CN107814851A - 贻贝多糖的提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了贻贝多糖的提取工艺，其具体步骤为：将贻贝鲜肉脱脂，粉碎；将脱脂贻贝粉溶于水中，加入的酶缓冲液，微波提取，灭酶，冷却至室温，离心，将上清液用Sevage法去蛋白，浓缩，透析得贻贝多糖提取液；将贻贝多糖提取液上样到ME‑1大孔吸附树脂层析柱，收集洗脱液；将洗脱液减压浓缩，加入乙醇，静置，离心后收集沉淀；将醇沉所得沉淀物用水复溶，冷冻干燥得贻贝多糖纯品。本发明提取方法简单可行，提取速率快，能耗低，提取率高，易于工业化规模生产；该提取工艺采用复合酶‑微波提取提取贻贝多糖，使多糖的提取效率提高、残留率降低，蛋白质的去除率高，脱脂速率高，石油醚的用量少，脱脂彻底。

Description

贻贝多糖的提取工艺

技术领域

本发明涉及天然产物深加工技术领域，特别涉及贻贝多糖的提取工艺。

背景技术

随着经济的发展，陆地资源的充分利用，以及海洋养殖业的快速发展，近年来海洋资源的开发变得日益迫切。海洋中有丰富的已开发和待开发的海洋药物资源，所以开发海洋药物资源变得尤其重要。不同的海洋药物资源具有不同的药物功效，而多糖不仅能提高机体免疫功能，还具有抗肿瘤、抗辐射及抗凝血和抗氧化等多种生物活性。多糖的多种生物活性对于肿瘤等世纪难题的防治具有重大意义。并且海洋资源具有区域性、季节性的特点，因此，多糖的提取工艺优化及多糖配方食品的开发利用具有重要的应用价值。多糖是一种生物大分子。存在于植物、动物及微生物细胞中，是生命有机体的重要组成部分。通过脱水各单糖之间形成糖苷键，糖苷键以线性或分支的方式连接，形成链状聚合物。大量研究表明，多糖具有抗衰老、抗肿瘤、免疫调节、抗乙肝病毒感染、抗艾滋病病毒等活性，更重要的是多糖毒副作用小，因此，多糖将在防治等方面解决癌症及艾滋病等世纪难题。贻贝多糖多为α构型活性，较少数是β构型活性。贻贝，属软体动物门贻贝，属软体动物门，瓣鳃纲，异柱目，贻贝科。俗称海虹，亦称为淡菜。贻贝多糖糖苷键主要为1-4糖苷键、1-6糖苷键、1-3糖苷键、1-2糖苷键，其中以1-4糖苷键为主。而起到抗肿瘤作用的主要是1-4糖苷键和1-6糖苷键。贻贝多糖具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等活性，且毒副作用小，因此，近年来贻贝多糖被广泛关注，且由大量贻贝配方食品和药品应用而生。

现有技术如授权公告号为CN 101357952 B的中国发明专利，公开了一种具有降血脂活性的贻贝多糖MA及其制备方法。经动物体内降血脂试验表明，贻贝多糖MA对高脂饲料诱导的大鼠高脂血症有明显的治疗作用，可降低大鼠总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平，作用与阳性药普伐他汀或血脂康相当。因此，贻贝多糖MA可用于制备降血脂的药物或食品，对充分利用海洋生物资源具有重要意义。但是该提取方法提取周期长，且得到的多糖中杂蛋白含量较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，资源利用率高，提取速率快，提取率高，多糖的提取效率提高、残留率降低，脱脂速率高，脱脂彻底的贻贝多糖的提取工艺。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

贻贝多糖的提取工艺，包括脱脂、复合酶-微波提取、层析、醇沉、冷冻干燥，其具体步骤为：

脱脂：将贻贝鲜肉绞碎、匀浆，用石油醚脱脂，经低温烘干、粉碎制成脱脂贻贝粉，多糖的组织细胞多有脂质包围，组织中往往含有较多的蛋白，所以要先进行脱脂处理，该步骤可以除去贻贝中的脂肪，而脂肪的存在可对产品的风味、色泽等产生不良影响，同时容易造成水解液的浑浊，影响贻贝多糖的活性，石油醚中含有石油醚重量0.023-0.036%的两性霉素和石油醚重量0.014-0.016%的5-氟胞嘧啶，两性霉素和5-氟胞嘧啶的加入不仅能够大大提高石油醚脱脂速率，降低石油醚的用量，且脱脂彻底，还可以贻贝细胞膜物质相结合，损伤膜的通透性，为提取细胞膜内的多糖成分作准备；

