CN108530547B - 一种阿拉伯半乳聚糖kmcp及其制备方法和在制备免疫调节剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种阿拉伯半乳聚糖KMCP及其制备方法和在制备免疫调节剂中的应用。本发明采用在我国已有广泛分布的菊科植物苦荬菜为原料提取分离具有免疫活性的阿拉伯半乳聚糖KMCP，植物材料来源极为丰富，且在应用开发中，通过大量采集利用到苦荬菜植物材料，还将有助于推进对苦荬菜植物进一步资源综合利用，因而将不仅具有潜在良好的经济效益，而且还将具有潜在良好的生态效益。

Description

一种阿拉伯半乳聚糖KMCP及其制备方法和在制备免疫调节剂 中的应用

技术领域：

本发明属于提高免疫保健和医药技术领域，具体涉及一种阿拉伯半乳聚糖KMCP及其制备方法和在制备免疫调节剂中的应用。

背景技术：

多糖是一类天然大分子物质，是自然界含量最丰富的生物聚合物，能广泛应用于食品、饲料、医药、造纸等不同领域，具活性的多糖基于多样的生物活性可参与到细胞各种生命现象的调节。药理和临床研究表明，一些具生物活性的多糖类化合物能激活免疫细胞，提高机体的免疫功能，而对正常细胞没有毒副作用。其中，从植物(尤其是从中药)中提取的具生物活性的水溶性多糖最为重要，其对免疫系统的潜在调节作用往往得到更多的关注，已成为当今新药的发展方向之一。苦荬菜(Ixerispolycephala Cass.)，又名多头苦荬，为苦荬菜属的一年生草本植物，广泛分布于亚洲东南部，东南亚南部。中国自古就有采集野生苦荬菜食用的习惯，以嫩茎叶供食用，可凉拌生食、做汤等，风味独特。自上世纪90年代，也被加工成饮料，罐装或脱水蔬菜和饲料添加剂，以增加其使用和商业价值。其全草入药，具清热解毒、去腐化癖、止血生机之功效，可治疗疮、无名肿毒、子宫出血等症。现代医学和营养学对苦荬菜功能成分进行了分析，认为其具有免疫调节潜力，这表明苦荬菜可作为适用于功能性食品的活性物质来源，不过目前尚鲜有关于其多糖及功能的报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种新的阿拉伯半乳聚糖KMCP。

我们近期在探索揭示苦荬菜(Ixerispolycephala)功能性活性成分的研究中，分离得到一种新的水溶性阿拉伯半乳聚糖(命名为KMCP)，其平均分子量为1.95×10⁶Da。经结构分析，确定KMCP是以27.5％的(1→4)-β-Galp残基和72.5％的(1→4,6)-β-Galp残基相连为主链，并以(1→5)-α-Ara残基或α-Araf(1→5)α-Araf(1→二糖残基通过(1→4,6)-β-Galp残基的O-6连接到主链。其最有可能的结构单元为：

然后，通过中性红吞噬、Griess试剂法测NO、脾细胞增殖以及荧光标记NF-κB实验评价了多糖 KMCP的免疫活性，显示KMCP在免疫调节方面具潜在重要价值用途。

本发明的阿拉伯半乳聚糖KMCP，其结构如下所示：

本发明的第二个目的是提供一种上述阿拉伯半乳聚糖KMCP的制备方法，其特征在于，阿拉伯半乳聚糖KMCP是从苦荬菜(Ixerispolycephala)植物全株或其之任一部位提取分离得到的。

具体制备方法如下：

将苦荬菜植物全株或其之任一部位用乙醇脱脂，药物残渣去除乙醇后水提取，水提液经过减压浓缩，再加入乙醇醇沉，沉淀用水复溶，透析，浓缩得到苦荬菜粗多糖，将苦荬菜粗多糖经DEAE纤维素层析，用NaCl溶液梯度洗脱，收集馏分，经浓缩，透析，冷冻干燥，得到阿拉伯半乳聚糖KMCP。

