CN105385723A

CN105385723A - 得自于一稻作物的稻壳的精制产物及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN105385723A
Application number: CN201510507710.8A
Authority: CN
Inventors: 林文川; 杨丽婵; 谢长奇
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2014-08-26
Filing date: 2015-08-18
Publication date: 2016-03-09
Also published as: TW201607551A; US10376577B2; US20160060367A1

Abstract

本发明揭示一种得自于一稻作物的稻壳的精制产物，其基本上是由具有一落在56至103kDa的范围的数量平均分子量的第二型阿拉伯半乳聚糖所构成。本发明也揭示一种用于制备该精制产物的方法，以及使用该精制产物来提升先天性免疫细胞的生物活性以及治疗过敏与癌症。

Description

得自于一稻作物的稻壳的精制产物及其制备方法与用途

【技术领域】

本发明是有关于一种得自于一稻作物的稻壳(ricehullofaricecrop)的精制产物(refinedproduct)及其制备方法。本发明也有关于使用该精制产物来提升先天性免疫细胞(innateimmunecell)的生物活性以及治疗过敏(allergy)与癌症。

【背景技术】

阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)是一种包含有阿拉伯糖(arabinose)以及半乳糖(galactose)的多糖(polysaccharide)，并且广泛地存在于植物[例如，西方落叶松(Larixoccidentalis)、赝靛(Baptisiatinctoria)、紫锥菊(Echinaceapurpurea)以及姜黄(Curcumalonga)等]中。已有文献指出，阿拉伯半乳聚糖具有治疗肠道疾病(intestinaldisorder)[例如，憩室病(diverticulosis)以及大肠急躁症(irritablebowelsyndrome)]、增强人类免疫系统的活性以及阻断肝肿瘤细胞的转移(metastasisoflivertumorcells)的功效，因而可被使用作为膳食纤维(dietaryfiber)、免疫调节剂(immunomodulator)以及癌症治疗剂等(A.Pal(2008)Chapter13.ArabinogalactanProteinandArabinogalactan:BiomoleculeswithBiotechnologicalandTherapeuticPotential,edsK.G.Ramawat,J.M.Merillon(Springer,Germany),pp255-270)。

阿拉伯半乳聚糖可依据结构的差异而被区分为下面2大类别：

(1)第一型阿拉伯半乳聚糖(typeIarabinogalactan)[也被称为阿拉伯糖-4-半乳聚糖(arabino-4-galactan)]，它具有1,4-连结的半乳糖残基(1,4-linkedgalactoseresidue)作为主链，并且通常为直链；以及

(2)第二型阿拉伯半乳聚糖(typeIIarabinogalactan)[也被称为阿拉伯糖-3,6-半乳聚糖(arabino-3,6-galactan)]，它具有1,3-连结的或1,6-连结的半乳糖残基(1,3-linkedor1,6-linkedgalactoseresidue)作为主链，并且通常与一蛋白质连结而形成一阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactanprotein)。

目前已有本领域的相关研究人员从天然生物来源中分离出阿拉伯半乳聚糖蛋白。例如，在BirgitClassenetal.(2000),CarbohydrateResearch,327:497-504中，BirgitClassen等人对紫锥菊(Echinaceapurpurea)的压榨汁(pressedjuice)进行切向交叉流过滤(tangentialcrossflowfiltration)而得到一高分子量区分物(highmolecularweightfraction)，继而以β-葡萄糖Yariv试剂(β-glucosylYarivreagent)来对该区分物进行沉淀，借此分离出一阿拉伯半乳聚糖蛋白。该阿拉伯半乳聚糖蛋白进一步被拿来进行分子量测定、组成分析以及键联分析(linkageanalysis)。由分子量测定的结果发现，该阿拉伯半乳聚糖蛋白具有一为1.2×10³kDa的分子量。由组成分析的结果发现，该阿拉伯半乳聚糖蛋白含有83％(w/w)的第二型阿拉伯半乳聚糖，其中半乳糖相对于阿拉伯糖的摩尔比为1.8：1。由键联分析的结果发现，该阿拉伯半乳聚糖蛋白中的半乳糖残基的主要键结型式为3,6-连结的半乳糖。

