성 또는 오염을 방지하거나 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 설명된 조성물 중 어느 것으로 물을 처리하는 단계를 포함한다.

다른 추가 양태에 따라서, 수면 밑 표면의 균막 형성 또는 오염을 방지하거나 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 설명된 조성물 중 어느 것으로 표면을 코팅하는 단계를 포함한다.

본 발명은 고착 수생 생물의 조성물을 제공함으로써 현재 알려진 단세포 생물의 유착 및 균막 형성의 단점을 성공적으로 다룬다. 또한, 본 발명은 제약 조성물, 균막방지 조성물을 식별하는 방법 및 병리학적 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 뿐만 아니라, 수생 생물로부터 유래하는 균막방지 조성물이 유착되어 포함되는 의료 장치를 제공한다.

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들도 본 발명의 실시나 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 아래 설명된다. 모순이 있는 경우 정의 부분을 포함하는 특허 명세서가 조절될 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 예들은 단지 예시하는 것이며, 제한을 의도하지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "포함하는" 및 "비롯한" 또는 이들의 문법적 변형들은 명시된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소를 특정하는 것으로서 이해되어야 하지만, 하나 이상의 추가적 특징, 정수, 단계, 구성요소 또는 이들의 그룹의 추가를 배제하는 것은 아니다. 이 용어는 용어 "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는"을 포괄한다.

용어 "본질적으로 구성되는" 또는 그것의 문법적 변형들은 본원에서 사용되었을 때 명시된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소를 특정하는 것으로서 이해되어야 하지만, 하나 이상의 추가적 특징, 정수, 단계, 구성요소 또는 이들의 그룹의 추가를 배제하지는 않으며, 단 추가의 특징, 정수, 단계, 구성요소 또는 이들의 그룹은 청구된 조성물, 장치 또는 방법의 기본적인 신규한 특성을 실질적으로 변경하지 않아야 한다.

용어 "방법"은 주어진 과제를 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 과정을 말하며, 제한되지는 않지만, 공지된 방식, 수단, 기술 및 과정이나, 화학, 생화학 및 생물물리학 분야의 전문가들에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 과정으로부터 쉽게 개발되는 방식, 수단, 기술 및 과정을 포함한다.

용어 "활성제"는 유착방지 효과를 갖는 수생 생물로부터 유래하는 어떤 제제를 말하며, 살아 있는 전체 생물, 그것의 일부, 그것의 균질물 또는 추출물을 포함하고, 추출물은 조 추출물 또는 극성 추출물을 포함한다.

본 발명에 의하면, 유기물의 표면 유착을 방지하거나 감소시키고, 세포독성 또는 세포증식억제 활성이 없는, 수생 생물로부터 유래하는 활성제를 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 단지 예시로서만 본원에서 설명된다. 이제 도면을 상세히 구체적으로 참조하여, 나타낸 특정 사항들이 본 발명의 바람직한 구체예를 예를 들어 논의하기 위한 목적으로 예시하는 것일 뿐이며, 본 발명의 원리 및 개념적 양태의 설명이 가장 유용하고 쉽게 이해된다고 생각되는 것을 제공하기 위한 목적에서 제시된다는 것이 강조된다. 이와 관련하여, 본 발명의 근본적인 이해에 필요한 것을 넘어서서 더 상세히 본 발명의 구조적인 세부사항을 나타내려고는 시도하지 않으며, 도면과 함께 발명의 설명을 읽는다면 본 발명의 몇몇 형태가 실제로 구형될 수 있는 방법이 당업자에게 분명해질 것이다.
도 1a-b는 말미잘 Actinia equina를 묘사한 그림이다. 도 1a는 에커라지(영영 공격 기관)가 연장된 상태의 일반적인 도면을 나타낸다. 크기는 약 5-6cm 높이이다. 도 1b는 여러 기관을 강조하여 나타낸 Actinia의 도식도이다.
도 2는 어류 및 유자포 동물의 조 추출물의 유착방지 효과를 나타낸 그래프이다. 어류(뱀장어, 메기)로부터 수집된 표면 점액 및 고착 유자포 동물(2종의 히드라와 말미잘)의 균질물 유래 샘플을 전염성 임상 박테리아 균주인 Acinetobacter baumannii과 함께 인큐베이션하고, 크리스탈 바이올렛 분석을 이용하여 박테리아의 유착을 시험했다. 3개의 상이한 샘플 희석물(PBS)에서 100% 양성 대조군과 비교한 박테리아 유착 퍼센트로서 결과가 표시된다.
도 3a-d는 Actinia equine로부터의 유착방지 분획들의 크로마토그래피 분리 및 특성화를 나타낸 그래프이다. 도 3a 및 3b는 에커라지(도 3a)와 촉수(도 3b) 조직 추출물의 RP-HPLC C-8 칼럼 크로마토그래피 분리를 나타낸다. 215nm에서 용출 패턴을 모니터했다. 도 3c는 Acinetobacter baumannii에 대해 선택된 촉수 분획들의 유착방지 효과를 나타내며, 이때 양성 대조군은 PBS를 이용했다. Actinia 촉수 조직의 크로마토그래피 분리에 의해 얻어진 분획들 - 이들의 유착방지 효과, 각 분획은 1:50으로 희석되었다. 기록 중, 촉수 분리에서 가장 활성인 분획들(20% 미만의 유착)(13-14, 17-20, 45-46)은 적색 원으로 표시되며(도 3b 참조), 추가의 특성화를 위해 선택되었다. 표시된(화살표) 에커라지 분획들에 의해서도 유사한 효과가 얻어졌다(도 3a 참조, 데이터 나타내지 않음). 도 3d는 선택된 분획들에 존재하는 단백질의 겔 전기영동을 나타낸다. 15% 변성 SDS-PAGE 겔 후 은 염색하여 활성 분획들이 분리되었다(실시예 2에 상세히 설명된 대로). 분획 45와 46은 많은 단백질 밴드를 드러낸 반면, 나머지 분획들은 약 60 kDa의 분자량을 가진 단백질 쌍을 거의 독점하여 드러냈다. 기록 중, 약 8 kDa보다 짧은 펩티드는 관찰될 수 없었다.
도 4는 유착방지 활성의 열 불안정성을 나타낸 막대 그래프이다. 촉수 분리물 분획 17을 첨가하거나 재조합 이퀴나톡신을 사용하여 폴리스티렌 마이크로플레이트에 대한 A. Baumannii의 유착이 분석되었으며, 둘 다 열 비활성화가 있기도 하고 없기도 하다. 두 화합물 모두 1:100 희석하여 시험하였고, 대조군 PBS(100%) 대비 유착 퍼센트로 결과가 표시된다.
도 5는 상이한 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 대한 분획 13의 유착방지 활성을 나타낸 막대 그래프이다. 1:100으로 희석한 촉수 분리물 분획 13을 사용하여 Acinetobacter baumanni , Staphylococcus aureus , Pseudomonas aurigenose 및 E. coli의 4개 임상 분리주에 대한 마이크로플레이트 유착 생물학적 분석이 수행되었다. 박테리아 유착(청색)은 PBS 대조군(100% 유착, 적색) 대비 퍼센트로서 표시된다. 기록 중, S. aureus는 그람 양성 박테리아이고, 나머지는 그람 음성 박테리아이다.
도 6a-c는 박테리아 유착에 대한 세 가지 상보적 분석이다. 도 6a는 고-처리량 폴리스티렌 마이크로플레이트 분석을 나타낸다. S. aureus(ATCC 25923)가 96-웰 둥근-바닥 폴리스티렌 플레이트에서 성장되었고(실시예 3에 상세히 설명된 대로), 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색되었다. 유착된 세포의 정량을 위하여, 웰에 남은 크리스탈 바이올렛 용액을 1% SDS 250μl에 용해하고, 595nm에서 광학 밀도를 판독하였다. A. equina 촉수의 조 물질의 유착방지 효과가 3개 희석물 1:10, 1:100 및 1:1000을 사용하여 3번 조사되었고, 양성 대조군(PBS와 함께 인큐베이션된 박테리아)과 비교되었다. 결과(도 6a의 아래 패널)는 분광광도 측정에 기초한다. 도 6b는 정성적 관찰을 나타낸다. S. aureus(ATCC 25923)가 5ml 폴리스티렌 관에서 2ml 배지 중에서 성장되었고, 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색되었다(실시예 3에 더 설명된 대로). 기록 중, 상이한 희석 비의 조 물질의 첨가로 인해 유착된 박테리아가 감소된 것이 관찰될 수 있다. 도 6c는 유리 슬라이드 상에 균막 형성에 대한 형광 현미경 분석을 나타낸다. 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 플라스미드를 함유하는 E. coli(DH5-α 균주 U85)가 A. equina 촉수 추출물, 이 추출물로부터의 2개의 크로마토그래피 분획(14, 17), 또는 재조합 이퀴나톡신을 가진 유리 커버 슬라이드 상에 평판되었다. 1, 7 및 22시간 후에 반전 에피-형광 1x2-81 현미경(Olympus, 미국)을 사용하여 유착된 박테리아가 가시화되었다. 기록 중, 박테리아를 A. equina 촉수 추출물, 이 추출물로부터의 2개의 크로마토그래피 분획(14, 17), 또는 재조합 이퀴나톡신과 함께 인큐베이션한 것은 박테리아 유착의 제거를 야기한다. 이들 결과는 규막 형성 방지가 초기 유착 단계에서 일어난다는 것을 시사한다.
도 7a-b는 활성 피크의 선택 및 MS 분석을 나타낸 그래프이다. 도 7a는 RP-HPLC에 의해 이전에 얻어진 활성 물질(T-18)(도 3)을 동일한 칼럼에서 다시 크로마토그래피하고, 피크를 수집한 것을 나타낸다. 활성 피크 75(적색 화살표)가 매트릭스로서 시나핀산을 사용하여 MALDI-TOF에 의해 측정되었다. 도 7b는 얻어진 스펙트럼에서 19863, 9926, 8261, 3655 Da의 질량에 존재하는 몇몇 피크가 단백질일 가능성을 나타낸다. 기록 중, 이들 데이터는 관련 물질들을 분리하여 화학적으로 특성화하는 능력을 나타낸다. 이퀴나톡신(Eq)의 활성이 두드러진다.
도 8은 Aiptasia pulchella 조 추출물의 분리를 나타낸 그래프이다. 도면은 조 추출물의 Sephadex G-10 크로마토그래피를 나타내며, 2개의 분획이 산출되었고, 이들은 모두 유착/균막 형성 방지 활성을 나타낸다.
도 9는 Sephadex G-10으로부터의 고 분자량 분획을 Sephadex G-75에서 다시 크로마토그래피한 것을 나타낸 그래프로서, 얻어진 2개의 주 피크는 고 분자량 분획 및 저 분자량 분획을 나타낸다.
도 10은 G-75 칼럼으로부터의 저 분자량 분획을 C-18 칼럼 RP-HPLC를 사용하여 분리한 것을 나타낸 막대 그래프이다. 이 분리에 의해 활성 분획들(분획 2 및 3 - 적색 원으로 표시)을 포함하는 몇몇 분획이 산출되었으며, 이들은 MS 분석 후 다당류로서 확인되었다.
도 11a-c는 크기에 기초한 다당류의 분리 프로필을 나타낸 도면이다. 도 11a 및 11b는 분획 2 및 3의 HPLC 분석을 나타내며, 여기서 상이한 피크들에 번호가 매겨진다. 도 11c는 덱스트란 래더 - 글루코오스 올리고머의 평균 래더를 나타낸다. 기록 중, 도 11a와 11b 모두에서 주 피크(피크 번호 1)는 디-글루코오스(원으로 표시)를 나타낸다.
도 12는 G-75 칼럼으로부터의 고 분자량 분획의 RP-HPLC 분리를 나타낸 도면이다. 이 분리에 의해 높은 유착방지 활성을 가진 적어도 3개 분획(13, 18 및 20)이 산출되었다. MS 분석 및 겔 전기영동은 활성 분획들이 펩티드임을 나타냈다.