所述水为热水(最好为沸水)。

所述的用NaCl溶液梯度洗脱，收集馏分，经浓缩，透析，冷冻干燥，得到阿拉伯半乳聚糖KMCP是依次用蒸馏水，0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M NaCl溶液进行洗脱，合并多糖洗脱部分，浓缩，透析，冷冻干燥，即得到阿拉伯半乳聚糖KMCP。

经体外药理实验证实，本发明提供的阿拉伯半乳聚糖KMCP表现出明显的免疫调节活性，既可以增强巨噬细胞的吞噬能力、促进巨噬细胞产生NO、激活NF-κB，还能促进脾细胞的增殖。

因此，本发明的第三个目的是提供上述阿拉伯半乳聚糖KMCP在制备免疫调节剂中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种免疫调节剂，其特征在于，含有有效量的阿拉伯半乳聚糖KMCP或其作为辅助载体。

本发明的第五个目的是提供苦荬菜全株或其之任一部位在制备阿拉伯半乳聚糖KMCP中的应用。

本发明采用在我国已有广泛分布的菊科植物苦荬菜为原料提取分离具有免疫活性的阿拉伯半乳聚糖KMCP，植物材料来源极为丰富，且在应用开发中，通过大量采集利用到苦荬菜植物材料，还将有助于推进对苦荬菜植物进一步资源综合利用，因而将不仅具有潜在良好的经济效益，而且还将具有潜在良好的生态效益。

附图说明：

图1a是高效凝胶色谱法测定分子量的标准曲线，图1b是化合物KMCP的高效凝胶色谱图；图2是化合物KMCP的¹H核磁图谱(A)和¹³C核磁图谱(B)；

图3是化合物KMCP的二维核磁谱图，HSQC(A)、HMBC(B)和¹H-¹H COSY(C)；

图4是化合物KMCP对巨噬细胞吞噬能力的影响。巨噬细胞与不同浓度的KMCP共孵育12 小时后，用裂解液溶解细胞后测定吸光度，计算吞噬指数。三组平行实验，结果用平均值± SD表示；

图5是化合物KMCP对巨噬细胞产生NO的影响。巨噬细胞RAW264.7与不同浓度的KMCP 共孵育12小时后，利用格里斯试剂测定细胞上清液中的NO含量。三组平行实验，结果用平均值±SD表示；

图6是化合物KMCP对脾细胞增殖的影响。小鼠脾细胞与不同浓度的KMCP在有ConA(5 μg/mL)或LPS(2μg/mL)存在的条件下共培养48h。三组平行实验，结果用平均值±SD表示；图7是化合物KMCP通过NF-κB信号途径激活抗原呈递细胞。图a表示分别用100μg/mL 的KMCP样品或者2μg/mL的LPS处理RAW264.7细胞3h，通过荧光显微镜来观察红色标记的NF-κB蛋白是否转运到蓝色标记的细胞核中，图b表示用PBS、100μg/mL KMCP、LPS 处理下的细胞的荧光强度。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：从苦荬菜中制备化合物KMCP

1.1仪器与试剂

减压浓缩采用日本东京理化公司N-1000旋转蒸发仪、CCA-1110循环式冷却箱和SB-1000电热恒温水浴锅；HPLC采用日本岛津公司LC-20AT型液相色谱仪、SPD-M20A检测器和Shim-PackPRC-ODS色谱柱(粒径5μm,孔径12nm,250mm×20mm)；中压半制备采用上海利穗科技有限公司(Dr Flash-S)分离纯化系统；电喷雾质谱(ESIMS)采用美国应用生物系统公司MDS SCIEXAPI 2000LC/MS/MS仪，以甲醇为溶剂直接进样测定；¹H NMR谱和¹³C NMR谱采用Bruker DRX-400核磁共振仪，并以四甲基硅烷为内标测定。显色方法采用10％硫酸乙醇溶液或硫酸香草醛处理后加热显色或碘蒸气显色。

