CN109879981A

CN109879981A - 一种青口贝多糖及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN109879981A
Application number: CN201910195135.0A
Authority: CN
Inventors: 谭道鹏; 何芋岐; 秦琳; 张倩茹; 鲁艳柳; 杜艺玫
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2019-06-14

Abstract

本方案公开了天然药物提取技术领域的一种青口贝多糖，包含D‑葡萄糖醛酸、D‑乙酰氨基半乳糖和L‑岩藻糖三种单糖，D‑葡萄糖醛酸、D‑乙酰氨基半乳糖和L‑岩藻糖的摩尔比为0.5～2.5:0.5～2.5:1，该青口贝多糖的重均分子量范围为：3000～8000Da；该青口贝多糖包括以β‑1，4‑糖苷键将D‑葡萄糖醛酸和D‑乙酰氨基半乳糖硫酸酯连接组成的主链，及以α‑1，3‑糖苷键连接L‑岩藻糖硫酸酯形成的侧链，该青口贝多糖以其碱金属盐的形式存在；上述青口贝多糖的制备方法如下：第一步是通过加入NaOH将青口贝肉体解离后，并经醇沉得到粗多糖；第二步将粗多糖加入NaCl、NaAc和乙酸温和降解得到重均分子量范围在3000‑8000的目标均一青口贝多糖。上述青口贝多糖可以用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种青口贝多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于天然药物提取技术领域，具体涉及一种青口贝多糖及其制备方法与应用。

背景技术

青口贝，也叫翡翠贻贝，又名海红。干制后即称为“淡菜”。分布于东海南部和南海沿岸。贝壳较大，壳长达13～14厘米。青口贝味咸、性温，无毒，入肝、肾经。可补肾益精、调肝养血、消瘿瘤、调经血、降血压之功效；用于虚劳羸瘦、眩晕、盗汗、阳痿、腰痛、呈血、崩漏、带下、瘿瘤、疝瘕等症。

青口贝的营养均衡,多糖、蛋白质及氨基酸含量较高，富含人体生命活动所必需的各种氨基酸、不饱和脂肪酸、无机元素等营养物质,必需氨基酸占总氨基酸量的33.2％。粗脂肪和脂肪酸含量丰富，特别是EPA和DHA总量占总脂肪酸的26.01％。除富含Ca、Mg、Fe等无机元素外,Se的含量也较高。其中牛磺酸、EPA、DHA和硒等生物活性物质对机体更具有抗病、解毒、增强免疫力等重要功能,具有较高的开发利用价值。

多糖是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。多糖在自然界分布极广，亦很重要。有的是构成动、植物细胞壁的组成成分，如肽聚糖和纤维素；有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，像人体中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。由同一种类型的单糖组成的多糖称为同多糖，如淀粉、纤维素和糖原；以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成，在化学结构上实属多种多样。就分子量而论，有从0.5万个分子组成的到超过106个的多糖。

青口贝多糖是青口贝中碳水化合物的主要存在形式，含量高达干重的20％～30％。青口贝多糖具有抗辐射损伤和改善放、化疗引起的副反应作用、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗衰老、增强免疫力等多种功能。有关青口贝多糖的报道已有很多文献，但大多局限于粗多糖，目前，并没有文献就青口贝中均一多糖(其单糖组成及聚合方式一致)的提取和应用进行研究。

发明内容

本发明意的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的青口贝多糖及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供如下方案：一种青口贝多糖，包含D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖三种单糖，所述D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖的摩尔比为0.5～2.5:0.5～2.5:1，所述青口贝多糖的重均分子量范围为：3000～8000Da。

进一步，所述青口贝多糖D-葡萄糖醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯通过β-1，4-糖苷键连接组成主链，及通过α-1，3-糖苷键将L-岩藻糖硫酸酯连接在主链上形成侧链，所述青口贝多糖以其钠盐、钾盐和钙盐的形式存在，其中以钠盐形式存在的化学结构式如下：

本发明还提供上述青口贝多糖的制备方法，包括以下步骤：

按以下步骤进行：1)取青口贝原料，加入0.5mol/L的NaOH溶液，NaOH溶液的体积为青口贝重量的10-20倍，在NaOH溶液的温度为60℃的条件下搅拌提取2小时；然后待NaOH溶液冷却至室温后，加入6mol/L HCl溶液至混合后的溶液pH值为2～3，离心处理得上清液；将上清液浓缩到青口贝原料的重量的2.5倍体积后，加入浓缩后的上清液三倍体积的95％食用乙醇，静置8-12小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖；

