CN103755827B

CN103755827B - 粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其制抗肾衰药的用途

Info

Publication number: CN103755827B
Application number: CN201410020149.6A
Authority: CN
Inventors: 叶明�; 吴艳娜; 荆莲艳
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2034-01-16
Also published as: CN103755827A

Abstract

本发明公开了一种粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其在制备抗慢性肾衰药物中的用途，特征是将菌种保藏编号为CCTCC？No:M？2011196的粒毛盘菌胞外多糖，经氯乙酸羧甲基化修饰后得到的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物，根据其具有显著地抗慢性肾衰作用，按照药剂学的常规制备方法，将有效量的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物与药用辅料制备成片剂、胶囊供临床用。药效学实验证明，该胞外多糖及其羧甲基化衍生物不仅具有显著的抗慢性肾衰作用，且无毒副作用，其制备方法简单经济。

Description

粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其制抗肾衰药的用途

技术领域

本发明属于粒毛盘菌胞外多糖在医药领域中的应用，具体涉及菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其在制备抗肾衰药物中的用途。

背景技术

现代医学认为，肾脏是人体重要的排泄器官，其主要功能是过滤形成尿并排出代谢废物，调节体内的电解质和酸碱平衡。慢性肾衰竭是由各种原发性肾脏疾病或继发于其他疾病引起的肾脏进行性损伤，以代谢产物潴留、水和电解质紊乱、酸碱平衡失调，全身各系统受损为主要表现的临床综合征，已成为全球性的公共健康问题。血液透析及肾移植可以治疗慢性肾衰竭终末期肾病，但是价格较为昂贵，难以普及，临床上使用的药物通常为海昆肾喜胶囊、尿毒清颗粒等，但长期服用易出现胃脘不适、纳差、肝功能损伤等不良反应。因此研究新型无毒副作用的天然的保护慢性肾衰竭的药物具有重要的意义。

真菌多糖是一类天然高分子化合物，由醛基和酮基通过糖苷键连接，具有控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性，可做为免疫增强剂和免疫激活剂，被称为“生物反应调节物”。英国《碳水化合物聚合物》(CarbohydratePolymers,2009,78:658-665)中报道，多糖的分子结构决定其活性，可对多糖进行硫酸化、磷酸化、羧甲基化、乙酰化等分子修饰，通过改变多糖在水溶液的链构象来提高其活性，不同的取代基团、取代位置和取代度对多糖衍生物的活性有重要的影响。多糖羧甲基化修饰可以提高多糖原有活性，且能为多糖增添新的活性。

粒毛盘菌属是一类腐生性真菌，在液态深层培养条件下可产生大量的活性多糖，具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗衰老、降脂利肝及抗肿瘤等活性。中国《食品科学》(2010,30(9):276-278)曾报道了对白术多糖的抗慢性肾衰竭活性的研究；中国专利申请号201110184104.9公开了一株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌YM281(本发明人课题组自定的编号代码)多糖在制备降脂利肝药物中的应用，显示粒毛盘菌多糖具有显著的降脂利肝作用；英国《碳水化合物聚合物》(CarbohydratePolymers,2013,97,690-694)公开了粒毛盘菌多糖磷酸化修饰及其抗肿瘤活性研究，结果表明经磷酸化修饰后，粒毛盘菌多糖的抗肿瘤活性明显增强。但目前国内外未见有公开文献提及粒毛盘菌胞外多糖的羧甲基化衍生物及其作为制备抗慢性肾衰药物的应用方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物及其在制备抗肾衰药中的用途，确立菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物的抗慢性肾衰的药理作用。