1.2植物来源与鉴定

供提取用植物材料苦荬菜(Ixerispolycephala)购自湖南药材市场，由中国科学院华南植物园易绮斐副研究员鉴定。

1.3提取分离

室温下，将3kg粉碎过筛后的苦荬菜植株用95％工业乙醇(按1:10，M/V g/ml)浸泡7天，浸泡期间用搅拌器搅拌浸泡，每隔1天更换一次工业乙醇用以脱脂。脱脂结束后，抽滤去除乙醇，收集材料残渣，室温挥发干乙醇。在100℃条件下，用蒸馏水(按1:10，M/V g/ml)分别将残渣提取3次，每次2h。收集苦荬菜蒸馏水提取液，旋蒸浓缩至1.0-1.5L，加入4倍体积的95％无水乙醇，4℃沉淀过夜，3500rpm离心30min去上清，沉淀用蒸馏水复溶，并用蒸馏水透析(分子量切断1000Da，即去除1000Da以下的)三天，得到栗棕色粗多糖。然后用 HPGPC检测粗多糖。

在预处理好的DEAE纤维素填料柱中上样。称取4g粗多糖样品，加入200mL蒸馏水搅拌溶解，离心，取上清液，沿玻璃柱壁缓慢加入多糖溶液，保持柱面平整。依次用蒸馏水，0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M NaCl以2mL/min的流速进行洗脱，下面用自动部分收集器收集洗脱液，利用硫酸-苯酚法合并糖含量多的洗脱部分，浓缩，透析，冷冻干燥，保存于干燥器内备用，即得到目标化合物KMCP(约970mg)，即为阿拉伯半乳聚糖KMCP。

1.4阿拉伯半乳聚糖KMCP的理化性质检测及结构鉴定

1.4.1纯度鉴定及相对分子量的测定

多糖(化合物KMCP)的纯度和相对分子量采用HPGPC进行测定。HPGPC使用waters515 色谱柱，Waters Ultrahydrogel预装柱(250，1000，2000；30cm×7.8mm，粒径6μm)，waters 2414示差检测器。流动相为3mM乙酸钠(含0.05％叠氮化钠)溶液；流速0.5mL/min，柱温37℃，进样量为100μL。

分别将相对分子质量为5.2，48.6，668，2000kDa的Dextran系列标准葡聚糖配制成5 mg/mL溶液，12000rpm离心5min，相继进样，记录各自的保留时间，记录色谱图。用N2000数据工作站系统进行数据处理，计算相对分子量与保留时间的关系，以Log(Mw)为纵坐标，时间为横坐标得出标准曲线公式。

1.4.2.化学组成的测定

利用硫酸-苯酚法、间羟基联苯法和考马斯亮蓝法对分离得到的化合物KMCP分别进行了中性糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量的测定。多糖的单糖组成参考文献所述的HPLC法进行测定。

称取标准品木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、核糖(Rbs)、葡萄糖醛酸(GlcA)及半乳糖醛酸(GalA)各5mg，加纯水配制成10mg/mL 单标溶液，然后配制成0.5mg/mL的混标溶液。吸取1mL混标溶液放入带帽反应管中，再加入 1mL 0.6M NaOH溶液、2mL 0.5M PMP(0.4355g，5mL)溶液，混匀，盖好塞子，70℃条件下反应100min，终止反应后冷却至室温，放置10min，加入2mL 0.3M的HCl，中和加入的 NaOH，摇匀后，加入等体积的氯仿进行萃取，反复操作至少三次，所得水相用0.22μm滤膜过滤，液相色谱进行测定。

称取10mg干燥的纯多糖样品(化合物KMCP)分别放置于带帽反应管中，加入4M TFA10 mL，110℃烘箱中反应水解4h，冷却后，少量多次加甲醇减压浓缩至干，多次操作至完全除去TFA；200μL水复溶残渣，取出残渣100μL，加入100μL的0.6mol/L的NaOH溶液充分溶解残渣，再加200μL的0.5mol/L的PMP(0.2613g，3mL)甲醇溶液，封口膜封紧，漩涡混匀，70℃水浴中反应100min，取出放置10min，冷却至室温，加入200μL 0.3mol/L的HCl中和，加水至 2mL，再加等体积的氯仿，漩涡振荡，静置。吸取上层水相，再重复萃取2次。所得水相用0.22 μm微滤膜过滤，HPLC进样分析。