2)将青口贝粗多糖溶解与水中，水的体积为青口贝粗多糖重量的20-30倍体积；在35℃水浴下，分别加入NaCl、NaAc和乙酸，使溶液中的浓度达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/LNaAc和4.0mol/L乙酸；待反应终止后，进行超滤处理，得到青口贝纯多糖。

本方案的工作原理及其有益效果为：本方案中第一步是通过加入NaOH将青口贝肉体解离后，并经醇沉得到粗多糖；第二步将粗多糖加入NaCl、NaAc和乙酸温和降解得到重均分子量范围在3000-8000的目标均一青口贝多糖，本方案制备的多糖结构均一、纯度高，成药性好。

本发明中将上述青口贝多糖用于制备抗肿瘤药物。

附图说明

图1为本发明中青口贝多糖的HPGPC色谱图；

图2为本发明中青口贝多糖的红外吸收图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

实施例1：一种青口贝多糖，包含D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖三种单糖，D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖的摩尔比为0.5:0.5:1，该青口贝多糖的重均分子量范围为：3500Da；该青口贝多糖D-葡萄糖醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯通过β-1，4-糖苷键连接组成主链，及通过α-1，3-糖苷键将L-岩藻糖硫酸酯连接在主链上形成侧链，(D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖是以硫酸酯的形式存在)，青口贝多糖以其钠盐、钾盐和钙盐的形式存在，其中以钠盐形式存在的化学结构式如：

实施例2：一种青口贝多糖，包含D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖三种单糖，D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖的摩尔比为1:1:1，该青口贝多糖D-葡萄糖醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯通过β-1，4-糖苷键连接组成主链，及通过α-1，3-糖苷键将L-岩藻糖硫酸酯连接在主链上形成侧链，青口贝多糖以其钠盐、钾盐和钙盐的形式存在，其中以钠盐形式存在的化学结构式如：

实施例3：一种青口贝多糖，包含D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖三种单糖，D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖的摩尔比为2.5:2.5:1，该青口贝多糖的重均分子量范围为：7000Da；该青口贝多糖D-葡萄糖醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯通过β-1，4-糖苷键连接组成主链，及通过α-1，3-糖苷键将L-岩藻糖硫酸酯连接在主链上形成侧链，青口贝多糖以其钠盐、钾盐和钙盐的形式存在，其中以钠盐形式存在的化学结构式如：

实施例4：一种制备实施例1-3的青口贝多糖的方法，包括以下步骤：

1)取青口贝2Kg，加入30L 0.5mol/L的NaOH溶液，在NaOH溶液的温度为60℃的条件下搅拌提取2小时；然后待NaOH溶液冷却至室温后，加6mol/L HCl至混合后的溶液pH值为2.5；离心处理得上清液。上清液浓缩到约5L，加入15L的95％食用乙醇，静置10小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖420g。

2)取上述青口贝粗多糖200g，加水5L溶解；在35℃水浴下，加入NaCl、NaAc和乙酸，使溶液中的浓度达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc和4.0mol/L乙酸；待反应4小时，反应完成后，通过超滤处理，得到青口贝均一多糖180g。

经高效凝胶色谱法(HPGPC)检测，以Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱(8.0m*300m，10μm)；以0.1mol/L氯化钠为流动相；流速为0.5mL/min；柱温为35℃；示差检测器检测为均一多糖(如图1所示)，其重均分子量为5000Da；取青口贝多糖3mg适量，加KBr粉末500mg研磨均匀后，压片，经红外光谱仪分析，红外光谱吸收如图2所示；取青口贝多糖10mg加入氘代吡啶溶解后，经核磁共振波谱仪分析，其¹H/¹³C-NMR数据如表1所示。

表1：青口贝多糖¹H/¹³C-NMR谱图数据及归属

实施例5：一种制备实施例1-3的青口贝多糖方法，包括以下步骤：

1)取青口贝2Kg，加入20L 0.5mol/L的NaOH溶液，在NaOH溶液的温度为60℃的条件下搅拌提取2小时；然后待NaOH溶液冷却至室温后，加6mol/L HCl至混合后的溶液pH值至2；离心处理得上清液。将上清液浓缩到约5L，加入15L的95％食用乙醇，静置11小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖350g。

2)取上述青口贝粗多糖200g，加水4L溶解；在35℃水浴下，加入NaCl、NaAc和乙酸，使溶液中的浓度达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc和4.0mol/L乙酸；反应4小时，待反应结束后，进行超滤处理，得到青口贝均一多糖143g。经高效凝胶色谱法(HPGPC)检测为均一多糖，其重均分子量为7000Da。