本发明的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物，其特征在于是将菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌发酵提取纯化后得到的胞外多糖进行羧甲基化修饰，按：取1g粒毛盘菌胞外多糖溶于50ml2.0mol/LNaOH溶液中，在200-400r/min转速搅拌下加入5g氯乙酸，于60℃继续搅拌反应3h，冷却至室温，用冰乙酸中和至pH为7.0，过滤后将滤液用截留分子量为3500Da的透析袋透析36-48h，收集透析袋内溶液加入其体积4～5倍的体积比浓度为95％的乙醇于4℃醇沉12-24h，收集沉淀后加入50mL蒸馏水复溶，冷冻干燥后，所得到的多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b；其基本结构为(1→3)-,(1→6)-β-D-葡聚糖，其中羧甲基基团-CH₂COOH与其C-3羟基的O连接。

本发明的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物在制备抗肾衰药中的用途，其特征在于通过小鼠慢性肾衰的药理实验，确立菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物的抗慢性肾衰的药理作用；该菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物可用于制备抗肾衰药物：按药剂学的常规制备方法加工成口服制剂，即，将有效量的菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物与药用辅料混匀后制备成片剂或胶囊剂供临床用。

本发明中采用氯乙酸对菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖进行羧甲基化修饰，经IR和¹³CNMR光谱结果验证羧甲基化修饰成功，其基本结构为(1→3)-,(1→6)-β-D-葡聚糖，羧甲基基团-CH₂COOH与其C-3羟基的O连接，通过改变分子结构、取代基团和取代度，增强了其抗肾衰作用。经药效学实验表明，粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物具有显著地抗肾衰的作用，方法简单且成本低廉，无毒副作用，克服了长期服用现有药物出现的胃脘不适、纳差、肝功能损伤等不良反应。

本发明的菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物，经药效学实验表明，能有效改善腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠肾脏病理组织状态，明显的降低血清中肌酐和尿素氮含量，增加总蛋白及白蛋白含量，增强小鼠肾、肝匀浆液中SOD、GSH-PX、CAT和GSH的活性，降低MDA含量。因此可将粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物应用于制备片剂或胶囊剂型的抗慢性肾衰药物。该方法简单经济。

附图说明

图1为粒毛盘菌CCTCCNo:M2011196胞外多糖的IR光谱图；

图2为粒毛盘菌CCTCCNo:M2011196胞外多糖羧甲基化衍生物的IR光谱图；

图3为粒毛盘菌CCTCCNo:M2011196胞外多糖的¹³CNMR光谱图；

图4为粒毛盘菌CCTCCNo:M2011196胞外多糖羧甲基化衍生物的¹³CNMR光谱图；

图5到图11分别给出了经粒毛盘菌多糖及其羧甲基化衍生物治疗后慢性肾衰小鼠肾脏组织病理学检查结果照片。其中图5为正常组，图6为模型组，图7为阳性组，图8为LEP-1b低剂量组，图9为LEP-1b高剂量组，图10为CLEP-1b低剂量组，图11为CLEP-1b高剂量组小鼠肾脏组织病理学检查的照片。

具体实施方式

实施例1：

一、粒毛盘菌YM281胞外多糖制备：

采用中国专利申请号201110184104.9中所公布的方法，将菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011196(YM281)的粒毛盘菌接种于5L发酵罐，培养基配方为：葡萄糖45g/L，酵母膏14g/L，甘氨酸6.0mg/L，MgSO₄·7H₂O1g/L，KH₂PO₄1g/L，装料系数体积比为0.7，接种量为15％(体积比)，培养温度为35℃，通气量为1.0L/min，搅拌转速为180r/min，发酵时间为12天；将发酵液抽滤、浓缩后，加入其3倍体积的体积比浓度为95％的乙醇于4℃醇沉24h，将醇析液以5000r/min离心10min，去上清，所得沉淀用蒸馏水溶解，采用赛沃杰法(Sevag法)脱蛋白，加入样液体积1/3的H₂O₂保温(50℃)脱色处理后，使用3500Da的透析袋，先用自来水透析72h再用蒸馏水透析48h，-50℃冷冻干燥，即得菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖LEP-1b。

二、粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物制备：

参照日本《生物学与药学通报》(ChemicalandPharmaceuticalBulletin,1988,36(3):1016-1025)中公布的羧甲基化修饰方法，对粒毛盘菌YM281胞外多糖进行羧甲基化修饰以形成羧甲基化衍生物：取菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌发酵提取纯化后得到的胞外多糖1gLEP-1b溶于50ml2.0mol/LNaOH溶液中，在200-400rpm转速搅拌下加入5g氯乙酸，于60℃继续搅拌反应3h，冷却至室温，用冰乙酸中和至pH为7.0，过滤后将滤液用截留分子量为3500Da的透析袋透析36-48h，收集透析袋内溶液加入其体积4-5倍的体积比浓度为95％的乙醇于4℃醇沉12-24h，收集沉淀后加入50mL蒸馏水复溶，溶液冷冻干燥得到菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌(YM281)胞外多糖羧甲基化衍生物，其羧甲基化产物得率为78.4％，羧甲基化取代度DS为1.433。

三、粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物结构鉴定：

分别取LEP-1b和CLEP-1b6mg与100mgKBr混合研磨后压片，于4000-400cm^-1使用傅里叶变换光谱仪(Nexus670)进行红外光谱扫描，图1和图2分别给出了粒毛盘菌YM281胞外多糖LEP-1b和粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b的IR光谱图。

由图1中所示，LEP-1b的红外光谱中3350cm^-1处的吸收峰是O-H伸缩振动引起的，2930cm^-1处的吸收峰是C-H伸缩振动引起的，1650cm^-1处出现的吸收峰为结合水所产生的H-O-H弯曲振动峰，1050cm^-1处的吸收峰是C-O-C不对称伸缩振动引起的，表明LEP-1b具有典型的(1→3)-,(1→6)-β-D-葡聚糖的特征吸收峰。由图2中所示，CLEP-1b中1650cm^-1处由结合水所产生的H-O-H弯曲振动吸收峰消失，1600cm^-1、1420cm^-1和1330cm^-1处出现的新吸收峰，分别是由羰基中C＝O键的不对称伸缩振动、C-O伸缩振动和次甲基的振动引起，表明LEP-1b羧甲基化修饰成功。

分别取LEP-1b和CLEP-1b样品各20.0mg分别溶于1mlD₂O，90℃于BrukerAvanceAV500兆核磁共振仪上进行¹³CNMR核磁光谱分析。图3和图4分别给出了粒毛盘菌YM281胞外多糖LEP-1b和粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物的¹³CNMR光谱图。如图3中所示，LEP-1b的¹³CNMR图谱中化学位移为102.817ppm的异头碳信号是→3)-β-D-Glcp-(1→的C-1产生的，表明糖环构型为吡喃型；C-2、C-3、C-4、C-5、C-6的化学位移分别为70.637ppm、78.769ppm、67.481ppm、73.902ppm、63.352ppm。如图4中所示，CLEP-1b的¹³CNMR图谱中出现两个新的吸收峰，化学位移为178.890ppm的吸收峰是C＝O的特征吸收峰，化学位移为17.416ppm的吸收峰是次甲基的特征吸收峰，说明LEP-1b中引入了-CH₂COOH基团，化学位移为78.769ppm的C-3信号峰消失，说明羧甲基基团-CH₂COOH与LEP-1b的C-3羟基中O结合。除此之外，CLEP-1b的¹³CNMR图谱中C-1、C-2、C-4、C-5、C-6的化学位移与LEP-1b相比均未发生变化。

上述IR和¹³CNMR光谱结果表明，LEP-1b羧甲基化修饰成功，羧甲基基团-CH₂COOH与LEP-1bC-3羟基的O连接。

四、粒毛盘菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物对小鼠抗慢性肾衰作用的药理实验：

(1)粒毛盘菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物生理盐水溶液的制备：将上述粒毛盘菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物粉末用质量百分浓度为0.9％的生理盐水分别配置成100mg/mL和200mg/mL的水溶液，采取的给药体积为0.25mL/每只小鼠。