1.4.3.甲基化分析

取10mg经五氧化二磷充分干燥后的多糖样品(化合物KMCP)，置于25mL圆底烧瓶中，加入3mL经分子筛充分干燥的DMSO，使圆底烧瓶中充满氮气，置超声波振荡10min，然后于室温下搅拌10min，使多糖样品溶解于DMSO中。在氮气的氛围下注射器缓慢滴加 1.5mLSMSM，并于室温超声30min，取出于室温避光搅拌过夜；次日于超声波冰浴中缓慢滴加1.5mL碘甲烷，后继续于室温反应1h，通氮气除去碘甲烷，对去离子水透析过夜，透析液冷都干燥，并且红外谱图在3500cm^-1附件无吸收，表示已甲基化完全，否则重复上述操作至完全为止。

完全甲基化多糖样品的降解及阿尔迪醇醋酸酯衍生物的制备：将已完全甲基化的多糖样品溶于3-4mL 98％的甲酸溶液中，密塞于100℃下水浴6h进行解聚，反应液减压蒸干后，加3mL甲醇4-5次蒸干，以除尽过量甲酸。解聚得到的样品溶解于5ml的2M TFA，密封，110℃水解2h，冷却，减压蒸干，加甲醇多次共蒸除去过量的TFA，固体残渣用3ml的蒸馏水溶解后，加入30mg NaBH₄室温下还原2h(间隔15min振摇一次)，然后用25％HOAc中和过量的NaBH₄，至溶液不再产生气泡为止，加甲醇加压蒸干，加4mL乙酸酐，密塞，110℃反应1h，冷却后用氯仿-水体系萃取衍生物，回收氯仿层，即得多糖阿尔迪醇醋酸酯衍生物，最后用GC-MS分析。

1.4.4核磁分析

取样品(化合物KMCP)30mg溶于0.5mLD₂O中，用D₂O溶解后进行冷冻干燥，反复操作2次，用0.5mLD₂O再次溶解样品，装入核磁管后，室温条件下用AVANCE II核磁共振仪进行¹H、¹³C、HMBC、HSQC、¹H-¹H COSY谱分析。

1.5实验结果

1.5.1 KMCP的分子量和单糖组成

在本文中，获得了较高的苦荬菜多糖提取率为13.2％。如图1所示，苦荬菜粗多糖经DEAE 纤维柱分离纯化后得到的纯多糖KMCP显示出单一且对称的峰，证明其是均分散的。其得率为3.6％。以葡聚糖为标准品，用HPGPC进行测定，记录保留时间并用N2000数据工作站系统进行数据处理，得到相对分子量与保留时间的标准曲线如图1a所示，得到计算公式：LogMw＝-0.1297T+11.158。通过分子量标准曲线和KMCP在HPGPC上的保留时间(图1b)计算得分子量为1.95×10⁶Da(T＝37.54min)。

利用硫酸-苯酚法、间羟基联苯法和考马斯亮蓝法对分离得到纯多糖KMCP分别进行了中性糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量的测定，结果如表1所示：

表1 KMCP的糖组成

多糖的单糖组成分析是研究多糖结构的基础。通过对比标准品的保留时间和多糖样品的保留时间确定了各多糖所含单糖的种类以及比例，结果如表1所示。KMCP主要由半乳糖和阿拉伯糖组成，约占单糖组成的98.3％。

1.5.2甲基化实验结果

表2 KMCP甲基化后糖残基的GC–MS测定结果

从甲基化分析的结果可以看出，多糖KMCP糖链的连接方式主要有五种，其中半乳糖残基有末端、1,4-和1,4,6-这三种连接方式，阿拉伯糖残基包含有末端和1,4-两种连接方式，并且所有的末端糖残基和具有分枝点糖残基的摩尔总数基本相等，这证实了甲基化分析的结果是可靠的。