实施例6：一种制备实施例1-3的青口贝多糖方法，包括以下步骤：

1)取青口贝2Kg，加入40L0.5mol/L的NaOH溶液，在NaOH溶液的温度为60℃的条件下搅拌提取2小时；然后待NaOH溶液冷却至室温后，加6mol/LHCl至混合后的溶液pH值为3；离心得上清液。将上清液浓缩到约5L，加入15L的95％食用乙醇，静置12小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖300g。

2)取上述青口贝粗多糖200g，加水6L溶解；在35℃水浴下，加入NaCl、NaAc和乙酸，使溶液中的浓度达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc和4.0mol/L乙酸；反应4小时，待反应终止后，进行超滤处理，得到青口贝均一多糖160g。经高效凝胶色谱法(HPGPC)检测为均一多糖，其重均分子量为3500Da。

实施例7：基于上述青口贝多糖用于制备抗肿瘤药物，具体为青口贝多糖对人肝癌细胞Be17402细胞增殖的抑制作用的应用，实验论证如下：

将人肝癌细胞Be17402细胞复苏，培养瓶传代培养，待细胞生长到对数生长期，消化细胞制成细胞悬液，用0.4％的台盼蓝染色，计数。

取对数生长期的细胞以1×104/mL密度接种于96孔板，37℃，5％CO2培养箱中培养24小时。吸弃培养液，加入200μL不同浓度的青口贝多糖溶液(以含10％胎牛血清RPI1640培养液配制成终浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL)，每一浓度设5个平行孔。培养24小时、48小时、72小时后，每孔加MTS 20μL混匀，于37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时，吸弃孔内液体，每孔加入二甲基亚砜200μL，用酶标仪于490nm处测吸光值。重复实验3次。计算抑制率(实验结果见表2)。

细胞生长抑制率(％)＝[(对照组平均OD值-用药组平均OD值)/对照组平均OD值]×100％。

表2青口贝多糖对Be17402细胞增殖的抑制作用

浓度	24H	48H	72H
				100μg/mL	40.42％	68.34％	76.45％
50μg/mL	29.96％	45.37％	61.83％
				25μg/mL	5.69％	16.48％	39.67％

结果显示本发明中青口贝多糖对人肝癌细胞Be17402增殖具有抑制作用，并呈剂量依赖关系。表明本发明中青口贝多糖具有治疗和/或预防肿瘤的潜在应用价值。

以上实施例只是例举了钠盐形式存在的青口贝多糖的制备方法；如需制备钾盐、钙盐等碱金属盐或碱土金属盐形式存在的青口贝多糖；只需在制备方法步骤二中，将NaCl溶液替换成相应的KCl或CaCl，NaAc替换为KAc或CaAc等相应碱金属溶液或碱土金属溶液即可。制备的其他碱金属盐或碱土金属盐形式存在的青口贝多糖也具有与上述钠盐形式存在的青口贝多糖相同或相近的抗肿瘤活性。

Claims

1.一种青口贝多糖，其特征在于：包含D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖三种单糖，所述D-葡萄糖醛酸、D-乙酰氨基半乳糖和L-岩藻糖的摩尔比为0.5～2.5:0.5～2.5:1，所述青口贝多糖的重均分子量范围为：3000～8000Da。

2.根据权利要求1所述的青口贝多糖，其特征在于：所述青口贝多糖D-葡萄糖醛酸和D-乙酰氨基半乳糖硫酸酯通过β-1，4-糖苷键连接组成主链，及通过α-1，3-糖苷键将L-岩藻糖硫酸酯连接在主链上形成侧链，所述青口贝多糖以其钠盐、钾盐和钙盐的形式存在，其中以钠盐形式存在的化学结构式如下：

3.根据权利要求2所述的青口贝多糖的制备方法，其特征在于：按以下步骤进行：1)取青口贝原料，加入0.5mol/L的NaOH溶液，NaOH溶液的体积为青口贝重量的10-20倍，在NaOH溶液的温度为60℃的条件下搅拌提取2小时；然后待NaOH溶液冷却至室温后，加入6mol/LHCl溶液至混合后的溶液pH值为2～3，离心处理得上清液；将上清液浓缩到青口贝原料的重量的2.5倍体积后，加入浓缩后的上清液三倍体积的95％食用乙醇，静置8-12小时，离心收集沉淀，得青口贝粗多糖；

2)将青口贝粗多糖溶解与水中，水的体积为青口贝粗多糖重量的20-30倍体积；在35℃水浴下，分别加入NaCl、NaAc和乙酸，使溶液中的浓度达到0.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaAc和4.0mol/L乙酸；待反应终止后，进行超滤处理，得到青口贝纯多糖。

4.根据权利要求2所述的青口贝多糖的应用，其特征在于：所述青口贝多糖用于制备抗肿瘤药物。