复合酶-微波提取：将脱脂贻贝粉溶于水中，使得底物浓度为3-5%，按加酶量为0.8-1.3%加入的酶缓冲液，在温度为50-60℃、微波功率为400-600W下微波提取40-60min，95-100℃灭酶18-25min，冷却至室温，在3000-5000r/min离心10-20min，取上清液，然后用Sevage法去蛋白，将上清液浓缩至原体积的1/4-1/2，装入透析袋透析，除去小分子杂质和盐类，即得贻贝多糖提取液，微波法对提取罐进行间歇式的抽真空和破真空，利用真空脉动强化传质，真空脉动强化传质的机制是：抽真空时贻贝细胞组织内的水分会因为减压而气化，造成贻贝细胞组织内压力大于细胞外，溶解了多糖的水在压差作用下能强制穿过贻贝细胞组织，当破真空时，贻贝组织细胞外压大于内压，贻贝组织细胞外的水分因为压差作用而迅速进入贻贝组织细胞内部去溶解多糖，这种贻贝组织细胞内外压力的交替变化强化了水分和溶解在水分中的多糖传质，使多糖的提取效率提高、残留率降低，且蛋白酶的加入可快速切断多糖糖链上连接的蛋白，可以除去大部分蛋白，再结合Sevage法除蛋白，进一步提高了蛋白质的去除率，同时也减少了多糖的损失，能保存多糖原有的结构与活性；

层析：将贻贝多糖提取液上样到ME-1大孔吸附树脂层析柱，以1.5-2.5ml/min的速度用去离子水洗脱，收集洗脱液，贻贝多糖具有吸附于疏水树脂表面孔径的能力，进而可利用疏水树脂提取贻贝多糖，而ME-1大孔吸附树脂柱对贻贝多糖吸附率高，且容易洗脱，再生也比较简便；

醇沉：将洗脱液减压浓缩至4-6mg/ml，加入3-5倍体积95%乙醇，在2-5℃条件下静置10-15h，离心后收集沉淀；

冷冻干燥：将醇沉所得沉淀物用水复溶，冷冻干燥得贻贝多糖纯品。

作为优选，酶缓冲液为含木瓜蛋白酶和中性蛋白酶、pH为6.8-7.5的磷酸盐缓冲液，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的重量比为1:0.76-0.83，将酶溶于缓冲液中，可使整个酶反应系统的pH始终维持在要求范围内，不需要反复调节pH，降低劳动强度或能耗。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明提取方法简单可行，机械化操作成度高，资源利用率高，提取速率快，能耗低，提取率高，生产成本低，易于工业化规模生产；2）该提取工艺采用复合酶-微波提取提取贻贝多糖，使多糖的提取效率提高、残留率降低，且蛋白酶的加入可快速切断多糖糖链上连接的蛋白，可以除去大部分蛋白，再结合Sevage法除蛋白，进一步提高了蛋白质的去除率，同时也减少了多糖的损失，能保存多糖原有的结构与活性；3）本发明脱脂处理可以除去贻贝中的脂肪，脱脂速率高，石油醚的用量少，脱脂彻底，且可损伤贻贝细胞膜的通透性，利于贻贝多糖的提取。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

贻贝多糖的提取工艺，包括脱脂、复合酶-微波提取、层析、醇沉、冷冻干燥，其具体步骤为：

1）脱脂：将贻贝鲜肉绞碎、匀浆，用石油醚脱脂，经低温烘干、粉碎制成脱脂贻贝粉，石油醚中含有石油醚重量0.023-0.036%的两性霉素和石油醚重量0.014-0.016%的5-氟胞嘧啶；

2）复合酶-微波提取：将脱脂贻贝粉溶于水中，使得底物浓度为3-5%，按加酶量为0.8-1.3%加入的酶缓冲液，在温度为50-60℃、微波功率为400-600W下微波提取40-60min，95-100℃灭酶18-25min，冷却至室温，在3000-5000r/min离心10-20min，取上清液，然后用Sevage法去蛋白，将上清液浓缩至原体积的1/4-1/2，装入透析袋透析，除去小分子杂质和盐类，即得贻贝多糖提取液；

3）层析：将贻贝多糖提取液上样到ME-1大孔吸附树脂层析柱，以1.5-2.5ml/min的速度用去离子水洗脱，收集洗脱液；

4）醇沉：将洗脱液减压浓缩至4-6mg/ml，加入3-5倍体积95%乙醇，在2-5℃条件下静置10-15h，离心后收集沉淀；

5）冷冻干燥：将醇沉所得沉淀物用水复溶，冷冻干燥得贻贝多糖纯品。

上述酶缓冲液为含木瓜蛋白酶和中性蛋白酶、pH为6.8-7.5的磷酸盐缓冲液，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的重量比为1:0.76-0.83。

实施例2：

贻贝多糖的提取工艺，包括脱脂、复合酶-微波提取、层析、醇沉、冷冻干燥，其具体步骤为：

1）脱脂：将贻贝鲜肉绞碎、匀浆，用石油醚脱脂，经低温烘干、粉碎制成脱脂贻贝粉，石油醚中含有石油醚重量0.035%的两性霉素和石油醚重量0.014%的5-氟胞嘧啶；