본 발명은 세포 유착의 방지를 위한 수생 생물로부터 추출된 조성물 및 이것의 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명의 원리 및 작동은 도면 및 첨부된 설명을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.

본 발명의 적어도 한 구체예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 다음의 설명에서 제시되고 실시예에 의해 예시된 세부사항에 본 발명의 적용이 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 다른 구체예들을 가질 수도 있고, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수도 있다. 또한, 본원에서 사용된 문구 및 용어는 설명을 위한 것일 뿐이며, 제한으로 간주되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다.

의약 분야에서 주된 우려 중 하나는 미생물 균막 형성이다. 사람에 있어서 균막은 전신 감염(예를 들어, 원내 감염)의 원인이며, 체내에 제품(예를 들어, 콘택트렌즈, 중심정맥 카테테르, 기계 심장판막 및 페이스메이커)를 도입할 때의 중요한 문제이다. 또한, 균막은 식품, 제약, 도료, 수도, 해운 및 공학 산업을 비롯한 많은 산업분야에서 문제를 일으키며, 특히 광범한 부정적 효과로서 산업 시스템의 부식, 기름 산패 및 생물오염을 가속한다. 균막은 그 안에서 성장하고 있는 미생물이 매우 조직적이고 고온 및 항균제(예를 들어, 항생제)와 같은 적대적 환경을 견딜 수 있기 때문에 제거하기가 매우 어렵다.

앞서 해양 생물(예를 들어, 해면)이 항박테리아 및 항진균 활성을 나타내는 2차 대사산물을 생산한다는 것이 보고되었다[Amade et al, supra]. 또한, 말미잘(예를 들어, Actinia equina)은 독성 기공-형성 펩티드(즉, 이퀴나톡신)을 생산한다고 알려져 있으며, 이것은 다른 작은 항균 펩티드와 유사하게 진핵 세포를 녹여 죽인다[Anderluh et al., supra]. 실시를 위해 본 발명을 한정하는 동안, 본 발명자들은 수생 고착 생물이 균방방지 특성을 포함한다는 것을 발견했다.

이후 설명 및 이어진 실시예 단락에 나타낸 대로, 본 발명자들은 본 발명의 교시에 따라서 추출된, 어류(뱀장어, 메기) 및 고착 유자포 동물(히드로충 및 말미잘)의 조 추출물이 박테리아의 표면 유착을 방지한다는 것을 발견했다(도 2). 이들 추출물은 살균성은 아니었으며, 박테리아의 성장에 영향을 미치지 않았다(하기 표 1, 실시예 2). 박테리아 유착방지 효과는 Actinia equina 촉수의 분리된 분획뿐만 아니라 Actinia equina 에커라지 조직에 대해서도 실질적이었다(도 3a-d). 분리된 분획의 유착방지 효과는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 대해 유사하게 효과적이었고(도 5), 박테리아 유착과 그에 따른 균막 형성을 억제했다(도 6c). Actinia equina 분획 중의 활성제는 폴리펩티드인 것으로 확인되었다(도 7b). 이에 더하여, Aiptasia pulchella의 조 추출물도 유착/균막 형성 방지 활성을 나타냈다(도 10). Aiptasia pulchella 중의 활성제는 다당류 및 폴리펩티드인 것으로 확인되었다(도 10-12).

Actinia equine로부터의 활성 단백질은 이퀴나톡신 2-이퀴나톡신-2 전구물질 (Equinatoxin II)(EqT II)(EqTII)이다. Genbank ACCESSION no. P61914:

본 발명의 교시들을 함께 습득하면 수생 고착 생물, 특히 고착 유자포 동물로부터 유래하는 광범한 신규의 유착방지 제제들이 그려진다. 이들 제제의 광범한 유착방지 효과(예를 들어, 그람 양성 및 그람 음성 박테리아의 유착 억제)는 미생물 균막 형성의 취약한 초기 단계에 영향을 미치는 능력과 함께 이들 제제를 균막방지제의 주요 후보로 만든다. 더욱이, 본원에 설명된 유착방지제는 클론성이므로, 변형 및 대량 생산이 가능하다. 또한, 이들의 안정성(즉, 환경 조건에 대한 내성)은 이들 제제를 다양한 용도에 적합하게 만든다.

따라서, 본 발명의 한 양태에 따라서, 표면에 대한 세포의 유착을 방지하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포의 표면 유착을 방지할 수 있는 수생 생물로부터 유래하는 조성물과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 이로써 세포의 표면 유착이 방지된다.

선택적으로, 세포는 단세포 생물을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "단세포 생물"은 단세포의 생물을 말하며, 미생물 또는 세균이라고도 한다. 본 발명의 단세포 생물은 진핵 단세포 생물(예를 들어, 원생동물 또는 진균, 예를 들어 효모) 또는 원핵 단세포 생물(예를 들어, 박테리아 또는 고세균)일 수 있다. 본 발명의 단세포 생물은 어떤 세포 환경에도 존재할 수 있으며, 예를 들어 분리된 세포로서 또는 세포 현탁물로서 균막에 존재할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "균막"은 미생물이 분산되고 및/또는 콜로니를 형성하는 세포외 매트릭스를 말한다. 균막은 전형적으로 다당류와 다른 거대분자로 이루어진다. 본 발명의 방법에 따라서 유착이 방지될 수 있는 예시적인 박테리아 세포는 그람 양성 박테리아 및 그람 음성 박테리아를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "그람 양성 박테리아"는 펩티도글리칸뿐만 아니라 다당류 및/또는 테이코산을 세포벽 구조의 일부로서 갖는 것을 특징으로 하는 박테리아를 말하며, 그람-염색 과정에서 청자색 반응을 특징으로 한다. 대표적인 그람 양성 박테리아는 Actinomyces spp ., Bacillus anthracis , Bifidobacterium spp ., Clostridium botulinum , Clostridium perfringens , Clostridium spp ., Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae , Corynebacterium jeikeium , Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium , Erysipelothrix rhusiopathiae , Eubacterium spp., Gardnerella vaginalis , Gemella morbillorum , Leuconostoc spp ., Mycobacterium abscessus , Mycobacterium avium complex , Mycobacterium chelonae , Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium haemophilium , Mycobacterium kansasii , Mycobacterium leprae , Mycobacterium marinum , Mycobacterium scrofulaceum , Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium terrae , Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium ulcerans , Nocardia spp ., Peptococcus niger , Peptostreptococcus spp., Proprionibacterium spp ., Sarcina lutea , Staphylococcus aureus , Staphylococcus auricularis , Staphylococcus capitis , Staphylococcus cohnii , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus haemolyticus , Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdanensis , Staphylococcus saccharolyticus , Staphylococcus saprophytics , Staphylococcus schleiferi , Staphylococcus similans, Staphylococcus warneri , Staphylococcus xylosus , Streptococcus agalactiae(group B streptococcus ), Streptococcus anginosus , Streptococcus bovis, Streptococcus canis , Streptococcus equi , Streptococcus milleri , Streptococcus mitior , Streptococcus mutans , Streptococcus pneumoniae , Streptococcus pyogenes ( group A streptococcus ), Streptococcus salivarius , Streptococcus sanguis를 포함한다.

본원에서 사용된 "그람 음성 박테리아"는 각 박테리아 세포를 둘러싸고 있는 이중막의 존재를 특징으로 한다. 대표적인 그람 음성 박테리아는 Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter baumannii , Actinobacillus actinomycetemcomitans , Aeromonas hydrophila , Alcaligenes xylosoxidans , Bacteroides , Bacteroides fragilis, Bartonella bacilliformis , Bordetella spp ., Borrelia burgdorferi , Branhamella catarrhalis , Brucella spp ., Campylobacter spp ., Chalmydia pneumoniae, Chlamydia psittaci , Chlamydia trachomatis , Chromobacterium violaceum, Citrobacter spp ., Eikenella corrodens , Enterobacter aerogenes , Escherichia coli , Flavobacterium meningosepticum , Fusobacterium spp ., Haemophilus influenzae , Haemophilus spp ., Helicobacter pylori , Klebsiella pneumoniae, Klebsiella spp ., Legionella spp ., Leptospira spp ., Moraxella catarrhalis, Morganella morganii , Mycoplasma pneumoniae , Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis , Pasteurella multocida , Plesiomonas shigelloides, Prevotella spp ., Proteus spp ., Providencia rettgeri , Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas spp ., Rickettsia prowazekii , Rickettsia rickettsii, Rochalimaea spp ., Salmonella spp ., Salmonella typhi , Serratia marcescens, Shigella spp ., Shigella sonnei , Treponema carateum , Treponema pallidum, Treponema pallidum endemicum , Treponema pertenue , Veillonella spp ., Vibrio cholerae , Vibrio vulnificus , Yersinia enterocolitica , Yersinia pestis를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "진균"은 키틴성 세포벽의 존재를 특징으로 하는 종속영양성 유기물을 말하며, 대부분의 종에서 다세포 균사로서 사상 성장을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 따라서 유착이 방지될 수 있는 대표적인 진균은 Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae , Candida glabrata , Candida parapsilosis 및 Candida dubliniensis를 포함한다.

