CN104710538A - 一种三七花阿拉伯半乳聚糖及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从三七花中提取的多糖、其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途。具体而言，本申请涉及一种从三七花中提取的阿拉伯半乳聚糖，所述制备方法包括：首先从三七花中提取粗多糖，醇沉、离子柱层析纯化和波谱鉴定后得一阿拉伯半乳聚糖。经体外实验证明，该多糖可显著抑制胰腺癌肿瘤细胞的生长并有效抑制血管生成，有望成为治疗肿瘤的潜在多糖药物。

Description

一种三七花阿拉伯半乳聚糖及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及多糖类物质、其提取方法及其在制备药物中的用途，具体涉及一种从三七花(flowers of Panax Notoginseng(BurK.)F.H.Chen)中提取阿拉伯半乳聚糖多糖RN1的方法、采用该方法提取的阿拉伯半乳聚糖多糖和所述阿拉伯半乳聚糖多糖在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统恶性肿瘤，其发病隐匿、进展快、预后差，大约80%的患者确诊时往往伴有局部的侵犯或远处的转移。我国胰腺癌发病率近20年增长了4倍，胰腺癌患者总体5年生存率低于5%，胰腺癌死亡率居高不下的主要原因是临床早期诊断的困难、缺乏有效的临床治疗方法以及对胰腺癌发生发展机制尚未完全清楚[参见：Kim EJ,Simeone DM.Advance in pancreatic cancer[J].Curr Opin Gastroenterol,2011,275:460-66.和Philp PA,Mooney M,Jaffe D,et al.Consensus report of the national cancerinstitute clinical trials planning meeting on pancreas cancer treatment[J].ClinOncol,2009,27(33):5660-5669.]。以吉西他滨为基础的化疗虽为标准化疗方案，但在改善症状和延长生存方面仅有微弱优势，因此，临床胰腺癌的治疗仍需要开发新的药物，特别是既能抑制肿瘤自身生长又能抑制其转移，并且毒副作用低的药物。
而近年来的研究发现，多糖具有显著地抗肿瘤活性并且对人体的毒副作用相对较小，对多糖的生物活性研究在医学领域已经成为国内外专家学者研究的热点。迄今为止，在我国已投放市场的多糖药物主要有：香菇多糖注射液、猪苓多糖注射液、云芝多糖胶囊、黄芪多糖、云芝肝泰、灰树花胶囊等。国外对多糖的研究也十分重视，目前有多种植物多糖已经在临床治疗上用于肿瘤的辅助治疗和减轻化疗的副作用[参见Schepetkin IA,Quinn MT.Botanical polysaccharides:Macrophage immunomodulation and therapeuticpotential[J].Int Immunopharmacol,2006,6(3):317-333.]。美国McAnalley教授领导的Carrington实验室经过多年的研究，分离出一种经过冻干后不再降解的，由β(1→4)键连接的活性黏多糖CarrisynTM，并已获得美国FDA的批准，作为一种生物制剂广泛用于治疗胃肠道、免疫类疾病以及癌症、艾滋病等，并取得了惊人的疗效。鉴于多糖物质的多种抗肿瘤活性，使其在成为治疗胰腺癌候选药物上具有巨大的应用前景。
发明内容
本发明利用一种简单有效的多糖提取工艺和方法，以三七花为原料获得了一种阿拉伯半乳聚糖的多糖，药理实验表明所述多糖在细胞水平上可显著抑制肿瘤细胞(实例为胰腺癌肿瘤细胞)的增殖并抑制新生血管的生成和迁移，该多糖有望开发成为一种治疗肿瘤的糖类药物。
本发明的一个目的在于提供一种多糖，其结构为
其中，所述多糖的重均分子量范围为5-100kDa，优选为20-80kDa；更优选为20.5-40kDa。
所述多糖含有41.2wt%的半乳糖、51.3wt%的阿拉伯糖、3.5wt%的半乳糖醛酸和4.0wt%的鼠李糖；
所述多糖的红外图谱的主要伸缩振动吸收峰与图1所示的红外图谱中的基本一致，优选地，在所述多糖的红外图谱中，3424cm-1附近为O-H伸缩振动吸收峰，2921cm-1附近为C-H伸缩振动吸收峰，1000-1400cm-1附近为C-O和糖环振动信号，1720cm-1附近没有吸收峰；
所述多糖的13C NMR谱的主要信号值与与图2所示的13C NMR谱一致，优选地，在所述多糖的13C NMR谱中，位于δ110-δ108的端基碳信号，分别为末端阿拉伯糖、1,3-阿拉伯糖及1,3,5-阿拉伯糖的C1信号；位于δ106-δ104的端基碳信号，分别为末端半乳糖、1,3-半乳糖、1,6-半乳糖及1,3,6-半乳糖的C1信号；位于δ102的微弱端基碳信号，分别为半乳糖醛酸及鼠李糖的C1信号；在δ17.7处为鼠李糖甲基碳的信号峰；在δ176.7处为半乳糖醛酸羧基碳的信号峰。
本发明的另一目的是提供所述多糖的制备方法。