在KiyoshiMashiguchietal.(2004),PlantCellPhysiol.,45:1817-1829中，KiyoshiMashiguchi等人对粳稻(japonicarice)的米糠(ricebran)进行均质处理，继而将所形成的均质物进行离心并收集上澄液，然后添加乙醇以进行沉淀处理，接着对所形成的沉淀物添加20mMTris-HCl[含有1％(v/v)TritonX-100](pH8)并进行离心，然后收集上澄液，接着对该上澄液添加CaCl₂并进行离心，继而收取上澄液并以去离子水(deionizedwater)进行透析，然后于真空下进行浓缩，所形成的浓缩物被添加以1mMβ-葡糖基Yariv试剂(β-glucosylYarivreagent,β-GlcY)以及1％(w/v)氯化钠并进行离心，然后收集沉淀物并添加二甲亚砜、二硫磺酸钠以及水而得到一呈浅黄色的溶液，接着以去离子水进行透析而得到一含有β-葡糖基Yariv-反应蛋白质(β-glucosylYariv-reactiveprotein)的溶液，然后借由逆相高效能液相层析法(reversephasehighperformanceliquidchromatography,RPHPLC)而从该溶液中分离出3个区分物，其中包括区分物A至C。该区分物A接着被进行去糖基化(deglycosylation)，然后对所得到的经去糖基化的区分物A进行N-端定序分析(N-terminalsequencing)并且将所得到的定序结果拿来与知识-基础的稻属分子生物学百科全书(knowledge-basedOryzamolecularbiologicalencyclopedia,KOME)的稻米cDNA资料库中的已知序列进行比对而证实该区分物A中的β-葡糖基Yariv-反应蛋白质为一标准的阿拉伯半乳聚糖蛋白(classicalarabinogalactanprotein)。

WO2011/139168A1主要对5种蜂蜜样品[分别为0.5年的麦芦卡蜂蜜(manukahoney)、2.5年的麦芦卡蜂蜜、5年的麦芦卡蜂蜜、1.5年的卡奴卡蜂蜜(kanukahoney)以及1年的三叶草蜂蜜(cloverhoney)]分别进行离心超过滤(centrifugalultrafiltration)，继而收集具有大于10kDa的分子量的区分物，而得到高分子量区分物(highmolecularweightfractions)。这些高分子量区分物接着被拿来进行盐沉淀(saltprecipitation)，继而移除沉淀物并添加Yariv试剂以进行进一步沉淀，借此而得到阿拉伯半乳聚糖蛋白。这些阿拉伯半乳聚糖蛋白经由活体外细胞实验而被证实能够促进细胞释放TNF-α，因而具有促发炎的作用(pro-inflammatoryeffect)。此外，这些高分子量区分物经由气相层析-质谱分析(gaschromatography-massspectrometryanalysis,GC-MSanalysis)以及糖基键联分析(glycosyllinkageanalysis)而被证实含有第二型阿拉伯半乳聚糖。

另外，已有本领域的相关研究人员从天然生物来源中发现第二型阿拉伯半乳聚糖的存在。例如，在EstherMarieGoellneretal.(2011),CarbohydratePolymers,86:1739-1744中，EstherMarieGoellner等人对美国落叶松(Larixlaricina)进行水性萃取(aqueousextraction)而得到一水性萃取物，继而添加乙醇至该水性萃取物中，借此而得到一具有高分子量的沉淀物。该沉淀物接着被拿来进行分子质量测定(molecularmassdetermination)、单糖组成分析(monosaccharidecompositionanalysis)以及键联分析而被证实含有第二型阿拉伯半乳聚糖。特别地，由单糖组成分析的结果发现，该沉淀物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖是由半乳糖、阿拉伯糖以及少量的葡萄糖醛酸(glucuronicacid)所组成，其中半乳糖相对于阿拉伯糖的摩尔比为6：1。由键联分析的结果发现，该沉淀物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖包含有3,6-连结的半乳糖残基(3,6-linkedgalactoseresidue)、1,6-连结的半乳糖残基(1,6-linkedgalactoseresidue)、末端连结的半乳糖残基(terminallylinkedgalactoseresidue)以及少量1,3-连结的半乳糖残基(1,3-linkedgalactoseresidue)。