2）复合酶-微波提取：将脱脂贻贝粉溶于水中，使得底物浓度为5%，加入粗脱脂贻贝粉重量0.035‰的β-氨基乙磺酸和0.046‰的十二烷基苯磺酸钠，按加酶量为0.8%加入的酶缓冲液，在温度为60℃、微波功率为450W下微波提取60min，100℃灭酶18min，冷却至室温，在5000r/min离心12min，取上清液，然后用Sevage法去蛋白，将上清液浓缩至原体积的1/4，装入透析袋透析，除去小分子杂质和盐类，即得贻贝多糖提取液，β-氨基乙磺酸和十二烷基苯磺酸钠的加入能够使多糖结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，利于蛋白酶水解掉糖蛋白的蛋白质部分，剩下糖链，提高蛋白酶酶解糖蛋白的速度和彻底度，达到意想不到的效果，且其能溶于水排除，无残留，对多糖的活性无不良影响；

3）层析：将贻贝多糖提取液上样到ME-1大孔吸附树脂层析柱，以1.7ml/min的速度用去离子水洗脱，收集洗脱液；

4）醇沉：将洗脱液减压浓缩至6mg/ml，加入3倍体积95%乙醇，在5℃条件下静置10h，离心后收集沉淀；

5）冷冻干燥：将醇沉所得沉淀物用水复溶，冷冻干燥得贻贝多糖纯品。

上述酶缓冲液为含木瓜蛋白酶和中性蛋白酶、pH为7.5的磷酸盐缓冲液，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的重量比为1:0.76。

实施例3：

贻贝多糖的提取工艺，包括脱脂、复合酶-微波提取、层析、醇沉、冷冻干燥，其具体步骤为：

1）脱脂：将贻贝鲜肉绞碎、匀浆，用石油醚脱脂，经低温烘干、粉碎制成脱脂贻贝粉，石油醚中含有石油醚重量0.03%的两性霉素和石油醚重量0.015%的5-氟胞嘧啶；

2）复合酶-微波提取：将脱脂贻贝粉溶于水中，使得底物浓度为4%，按加酶量为1.0%加入的酶缓冲液，在温度为55℃、微波功率为500W下微波提取50min，98℃灭酶20min，冷却至室温，在4000r/min离心15min，取上清液，然后用Sevage法去蛋白，将上清液浓缩至原体积的1/3，装入透析袋透析，除去小分子杂质和盐类，即得贻贝多糖提取液；

3）层析：将贻贝多糖提取液上样到ME-1大孔吸附树脂层析柱，以2.0ml/min的速度用去离子水洗脱，收集洗脱液；

4）醇沉：将洗脱液减压浓缩至5mg/ml，加入4倍体积95%乙醇，在4℃条件下静置12h，离心后收集沉淀；

5）冷冻干燥：将醇沉所得沉淀物用水复溶，冷冻干燥得贻贝多糖纯品。

上述酶缓冲液为含木瓜蛋白酶和中性蛋白酶、pH为7.0的磷酸盐缓冲液，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的重量比为1:0.8。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.贻贝多糖的提取工艺，包括脱脂、复合酶-微波提取、层析、醇沉、冷冻干燥，其特征在于：所述复合酶-微波提取步骤为：将脱脂贻贝粉溶于水中，加入的酶缓冲液，微波提取，灭酶，冷却至室温，离心，取上清液，然后用Sevage法去蛋白，将上清液浓缩，装入透析袋透析，即得贻贝多糖提取液。

2.根据权利要求1所述的贻贝多糖的提取工艺，其特征在于：所述复合酶-微波提取步骤中底物浓度为3-5%，加酶量为0.8-1.3%，提取温度为50-60℃，微波功率为400-600W，提取时间为40-60min。

3.根据权利要求1所述的贻贝多糖的提取工艺，其特征在于：所述复合酶-微波提取步骤中酶缓冲液为含木瓜蛋白酶和中性蛋白酶、pH为6.8-7.5的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求3所述的贻贝多糖的提取工艺，其特征在于：所述复合酶-微波提取步骤中木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的重量比为1:0.76-0.83。

5.根据权利要求1所述的贻贝多糖的提取工艺，其特征在于：所述脱脂步骤中石油醚中含有石油醚重量0.023-0.036%的两性霉素和石油醚重量0.014-0.016%的5-氟胞嘧啶。

6.根据权利要求1所述的贻贝多糖的提取工艺，其特征在于：所述层析步骤为：将贻贝多糖提取液上样到ME-1大孔吸附树脂层析柱，以1.5-2.5ml/min的速度用去离子水洗脱，收集洗脱液。

7.根据权利要求1所述的贻贝多糖的提取工艺，其特征在于：所述醇沉步骤为：将洗脱液减压浓缩至4-6mg/ml，加入3-5倍体积95%乙醇，在2-5℃条件下静置10-15h，离心后收集沉淀。