1.5.3 NMR结果分析

如图2所示，KMCP的¹³C NMR谱中，在异头碳区域主要存在阿拉伯糖残基(δ108.56,δ106.37)和半乳糖残基(δ104.72)的C-1信号。在非异头碳区出现了δ67.51和δ68.74，说明阿拉伯糖残基(E)的C-5还有半乳糖残基(B)的C-6发生取代，结合甲基化分析中两种连接方式的比例，可以确定δ67.51，δ68.74分别是Residue E的C-5和Residue B的C-6信号峰。碳谱中大于δ75的有三个碳信号，分别是δ77.17,δ80.03,δ81.25，其中δ77.17处信号最强，可以确定为Residue A的C-4信号，δ80.03和δ81.25是阿拉伯糖残基的碳信号，结合二维NMR图谱进行归属。

根据KMCP的HSQC和¹H-¹H COSY图谱(图3)，并结合甲基化中各个糖残基的比例，可知Residue A,B,C的H-1信号在δ4.6左右，Residue D,E的H-1信号在δ5.1左右，可以推断出KMCP中半乳糖残基是β型的，而阿拉伯糖残基是α型的。在HMBC谱图中，检测到很强的Residue A和Residue A相连的H1-C4和C1-H4相关峰，说明KMCP主链是由Residue A 构成的。此外，Residue D和Residue E与Residue B相连的H1-C6，H6-C1交叉峰也被检测到了，说明Residue D和Residue E是通过Residue B的C-6分枝相连的。

综上所述，化合物KMCP的平均分子量为1.95×10⁶Da。经结构分析，确定KMCP是以27.5％的(1→4)-β-Galp残基和72.5％的(1→4,6)-β-Galp残基相连为主链，并以(1→5)-α-Ara残基或α-Araf(1→5)α-Araf(1→二糖残基通过(1→4,6)-β-Galp残基的O-6连接到主链。其最有可能的结构单元为：

实施例2：化合物KMCP的免疫活性检测

2.1实验试剂

多糖KMCP由以上实施例1制备；无水二甲亚砜(DMSO)(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(分析纯，Sigma公司)、脂多糖(LPS)、RPMI 1640(生物试剂，Gibco公司)；牛胎儿血清(生物试剂，杭州四季青公司)。

2.2实验动物

昆明小白鼠：体重18-22g，购买于华南农业大学实验动物中心。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株(华南农业大学食品学院)。所有小鼠在动物室中驯化7天，并在25±2℃的温度下自由取食、饮水。所有实验均按照《实验动物管理条例》的规定执行。

2.3实验方法

2.3.1KMCP对巨噬细胞株释放NO的影响

亚硝酸盐的积累量常常作为NO产量的一个指标。将巨噬细胞RAW264.7(1×10⁶/孔)接种至96孔板上，加入PBS(作为空白对照)、不同浓度的KMCP(终浓度为10，100，200μg/mL)，在37℃条件下培养24h，取上清液100μL，先加入50μL Griess试剂A(无水对氨基苯磺酸1.0 g、85％的磷酸6mL、超纯水70mL混匀，定容至100mL)，37℃条件下反应10min，然后再加入50μL Griess试剂B(N-1-萘乙二胺盐酸盐0.1g溶于超纯水，定容至100mL)，37℃条件下反应10min。将96孔板振荡3min，在540nm处测定吸光度。用亚硝酸钠作为标准品按照上述方法测定标准曲线，根据吸光度算出样品里NO的含量。

2.3.2 KMCP对巨噬细胞吞噬作用的影响

本实验采用中性红试剂法²³检测在KMCP刺激下，巨噬细胞吞噬能力的变化。用含1％胎牛血清的RPMI-1640培养基(含双抗)培养巨噬细胞细胞(RAW264.7)，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔板中每孔加入100μL(1×10⁶/孔)，四周的孔用200μL无菌PBS缓冲液填充。 5％CO₂、37℃的培养箱中培养4h后，吸弃培养基。