(2)动物：昆明雄性小鼠70只，体重20±2g。

(3)试剂：腺嘌呤购自洛阳德胜化工有限公司(河南、中国)，海昆肾喜胶囊购自辉南长龙生化药业股份有限公司(吉林、中国)，血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(江苏、中国)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(江苏、中国)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GSH)和丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(江苏、中国)。

(4)方法：采用腺嘌呤灌胃法建立小鼠慢性肾衰竭模型。健康雄性昆明小鼠70只，适应性喂养一周后，随机取出10只作为正常组(对照)，生理盐水灌胃(10mL/kg)，其余小鼠用300mg/Kg.d腺嘌呤灌胃给药，每天一次，连续21天，检测小鼠血肌酐和尿素氮含量。小鼠血肌酐含量高于115mM/L和尿素氮含量高于8.05mM/L时表示建模成功。取建模成功小鼠随机分成6组，每组10只，分别为：模型组(生理盐水10mL/kg)、阳性组(海昆肾喜胶囊150mg/Kg)、LEP-1b低剂量组(100mg/Kg)、LEP-1b高剂量组(200mg/kg)，CLEP-1b低剂量组(100mg/Kg)、CLEP-1b高剂量组(200mg/Kg)。连续给药28天。

(5)相关指标测定：

小鼠摄食量、体重和肾脏指数测定：

给药过程中，每天测定摄食量，取平均值。末次给药后，小鼠称体重，脱颈椎处死，取双侧肾脏，称质量，计算肾脏指数。

肾脏指数＝双肾质量/小鼠体重×100％

肾脏组织病理学检查：

取单侧肾脏，置AFF固定液中固定，O.C.T.包埋剂包埋、切片，HE(HaematoxylinandEosin)染色，光学显微镜下观察拍照。

小鼠血液生化指标测定：

小鼠脱颈椎处死后眼球采血，所得血液室温静置半小时自然凝血，5000r/min离心5min，取血清4℃保存，用于测定小鼠血液生化指标，包括BUN、Scr、TP、ALB等。按试剂盒说明书方法检测。

小鼠肾、肝组织匀浆的抗氧化物酶活等指标测定：

准确称取小鼠肾组织、肝重量，按重量(g):体积(mL)＝1:10的比例加入匀浆介质(质量分数为0.9％的生理盐水)，冰水浴条件下机械匀浆，3000r/min离心10min，取上清得质量分数为10％组织匀浆液，分别测定匀浆液中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA的含量。按照试剂盒说明书方法检测。

(6)药理实验结果：

表1给出了上述粒毛盘菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物对肾衰小鼠摄食量、体重和肾脏指数的影响。

表1LEP-1b、CLEP-1b对肾衰小鼠摄食量、体重和肾脏指数的影响

与模型组相比：^aP＜0.05，^bP＜0.01

由表1结果分析可知粒毛盘菌YM281胞外多糖及其羧甲基化衍生物对慢性肾衰小鼠摄食量、体重和肾脏指数的影响。与模型组相比，LEP-1b组和CLEP-1b组小鼠的摄食量均有不同程度的增加，其中高剂量CLEP-1b组小鼠的摄食量比模型组增加了9.93％，具有显著差异(P﹤0.05)。LEP-1b组和CLEP-1b组小鼠的体重均显著高于模型组小鼠(P﹤0.01)，其中高剂量的CLEP-1b组小鼠的体重接近正常组小鼠。肾脏指数是衡量小鼠肾脏健康程度的一个重要指标，正常小鼠的肾脏指数一般小于1％，而经腺嘌呤诱导出肾衰状态后，肾脏肿大导致肾脏指数增加。与模型组相比，低、高剂量的LEP-1b组小鼠的肾脏指数均显著减小(P＜0.01)，呈剂量-效应关系，且同剂量的CLEP-1b组小鼠的肾脏指数较LEP-1b组低。