本发明提供的多糖的制备方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的三七花经乙醇脱脂、水提、过滤，将所得滤液浓缩，透析、浓缩、醇沉、离心、真空干燥，得水提三七花粗多糖；
优选地，所述步骤a包括：干燥的三七花经75%-95%乙醇脱脂，干燥，加入去离子水，加热条件下提取，过滤，残渣再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩，离心，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的75%-95%乙醇，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提三七花粗多糖；
更优选地，所述步骤a.包括：干燥的三七花经95%乙醇脱脂7-10天，室温自然干燥，干燥后的三七花加入20倍重量的去离子水，100℃下提取2-6次，每次5-7h，滤液合并，加热浓缩，离心，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的95%乙醇，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提三七花粗多糖；
b.多糖纯化：将所述水提三七花粗多糖用DEAE纤维素阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.1M NaCl洗脱，收集0.1M NaCl洗脱组分得纯化多糖；
优选地，所述步骤b.包括：取三七花粗多糖，水溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，依次以蒸馏水和0.1M NaCl洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并0.1M NaCl洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得多糖；
更优选地，所述步骤b.包括：取三七花粗多糖，加入10倍重量的水中溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，依次以蒸馏水和0.1MNaCl洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并0.1M NaCl洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得多糖。
本发明的又一目的是提供所述多糖在制备治疗肿瘤的药物中用途。
本发明的又一目的是提供所述多糖在制备预防或治疗肿瘤转移的药物中的用途。
优选地，所述肿瘤为胰腺癌。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的内容。
附图说明
图1为实施例1制备的多糖RN1的IR谱图；
图2为实施例1制备的多糖RN1的13C NMR谱图；
图3为根据实验实施例1测量的实施例1制备的多糖RN1对人胰腺癌细胞BxPC-3和AsPC-1以及人正常肝细胞LO2生长抑制作用随浓度变化的示意图；
图4为根据实验实施例1测量的实施例1制备的多糖RN1对人胰腺癌细胞BxPC-3和AsPC-1平板克隆形成抑制作用示意图；
图5为根据实验实施例1测量的实施例1制备的多糖RN1对人表皮血管内皮细胞HMEC-1管腔形成及迁移抑制作用示意图。
具体实施方式
实施例1：阿拉伯半乳聚糖RN1的制备
a.多糖提取：
干燥的三七花，用95％的乙醇脱脂一周，然后室温自然干燥。干燥后的三七花1000g用沸水(去离子水)20升提取5次，每次6h。硫酸-苯酚检测至无明显反应，过滤，将每次的提取液合并后加热浓缩至2升，在搅拌下加入三倍体积6升的95%乙醇，静置过夜，倾去上清液，离心分离，所得沉淀用2倍体积的无水乙醇洗涤，离心分离，沉淀置40℃下真空干燥，得水提三七花粗多糖100g。
b.多糖纯化：
取上述制备的三七花粗多糖10g，100mL水溶解，离心除去不溶物，上清液通过Cl-型DEAE-纤维素阴离子柱进行初步分离。依次以蒸馏水和0.1MNaCl洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并0.1M NaCl洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得RN多糖0.5g。
c.多糖结构鉴定：
经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定RN1多糖相对分子质量为20.5kDa。将其进行单糖组成分析，即将多糖完全水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后送入GC分析。单糖组成分析结果显示，RN1多糖主要含半乳糖、阿拉伯糖，及痕量的鼠李糖和半乳糖醛酸。结合红外和核磁共振分析(参见图1和2)，确定RN1为一阿拉伯半乳聚糖。
d.多糖结构解析：
经高效凝胶色谱法析(HPGPC)分析表明RN1的分子量为20.5kDa，其纯度测定图见图1。
单糖组成分析表明RN1主要含有半乳糖(41.2%)，阿拉伯糖(51.3%)及少量的半乳糖醛酸(3.5%)和鼠李糖(4.0%)。
