CN104231105B - 一种海葵多糖的制备方法及其抗肿瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海葵多糖的制备方法，采用恒温高速剪切法破碎原料，经水浸提、分30％、60％、80％三级醇沉、然后用木瓜蛋白酶酶解、sevag脱蛋白，制得三种糖含量较高的海葵多糖，本发明制得的三种海葵多糖可用于制备抗肿瘤药物，具体可用于制备抗肺癌、抗前列腺癌或腹水瘤药物。

Description

一种海葵多糖的制备方法及其抗肿瘤应用

一、技术领域

本发明涉及海洋产品深加工领域，特别涉及一种海葵抗肿瘤活性多糖的制备方法。

二、背景技术

海洋高盐、高压、低温、缺氧、寡营养与光照不足的环境，促成了海洋生物多糖结构与功能的丰富性和多样性，众多研究表明，海洋动物多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗心血管疾病，抗氧化和免疫调节等生物活性作用，如：鲍鱼多糖(殷红玲，杨静峰.酶法提取鲍鱼多糖的研究，食品与发酵工业，2006，32(12)：158)、海参多糖(蔡彬新，吴成业.海参多糖的分离纯化方法及其主要生物活性，福建水产，2008，03：70)、贻贝多糖(栾洁，辛甜，储智勇，等.贻贝多糖对小鼠免疫功能的调节作用.中国海洋药物，2010，29(04):39)、海星多糖(骆传环，黄荣清，刘曙晨.海星多糖的分子量测定.军事医学科学院院刊，2002，26(02):157)、牡蛎多糖(黄传贵，李勇，赵金华.牡蛎多糖的分离和纯化.华西药学杂志，2009，24(04)：439)。海葵是最丰富的近海动物之一，属于腔肠动物门，珊瑚虫纲，六放珊瑚亚纲。海葵的药用价值较高，具有滋阴壮阳、止泻和驱虫等多种功能，可以治疗痔疮、脱肛、绕虫病、体癣、白带过多等多种疾病。

星虫爱氏海葵(Edwardsiasipunculoides)俗称“涂蒜”，在我国主要分布渤海，黄海，南海等海域，栖息于潮间带的泥滩内，营埋栖生活，隶属于爱氏海葵科。在浙江省沿海地区居民把它当作较为喜爱的海洋食品之一。郑淑贞等(郑淑贞，潘亮君，黄方吕，等.斯式花群海葵多糖I和II的组成研究.广州化学，1991，3：52-56.)首次对生长于我国南海西沙群岛的斯式花群海葵Zoanthusstephensoni化学成分进行了研究，采用捣碎法，75％乙醇浸提，乙醚脱脂，过GelCHP-20多孔性树脂，再经过甲醇除盐，最后浓缩透析得到了两种多糖，具有明显的降压作用(郑淑贞，黄方吕，潘亮君，等.斯氏花群海葵多糖对大白鼠血压和兔离体心脏灌流的影响.广州化学，1991，4：53-57.)；该实验过程中并未出现除蛋白过程，实验结果对于最终多糖的得率与含量也并未指明。刘兴杰等(刘兴杰，刘传琳，任虹，等.海葵等四种动物粘多糖碱提取的比较研究.烟台大学学报，2001，14(14)：264-268.)用碱提法从绿疣海葵Anthopleuramidori中分离得到了酸性粘多糖，多糖得率为9.9％，糖含量为85.7％，并未研究其生物活性，采用碱提法可能会造成糖链的断裂、降解并影响其生物活性。朱春晓(朱春晓.太平洋侧花海葵多糖营养分析及多糖提取分离.中国海洋大学，2011)采用酶法醇提从太平洋侧花海葵中提取多糖，该方法多糖提取率较低，粗多糖最高总得率仅为12.47％。

浙江沿海盛产星虫爱氏海葵，对星虫爱氏海葵的多糖提取方法及其生物活性研究未见报道。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种海葵多糖的制备方法。