图5到图11分别给出了经粒毛盘菌胞外多糖及其羧甲基化衍生物治疗后慢性肾衰小鼠肾脏组织病理学检查结果照片。其中图5为正常组，图6为模型组，图7为阳性组，图8为LEP-1b低剂量组，图9为LEP-1b高剂量组，图10为CLEP-1b低剂量组，图11为CLEP-1b高剂量组小鼠肾脏组织病理学检查的照片。从中可以看出粒毛盘菌CCTCCNo:M2011196胞外多糖及其羧甲基化衍生物对慢性肾衰小鼠肾脏组织病理学改善情况。

正常组小鼠肾小球和肾小管的排列紧凑，无变性坏死，亦无腺嘌呤代谢沉积物。模型组小鼠肾脏组织中有大量气泡，几乎没有正常的肾小球和肾小管。低、高剂量的LEP-1b组小鼠肾脏组织中均可见到少量完整的肾小球和肾小管。低、高剂量的CLEP-1b组小鼠肾脏组织中完整的肾小球和肾小管数目比同剂量的LEP-1b多，且高剂量的CLEP-1b组肾小管肿胀及官腔扩张程度最小，间质炎细胞的浸润程度较轻，且无明显的腺嘌呤代谢物。显然，LEP-1b能改善肾脏病理组织状态，但CLEP-1b具有更显著的改善作用。

表2给出了粒毛盘菌胞外多糖及其羧甲基化衍生物对肾衰小鼠Scr、BUN、TP和ALB含量的影响。

表2LEP-1b、CLEP-1b对肾衰小鼠Scr、BUN、TP和ALB含量的影响

与模型组相比：^aP＜0.05，^bP＜0.01

Scr和BUN水平能准确反映肾小球滤过功能，当肾小球的滤过功能衰退时会导致其水平增高，多发于肾功能衰竭、肾功能损伤及肾炎等疾病中。与模型组相比，低、高剂量的LEP-1b组多糖的Scr和BUN含量均有不同程度的降低(P＜0.05或P＜0.01)，同剂量的CLEP-1b的Scr和BUN含量比LEP-1b的更低。

慢性肾衰竭常导致机体的TP和ALB水平降低。与模型组相比，低、高剂量的LEP-1b组小鼠的TP和ALB含量均有不同程度的增加(P＜0.01)，同剂量的CLEP-1b组小鼠的TP和ALB含量较LEP-1b组小鼠高，且高剂量CLEP-1b组小鼠的TP和ALB含量接近正常组小鼠。

表3给出了粒毛盘菌胞外多糖及其羧甲基化衍生物对肾衰小鼠肾组织匀浆中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA含量的影响。

表3LEP-1b、CLEP-1b对肾衰小鼠肾组织匀浆中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA含量的影响

与模型组相比：^aP＜0.05，^bP＜0.01

研究发现肾脏疾病与生物体内氧化应激反应和活性氧的产生密切相关。SOD、GSH-PX、CAT、和GSH能清除自由基、抑制自由基脂质过氧化反应以及降低脂质过氧化水平，缓解小鼠慢性肾衰竭进程。MDA含量高低可间接反映出机体细胞受自由基攻击的严重程度，许多学者研究发现慢性肾功能衰竭病人体内的抗氧化物酶的活性降低，MDA含量升高。

在小鼠肾组织匀浆中，与模型组相比，低、高剂量的LEP-1b组小鼠的SOD、GSH-PX、CAT和GSH含量均显著增加(P＜0.05或P＜0.01，见表3)，MDA含量明显降低(P＜0.01)，同剂量的CLEP-1b组小鼠的SOD、GSH-PX、CAT和GSH含量明显高于LEP-1b组小鼠，而MDA含量低于LEP-1b组，表明LEP-1b能显著提高小鼠肾组织匀浆中的SOD、GSH-PX、CAT和GSH含量，降低MDA含量，而CLEP-1b作用更为显著。