본원에서 사용된 문구 "유착을 방지하는"은 세포의 표면 유착을 감소시키거나 제거하는 것을 말한다(예를 들어, 표면에서의 성장 속도를 감소시킴으로써). 바람직하게, 본 발명의 조성물은 세포 유착 분석에 의해서 측정했을 때, 세포 유착을 10% 정도까지, 더 바람직하게 20%까지, 더 바람직하게 30%까지, 더 바람직하게 40%까지, 더 바람직하게 50%까지, 더 바람직하게 60%까지, 더 바람직하게 70%까지, 더 바람직하게 80%까지, 더 바람직하게 90%까지, 가장 바람직하게 100%까지 방지한다. 예시적인 세포 유착 분석이 하기 설명 및 이어진 실시예 단락에 설명된다. 본 발명의 조성물이 세포 응집을 또한 방지할 수 있다는 것이 인정될 것이다(즉, 표면에서 세포가 응집되지 않음).

본 발명은 직물, 섬유, 폼, 필름, 콘크리트, 석조물, 유리, 금속, 플라스틱, 중합체 등을 포함하는 여러 다양한 표면에 대한 세포 유착의 방지를 고려한다. 한 구체예에 따라서, 표면은 균막 형성이 쉽게 될 수 있는 장치에 포함된다. 본 발명에 의해 표면이 고려되는 예시적인 장치는, 제한은 아니지만, 선체, 자동차 표면, 항공기 표면, 멤브레인, 필터, 및 산업 장비를 포함한다.

또한, 표면은 의료 장치, 기기 및 삽입물에 포함될 수 있다. 이러한 의료 장치, 기기, 및 삽입물의 예는 포유류 생물, 예를 들어 사람에게 일시적으로 또는 영구적으로 이식될 수 있는 어떤 물체를 포함한다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 대표적인 의료 장치, 기기 및 삽입물은, 예를 들어 중심정맥 카테테르, 도뇨관, 기관내관, 기계 심장판막, 페이스메이커, 혈관 이식물, 스텐트 및 보형관절을 포함한다. 의료 장치에 대한 세포 유착을 방지하는 방법, 및 이들의 추가의 예들이 하기 설명된다. 또 다른 구체예에 따라서, 표면은 생물학적 조직, 예를 들어 포유류 조직, 예를 들어 피부에 포함된다.

언급된 대로, 본 발명의 방법은 세포의 표면 유착을 방지할 수 있는 수생 생물로부터 유래하는 조성물을 세포와 접촉시킴으로써 행해진다. 본원에서 사용된 용어 "접촉하는"은 조성물 안에 포함된 활성제가 세포의 유착을 방지할 수 있는 방식으로 본 발명의 조성물이 유착성 세포와 직접 또는 간접적으로 접촉하도록 본 발명의 조성물을 배치하는 것을 말한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 원하는 표면에 도포하는 것과 및/또는 유착성 세포에 직접 도포하는 것을 모두 고려한다.

접촉은 생체내(즉, 포유류 체내에서), 생체외(즉, 몸에서 떼어 낸 세포에서) 및/또는 시험관내(즉, 포유류 몸 바깥에서)에서 행해질 수 있다.

조성물과 표면의 접촉은 분무, 살포, 적시기, 침지, 디핑, 도장, 초음파 용접, 접합 또는 접착을 포함하여 본 분야에 공지된 어떤 방법을 사용하여 행해질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단층 또는 다층으로 유착될 수 있다.

한 구체예에 따라서, 본 발명의 조성물은 전체 살아 있는 수생 생물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 미생물 유착을 방지하기 위해 표면과 접촉하고 및/또는 표면에 유착된 세포(예를 들어, 수중 파이프, 선체)와 접촉할 수 있도록 수면 밑 환경에 살아 있는 수생 생물을 첨가하는 것을 고려한다. 활성제가 수생 생물로부터 선택될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 이 경우, 수생 생물은 표면 또는 미생물 세포와 직접 접촉하지는 않지만, 활성제가 작용 부위로 확산될 수 있을 만큼의 충분히 근접하여 위치된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 물로 분비될 수 있어서, 예를 들어 해수나 염분이 있는 물의 탈염과 같은 물 정제 처리에 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 문구 "수생 생물"은, 예를 들어 어류 또는 고착 수생 생물과 같은 물속 환경(바다 또는 민물)에서 살고 있는 생물을 말한다.

본원에서 사용된 문구 "고착 수생 생물"은 생명 주기의 적어도 어느 일부분 동안 자유롭게 이동하지 못하는 수생 생물을 말한다. 수생 고착 생물은 일반적으로 기판에 물리적으로 고정되거나, 또는 어떤 다른 이유(예를 들어, 스톤 피시)로 인해서 어떤 종류의 단단한 기판, 예를 들어 바위나 선체에 영구적으로 유착된다.

고착 생물의 예는, 제한은 아니지만, 고착 유자포 동물, 예를 들어 산호, 말미잘(예를 들어, Actinia equine 및 Aiptasia pulchella), 바다조름, 수생 고착 유충(예를 들어, 해파리 유충), 관 거주 말미잘 및 히드로충(예를 들어, Chlorohydra viridissima 및 Hydra vulgaris)를 포함한다.

바람직하게, 본 발명의 상기 양태에 따라서 사용될 수 있는 어류의 예는 얕은 물에 거주하는 것들이나, 또는 바다의 밑바닥에, 때로는 구멍이나 동굴에 숨어 있는 것들이다. 이러한 어류는 뱀장어 및 메기를 포함한다.

다른 추가 구체예에 따라서, 본 발명의 조성물은 수생 생물로부터 분리될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "분리된"은 생체내 장소(예를 들어, 수생 생물)로부터 제거된 조성물을 말한다. 바람직하게, 본 발명의 분리된 조성물은 그 생체내 장소에 존재하는 다른 물질(예를 들어, 유착방지 효과를 포함하지 않는 다른 단백질)을 실질적으로 함유하지 않는다(즉, 정제되거나 반-정제된다).

따라서, 본 발명의 상기 양태의 한 구체예에 따라서, 본 발명의 조성물은 조 추출물 또는 극성 추출물일 수 있다.

본원에서 사용된 문구 "조 추출물"은 수생 생물 기원의 세포 또는 조직의 가공되지 않은 추출물을 말한다. 조 추출물을 얻는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 세포나 조직의 집합, 세포나 조직의 절개부분 및 균질 용해물을 포함한다.

본원에서 사용된 문구 "극성 추출물"은 극성 용매의 사용에 의해 더 정제된 조 추출물을 말한다. 아세토니트릴, 물 또는 암모니아와 같은 극성 용매가 본 분야에 잘 알려져 있으며, 분리된 분획을 얻는데 사용될 수 있다. 극성 분자로 이루어진 극성 용매는 극성 추출물 중에서 이온화되어 이온 화합물이나 공유 화합물을 용해시킬 수 있으며, 이로써 분리된 분획이 산출된다. 본 발명의 극성 추출물은 극성 용매를 임의의 퍼센트로 포함할 수 있으며, 예를 들어 1-10% 극성 용매, 10-20% 극성 용매, 20-30% 극성 용매, 30-40% 극성 용매, 40-50% 극성 용매, 50-60% 극성 용매, 70-80% 극성 용매, 80-90% 극성 용매 및 90-100% 극성 용매를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 양태의 한 구체예에 따라서, 극성 추출물은 말미잘(예를 들어, Actinia equine)의 촉수 조직 또는 에커라지 조직으로부터 유래된다. Actinia equine로부터 유래하는 예시적인 극성 추출물은 약 1-10% 아세토니트릴, 약 40-60% 아세토니트릴, 또는 약 70-90% 아세토니트릴(전체 조성물 중 v/v)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 극성 추출물은 Aiptasia pulchella로부터 유래할 수 있다. Aiptasia pulchella로부터 유래하는 극성 추출물은 약 8-12% 아세토니트릴, 약 16-20% 아세토니트릴, 약 22-26% 아세토니트릴, 또는 약 26-30% 아세토니트릴(전체 조성물 중 v/v)을 포함할 수 있다.

한 구체예에 따라서, 본 발명의 조성물 중의 활성제는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 본 발명자들은 Actinia equina 및 Aiptasia pulchella 분획에 존재하는 활성제가 폴리펩티드였다는 것을 알았다(Actinia equina에 대해서는 도 7b, Aiptasia pulchella에 대해서는 데이터 나타내지 않음). 비제한적 예는 SEQ ID NO:1이다. 따라서, 본 발명의 조성물에서 활성제로서 소용될 수 있는 폴리펩티드 제제는 19863 Da, 9926 Da, 8261 Da 또는 3655 Da의 피크 질량을 특징으로 하는 것들이다. 단백질 피크 질량은 당업자에게 공지된 임의의 기기, 예를 들어 매트릭스로서 시나핀산을 사용하는 MALDI-TOF(Voyager-DE STR Applied Biosystems)와 같은 MS 분석에 의해 측정된다.

또한, 본 발명의 조성물은 유전공학 기술을 사용하여 생체내 발현될 수도 있다(예를 들어, 트랜스제닉 수생 고착 생물을 이용).

*세포 유착 방지에 사용될 수 있는 수생 생물로부터 유래된 예시적인 폴리펩티드 제제는 이퀴나톡신이다. 이퀴나톡신(즉, 이퀴나톡신 1, 2 및 3)은 말미잘(예를 들어, Actinia equina)에서 발견되는 기공-형성 독소로서 본 분야에 잘 알려져 있다. 이퀴나톡신은 말미잘 세포에 포함될 수도 있고, 또는 이들로부터 분리될 수도 있다. 세포의 표면 유착을 억제하기 위해 본 발명의 교시에 따라서 어떤 이퀴나톡신도 사용될 수 있다.