加入90μL新培养基后，依次加入不同浓度的KMCP样品(终浓度为10，100，200μg/mL) 和PBS10μL，孵育24h。然后每孔加入100μL的0.075％中性红溶液继续孵育1h，吸弃上清液，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤三次以除去没有被巨噬细胞吞噬的中性红。然后在每孔中加入100μL 的裂解液(1％冰醋酸：乙醇＝1:1)以溶解细胞释放出已经被吞噬的中性红，常温下放置15h后，在540nm处检测96孔板各孔的吸光度。

2.3.3 KMCP对对巨噬细胞内NF-κB转录因子的影响

本实验采用荧光免疫染色法²⁴来观察多糖(化合物KMCP)对NF-κB转录因子表达的影响用100μg/mL HAs,dHAs或者1μg/mL LPS处理RAW264.7巨噬细胞3小时。然后按照碧云天的细胞NF-κB激活-核转运试剂盒说明书对RAW264.7细胞进行免疫荧光标记，观察拍照。操作如下：

a.吸除培养液，用PBS洗涤1次。

b.每孔加入1mL固定液，固定5-15分钟。

c.吸除固定液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。每次洗涤时须尽量吸尽残余液体，同时要保持样品表面有些湿润，不能干掉，最后一遍洗涤完时吸尽洗涤液。

d.每孔加入1mL免疫染色封闭液，室温封闭1小时。

e.吸除免疫染色封闭液，加入NF-κB p65抗体，室温孵育1小时或4℃孵育过夜。

f.小心吸出NF-κB p65抗体到适当的容器内，4℃保存，留做下次使用。

g.洗涤液洗涤3次，每次5-10分钟。

h.每孔加入1mL抗兔Cy3，室温孵育1小时。

i.小心吸出抗兔Cy3到适当的容器内，4℃保存，留做下次使用。

j.洗涤液洗涤2次，每次5-10分钟。

k.每孔加入1mL细胞核染色液(DAPI)，室温染色5分钟左右。

l.吸除细胞核染色液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。

m.滴加适当量的抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片后荧光显微镜下观察。NF-κB的染色为红色荧光，细胞核的DAPI染色为蓝色荧光。

2.3.4 KMCP对脾淋巴细胞的增殖作用

1)脾淋巴细胞的获得：取5只B6小鼠，充氮气处死，70％酒精浸泡10min，无菌条件下剖开小鼠腹腔取脾，用注射器内芯研磨过70μm的筛网，PBS液冲洗，再过40微米筛网，收集分离的脾细胞悬液分成五管，1000r/min离心5min，弃上清。每个离心管加氯化铵红细胞裂解液12mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5min，弃上清去除红细胞，PBS洗1-2遍，用RPMI-1640(含10％胎牛血清)重悬细胞，计数调整细胞浓度为8-10×10⁶个/mL。

2)药物刺激脾细胞增值实验：将获得的脾淋巴细胞混合均匀，加入到96孔板中，每孔加 90μL，然后分别加10μL PBS，HA-120kDa(1mg/mL)和dHA-110kDa(1mg/mL)，每组做六个平行孔，37℃培养箱培养48h，每孔加10μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h，离心，去掉上清，每孔加入200μL二甲基亚砜，用酶标仪在570nm测定吸光度。

3)药物与ConA和LPS协同刺激脾细胞中T，B细胞的增殖：同步骤2)，将获得的脾细胞铺板，加药，然后分别加PBS，ConA和LPS，ConA+HA-120kDa(1mg/mL)，LPS+HA- 120kDa(1mg/mL)，ConA+dHA-110kDa(1mg/mL)，LPS+dHA-110kDa(1mg/mL)，每组做六个平行孔，培养48h，加MTT，培养4h，加DMSO，测定吸光度。