表4给出了粒毛盘菌胞外多糖及其羧甲基化衍生物对肾衰小鼠肝组织匀浆中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA含量的影响。

表4LEP-1b、CLEP-1b对小鼠肝组织匀浆中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA含量的影响

与模型组相比：^aP＜0.05，^bP＜0.01

肝脏是机体重要的氧化防御器官，含有大量的抗氧化物酶。研究表明，慢性肾衰竭时炎症因子及代谢紊乱会导致肝脏功能受损，引起肝脏内相关酶活发生变化。在小鼠肝组织匀浆中，各剂量多糖组小鼠SOD含量均低于模型组，无显著差异(P＞0.05)，说明各剂量多糖对小鼠肝匀浆中SOD含量影响不明显(见表4)。与模型组相比，低、高剂量的LEP-1b组小鼠的GSH-PX、CAT、GSH含量均有不同程度的增加，呈剂量-效应关系(见表4)，而MDA含量则明显降低，具有极显著差异(P＜0.01)，相同剂量的CLEP-1b组小鼠的GSH-PX、GSH、CAT含量比LEP-1b组高，MDA含量比LEP-1b组低。表明LEP-1b能显著提高小鼠肝组织匀浆中的GSH-PX、CAT和GSH含量，降低MDA含量，而CLEP-1b作用更为显著。

以上结果显示，LEP-1b和CLEP-1b可通过调节小鼠肾组织匀浆中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA含量来缓解小鼠肾脏衰竭程度，同时可调节小鼠肝组织匀浆中GSH-PX、CAT、GSH和MDA含量，降低肝脏组织的受损程度，增强肝脏的免疫能力，进而保护肾衰小鼠肾脏，表明LEP-1b和CLEP-1b对小鼠慢性肾衰竭的保护作用与其抗氧化活性密切相关。

五、粒毛盘菌多糖制剂的加工：

1、片剂加工：

将100-300g粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物与药用辅料稀释剂150-300g、助流剂10-40g混匀后，与50-150mL乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂5-10g混匀后压片，制成1000片片剂。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润滑剂采用硬脂酸镁或硬脂酸锌。

本实施例推荐的片剂加工的优选例为：取过80～100目筛的粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物200g、稀释剂糊精260g、助流剂滑石粉30g混合均匀后加适量乙醇混合均匀制得软材，软材过筛得到湿颗粒，干燥后整粒，最后加入润滑剂硬脂酸镁10g混匀后压片，制成1000片。片重0.5g，多糖含量0.2g/片。

2、胶囊剂加工：

将药用辅料稀释剂150-450g、助流剂30-60g、润湿剂2-6g混匀后与150-350g的上述粒毛盘菌YM281胞外多糖羧甲基化衍生物混合均匀，装1#空心胶囊，制得胶囊剂1000粒。所述药用辅料稀释剂选用糊精或干淀粉；所述助流剂采用滑石粉或微粉硅胶或微晶纤维素；所述润湿剂采用十二烷基硫酸钠或者磺基丁二酸二辛酯。

本实施例推荐的胶囊剂加工优选例为：取稀释剂干淀粉250g，助流剂滑石粉45g，润湿剂十二烷基硫酸钠5g混合均匀与200g粒毛盘菌YM281胞外多糖混合均匀后装1#空心胶囊1000粒。多糖含量0.2g/粒。

本发明使用菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌YM281胞外多糖，并以其羧甲基化衍生物为原料在制备抗慢性肾衰药物中的应用。药效学实验表明粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物对腺嘌呤所致慢性肾衰小鼠有明显的促进肾脏组织的修复，降低血清中的肌酐和尿素氮含量，增加总蛋白及白蛋白含量，并能增强小鼠肾、肝匀浆液中SOD、GSH-PX、CAT、GSH含量，降低MDA含量。因此它能用于制备抗慢性肾衰药物，且制备方法经济简单，安全无毒副作用。