또 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 조성물 중의 활성제는 다당류이다. 예를 들어, 본 발명자들은 Aiptasia pulchella에 존재하는 활성제가 다당류였다는 것을 알았다(도 10-11a-c). 따라서, 본 발명의 조성물에서 활성제로서 소용될 수 있는 예시적인 다당류 제제는 크기 배제 HPLC에 의해 특정된 것들이다. 다당류 특성화는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 PACE(탄수화물 겔 전기영동을 이용한 다당류 분석에 의해 행해질 수 있다.

본 발명의 상기 양태의 한 구체예에 따라서, 본 발명의 조성물은 세포독성이나 세포증식억제 활성을 갖지 않으며, 예를 들어 이들은 살균성이나 정균성이 아니다.

본 발명의 상기 양태의 다른 구체예에 따라서, 본 발명의 조성물의 활성제의 활성은 동결건조 후에 보존된다.

앞서 나타낸 대로, 본 발명의 조성물은 생체내에서 균막 형성을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 체내 감염을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있는 제약 조성물을 고려한다.

본원에서 사용된 "제약 조성물"은 본원에 설명된 활성 원료 중 하나 이상과 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분의 제제를 말한다. 제약 조성물의 목적은 생물에 화합물의 투여를 촉진하는 것이다.

본원에서 사용된 용어 "활성 원료"는 의도된 생물학적 효과를 야기할 수 있는 수생 생물 조성물(및 그로부터 정제된 제제)을 말한다.

이후, 문구 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "제약학적으로 허용되는 담체"는 호환하여 사용될 수 있으며, 생물에 유의한 자극을 일으키지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 파괴하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 애쥬번트가 이들 문구에 포함된다.

본원에서 용어 "부형제"는 활성 원료의 투여를 더 촉진하기 위해 제약 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 부형제의 예는, 제한되지는 않지만, 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당류 및 전분, 셀룰로오스 유도체들, 젤라틴, 식물성 기름, 및 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.

약물의 제형 및 투여 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences,"(Mack Publishing Co., Easton, PA)의 최근 판본에서 찾을 수 있으며, 이것은 참고자료로 본원에 포함되고, 이후 더 설명된다.

언급된 대로, 본 발명의 제약 조성물은 병원균 감염을 예방하거나 치료하기 위해 필요한 피험자에게 투여될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "필요한 피험자"는 포유류, 바람직하게는 사람 피험자를 말한다.

본원에서 사용된 용어 "치료하는"은 병원균 감염의 유해 효과의 치유, 역전, 약화, 완화, 최소화, 억제 또는 중단을 말한다.

본원에서 사용된 문구 "병원균 감염"은 병원성 유기물에 의해 야기되는 어떤 의학적 상태를 말한다. 병원균 감염의 예는, 제한되지는 않지만, 만성 감염 질환, 아급성 감염 질환, 급성 감염 질환, 바이러스성 질환, 세균성 질환, 원충성 질환, 기생충 질환, 진균성 질환, 미코플라즈마 질환, 고세균 질환 및 프리온 질환을 포함한다.

한 구체예에 따라서, 병원균 감염은 균막 내부나 균막 위에서 성장할 수 있는 유기물에 의해 야기된다.

미생물 균막에 의해 야기되는 병원균 감염의 예는 자연판막 심내막염(NVE), 중이염(OM), 만성 세균성 전립선염, 낭성 섬유증(CF) 및 치주염을 포함한다. 특별히 균막이 원인이 아닌 추가의 병원균 감염은, 제한되지는 않지만, 요도 감염, 여성 생식관 감염 및 폐렴을 포함한다. 의료 장치의 이식으로 인한 감염은 혈관 카테테르 감염, 동맥 보철물 감염, 인공심장판막의 감염, 보형관절 감염, 중추신경계 션트의 감염, 정형외과 이식물 감염, 페이스메이커 및 심장제세동기 감염, 혈액투석 및 복막투석 감염, 안구 감염, 도뇨관 감염, 여성 생식관의 감염, 기관내 삽관 및 기관절개술과 관련된 감염, 그리고 치의학적 감염을 포함한다.

본원에 사용된 문구 "병원성 유기물"은 질환을 야기할 수 있는 어떤 단세포 생물을 말하며, 특히 박테리아나 진균 같은 살아 있는 미생물을 말한다. 바람직하게, 병원성 유기물은 균막 내부나 균막 위에서 성장할 수 있다. 많은 흔한 병원성 유기물이 균막으로서 포유류(예를 들어, 사람)에 존재하며 질환을 일으킨다. 이들은, 제한되지는 않지만, Mannheimia haemolytica 및 Pasteurella multocida(폐렴을 일으킴), Fusobacterium necrophorum(간질환을 일으킴), Staphylococcus aureus 및 Pseudomonas aeruginosa(상처감염을 일으킴), Escherichia coli 및 Salmonella spp (장염을 일으킴), Staphylococcus aureus 및 Staphylococcus epidermidis(OM을 일으킴), 그리고 Streptococci sp., Staphylococci sp., Candida , 및 Aspergillus sp.(NVM을 일으킴)을 포함한다.

본 발명에 따른 감염성 질환의 치료가 본 분야에 공지된 다른 치료법과 조합될 수 있다는 것이 인정될 것이다(즉, 조합요법). 이들은, 제한은 아니지만, 페니실린, 세팔로스포린, 카르바페넴, 아미노글리코시드, 마크롤리드, 린코마이신, 테트라시클린, 클로람페니콜 및 그리세오풀빈과 같은 항균제를 포함한다.

적합한 투여 경로는, 예를 들어 경구, 직장, 경점막, 특히 경비강, 장내, 또는 비경구 송달을 포함할 수 있으며, 비경구 송달은 근육내, 피하 및 골수내 주사뿐만 아니라, 기관내, 직접 뇌내, 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 안내 주사를 포함한다.

또 다르게는, 전신 방식보다는 국소 방식으로 제약 조성물을 투여할 수 있는데, 예를 들어 제약 조성물을 환자의 조직 영역에 바로 주사할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 본 분야에 잘 공지된 과정, 예를 들어 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 포착화, 또는 동결건조 과정에 의해서 제조될 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 제약 조성물은 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 종래의 방식으로 제형화될 수 있으며, 부형제 및 보조제는 활성 원료가 제약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공되는 것을 촉진한다. 적합한 제형은 선택된 투여 경로에 따른다.

주사용으로는, 제약 조성물의 활성 원료는 수성 용액 중에, 바람직하게 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적 염 버퍼 같은 생리학적으로 적합한 버퍼 중에 제형화될 수 있다. 경점막 투여용으로는, 투과해야 하는 장벽에 적합한 침투제가 제형 중에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 본 분야에 공지되어 있다.

국소 투여용으로는, 본 발명의 조성물은 젤, 크림, 세척액, 헹굼액 또는 스프레이로서 제형화될 수 있다.

경구 투여용으로는, 제약 조성물은 활성 화합물을 본 분야에 잘 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 조합함으로써 쉽게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 제약 조성물을 환자에 의해 경구 섭취될 수 있는 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다. 경구 용도를 위한 약물학적 제제는 고체 부형제를 사용하여 제조될 수 있으며, 선택적으로 얻어진 혼합물을 분쇄하고, 원한다면 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물로 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 얻을 수 있다. 적합한 부형제는, 특히 충전제, 예를 들어 락토오스, 수크오로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당류; 셀룰로오스 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트래거캔스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 및 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스; 및/또는 생리학적으로 허용되는 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈(PVP)이다. 원한다면, 붕해제, 예를 들어 가교결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가, 또는 알긴산이나 그 염, 예를 들어 나트륨 알기네이트가 첨가될 수 있다.

당의정 핵은 적합한 코팅을 가질 수 있다. 이 목적을 위하여, 농축 당 용액이 사용될 수 있고, 이것은 선택적으로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 젤, 폴리에틸렌글리콜, 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 식별하거나 특성화하기 위한 목적으로 정제나 당의정 코팅에 염료나 안료가 첨가될 수 있다.

경구 사용될 수 있는 제약 조성물은 젤라틴으로 만들어진 푸시-핏 캡슐뿐만 아니라 젤라틴과 글리세롤이나 소르비톨 등의 가소제로 만들어진 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 락토오스 등의 충전제, 전분 등의 결합제, 탈크나 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 및 선택적으로 안정제와 함께 혼합된 활성 원료를 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서 활성 원료는 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌글리콜과 같은 적합한 액체에 용해되거나 현택될 수 있다. 추가로, 안정제가 첨가될 수 있다. 경구 투여용의 모든 제형은 선택된 투여 경로에 적합한 투약량이어야 한다.

협측 투여용으로는, 조성물은 종래의 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.

비강 흡입에 의한 투여용으로는, 본 발명에 따라서 사용되는 활성 원료가 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 함께 사용하는 가압팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 편리하게 송달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투약량은 계량된 양을 송달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 화합물과 락토오스나 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하는, 디스펜서에서 사용하기 위한, 예를 들어 젤라틴으로 된 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다.

본원에 설명된 제약 조성물은, 예를 들어 일시 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투약 형태, 예를 들어 앰풀로 제공되거나, 또는 다수 용량 용기로 제공될 수 있으며, 선택적으로 보존제가 첨가된다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼일 수 있고, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 상용 제제를 함유할 수 있다.

비경구 투여용의 제약 조성물은 수용성 형태의 활성 제제의 수성 용액을 포함한다. 추가로, 활성 원료의 현탁액이 적합한 유성 또는 물-기재 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참깨기름 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세리드 또는 리포솜 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한, 적합한 안정제 또는 활성 원료의 용해도를 증가시키는 제제를 함유할 수 있으며, 이로써 고도로 농축된 용액으로 제제를 만들 수 있다.

또 다르게는, 활성 원료는 분말 형태일 수 있고, 이것은 적합한 비히클, 예를 들어 멸균, 무-발열원, 물-기재 용액을 사용하여 사용하기 전에 복원된다.

또한, 본 발명의 제약 조성물은, 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 종래의 좌약 기재를 사용하여, 좌약 또는 정체관장제와 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.