红外图谱显示，3424cm-1为O-H伸缩振动吸收峰，2921cm-1为C-H伸缩振动吸收峰,1000-1400cm-1附近为C-O和糖环振动信号，1720cm-1附近没有吸收峰，表明该多糖不含有糖醛酸(图1)。
13C NMR谱中(图2)，位于δ110-δ108的端基碳信号，分别为末端阿拉伯糖、1,3-阿拉伯糖及1,3,5-阿拉伯糖的C1信号；位于δ106-δ104的端基碳信号，分别为末端半乳糖、1,3-半乳糖、1,6-半乳糖及1,3,6-半乳糖的C1信号；位于δ102的微弱端基碳信号，分别为半乳糖醛酸及鼠李糖的C1信号。此外，在δ17.7处为鼠李糖甲基碳的信号峰，在δ176.7处为半乳糖醛酸羧基碳的信号峰。从上述结果可以发现RN1为一阿拉伯半乳聚糖。
实施例2：阿拉伯半乳聚糖RN1抑制胰腺癌肿瘤活性
MTT(四氮唑盐法)实验
实验采用人胰腺癌细胞株BxPC-3和AsPC-1以及人正常肝细胞株LO2(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)培养于含有10%胎牛血清(Gibco公司)、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养基(HyClone公司)中。细胞在37℃含5%CO2培养箱中培养。
将处于对数生长期的BxPC-3,AsPC-1,LO2细胞5×103个接种于96孔板中，培养箱孵育24h后弃上清，加入含有均一的多糖RN1(实施例1制备)的培养基溶液100μL，使终浓度为62.5、125、250、500和1000μg/mL，每个浓度均为五个复孔，另设空白对照孔(仅加相应体积的样品溶解液)。细胞在培养箱培养24,48和72h后，用MTT法检测。
平板克隆形成实验
待胰腺癌细胞BxPC-3及AsPC-1生长至汇合度达到70%-80%时，以0.25%胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，并用吸管反复吹打细胞悬液，使细胞充分分散至单细胞百分率＞95%，台盼蓝染色后用细胞计数板计活细胞数，调整细胞密度，接种1×103个细胞于6孔细胞培养板，培养箱孵育24h后加入含有均一的多糖RN1(实施例1制备)的培养基溶液2mL，使终浓度为0.5mg/mL和1mg/mL，另设空白对照组，每隔2天换新鲜培养液，37℃，5%CO2培养箱孵育14天后，终止培养，弃上清，PBS浸洗2次，4%多聚甲醛溶液5mL固定15分钟，然后去固定液，加适量吉姆萨染液染20分钟，用流水缓慢洗去染液，空气干燥。用肉眼直接计数克隆数目并统计。
实施例3：多糖RN1抑制新生血管生成及其迁移
体外血管生成实验
实验采用人表皮血管细胞HMEC-1(美国埃默里大学建系，保存于中国科学院上海药物研究所)培养于含有15%胎牛血清(Gibco公司)、2mM L-谷氨酰胺、10ng/mL EGF、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的MCDB131培养基(Gibco公司)中。细胞在37℃含5%CO2培养箱中培养。
4℃化冻的基质胶50μL加入到4℃预冷的96孔板中，于37℃固化30分钟，然后加入含有0,0.5mg/mL和1mg/mL RN1的HMEC-1细胞4.5×104个，在细胞培养箱中继续培养12h。结果用倒置显微镜拍摄记录，放大倍数为40倍，利用Image J软件统计视野中管腔的平均长度。
划痕愈合实验
HMEC-1细胞5×105个种入六孔板中，24h后，用黄枪头划一痕，PBS小心洗3次，加入含有0,0.5mg/mL和1mg/mL RN1的培养基2mL，置于细胞培养箱中继续培养12h。刚划痕(t=0)及划痕后(t=12)用倒置显微镜拍摄记录细胞愈合情况，放大倍数为40倍。
MTT实验
HMEC-1细胞5×103个接种于96孔板，培养24h后，弃上清加入含有均一的多糖RN1(实施例1制备)的培养基溶液100μL，使终浓度为62.5,125,250,500和1000μg/mL，每个浓度均为五个复孔，另设空白对照孔(仅加相应体积的样品溶解液)。细胞在培养箱培养72h后，用MTT法检测。
由图3可见，RN1在62.5至1000μg/mL的浓度范围内，对BxPC-3和AsPC-1细胞的生长抑制率随浓度的增加而升高，呈现良好的浓度依赖性。当RN1浓度达到1000μg/mL时，其对BxPC-3细胞的抑制率达66%。对LO2细胞的MTT实验结果表明RN1没有明显的肝毒性。该实验结果表明，RN1可有效抑制肿瘤细胞活力并对正常细胞没有影响。
由图4可见，RN1可明显抑制BxPC-3和AsPC-1克隆形成，呈现良好的浓度依赖性。当RN1浓度达到1mg/mL时，细胞生长缓慢，不仅可见的克隆数目明显减少，而且每个克隆包含的细胞数目也明显减少。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状，该实验结果表明，RN1可有效抑制肿瘤细胞增殖。