本发明采用恒温高速剪切法破碎原料，经水浸提、分级醇沉、酶解和sevag脱蛋白等步骤，得到三种糖含量较高的海葵多糖，并对其进行抗肿瘤活性验证实验。结果表明星虫爱氏海葵多糖具有潜在的药用价值，可用于制备抗肿瘤药物。

本发明采用的技术方案是：

一种海葵多糖的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将新鲜海葵外表清洗干净，剪开，洗去其腔肠内含物质后剪碎，所得碎海葵经匀浆剪切10-20min，所得匀浆液中加入匀浆液体积4-10倍的水，所得混合液在30-70℃浸提2-4h，提取液离心，取上清液A浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液A，

(2)浓缩液A中加入体积分数95％乙醇，使所得醇提混合液I中乙醇的体积分数为30％，4℃环境中放置4-8h，离心、分离得到沉淀I和上清液I，向上清液I中加入体积分数95％乙醇，使所得醇提混合液II中乙醇的体积分数为60％，4℃环境中放置4-8h，离心、分离得到沉淀II和上清液II，向上清液II中加入体积分数95％乙醇，使所得醇提混合液III中乙醇的体积分数为80％，4℃环境中放置4-8h，离心、分离得到沉淀III；

(3)将沉淀I、II和III分别溶于水，加木瓜蛋白酶，在pH5-6、温度30-70℃条件下酶解1-4h，所述木瓜蛋白酶的质量用量为沉淀I、II或III重量的0.1-1％，酶解完成后煮沸灭酶，分别得到酶解液I、酶解II、酶解液III；

(4)(4a)向酶解液I中加入其体积三分之一体积的Sevag试剂，所述Sevag试剂是将正丁醇和氯仿按体积比1:4混合制成，搅拌30～60min，离心除去析出的变性蛋白，取上清液B按照上述步骤重复操作3-5次，最后得到的上清液C减压浓缩，得浓缩液C，真空冷冻干燥制得海葵多糖I；

(4b)酶解液II、III按照上述步骤(4a)进行同样操作，分别制得海葵多糖II和海葵多糖III。

本发明所述方法中，所述离心是在4℃下、8000-10000rpm、离心5-15min，优选在4℃、10000rpm、离心10min。

本发明所述的海葵优选星虫爱氏海葵。

所述步骤(1)中，混合液优选在30℃浸提4h。

所述步骤(3)中，水的体积用量通常以沉淀I、II或II的质量计为10～20mL/g。

所述步骤(3)中，木瓜蛋白酶活力为3000U。

所述步骤(3)中，酶解的条件优选为pH5.5、温度50～65℃条件下酶解2-4h，最优选pH5.5、温度65℃条件下酶解4h。

所述步骤(3)中，所述木瓜蛋白酶的质量用量优选为沉淀I、II或III重量的0.5～1％。

本发明制得的海葵多糖I可以记为SAP30，海葵多糖II记为SAP60，海葵多糖III记为SAP80。

其中，SA为海葵SeaAnemone的英文首字母；P为多糖的英文polysaccharide首字母；30，60，80分别的代表三个不同醇沉浓度。

本发明制得的三种海葵多糖的总糖含量均在75-95％之间。

本发明还提供按照本发明方法制得的海葵多糖I、海葵多糖II或海葵多糖III。

本发明提供的海葵多糖I、海葵多糖II或海葵多糖III具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物，具体的，海葵多糖I、海葵多糖II或海葵多糖III可用于制备抗肺癌、抗前列腺癌或抗腹水瘤药物。