본 발명과 관련하여 사용하기 적합한 제약 조성물은 활성 원료가 의도된 목적을 달성하는데 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 더 구체적으로, "치료적 유효량"은 병원균 감염 증상(예를 들어, 열)을 예방, 완화, 또는 개선하는데 효과적이거나, 또는 치료될 피험자의 생존을 연장하는데 효과적인 활성 원료(예를 들어, 수생 생물 조성물)의 양을 의미한다.

치료적 유효량의 결정은 당업자의 능력 범위 내이며, 특히 본원에 제공된 상세한 설명에 비추어 결정된다.

본 발명의 방법에서 사용되는 어떤 제제에 있어서, 투약량 또는 치료적 유효량은 시험관내 및 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정될 수 있다. 예를 들어, 원하는 농도 또는 역가를 달성할 수 있는 용량이 동물 모델에 처방될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 사람에게 유용한 용량을 더 정확하게 결정할 수 있다.

본원에 설명된 활성 원료의 독성 및 치료 효과는 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 시험관내 제약 과정에 의해서 측정될 수 있다. 이러한 시험관내 및 세포 배양 분석과 동물 연구로부터 얻어진 데이터를 사용하여 사람에게 사용하기 위한 투약량 범위를 처방할 수 있다. 투약량은 사용된 투약 형태 및 이용된 투여 경로에 따라서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 및 투약량은 전담 의사에 의해서 환자의 상태에 비추어 선택될 수 있다(예를 들어, Fingl, E. et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Ch. 1, p.l. 참조).

투약량 및 투여 간격은 생물학적 효과를 유도하거나 억제할 수 있는 활성 성분의 충분한 혈장 또는 뇌 농도를 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다(즉, 최소 유효 농도, MEC). MEC는 각 제제에 따라 변할 것이며, 시험관내 데이터로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하기 위해 필요한 투약량은 개체 특성 및 투여 경로에 의존할 것이다. 검출 분석을 사용하여 혈장 농도를 측정할 수 있다.

치료될 상태의 심각성 및 반응성에 따라서, 투약은 단일 투여 또는 복수 투여로 이루어질 수 있으며, 치료 과정은 수 일에서 수 주간 지속되거나, 또는 질환이 치유되거나, 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 지속된다.

투여될 조성물의 양은 물론 치료될 피험자, 질병의 심각성, 투여 방식, 주치의의 판단 등에 의존할 것이다.

본 발명의 조성물은 원한다면 FDA 승인 키트와 같은, 팩이나 디스펜서 장치에 제공될 수 있고, 이것은 활성 원료를 함유하는 단위 투약 형태를 하나 이상 함유할 수 있다. 팩은, 예를 들어 금속이나 플라스틱 호일, 예를 들어 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여 설명서가 수반될 수 있다. 또한, 팩이나 디스펜서 장치에는 의약의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부기구에 의해 규정된 서식의 공지가 수반될 수 있으며, 이러한 공지는 사람 또는 동물 투여를 위해 조성물의 형태가 정부기구에 의해 승인된 것을 반영한다. 이러한 공지는, 예를 들어 처방약물 또는 승인된 제품 삽입물에 미식품의약국에 의해 승인된 라벨을 유착하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 제약학적으로 허용되는 담체 중에서 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물을 제조하여 적합한 용기에 담은 후, 상기 더 상세히 설명된 대로, 지시된 상태의 치료에 관한 라벨을 유착할 수 있다.

언급된 대로, 의료 장치 및 삽입물은 통상 기회감염 박테리아 및 다른 감염성 미생물(예를 들어, 진균)로 감염되며, 어떤 경우 이식된 장치의 제거가 필요하다. 또한, 이러한 감염은 발병, 장기 입원, 또는 심지어 사망을 초래할 수도 있다. 따라서, 의료 장치의 균막 형성 및 감염의 예방이 매우 필요하다.

따라서, 본 발명은 또 상기 설명된 조성물이 유착된 의료 장치를 고려한다.

본원에서 사용된 용어 "의료 장치"는 질환 또는 다른 상태의 진단, 치료, 치유 또는 예방에서의 사용이 의도된 어떤 삽입물, 기기, 장비, 도구, 기계, 장치 또는 어떤 다른 유사한 또는 관련된 물체(어떤 구성요소 또는 부속요소를 포함하여)를 말한다. 이러한 의료 장치는 사람 또는 다른 동물에서 사용하도록 의도되며, 체내의 구조나 어떤 기능에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 이러한 의료 장치는 화학적 작용을 통해서는 그것의 일차적인 목적을 달성하지 못하며, 그것의 일차적 목적의 달성을 위해서 대사에도 의존하지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "삽입물"은 인체 내부에 배치되도록 의도된 살아 있는 조직이 아닌 어떤 물체를 말한다. 삽입물은 일시적이거나 영구적일 수 있다. 삽입물은 카테테르나 페이스메이커와 같은 인공 구성요소를 포함하는 물품일 수 있다. 또한, 삽입물은 살아 있는 조직의 생명력이 제거되도록 가공된 자연 유래의 물체를 포함할 수 있다. 예로서, 뼈 이식물은 살아 있는 세포는 제거되지만(무세포화), 숙주로부터 뼈 성장을 위한 주형으로서 소용될 수 있게 그 모양은 유지되도록 가공된다. 다른 예로서, 어떤 정형외과 및 치의학적 치료를 위해서 신체에 적용될 수 있는 히드록시아파타이트 제제가 얻어지도록 자연 발생 산호가 가공될 수 있다.

따라서, 본 발명은 세포 유착을 방지하기 위해 본 발명의 조성물로 의료 장치를 코팅하는 것을 계획하며, 이로써 이식 후 발생한다고 알려진 어떤 가능한 세포 응집 및 균막 형성을 감소/제거할 수 있다. 장치-관련 감염은 일반적으로 장치 삽입 또는 이식 과정 동안 미생물, 주로 박테리아가 유입된 결과이거나, 또는 새로 삽입된 장치에 혈행성 유기물이 유착된 후 이들이 장치 표면에서 증식한 결과이다. 따라서, 본 발명의 조성물을 사용한 의료 장치의 코팅은 하나 이상의 미생물 종의 균막 형성을 억제하고, 의료 장치 관련 감염을 방지할 것이며, 그 결과 항생제 치료나 피험자로부터 의료 장치를 제거할 필요성이 줄어들 것이다.

본 발명의 교시에 따라서 코팅될 수 있는 의료 장치는, 제한되지는 않지만, 인공혈관, 카테테르 및 환자에서 유체의 제거 또는 송달을 위한 다른 장치, 인공심장, 인공신장, 정형외과용 핀, 보형관절, 보철 판 및 삽입물; 카테테르 및 다른 관들(비뇨기관 및 담즙관, 기관내관, 말초 삽입가능한 중심정맥 카테테르, 투석 카테테르, 장기 터널형 중심정맥 카테테르, 말초정맥 카테테르, 단기 중심정맥 카테테르, 동맥 카테테르, 폐 카테테르, Swan-Ganz 카테테르, 요도 카테테르, 복막 카테테르를 포함); 요도 장치(장기 요도 장치, 조직접합 요도 장치, 인공 요도 스핑크터, 요도 딜레이터를 포함), 션트(심실 또는 동정맥 션트를 포함); 보철(유방 삽입물, 음경 보철물, 혈관이식 보철물, 동맥류 복구 장치, 기계 심장판막, 인공관절, 인공후두, 이과용 삽입물), 문합부위 장치, 혈관 카테테르 포트, 혈관 스텐트, 클램프, 색전성 장치, 상처 배액관, 안구용 렌즈, 치아 임플란트, 뇌수종 션트, 페이스메이커 및 이식가능한 심장제세동기, 무바늘 커넥터, 공성대 등을 포함한다.

본 발명의 수생 생물 조성물의 또 다른 가능한 용도는 의료 환경 및 치의학적 환경에서 발견되는 표면의 코팅이다. 이러한 표면은 일회용이거나 반복 사용되는 다양한 기기 및 장치의 내외부 측면을 포함한다. 이러한 표면은 의료 용도로 적합하게 된 전 범위의 물품을 포함하며, 제한되지는 않지만, 외과용 메스, 바늘, 가위, 및 침습적 수술, 치료 또는 진단 과정에 사용되는 다른 장치; 혈액 필터를 포함한다. 다른 예들도 본 분야의 전문가들에게 자명할 것이다.

또한, 의료 환경에서 발견되는 표면은 의료 장비의 부품, 건강관리 환경에서 개인이 착용하거나 지니고 있는 의료용 전동장치의 내외부 측면을 포함한다. 이러한 표면은 장갑, 앞치마 및 안면보호기와 같은, 의료 환경에서 감염성 유기물에 대한 생물학적 장벽으로서 의도된 표면을 포함할 수 있다. 생물학적 장벽에 흔히 사용되는 재료는 열가소성 또는 중합성 재료, 예를 들어 폴리에틸렌, 데이크론, 나일론, 폴리에스테르, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리우레탄, 라텍스, 실리콘 및 비닐이다. 다른 표면은 의료 과정에서 사용되거나, 또는 산소, 분무기에 넣은 용해된 약물 및 마취제의 투여를 포함하여 호흡기 치료에 사용되는 의료 기구, 관 및 캐니스터를 준비하기 위해 사용되는 영역에 있는 상판 및 고정물을 포함할 수 있다. 다른 이러한 표면은 멸균되지 않는 의료 또는 치의학용 장비의 핸들 및 케이블을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 표면은 혈액 또는 체액 또는 다른 위험한 생체물질이 흔히 직면하게 되는 영역에서 발견되는 관 및 다른 장치의 멸균되지 않은 외면을 포함할 수 있다.

본 발명의 수생 생물 조성물은 이들 의료 장치의 표면에 또는 내부에 사용될 수 있으며, 이로써 미생물 군락형성에 대한 장기적 보호를 제공하고, 장치-관련 감염의 발생을 줄일 수 있다. 또한, 이들 조성물은 의료 장치의 코팅제에 항균제(예를 들어, 항생제)와 함께 조합하여 혼입될 수 있다. 이러한 조합은 초기 군락형성 박테리아를 충분히 죽이거나 억제할 것이며, 이 물질이 장치-미생물 계면에 억제성 농도로 제공되는 한 장치-관련 감염을 방지할 것이다.