4)根据吸光度作图，比较药物对脾细胞的增值作用。

脾细胞增殖率按公式(2)计算

2.4实验结果

2.4.1 KMCP对巨噬细胞吞噬能力的影响

如图4所示，经过12h的共孵育，KMCP的吞噬指数都超过了1.0，表明KMCP能在10-200 μg/mL的浓度范围内极显著地刺激巨噬细胞吞噬中性红，且呈现出一定的浓度依赖性。

2.4.2 KMCP对巨噬细胞生成NO的影响

Griess实验结果(图5)与中性红实验结果类似，在10-200μg/mL浓度范围内，与巨噬细胞共孵育24h后，KMCP能不同程度地刺激巨噬细胞产生NO，且呈现出一定的浓度依赖性。当KMCP的浓度为200μg/mL时，巨噬细胞产生的NO量显著增加。

2.4.3 KMCP对脾细胞增殖的影响

由图6可知，KMCP在一定的浓度条件下既可以促进T细胞的增殖又可以促进B细胞的增殖。KMCP在10-200μg/mL的浓度范围内都能浓度依赖性地协同ConA促进T细胞的增殖，尤其当KMCP的浓度为200μg/mL时，与空白对照组相比，T细胞成三倍多的增殖，说明KMCP在浓度为100和200μg/mL时能极显著地协同ConA促进T细胞的增殖。观察结果还可以发现，KMCP在浓度为100和200μg/mL时也能极显著地协同LPS促进B的增殖。.

2.4.4多糖对巨噬细胞内NF-κB转录因子的影响

图7a显示相比于空白对照组(PBS)，经LPS刺激后的巨噬细胞的p65亚基明显转运至了细胞核内(LPS组的细胞核内红色荧光明显比空白对照组的亮)，证明LPS可以激活细胞内的NF-κB核转录因子。再观察结果可以发现，相比于空白对照组，KMCP也能激活NF-κB，即KMCP能通过NF-κB来激活巨噬细胞，暗示KMCP可能是通过NF-κB途径来促进免疫细胞释放NO分子，进而引起免疫响应。图7b显示荧光强度LPS>KMCP>PBS，表明KMCP刺激下红色标记的NF-κB蛋白转运到蓝色标记的细胞核中，但是量小于LPS作用下转移的量。

2.5结论

本发明首次从苦荬菜中分离纯化得到一水溶性多糖KMCP，经结构分析确定KMCP为一平均分子量为1.95×10⁶Da的新的阿拉伯半乳聚糖。相应提供了KMCP的制备方法，得率可达3.5％。

免疫活性评价实验结果表明KMCP表现出明显的免疫调节活性。KMCP既可以通过NF-κB激活巨噬细胞、增强巨噬细胞的吞噬能力、促进巨噬细胞产生NO，还能促进脾细胞的增殖。

苦荬菜资源丰富，从中分离纯化的多糖KMCP有较好的免疫调节活性，在开发有效安全的免疫调节剂和功能添加剂方面具有潜在重要的价值用途。

Claims (4)

1.一种阿拉伯半乳聚糖KMCP的制备方法，其特征在于，将苦荬菜植物全株或其之任一部位用乙醇脱脂，药物残渣去除乙醇后水提取，水提液经浓缩，再加入乙醇醇沉，沉淀用水复溶，透析，浓缩得到苦荬菜粗多糖，将苦荬菜粗多糖经DEAE纤维素层析，依次用蒸馏水，0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M NaCl溶液进行洗脱，合并多糖洗脱部分，浓缩，透析，冷冻干燥，即得到阿拉伯半乳聚糖KMCP，所述的KMCP是以72.5％的(1→4)-β-Galp残基和27.5％的(1→4,6)-β-Galp残基相连为主链，并以(1→5)-α-Ara残基或α-Araf(1→5)α-Araf(1→二糖残基通过(1→4,6)-β-Galp残基的O-6连接到主链。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水提取的水为热水。

3.按照权利要求1所述的制备方法制备得到的阿拉伯半乳聚糖KMCP在制备免疫调节剂中的应用。

4.一种免疫调节剂，其特征在于，含有有效量的权利要求1所述的制备方法制备得到的阿拉伯半乳聚糖KMCP。

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