本发明的优点和产生的有益效果：

1)恒温高速剪切法结合酶解法，可以显著提高海葵多糖的得率，并能保持多糖原有的生物活性。

2)采用木瓜蛋白酶进行酶解，酶解后再用Sevag法除蛋白，可以提高多糖的纯度；

3)采用冷冻干燥技术，能较好的保留海葵多糖原有的生物活性和样品的溶解性。

4)制备的活性多糖具有较明显的抗肿瘤活性和较高的细胞毒选择性，对正常细胞毒害较少，可用于开发低毒副作用的抗肿瘤药物。

四、附图说明

图1海葵多糖的制备方法步骤流程图。

图2实施例5制得的SAP30紫外全扫描图。

图3实施例5制得的SAP60紫外全扫描图。

图4实施例5制得的SAP80紫外全扫描图。

图5实施例5制得的SAP30、SAP60与SAP80对A549细胞的抑制作用柱状图。

图6实施例5制得的SAP30、SAP60与SAP80对Du145细胞的抑制作用柱状图。

图7实施例5制得的SAP30、SAP60与SAP80对S180细胞的抑制作用柱状图。

五、具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1：

a)原料处理：将新鲜星虫爱氏海葵外表清洗干净，剪开，洗去其腔肠内含物质，剪碎；

b)碎海葵匀浆剪切10min，然后在匀浆液中加入体积为匀浆液4倍体积的水，在30℃浸提2h，得提取液；

c)提取液离心：8000rpm，4℃，离心5min，得上清液；

d)浓缩：对上清液进行减压旋转蒸发浓缩(45℃)至原体积的1/4，得浓缩液；

e)醇沉：向浓缩液中加入95％乙醇至乙醇体积分数为30％，4℃环境中置放4h，离心、分离得到其中的沉淀Ⅰ和上清液I，继续往上清液I中加入95％乙醇至乙醇体积分数为60％，静置相同的时间离心、分离得到沉淀Ⅱ和上清液II，再向上清液II中加入95％乙醇至乙醇体积分数为80％，静置相同的时间离心、分离得到沉淀Ⅲ；

f)酶解及灭酶：分别将三种沉淀溶于水(水的体积用量以各沉淀的质量计为10mL/g)，添加占沉淀物湿重质量0.1％的木瓜蛋白酶(3000U)、pH5、温度30℃进行酶解1h，酶解完成后煮沸10min灭酶，分别得到三种酶解液；

g)Sevag法脱蛋白：用正丁醇:氯仿体积比＝1:4的配比制成Sevag试剂，在酶解液中加入酶解液三分之一体积的Sevag试剂，磁力搅拌30min，离心去除析出的变性蛋白，此操作反复进行3次，取上清液，然后进行减压浓缩(45℃)，除去残留Sevag试剂同时得浓缩液；

h)干燥：将浓缩液进行真空冷冻干燥，最终分别得到SAP30、SAP60和SAP80三种海葵多糖，多糖得率分别为6.33％，7.28％和5.98％，总得率为19.59％；多糖得率是指多糖相对于新鲜海葵质量的得率。经苯酚-硫酸法测定三种海葵多糖总糖含量分别为78.34％，76.09％和76.94％；经DNS法测定三种海葵多糖还原糖含量分别为7.52％，4.05％和0.86％；经考马斯亮蓝法测定三种海葵多糖中蛋白含量分别为7.74％，7.69％和7.57％。

实施例2：

a)原料处理：将新鲜星虫爱氏海葵外表清洗干净，剪开，洗去其腔肠内含物质，剪碎；

b)碎海葵匀浆剪切15min，在匀浆液中加入6倍体积的水，在50℃浸提3h，得提取液；

c)提取液离心：9000rpm，4℃，离心10min，得上清液；

d)浓缩：对上清液进行减压旋转蒸发浓缩(45℃)至原体积的1/4，得浓缩液；

e)醇沉：向浓缩液中加入95％乙醇至乙醇体积分数为30％，4℃环境中置放6h，离心、分离得到其中的沉淀Ⅰ和上清液I，继续往上清液I中加入95％乙醇至乙醇体积分数为60％，静置相同的时间离心、分离得到沉淀Ⅱ和上清液II，再向上清液II中加入95％乙醇至乙醇体积分数为80％，静置相同的时间离心、分离得到沉淀Ⅲ；

f)酶解及灭酶：分别将三种沉淀溶于水(水的体积用量以各沉淀的质量计为10mL/g)，添加占沉淀物湿重质量0.5％的木瓜蛋白酶(3000U)、pH5.5、温度50℃进行酶解2h，酶解完成后煮沸10min灭酶，分别得到三种酶解液；