본 발명의 수생 조성물은 중합체 합성 단계나 장치 제조 단계에서 의료 장치의 중합체 매트릭스에 직접 혼입될 수 있다. 또한, 수생 조성물은 의료 장치 중합체에 공유 유착될 수 있다. 의료 장치를 코팅하는 이런 방법 및 다른 많은 방법들은 당업자에게 자명하다.

본 발명의 교시에 따라서 처리될 수 있는 추가 표면은 물 정제, 물 저장 및 물 수송에 관련된 물품, 그리고 식품 가공에 관련된 물품의 내외부 측면을 포함한다. 따라서, 본 발명은 내용물의 저장수명을 연장하기 위해 식품이나 음료 용기의 단단한 표면을 코팅하는 것을 계획한다.

또한, 건강과 관련된 표면은 영양, 위생 또는 질환 예방과 관련된 가정용품의 내외부 측면을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 수생 조성물은 외부 표면으로부터 질환-야기 미생물의 제거를 위해 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어 가정에서 사용하는 식품가공 기기, 유아를 돌보는데 사용되는 용품, 탐폰, 비누, 세제, 건강 및 스킨케어 제품, 가정용품 클리너 및 욕실 세면대를 포함할 수 있다.

또한, 표면은 실험실 물품일 수 있으며, 제한되지는 않지만, 현미경 슬라이드, 배양 후드, 페트리 접시, 또는 본 분야에 공지된 어떤 다른 적합한 타입의 조직 배양 그릇이나 용기를 포함한다.

또한, 본 출원의 발명자들은 오염방지제로서 본 발명의 수생 생물 조성물의 사용을 계획한다.

본원에서 사용된 용어 "오염방지제"는 단세포 생물의 유착으로부터 수면 밑 표면을 보호하는데 사용되는 화합물을 말한다. 이들 단세포 생물은 박테리아 및 진균과 같은 미생물을 포함한다.

이들 수면 밑 표면은 어떤 물에 잠긴 표면을 포함하며, 배/보트 선체(즉, 배나 보트의 몸통 또는 프레임), 잠수 차량, 항해 보조장치, 스크린, 그물, 구조물, 부유하거나 설치된 근해 플랫폼(예를 들어, 선착장), 부표, 신호 장치 및 바닷물이나 염분이 있는 물과 접촉하는 물품을 포함한다. 다른 수면 밑 표면은 말뚝, 해양 표지, 케이블 및 파이프 같은 바다밑 수송장비, 어업용 그물, 격벽, 냉각타워, 및 물에 잠긴 상태에서 운용되는 어떤 장치 또는 구조를 포함하여 바닷물에 노출된 구조를 포함한다.

본 발명의 수생 생물 조성물은 바람직하지 않은 해양 오염을 제한하기 위한 해양용 코팅제에 혼입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 오염방지제는 독성 물질(중금속 같은)을 함유하지 않으면서 그 효능은 잘 유지되도록 제형화될 수 있다. 본 발명의 오염방지 도료는 결합제(들), 안료(들), 용매(들) 및 첨가제(들)를 더 함유할 수 있다.

사용될 수 있는 용매의 예는 방향족 탄화수소, 예를 들어 자일렌 및 톨루엔; 지방족 탄화수소, 예를 들어 헥산 및 헵탄, 에스테르, 예를 들어 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 아미드, 예를 들어 N-메틸피롤리돈 및 N5N-디메틸포름아미드; 알콜, 예를 들어 이소프로필알콜 및 부틸알콜; 에테르, 예를 들어 다이옥산, THF 및 디에틸에테르; 및 케톤, 예를 들어 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤 및 메틸이소아밀 케톤을 포함한다. 용매는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 결합제의 예는 알키드 수지, 아크릴 또는 비닐 에멀젼, 폴리우레탄 수지, 에폭시 수지, 실리콘계 수지, 아크릴 수지, 무기 실리케이트계 수지, 비닐 수지, 특히 염화비닐/비닐 아세테이트 공중합체, 및 로진을 포함한다.

사용될 수 있는 안료의 예는 이산화티타늄, 산화구리, 산화철, 탈크, 알루미늄 플레이크, 운모 플레이크, 산화제2철, 티오시아네이트 구리, 산화아연, 아세테이트 메타-아르세네이트 제2구리염, 크롬산아연, 아연 디메틸 디티오카르바메이트, 아연 에틸렌 비스(디티오카르바메이트) 및 아연 디에틸 디티오카르바메이트를 포함한다.

코팅 조성물에 혼입될 수 있는 첨가제의 예는 제습제, 습윤/분산제, 침전방지제, 박리방지제, 건조/경화제, 훼손방지제 및 안정제 및 포말방지제로서 코팅 조성물에 일반적으로 사용되는 첨가제를 포함한다. 추가로, 해수에 비교적 불용성인 임의의 항생제가 해양용 오염방지 도료와 함께 사용될 수 있다.

해양용 오염방지 도료의 제조 방법은 미국특허 제4,678,512호; 미국특허 제4,286,988호; 미국특허 제4,675,051호; 미국특허 제4,865,909호; 그리고 미국특허 제5,143,545호에 상세히 설명된다.

본 발명이 균막방지 활성을 포함하는 제제를 식별하는 것을 포함하여 다양한 용도를 가진다는 것이 인정될 것이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 균막방지 조성물을 식별하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 수생 생물로부터 유래하는 복수의 조성물을 균막 형성 박테리아와 접촉시키는 단계; 복수의 조성물의 존재하에 균막 형성 박테리아의 균막 활성을 분석하는 단계; 및 복수의 조성물로부터 정해진 역치 이상의 균막방지 활성을 갖는 적어도 하나의 조성물을 식별하는 단계를 포함하고, 이로써 균막방지 조성물이 식별된다.

*본원에서 사용된 문구 "균막 형성 박테리아"는 균막을 형성하고 및/또는 거기에서 살 수 있는 어떤 박테리아를 말한다. 이러한 박테리아는 상기 더 설명된 대로, 그람 양성 및 그람 음성 박테리아를 포함한다.

본 발명자들이 나타낸 대로(실시예 3), 균막 형성 박테리아의 균막 활성 분석은 박테리아 유착 생물학적 분석에 의해 달성될 수 있다. 본 분야에 공지된 어떤 박테리아 유착 생물학적 분석도 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 고-처치량 폴리스티렌 마이크로플레이트 분석, 정성적 박테리아 유착 분석 또는 유리 슬라이드 위의 균막 형성에 대한 형광 현미경 분석을 포함한다.

본원에서 사용된 문구 "정해진 역치"는 표면에 유착되는 박테리아 수의 역치를 말한다. 바람직하게, 균막방지 조성물은 균막 형성을 10% 정도까지, 더 바람직하게 20%까지, 더 바람직하게 30%까지, 더 바람직하게 40%까지, 더 바람직하게 50%까지, 더 바람직하게 60%까지, 더 바람직하게 70%까지, 더 바람직하게 80%까지, 더 바람직하게 90%까지, 가장 바람직하게 100%까지 감소시킬 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "약"은 ±10%를 말한다.

본 발명의 추가의 목적, 이점 및 신규한 특징들은 다음의 실시예에서의 시험에 의하여 당업자에게 명백해질 것이며, 이러한 실시예는 제한을 의도하지 않는다. 추가로, 상기 묘사되고 하기 청구범위 부분에 청구된 본 발명의 다양한 구체예 및 양태는 다음 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.

실시예

상기 설명과 함께 이후 실시예를 참조하여 비제한적 방식으로 본 발명을 예시한다.

일반적으로 본원에서 사용된 명명법과 본 발명에서 이용된 실험실 과정은 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명된다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes HII Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 제시된 방법들; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III Cellis, J.E. ed.(1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed., (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980); 특허문헌 및 과학문헌에 광범하게 설명된 가용 면역분석법, 예를 들어 미국특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호, 그리고 제5,281,521호 참조; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., Eds., (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B.(1984) 및 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications" Academic Press, San Diego, California (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)를 참조하며, 이들은 모두 본원에 충분히 제시된 바대로 참고자료로 포함된다. 다른 일반적인 사항들도 이 문헌들의 도처에서 제공된다. 거기서 설명된 과정은 본 분야에 잘 공지되어 있다고 생각되며, 독자의 편의를 위해 제공된다. 거기에 함유된 모든 정보는 참고자료로 본원에 포함된다.

실시예 1

어류 및 유자포 동물 조 추출물은 유착방지 방식으로 작용한다

재료 및 실험 과정

유자포 동물 및 다른 실험 생물

말미잘인 Actinia equina 및 Aiptasia pulchella과 히드로충인 Chlorohydra viridissima 및 Hydra vulgaris를 포함하는 유자포 동물 및 다른 실험 생물들을 실험실에서 성장시켜 보존하거나, 그들의 자연 서식지로부터 직접 수집하였다.

샘플 수집

어류(뱀장어, 메기)의 표면 점액과 고착 유자포 동물(두 종류의 히드라와 말미잘)의 균질물로부터 샘플을 수집했다. 간단히 말해서, 말미잘 조직 300mg 습 중량을 절제하고 증류수(DDW)로 헹군 다음, 300μl 부피의 DDW 중에서 균질화하여(총 부피 약 500μl) 원심분리(3분, 14000x g)하고 예비여과했다(0.2μl).

박테리아 성장

모든 박테리아 균주는 실험마다 3벌씩 성장시켰다. Acinetobacter baumanni , Staphylococcus aureus, Pseudomonas aurigenose는 트립토 카제인 콩 육즙(TSB) + 0.25% D-글루코오스에서 성장시켰고, GFP를 발현하는 E. coli 균주 U85는 50μg/ml 카나마이신을 함유한 Luria-Bertani(LB)에서 성장시켰다.

박테리아 유착 생물학적 분석

균막을 96-웰 둥근-바닥 폴리스티렌 플레이트에서 성장시켰다. 상기 설명된 대로 수집된 샘플을 PBS에 희석하고, 전염성 임상 박테리아 균주인 Acinetobacter baumannii와 함께 인큐베이션했다.

간단히 말해서, 하룻밤 성장시킨 A. baumannii 배양물 180μl를 적합한 샘플 (PBS로 희석된) 20μl로 보충했다. 37℃에서 24시간 인큐베이션한 후, 웰을 물로 세척하고 250μl 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색했다. 물로 완전히 세척하여 염료를 제거했다. 유착된 세포의 정량을 위해 크리스탈 바이올렛을 1% SDS 250μl에 용해한 다음, 595nm에서 흡광도를 측정했다.