实施例2：

先按如下条件和方式制备获得粒毛盘菌胞外多糖：将菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌接种于4L发酵罐，培养基配方为：葡萄糖40g/L，酵母膏12g/L，甘氨酸5.0mg/L，MgSO₄·7H₂O1.1g/L，KH₂PO₄1.2g/L，装料系数体积比为0.6，接种量为12％(体积比)，培养温度为30℃，通气量为1.1L/min，搅拌转速为170r/min，发酵时间为10天；将发酵液抽滤、浓缩后，加入其2倍体积的质量分数为95％的乙醇于4℃醇沉24h，将醇析液以3500r/min离心10min，去上清，沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤2-3次，然后用蒸馏水溶解，Sevage法脱蛋白及溶液1/3体积的H₂O₂保温(50℃)脱色处理后，蒸馏水常温透析48h，-50℃冷冻干燥，即得菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖LEP-1b。

再用如下条件和方式制备获得粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物：将1gLEP-1b溶于45ml2.0mol/LNaOH溶液中，剧烈搅拌下加入4.5g氯乙酸，于60℃继续搅拌反应4h。冷却至室温，冰乙酸中和至pH为7.0，过滤，滤液用自来水透析2d，蒸馏水透析2d，浓缩至40ml，加入4～5倍体积比浓度为95％的乙醇收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤两次，冷冻干燥得多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b，其羧甲基化得率为72.3％，取代度为1.398，去实施例1中羧甲基化多糖的得率和取代度相似。

然后将上述粒毛盘菌胞外多糖及其羧甲基化衍生物生物粉末用质量百分浓度为0.9％的生理盐水配置成100mg/mL、200mg/mL的水溶液，给药体积为0.25mL/只。

将上述各剂量的粒毛盘菌胞外多糖及其羧甲基化衍生物进行抗慢性肾衰药理实验，所采用的方式步骤和其他条件均与实施例1中相同，也都得到了与实施例1中类似的结果。

上述实施例的实验说明，菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖及其羧甲基化衍生物不仅具有显著的抗慢性肾衰作用，且无毒副作用，其制备方法简单经济，故可将菌种保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖及其羧甲基化衍生物应用于制备片剂或胶囊剂型的抗慢性肾衰药物。

Claims

1.一种粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物，其特征在于是将菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌发酵提取纯化后得到的胞外多糖进行羧甲基化修饰，按：取1g粒毛盘菌胞外多糖溶于50ml2.0mol/LNaOH溶液中，在200-400r/min转速搅拌下加入5g氯乙酸，于60℃继续搅拌反应3h，冷却至室温，用冰乙酸中和至pH为7.0，过滤后将滤液用截留分子量为3500Da的透析袋透析36-48h，收集透析袋内溶液加入其体积4～5倍的体积比浓度为95%的乙醇于4℃醇沉12-24h，收集沉淀后加入50mL蒸馏水复溶，冷冻干燥后，所得到的多糖羧甲基化衍生物CLEP-1b；其基本结构为(1→3)-,(1→6)-β-D-葡聚糖，其中羧甲基基团-CH₂COOH与其C-3羟基的O连接。

2.权利要求1所述粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物在制抗肾衰药中的用途，其特征在于菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物用于制备抗慢性肾衰的药物。

3.如权利要求2所述的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物在制抗肾衰药中的用途，特征在于所述制备抗慢性肾衰的药物，是按照药剂学的常规方法，将有效量的菌株保藏编号为CCTCCNo:M2011196的粒毛盘菌胞外多糖羧甲基化衍生物与药用辅料混匀后制备成片剂或胶囊。