g)Sevag法脱蛋白：用正丁醇:氯仿体积比＝1:4的配比制成Sevag试剂，在上清液中加入三分之一体积的Sevag试剂，磁力搅拌30min，离心去除析出的变性蛋白，此操作反复进行5次，取上清液，然后进行减压浓缩(45℃)，除去残留Sevag试剂同时得浓缩液；

h)干燥：将浓缩液进行真空冷冻干燥，最终得到SAP30、SAP60和SAP80三种海葵多糖，多糖得率分别为6.97％，8.29％和6.19％，总得率为21.45％；多糖得率是指多糖相对于新鲜海葵质量的得率。经苯酚-硫酸法测定三种海葵多糖总糖含量分别为87.66％，82.54％和84.93％；经DNS法测定三种海葵多糖还原糖含量分别为8.42％，4.40％和0.95％；经考马斯亮蓝法测定三种多糖中蛋白含量分别为1.31％，1.08％和0.94％。

实施例3：

a)原料处理：将新鲜星虫爱氏海葵外表清洗干净，剪开，洗去其腔肠内含物质，剪碎；

b)碎海葵匀浆剪切20min，在匀浆液中加入10倍体积的水，在70℃浸提4h，得提取液；

c)提取液离心：10000rpm，4℃，离心15min，得上清液；

d)浓缩：对上清液进行减压旋转蒸发浓缩(45℃)至原体积的1/4，得浓缩液；

e)醇沉：向浓缩液中加入95％乙醇至乙醇体积分数为30％，4℃环境中置放8h，离心、分离得到其中的沉淀Ⅰ和上清液I，继续往上清液I中加入95％乙醇至乙醇体积分数为60％，静置相同的时间离心、分离得到沉淀Ⅱ和上清液II，再向上清液II中加入95％乙醇至乙醇体积分数为80％，静置相同的时间离心、分离得到沉淀Ⅲ；

f)酶解及灭酶：分别将三种沉淀溶于水(水的体积用量以各沉淀的质量计为10mL/g)，添加占沉淀物湿重质量1％的木瓜蛋白酶(3000U)、pH6、温度70℃，酶解4h，酶解完成后煮沸10min灭酶，分别得到三种酶解液；

g)Sevag法脱蛋白：用正丁醇:氯仿体积比＝1:4的配比制成Sevag试剂，在酶解液中加入三分之一体积的Sevag试剂，磁力搅拌30min，离心去除析出的变性蛋白，此操作重复进行5次，取上清液，然后进行减压浓缩(45℃)，除去残留Sevag试剂同时得浓缩液；

h)干燥：将浓缩液进行真空冷冻干燥，最终分别得到SAP30、SAP60和SAP80三种海葵多糖，多糖得率分别为6.22％，6.93％和5.47％，总得率为18.62％；多糖得率是指多糖相对于新鲜海葵质量的得率。经苯酚-硫酸法测定三种海葵多糖总糖含量分别为88.43％，85.61％和87.05％；经DNS法测定三种海葵多糖还原糖含量分别为8.49％，4.56％和0.98％；经考马斯亮蓝法测定三种海葵多糖蛋白含量分别为12.37％，13.04％和12.98％。

实施例4

a)原料处理：将新鲜星虫爱氏海葵外表清洗干净，剪开，洗去其腔肠内含物质，剪碎；

b)碎海葵匀浆剪切20min，在匀浆液中加入10倍体积的水，在30℃浸提4h，得提取液；

c)提取液离心：10000rpm，4℃，离心10min，得上清液；

d)浓缩：对上清液进行减压旋转蒸发浓缩(45℃)至原体积的1/4，得浓缩液；

e)醇沉：向浓缩液中加入95％乙醇至乙醇体积分数为30％，4℃环境中置放4h，离心、分离得到其中的沉淀Ⅰ和上清液I，继续往上清液I中加入95％乙醇至乙醇体积分数为60％，静置相同的时间离心、分离得到沉淀Ⅱ和上清液II，再向上清液II中加入95％乙醇至乙醇体积分数为80％，静置相同的时间离心、分离得到沉淀Ⅲ；