결과

몸통 균질물로부터 유래된 조 추출물, 어류(뱀장어, 메기)로부터 수집된 표면 점액 샘플 및 고착 유자포 동물(두 종료의 히드라와 말미잘)은 Acinetobacter baumannii 박테리아의 전염성 임상 분리주의 유착을 방지하는 기본적인 능력을 나타냈다. 도 2로부터 명백한 듯이, 최고의 효능은 말미잘 Actinia equina(도 1a-b에 예시) 촉수의 추출물에 의해 나타났다.

실시예 2

Actinia equina 추출물은 유착방지 기능을 하지만 살균작용은 하지 않는다

재료 및 실험 과정

Actinia equina

말미잘인 Actinia equina를 실험실에서 성장시켜 보존하였다.

샘플 수집

고착 유자포 동물(Actinia equina)의 균질물을 수집했다. 간단히 말해서, 말미잘 조직 300mg 습 중량을 절제하고 증류수로 헹군 다음, 300μl 부피의 DDW 중에서 균질화하여(총 부피 약 500μl) 원심분리(3분, 14000x g)하고 예비여과했다(0.2μl).

칼럼 크로마토그래피 및 단백질 화학

샘플(100μl)을 분석 C-8(Thermo-Hypersil, Keystone) 또는 C-18(Vydac) 칼럼에서 선형 구배의 DDW 중의 아세토니트릴 + 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA, 3-80%, 5-75분)에 의해 용출시켜 분리하였다. 용출 패턴을 215nm에서 모니터했다.

박테리아 성장

실시예 1에 설명된 대로 했다.

박테리아 유착 생물학적 분석

실시예 1에 설명된 대로 했다.

박테리아 사멸/성장 억제

A. equine 촉수의 조 추출물과 분리된 분획들(하기 도 4 참조)을 박테리아 A. baumannii의 액체 배양물에 첨가했다. 600nm에서 배양물의 광학 밀도를 측정하여 박테리아의 하룻밤 성장을 기록했다.

단백질 겔 전기영동

활성 분획 100μl를 얼음 냉각 아세톤으로 침전시키고, SDS 및 β-메르캅토에탄올을 함유하는 러닝 버퍼에 재현탁하여 3분간 끓인 다음, 15% 변성 SDS-PAGE 겔에서 분리했다. 전기영동 후 겔을 은 염색했다.

샘플의 열 변성

PCR 서모사이클에서 30분간 100℃에 샘플을 노출시켜 열 변성을 행했다.

결과

Actinia 에커라지 조직(도 3A)과 Actinia 촉수 조직(도 3B)의 크로마토그래피 분리로부터 얻어진 분획들에 의해 Acinetobacter baumannii에 대한 박테리아 유착방지 효과가 나타났다. 동결건조를 필요로 하는(제거를 위해) 유기용매의 존재하에 HPLC 시스템 분석 역상(RP) 칼럼에서 분리가 수행되었다는 것을 주목할 만하다. 이것은 얻어진 활성 분획들이 안정하며 유기용매와 동결건조를 견딘다는 것을 시사했다. 이에 더하여, 도 3D는 활성 성분의 분자 질량과 이들의 균질도에 대한 대략적인 지표를 제공한다(전기영동 그래프).

유착 생물학적 분석에 의해 인공 표면에 대한 박테리아 유착이 모니터된다는 것이 주목할 만하다. 그것은 박테리아를 죽이는 것이나 심지어 박테리아의 성장을 억제하는 것도 나타내지 않는다. 더욱이, 이런 회피(사멸 또는 성장 억제의 부재)는 추출물과 함께 24시간 인큐베이션한 후 측정한 대조군 대비 처리군의 OD600nm (측정된 입자 밀도)의 상보적 측정에 의해 검증되었다. 결과(하기 표 1에 나타냄)는 유착방지 물질, 즉 Actinia equina 촉수의 조 추출물뿐만 아니라 분리된 분획들 (도 2 및 3a-d) 중 어느 것도 PBS(양성 대조군)의 존재하에 성장된 박테리아와 비교하여 Acinetobacter baumannii에 대해 살균 효과나 성장 억제 효과를 나타내지 않았음을 시사한다.

광범한 미생물에 대해 균막방지 및 유착방지 활성을 나타낸 촉수 분획 17과 기공-형성 펩티드인 이퀴나톡신(도 4), 뿐만 아니라 분획 13, 14, 조 추출물 및 에커라지 분획들(데이터 나타내지 않음)은 열 변성 및 프로테이나제 K로의 처리 후에 박테리아 유착방지 활성을 잃은 것으로 나타났다(데이터 나타내지 않음). 이런 정보들을 취합하면 활성 인자는 폴리펩티드라고 생각된다.

촉수 분획의 유착방지 효과를 상이한 네 그룹의 박테리아, 즉 Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli(모두 그람 음성 박테리아이며, 상이한 과에 속한다) 및 Staphylococcus aureus(그람 양성 박테리아)에 대해서 더 증명하였다. E. coli는 동물의 장관에서 사는 Enterobacteriaceae에 속하고, P. aeruginosa 및 A. baumannii는 흙과 물에서 자유롭게 살고 있는 유기물로서, 과는 다르지만 모두 Pseudomonadales 목에 속한다. 도 5로부터 분명한 대로, 촉수 분획 13은 모든 네 그룹의 박테리아에 대해 유착방지 효과를 나타냈다.

실시예 3

Actinia equine 조 추출물은 초기 단계의 균막 형성에 영향을 미친다

재료 및 실험 과정

Actinia equina

말미잘인 Actinia equina를 실험실에서 성장시켜 보존하였다.

샘플 수집

고착 유자포 동물(Actinia equina)의 균질물을 수집했다. 간단히 말해서, 말미잘 조직 300mg 습 중량을 절제하고 증류수로 헹군 다음, 300μl 부피의 DDW 중에서 균질화하여(총 부피 약 500μl) 원심분리(3분, 14000x g)하고 예비정제했다(0.2μl).

박테리아 성장

실시예 1에 설명된 대로 했다.

고-처리량 폴리스티렌 마이크로플레이트 분석

다양한 박테리아(예를 들어, S. aureus ATCC 25923을 96-웰 둥근-바닥 폴리스티렌 플레이트에서 성장시켰다. 37℃에서 24시간 인큐베이션한 후, 각 웰을 물로 세척하고 250μl 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색했다. 물로 완전히 세척하여 염료를 제거했다. 유착된 세포의 정량을 위해서, 웰에 남은 크리스탈 바이올렛을 1% SDS 250μl에 용해하고, 595nm에서 광학 밀도를 읽었다. A. equina 촉수의 조 물질의 1:10, 1:100 및 1:1000의 3가지 희석물을 0시간째에 플레이트에 첨가했다. 양성 대조군으로서 박테리아를 PBS와만 인큐베이션했다.

정성적 박테리아 유착 분석

S. aureus ATCC 25923를 5ml 폴리스티렌 관에서 2ml 배지 중에서 성장시켰다. 37℃에서 24시간 인큐베이션한 후, 각 관을 물로 세척하고 250μl 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색했다. 물로 완전히 세척하여 염료를 제거했다. 유착된 세포의 정량을 위해서, 웰에 남은 크리스탈 바이올렛을 1% SDS 250μl에 용해하고 595nm에서 광학 밀도를 읽었다. A. equina 촉수의 조 물질의 1:10, 1:100 및 1:1000의 3가지 희석물을 0시간째에 플레이트에 3벌씩 첨가했다. 양성 대조군으로서 박테리아를 PBS와만 인큐베이션했다.

유리 슬라이트 위 균막 형성에 대한 형광 현미경 분석

*녹색 형광 단백질(GFP)의 발현을 위한 플라스미드를 함유하는 E. coli DH5-α 균주 U85를 유리 커버 슬라이드와 함께 2ml LB 배지 중에서 인큐베이션하고, 유착된 박테리아를 반전 에피-형광 1x2-81 현미경(Olympus, 미국)을 사용하여 시각화했다. 조 물질과 분획들을 0시간째에 첨가하고, 1시간, 7시간 및 22시간 후에 균막 형성을 조사했다.

결과

균막 형성에 있어서 A. equina 촉수 조 물질의 첨가로 인해 유착된 박테리아의 감소가 나타난다(도 6a 및 6b). 또한, 도 6c에 나타낸 대로, PBS와 함께 1시간 인큐베이션한 후에 이미 박테리아 유착이 분명히 보였으며, 22시간 후에는 치밀한 박테리아 매트가 관찰되었다. 반대로, A. equina 촉수 추출물, 이 추출물로부터의 2개의 크로마토그래피 분획(14, 17) 또는 재조합 이퀴나톡신과 함께 박테리아를 인큐베이션한 경우에는 박테리아 유착이 제거되었다. 따라서, 이들 결과는 초기 유착 단계에서 균막 형성이 방지된다는 것을 시사한다.

실시예 4

Actinia equine 활성 물질이 분리될 수 있다

재료 및 실험 과정

Actinia equina

말미잘인 Actinia equina를 실험실에서 성장시켜 보존하였다.

샘플 수집

칼럼 크로마토그래피 및 단백질 화학

실시예 2에 설명된 대로 했다.

활성 피크의 선택 및 MS 분석

RP-HPLC에 의해 이미 얻어진 활성 물질(T-18)을 동일한 칼럼에서 다시 크로마토그래피하여 피크를 수집하고 동결건조한 다음, 표준 부피의 PBS에 용해하였다. 20μl 부피를 박테리아 유착방지 활성에 대해 분석하였다.

추가로, 동결건조된 샘플(활성 피크 75)을 50% 메탄올-0.5% 포름산에 용해하고, MALDI-TOF(Voyager-DE STR Applied Biosystems)에 의해 매트릭스로서 시나핀산을 사용하여 측정했다. 측정은 양성 선형 모드로 수행하였다.

박테리아 성장

실시예 1에 설명된 대로 했다.

박테리아 유착 생물학적 분석

실시예 1에 설명된 대로 했다.

결과

다시 크로마토그래피된 활성 분획 T-18(도 7a)로부터 활성 분획 75, 79 및 1061(도 7a)을 획득했다. 분획 75(적색 화살표로 표시)의 MS 분석은 19863, 9926, 8261 및 3655 Da의 질량에서 몇몇 피크를 나타냈으며, 이들은 단백질일 가능성이 있다(도 7b). 이들 데이터는 관련 물질을 분리하고 화학적으로 특성화하는 능력을 나타낸다.