由图5A可见，RN1能抑制HMEC-1细胞在基质胶上的管腔形成，并且与对照组相比，RN1在1mg/mL的浓度下，几乎抑制了HMEC-1细胞的管腔形成能力。进而我们研究了RN1对HMEC-1细胞迁移能力的影响，在划痕愈合实验中，RN1能明显抑制HMEC-1细胞的迁移(图5B)，并呈现较好的剂量依赖性关系。血管生成是一个多步骤的过程，于是，我们进一步检测了RN1对HMEC-1生长的影响，结果发现在抑制血管生成的有效浓度下，RN1对内皮细胞的生长几乎没有影响(图5D)。管腔形成和划痕愈合实验是体外评价对化合物对血管生成作用的经典模型，血管生成作用又与肿瘤的转移密切相关。
肿瘤的发生发展是一个多步骤的过程，参与整个过程的有肿瘤细胞、内皮细胞以及边缘细胞等，我们经过系统研究，证明了RN1既可以对肿瘤细胞本身产生增殖抑制作用又可以对血管生成有效抑制，胰腺癌是一种恶性程度极高，转移能力极强的消化道肿瘤，因而本研究表明，RN1是一种潜在的治疗胰腺癌的有效药物。

Claims (10)

1.一种多糖，其结构为：
优选地，所述多糖的重均分子量范围为5-100kDa，优选为20-80kDa；更优选为20.5-40kDa。
2.根据权利要求1所述的多糖，其含有41.2wt%的半乳糖、51.3wt%的阿拉伯糖、3.5wt%的半乳糖醛酸和4.0wt%的鼠李糖。
3.根据权利要求1所述的多糖，其红外图谱的主要伸缩振动吸收峰与附图1所示的红外图谱中的基本一致；
优选地，在所述多糖的红外图谱中，3424cm-1附近为O-H伸缩振动吸收峰，2921cm-1附近为C-H伸缩振动吸收峰，1000-1400cm-1附近为C-O和糖环振动信号，1720cm-1附近没有吸收峰。
4.根据权利要求1所述的多糖，其13C NMR谱的主要信号值与附图2所示的13C NMR谱基本一致；
优选地，在所述多糖的13C NMR谱中，位于δ110-δ108的端基碳信号，分别为末端阿拉伯糖、1,3-阿拉伯糖及1,3,5-阿拉伯糖的C1信号；位于δ106-δ104的端基碳信号，分别为末端半乳糖、1,3-半乳糖、1,6-半乳糖及1,3,6-半乳糖的C1信号；位于δ102的微弱端基碳信号，分别为半乳糖醛酸及鼠李糖的C1信号；在δ17.7处为鼠李糖甲基碳的信号峰；在δ176.7处为半乳糖醛酸羧基碳的信号峰。
5.一种制备如权利要求1所述的多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的三七花经乙醇脱脂、水提、过滤，将所得滤液浓缩，透析、浓缩、醇沉、离心、真空干燥，得水提三七花粗多糖；
b.多糖纯化：将所述水提三七花粗多糖用DEAE纤维素阴离子柱进行分级纯化，依次用水和0.1M NaCl洗脱，收集0.1M NaCl洗脱组分得纯化所述多糖RN1。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的三七花经75%-95%乙醇脱脂，干燥，加入去离子水，加热条件下提取，过滤，残渣再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩，离心，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的75%-95%乙醇，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提三七花粗多糖；
b.多糖纯化：取三七花粗多糖，水溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，依次以蒸馏水和0.1M NaCl洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并0.1M NaCl洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得所述多糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的三七花经95%乙醇脱脂7-10天，室温自然干燥，干燥后的三七花加入20倍重量的去离子水，100℃下提取2-6次，每次5-7h，滤液合并，加热浓缩，离心，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的95%乙醇，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提三七花粗多糖；
b.多糖纯化：取三七花粗多糖，加入10倍重量的水中溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，依次以蒸馏水和0.1M NaCl洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并0.1M NaCl洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得所述多糖RN1。
8.根据权利要求1所述的多糖RN1在制备治疗肿瘤的药物中用途。
9.根据权利要求1所述的多糖RN1在制备预防或治疗肿瘤转移的药物中的用途。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中，所述肿瘤为胰腺癌。
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