f)酶解及灭酶：分别将三种沉淀溶于水(水的体积用量以各沉淀的质量计为10mL/g)，添加占沉淀物湿重质量1％的木瓜蛋白酶(3000U)、pH5.5、温度50℃进行酶解4h，酶解完成后煮沸10min灭酶，分别得到三种酶解液；

g)Sevag法脱蛋白：用正丁醇:氯仿体积比＝1:4的配比制成Sevag试剂，在酶解液中加入三分之一体积的Sevag试剂，磁力搅拌30min，离心去除析出的变性蛋白，此操作重复进行5次，取上清液，然后进行减压浓缩(45℃)，除去残留Sevag试剂同时得浓缩液；

h)干燥：将浓缩液进行真空冷冻干燥，最终分别得到SAP30、SAP60和SAP80三种海葵多糖，多糖得率分别为7.40％，8.51％和7.04％，总得率为22.95％；多糖得率是指多糖相对于新鲜海葵质量的得率。经苯酚-硫酸法测定三种海葵多糖总糖含量分别为92.79％，87.52％和88.63％；经DNS法测定三种海葵多糖还原糖含量分别为8.91％，4.66％和1.00％；经考马斯亮蓝法测定三种海葵多糖中蛋白含量分别为0.63％，0.74％和0.58％。

实施例5

a)原料处理：将新鲜星虫爱氏海葵外表清洗干净，剪开，洗去其腔肠内含物质，剪碎；

b)碎海葵匀浆剪切20min，在匀浆液中加入10倍体积的水，在30℃浸提4h，得提取液；

c)提取液离心：10000rpm，4℃，离心10min，得上清液；

d)浓缩：对上清液进行减压旋转蒸发浓缩(45℃)至原体积的1/4，得浓缩液；

e)醇沉：向浓缩液液中加入95％乙醇至乙醇体积分数为30％，4℃环境中置放8h，离心、分离得到其中的沉淀Ⅰ和上清液I，继续往上清液I中加入95％乙醇至乙醇体积分数为60％，静置相同的时间离心、分离得到的沉淀Ⅱ和上清液II，再向上清液II中加入95％乙醇至乙醇体积分数为80％，静置相同的时间离心、分离得到沉淀Ⅲ；

f)酶解及灭酶：分别将三种沉淀溶于水(水的体积用量以各沉淀的质量计为10mL/g)，添加占沉淀物湿重质量0.5％的木瓜蛋白酶(3000U)、pH5.5、温度65℃进行酶解4h，酶解完成后煮沸10min灭酶，分别得到三种酶解液；

g)Sevag法脱蛋白：用正丁醇:氯仿体积比＝1:4的配比制成Sevag试剂，在酶解液中加入三分之一体积的Sevag试剂，磁力搅拌30min，离心去除析出的变性蛋白，此操作重复进行5次，取上清液，然后进行减压浓缩(45℃)，除去残留Sevag试剂同时得浓缩液；干燥：将浓缩液进行真空冷冻干燥，最终分别得到SAP30、SAP60和SAP80三种海葵多糖，多糖得率分别为7.46％，8.92％和7.45％，总得率为23.83％；多糖得率是指多糖相对于新鲜海葵质量的得率。经苯酚-硫酸法测定三种海葵多糖总糖含量别为94.61％，89.83％和89.97％；经DNS法测定三种海葵多糖还原糖含量分别为9.08％，4.78％和1.01％；经考马斯亮蓝法测定三种海葵多糖中蛋白含量分别为0.08％，0.05％和0.08％。紫外光谱分析

对实施例5中最终得到的SAP30、SAP60和SAP80多糖进行200-400nm的紫外全扫描，扫描结果如图2-图4所示，经过酶解除蛋白后的三种海葵多糖在250-280nm的吸收峰很弱，表明其蛋白或核酸含量微量。