*실시예 5

Aiptasia pulchella 추출물은 유착방지 활성을 포함한다

재료 및 실험 과정

Aiptasia pulchella 로부터 조 물질의 분리

Aiptasia pulchella로부터 활성 분획의 분리를 G-10 및 G75 겔 여과 칼럼(GE Healthcare, 스웨덴)을 사용하여 행하였다. 겔 여과 분리로부터 수집된 물질의 C-18 칼럼 RP-HPLC는 고 분해능 분리를 제공했다. 활성 분획들을 MS에 의해 분석하였다.

고 분자량 분획을 Sephadex G-75에서 다시 크로마토그래피하여 2개의 분획을 산출했으며, 이들은 모두 유착/균막 형성 방지 활성을 나타냈다. 얻어진 각 분획을 C-18 칼럼 RP-HPLC를 사용하여 분리하였다. 이 분리에서 몇 개의 분획이 산출되었다.

결과

Sephadex G-10 칼럼에서 분리된 Aiptasia pulchella(전체 생물)의 조 추출물은 2개의 분획을 산출했으며, 이들은 모두 유착/균막 형성 방지 활성을 나타낸다(도 8).

Sephadex G-10으로부터의 고 분자량 분획을 Sephadex G-75에서 다시 크로마토그래피하여 고 분자량 분획 및 저 분자량 분획을 나타내는 2개의 주 피크를 얻었다(도 9).

G-75 칼럼으로부터의 저 분자량 분획의 C-18 칼럼을 사용한 RP-HPLC 분리는 활성 분획을 포함하는 몇 개의 분획을 산출했으며(분획 2 및 3, 도 10), 이들은 이어진 HPLC 분석에서 다당류로서 확인되었다(도 11a-c). 분획 2 및 3의 HPLC 분석은 각 분획에 있어서 단당들의 조합이 상이함을 나타냈다(도 11a-b). 그러나, 분획 2와 분획 3 모두에서 주 피크(피크 번호 1)는 디-글루코오스를 나타내며, 이것은 분획 2의 전체 글리칸의 45.5%와 분획 3의 전체 글리칸의 약 91%를 구성한다(표 2).

G-75로부터의 고 분자량 분획의 C-18 칼럼을 사용한 RP-HPLC 분리는 높은 유착방지 활성을 가진 적어도 3개 분획(13, 18 및 20, 도 12)을 산출하였다. MS 분석 및 겔 전기영동은 이 활성 분획들이 펩티드임을 나타냈다(데이터 나타내지 않음).

서열목록: SEQ ID NO:1

명확성을 위하여 개별 구체예들과 관련하여 설명된 본 발명의 어떤 특징들은 단일 구체예에서 조합하여 제공될 수도 있다. 반대로, 간결성을 위하여 단일 구체예와 관련하여 설명된 본 발명의 여러 특징들은 개별적으로 또는 어떤 적합한 하위조합으로 제공될 수도 있다.

본 발명이 특정 구체예와 함께 설명되었지만, 많은 변경, 변형 및 변화가 당업자에게 분명하다는 것은 자명하다. 따라서, 첨부된 청구항의 사상 및 광의의 범위 내에 들어가는 모든 이러한 변경, 변형 및 변화를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 인용된 모든 출판물, 특허 및 특허출원 그리고 GenBank 기탁번호는 각 개별 출판물, 특허 또는 특허출원 또는 Genbank 기탁번호가 참고자료로서 본원에 포함되도록 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 범위까지 그 전문이 본 명세서에 참고자료로 포함된다. 또한, 본 명세서 중의 어떤 참고자료의 인용이나 확인은 이러한 참고자료가 본 발명에 대한 선행기술로서 이용될 수 있다는 승인으로서 해석되어서는 안 된다.

<110> TEL HASHOMER MEDICAL RESEARCH INFRASTRUCTURE AND SERVICES LTD. <120> COMPOSITIONS OF AQUATIC ORIGIN FOR PREVENTION OF CELL ADHESION AND METHODS OF USING SAME <130> 095432-0112 <140> KR 2010-7008482 <141> 2010-04-19 <150> PCT/IL2008/001264 <151> 2008-09-21 <150> 60/960,214 <151> 2007-09-20 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Actinia equina <400> 1 Met Ser Arg Leu Ile Ile Val Phe Ile Val Val Thr Met Ile Cys Ser 1 5 10 15 Ala Thr Ala Leu Pro Ser Lys Lys Ile Ile Asp Glu Asp Glu Glu Asp 20 25 30 Glu Lys Arg Ser Ala Asp Val Ala Gly Ala Val Ile Asp Gly Ala Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Asp Ile Leu Lys Thr Val Leu Glu Ala Leu Gly Asn Val 50 55 60 Lys Arg Lys Ile Ala Val Gly Val Asp Asn Glu Ser Gly Lys Thr Trp 65 70 75 80 Thr Ala Leu Asn Thr Tyr Phe Arg Ser Gly Thr Ser Asp Ile Val Leu 85 90 95 Pro His Lys Val Pro His Gly Lys Ala Leu Leu Tyr Asn Gly Gln Lys 100 105 110 Asp Arg Gly Pro Val Ala Thr Gly Ala Val Gly Val Leu Ala Tyr Leu 115 120 125 Met Ser Asp Gly Asn Thr Leu Ala Val Leu Phe Ser Val Pro Tyr Asp 130 135 140 Tyr Asn Trp Tyr Ser Asn Trp Trp Asn Val Arg Ile Tyr Lys Gly Lys 145 150 155 160 Arg Arg Ala Asp Gln Arg Met Tyr Glu Glu Leu Tyr Tyr Asn Leu Ser 165 170 175 Pro Phe Arg Gly Asp Asn Gly Trp His Thr Arg Asn Leu Gly Tyr Gly 180 185 190 Leu Lys Ser Arg Gly Phe Met Asn Ser Ser Gly His Ala Ile Leu Glu 195 200 205 Ile His Val Ser Lys Ala 210

Claims

단세포 생물이 표면에 유착되거나 단세포 생물들 사이에 서로 유착되는 것을 방지하거나 감소시킬 수 있는 활성제를 생산하는 방법으로서, (a)수생 생물로부터 활성제를 식별하는 단계; 및 (b)상기 활성제를 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 활성제는 유전 공학 기술을 이용하여 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 활성제는 대량 생산되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 활성제는 폴리펩티드 또는 다당류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 활성제는 SEQ ID NO:1 또는 그 일부를 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 활성제는 19863 Da, 9926 Da, 8261 Da 및 3655 Da으로 구성되는 군으로부터 선택된 피크 질량을 특징으로 하는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 수생 생물은 상기 수생 생물은 고착 유자포(Cnidarian) 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 고착 유자포 동물은 Actinia equine 또는 Aiptasia pulchella인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단세포 생물 또는 단세포 생물들은 박테리아, 고세균(archaea), 진균 및 원생동물로 구성되는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 박테리아는 그람 양성 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 박테리아는 그람 음성 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 생산된 활성제를 포함하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 조성물은 젤, 크림, 린스 및 스프레이로 구성되는 군으로부터 선택되는 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
단세포 생물이 표면에 유착되거나 단세포 생물들 사이에 서로 유착되는 것을 방지하거나 감소시키는 방법으로서, 상기 단세포 생물 또는 단세포 생물들을 제 12 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체외에서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체내에서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 방법은 단세포 생물이 표면에 유착되는 것을 방지하거나 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 표면은 직물, 섬유, 폼, 필름, 콘크리트, 석조물, 유리, 금속, 플라스틱 및 폴리머로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 표면은 선체, 자동차 표면, 항공기 표면, 멤브레인, 필터 및 산업 장비로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 표면은 의료 장치, 치과 장치, 기기 및 삽입물(implant)로 구성되는 군으로부터 선택되는 장치상에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 장치는 메스, 바늘, 가위, 장갑, 앞치마 및 안면보호기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 조성물을 표면위에 코팅시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 방법은 단세포 생물들이 서로 유착되는 것을 방지하거나 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 단세포 생물 또는 단세포 생물들은 균막내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 의료 장치.
제 25 항에 있어서, 상기 의료 장치는 체외 장치 및 체내 장치로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 25 항에 있어서, 상기 의료 장치는 콘택트렌즈, 카테테르, 기관내관, 기계식 심장판막, 페이스메이커, 혈관 이식편, 스텐트, 인공 기관, 인공 심장, 인공 신장, 기형교정 핀, 플레이트(plate), 소변 장치, 션트(shunt), 문합 장치, 혈관 카테테르 포트, 혈관 스텐트, 클램프, 색전 장치,상처 배출관 튜브, 치과 임플란트, 뇌수종 션트, 이식형 제세동기, 무바늘 연결기 및 발성 인공 기관으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 25 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 의료 장치의 중합체 매트릭스 안에 혼입되는 것을 특징으로 하는 의료 장치.
제 12 항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 조성물을 의료 장치에 접촉시키는 단계를 포함하여, 단세포 생물의 의료 장치에의 유착을 방지하거나 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 의료 장치는 체내 장치 및 체외 장치로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 의료 장치는 콘택트렌즈, 카테테르, 기관내관, 기계식 심장판막, 페이스메이커, 혈관 이식편, 스텐트, 인공 기관, 인공 심장, 인공 신장, 기형교정 핀, 플레이트(plate), 소변 장치, 션트(shunt), 문합 장치, 혈관 카테테르 포트, 혈관 스텐트, 클램프, 색전 장치,상처 배출관 튜브, 치과 임플란트, 뇌수종 션트, 이식형 제세동기, 무바늘 연결기 및 발성 인공 기관으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 의료 장치의 중합체 매트릭스 안에 혼입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 내지 제32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 조성물로 상기 의료 장치를 코팅시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 활성제 및 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
제 34 항에 있어서, 상기 조성물은 스프레이, 린스, 크림, 젤, 정제, 약용 캔디, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형인 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
제 33 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여, 피험자의 병원균 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제 36 항에 있어서, 상기 투여하는 단계는 경구 투여, 직장 투여, 경점막 투여, 장내 투여, 비경구 송달 및 주사로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.