TWI379688B1揭示一种用于促进颗粒性白血球集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)的释放的金线莲多糖萃取物(AnoectochilusformosanusHayatapolysaccharideextract)。该金线莲多糖萃取物是借由下列方法而被制得：以水来萃取台湾金线莲而得到一水萃取物，继而对该水萃取物添加乙酸乙酯(ethylacetate)以进行分配分离(partitioning)并收集水溶性分离部分，接着将乙醇添加至该水溶性分离部分中并收取沉淀物，然后将该沉淀物溶于水中。该金线莲多糖萃取物接着以淀粉酶(amylase)、淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase)以及蛋白酶(protease)而被进行酵素水解处理，所得到的水解物被添加以乙醇，然后将所得到的沉淀物溶于水中，而得到一具有29kDa的平均分子量的未经纯化的多糖(下称“金线莲多糖”)。该金线莲多糖经由实验而被证实含有第二型阿拉伯半乳聚糖，并且能够促进巨噬细胞释放一氧化氮(nitricoxide)以及颗粒球-群落刺激因子(granulocyte-colonystimulatingfactor,G-CSF)，以及降低小鼠血中肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的浓度，因而具有活化先天性免疫细胞(innateimmunecell)以及抗发炎的效用。

YangL.C.etal.(2013),Evid.BasedComplementAlternat.Med.,2013:458075以及YangL.C.etal.(2014),Phytomedicine,21:647-655是TWI379688B1的研究团队的后续研究发表。其中，在YangL.C.etal.(2013)(同上述)中，YangL.C.等人将小鼠结肠癌细胞CT26接种至小鼠体内以诱发结肠癌，继而对小鼠腹膜内注射以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)以及口服投药以该金线莲多糖，以探讨该金线莲多糖与5-FU在抗结肠癌细胞上的协同作用。而实验结果显示，该金线莲多糖能够有效地减少5-FU所导致的白血球减少(leukopenia)。在YangL.C.etal.(2014)(同上述)中，YangL.C.等人借由使用阴离子层析法来进一步纯化该金线莲多糖，而得到一第二型阿拉伯半乳聚糖。该第二型阿拉伯半乳聚糖经由实验而被证实具有先天性免疫调节活性以及抗-结肠癌活性。

稻壳(ricehull)是稻作物(ricecrop)的一保护层(protectingcovering)，它通常被使用作为建筑材料(buildingmaterial)、绝缘材料(insulationmaterial)、肥料(fertilizer)以及燃料(fuel)。经研究，申请人意外地从一稻作物的稻壳中得到一精制产物，该精制产物基本上是由具有一落在56至103kDa的范围的数量平均分子量的第二型阿拉伯半乳聚糖所构成。特别地，在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖的物化性质(例如，半乳糖与阿拉伯糖的相对比例以及主链)是不同于其他生物来源中所含有的以往第二型阿拉伯半乳聚糖所具者，并且具有提升先天性免疫细胞的生物活性以及治疗过敏与癌症(特别是结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌以及淋巴瘤)的功效。

【发明内容】

于是，在第一个方面，本发明提供一种得自于一稻作物的稻壳的精制产物，其中该精制产物是借由一包含下列步骤的方法而被制得：

以一水性溶液萃取该稻作物的稻壳，以得到一水性萃取产物；

令该水性萃取产物与一第一醇混合，以得到一第一沉淀物；

令该第一沉淀物进行酵素水解处理，以得到一水性的酵素水解产物，该酵素水解处理是使用一含有α-淀粉酶、蛋白酶以及淀粉葡萄糖苷酶的水性组合物；

令该水性的酵素水解产物与一第二醇混合，以得到一第二沉淀物；以及

以阴离子层析法来精制该第二沉淀物，以使得所得到的精制产物基本上是由具有一落在56至103kDa的范围的数量平均分子量的第二型阿拉伯半乳聚糖所构成。

在第二个方面，本发明提供一种用于提升先天性免疫细胞的生物活性的方法，其包括对一需要提升先天性免疫细胞的生物活性的个体投予(administering)一如上所述的精制产物。