1)体外抗肿瘤实验结果与分析

对实施例5中得到的三种海葵多糖进行体外抗肿瘤活性实验。不同浓度海葵多糖处理A549(人肺癌细胞)、Du145(人前列腺癌细胞)和S180(腹水瘤细胞)48h后，用MTT法检测细胞的活性，计算抑制率，所得结果如图5-图7所示。SAP30、SAP60和SAP80均可不同程度的抑制A549、Du145和S180肿瘤细胞的生长。三种多糖中SAP30对肿瘤细胞的抑制作用最明显。SAP30在三种肿瘤细胞中又对A549肿瘤细胞的抑制作用最大，当其浓度达到最高浓度250μg/mL时，它对三种肿瘤细胞的抑制率分别为52.17％，46.74％和37.59％；半抑制率IC₅₀值分别为202.2μg/mL，258.7μg/mL和282.4μg/mL；选择性细胞毒性SI值分别为4.01，3.13和2.87。

SAP60的抗肿瘤作用略低于SAP30，当其浓度达到最高浓度250μg/mL时，它对三种肿瘤细胞的抑制率分别为44.43％，34.38％和33.21％；半抑制率IC₅₀值分别为391.3μg/mL，435μg/mL和383.4μg/mL；选择性细胞毒性SI值分别为2.00，1.80和2.04。

三种多糖中，SAP80的抗肿瘤效果最低，但依旧对肿瘤细胞有着一定的抑制作用，当其浓度达到250μg/mL时，它对三种肿瘤细胞的抑制率分别为37.27％，40.22％和32.30％；半抑制率IC₅₀值分别为390.5μg/mL，323μg/mL和374.7μg/mL；选择性细胞毒性SI值分别为2.05，2.48和2.14。

IC₅₀根据origin软件线性模拟计算得到。

SI值＝IC₅₀(CHL)/IC₅₀(肿瘤细胞)。

Claims (10)

1.一种海葵多糖的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)将新鲜海葵外表清洗干净，剪开，洗去其腔肠内含物质后剪碎，所得碎海葵经匀浆剪切10-20min，所得匀浆液中加入体积为匀浆液体积4-10倍的水，所得混合液在30-70℃浸提2-4h，所得提取液离心，取上清液A浓缩至原体积的1/4，得到浓缩液A，

(2)浓缩液A中加入体积分数95％乙醇，使所得醇提混合液I中乙醇的体积分数为30％，4℃环境中放置4-8h，离心、分离得到沉淀I和上清液I，向上清液I中加入体积分数95％乙醇，使所得醇提混合液II中乙醇的体积分数为60％，4℃环境中放置4-8h，离心、分离得到沉淀II和上清液II，向上清液II中加入体积分数95％乙醇，使所得醇提混合液III中乙醇的体积分数为80％，4℃环境中放置4-8h，离心、分离得到沉淀III；

(3)将沉淀I、II和III分别溶于水，加木瓜蛋白酶，在pH5-6、温度30-70℃条件下酶解1-4h，所述木瓜蛋白酶的质量用量为沉淀I、II或III重量的0.1-1％，酶解完成后煮沸灭酶，分别得到酶解液I、酶解液II、酶解液III；

(4)(4a)向酶解液I中加入其体积三分之一的Sevag试剂，所述Sevag试剂是将正丁醇和氯仿按体积比1:4混合制成，搅拌30～60min，离心除去析出的变性蛋白，取上清液B按照上述步骤重复操作3-5次，最后得到的上清液C减压浓缩，得浓缩液C，真空冷冻干燥制得海葵多糖I；

(4b)酶解液II、III按照上述步骤(4a)进行同样操作，分别制得海葵多糖II和海葵多糖III。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述海葵为星虫爱氏海葵。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述离心是在4℃条件下、8000-10000rpm、离心5-15min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，水的体积用量以沉淀I、II或II的质量计为10～20mL/g。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，木瓜蛋白酶活力为3000U。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，酶解的条件为pH5.5、温度50～65℃条件下酶解2-4h。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，酶解的条件为pH5.5、温度65℃条件下酶解4h。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述木瓜蛋白酶的质量用量为沉淀I、II或III重量的0.5～1％。

9.如权利要求1～8之一所述的方法制得的海葵多糖I、海葵多糖II或海葵多糖III。

10.如权利要求9所述的海葵多糖I、海葵多糖II或海葵多糖III在制备抗肺癌、抗前列腺癌或抗腹水瘤药物中的应用。