在第三个方面，本发明提供一种用于治疗一具有或被怀疑具有过敏的个体的方法，其包括对该个体投药以一如上所述的精制产物。

在第四个方面，本发明提供一种用于治疗一具有或被怀疑具有癌症的个体的方法，其包括对该个体投药以一如上所述的精制产物。

在第五个方面，本发明提供一如上所述的精制产物用于制备一用来提升先天性免疫细胞的生物活性的医药品的用途。

在第六个方面，本发明提供一如上所述的精制产物用于制备一用来治疗过敏的医药品的用途。

在第七个方面，本发明提供一如上所述的精制产物用于制备一用来治疗一癌症的医药品的用途。

在第八个方面，本发明提供一种用于制备一得自于一稻作物的稻壳的精制产物的方法，其包含：

令该水性萃取产物与一第一醇混合，以得到一第一沉淀物；

【附图说明】

下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、随文所附的权利要求书和伴随的附图而变得更为明显，附图中：

图1显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠的血清内G-CSF的浓度的影响；

图2显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠的血清内TNF-α的浓度的影响；

图3显示得自于不同生物来源的第二型阿拉伯半乳聚糖对于RAW264.7细胞的亚硝酸盐浓度的影响，其中对照组表示被处理以DMEM的RAW264.7细胞；实验组1表示被处理以一得自于金线莲的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为100μg/mL)的RAW264.7细胞；实验组2表示被处理以一得自于栽培稻的米糠的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为100μg/mL)的RAW264.7细胞；实验组3表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为100μg/mL)的RAW264.7细胞；正对照组表示被处理以脂多糖(浓度为1μg/mL)的RAW264.7细胞；以及“***”表示：当与对照组比较，p＜0.001；

图4显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于RAW264.7细胞的吞噬能力的提升效用，其中对照组表示没有接受任何处理的RAW264.7细胞；实验组1至3表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度分别为10μg/mL、50μg/mL以及100μg/mL)的RAW264.7细胞；“**”表示：当与对照组比较，p＜0.01；以及“***”表示：当与对照组比较，p＜0.001；

图5显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠的腹腔中巨噬细胞与嗜中性白血球的吞噬活性的提升效用，其中对照组表示被注射以生理食盐水(normalsaline)的BALB/c小鼠；实验组1与2表示被注射以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(剂量分别为3mg/kg以及6mg/kg)的BALB/c小鼠；“*”表示：当与对照组比较，p＜0.05；以及“***”表示：当与对照组比较，p＜0.001；

图6显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖在提升自然杀手细胞对于肺癌细胞的细胞毒性上的效用，其中对照组表示与A549细胞进行共培养的NK-92MI细胞；实验组1表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为1μg/mL)以及与A549细胞进行共培养的NK-92MI细胞；实验组2表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为10μg/mL)以及与A549细胞进行共培养的NK-92MI细胞；实验组3表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为100μg/mL)以及与A549细胞进行共培养的NK-92MI细胞；实验组4表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为200μg/mL)以及与A549细胞进行共培养的NK-92MI细胞；“*”表示：当与对照组比较，p＜0.05；以及“**”表示：当与对照组比较，p＜0.01；

图7显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖在提升自然杀手细胞对于乳腺癌细胞的细胞毒性上的效用，其中对照组表示与MDA-MB-231细胞进行共培养的NK-92MI细胞；实验组1表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为1μg/mL)以及与MDA-MB-231细胞进行共培养的NK-92MI细胞；实验组2表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为10μg/mL)以及与MDA-MB-231细胞进行共培养的NK-92MI细胞；实验组3表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为100μg/mL)以及与MDA-MB-231细胞进行共培养的NK-92MI细胞；实验组4表示被处理以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(浓度为200μg/mL)以及与MDA-MB-231细胞进行共培养的NK-92MI细胞；“*”表示：当与对照组比较，p＜0.05；以及“**”表示：当与对照组比较，p＜0.01；

图8显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠结肠癌细胞(mousecoloncarcinomacell)的增生(proliferation)的抑制效用，其中病理对照组表示被注射以小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠；实验组1与2表示被注射以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(剂量分别为5mg/kg以及15mg/kg)以及小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠；正常对照组表示没有接受任何处理的小鼠；以及“*”表示：当与病理对照组比较，p＜0.05；

图9显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠结肠癌细胞的转移(metastasis)的抑制效用，其中病理对照组表示被注射以小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠；实验组1与2表示被注射以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(剂量分别为50mg/kg以及100mg/kg)以及小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠；假手术组表示没有被注射以小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠；“###”表示：当与假手术组比较，p＜0.001；“*”表示：当与病理对照组比较，p＜0.05；以及“**”表示：当与病理对照组比较，p＜0.01；

图10显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠结肠癌细胞的转移的抑制效用，其中病理对照组表示被注射以小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠；实验组1与2表示被注射以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(剂量分别为50mg/kg以及100mg/kg)以及小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠；假手术组表示没有被注射以小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠；“###”表示：当与假手术组比较，p＜0.001；“*”表示：当与病理对照组比较，p＜0.05；以及“**”表示：当与病理对照组比较，p＜0.01；

图11显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于氧偶氮甲烷(azoxymethane)-诱发的肠道异常腺窝(aberrantcrypt)的抑制效用，其中病理对照组表示带有氧偶氮甲烷-诱发的肠道异常腺窝的小鼠；实验组1与2表示被口服投药以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(剂量分别为5mg/kg以及15mg/kg)的带有氧偶氮甲烷-诱发的肠道异常腺窝的小鼠；正对照组表示被口服投药以阿斯匹林(aspirin)(剂量为10mg/kg)的带有氧偶氮甲烷-诱发的肠道异常腺窝的小鼠；以及“***”表示：当与病理对照组比较，p＜0.001；以及

图12显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于氧偶氮甲烷-诱发的肠道异常腺窝病灶(aberrantcryptfoci)的抑制效用，其中病理对照组表示带有氧偶氮甲烷-诱发的肠道异常腺窝病灶的小鼠；实验组1与2表示被口服投药以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖(剂量分别为5mg/kg以及15mg/kg)的带有氧偶氮甲烷-诱发的肠道异常腺窝病灶的小鼠；正对照组表示被口服投药以阿斯匹林(剂量为10mg/kg)的带有氧偶氮甲烷-诱发的肠道异常腺窝病灶的小鼠；以及“***”表示：当与病理对照组比较，p＜0.001。

【具体实施方式】

本发明的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例后，将变得明显。

除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有熟悉本发明所属领域的人士所共同了解的意义。一熟悉本领域者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。

为了开发出可有效提升先天性免疫细胞的生物活性以及治疗过敏与癌症的新颖药物，申请人尝试以一水性溶液来萃取一稻作物的稻壳，由此所得到的水性萃取产物被拿来进行沉淀、酵素水解以及精制处理，借此而得到一得自于该稻作物的稻壳的精制产物，该精制产物基本上是由具有一落在56至103kDa的范围的数量平均分子量的第二型阿拉伯半乳聚糖所构成。

因此，本发明提供一种得自于一稻作物的稻壳的精制产物，其中该精制产物是借由一包含下列步骤的方法而被制得：

令该水性萃取产物与一第一醇混合，以得到一第一沉淀物；

如本文中所用的，术语“精制产物(refinedproduct)”意指对一原料(rawmaterial)进行纯化(purification)、加工处理(processing)、分离(separation)和/或浓缩(concentration)而去除杂质的纯化物质(purifiedsubstance)。

如本文中所用的，术语“稻壳(ricehull)”以及“粗糠(ricehusk)”可被交换地使用。

如本文中所用的，术语“数量平均分子量(numberaveragemolecularweight)”意指借由将一样品中的全部分子的分子量总和除以该样品中的全部分子的总数而被测量的分子量。在本发明的一个较佳具体例中，该第二型阿拉伯半乳聚糖具有一为77kDa的数量平均分子量。

依据本发明，以水性溶液来萃取稻壳的方法可以采用熟习此项技艺者所详知且惯用的技术来进行。在此方面，可以参照，例如，EstherMarieGoellneretal.(2011)(同上述)、TWI379688B1以及YangL.C.etal.(2013)(同上述)。

可了解到的是，有关萃取方法的操作条件会进一步随着所使用的水性溶液与稻壳的用量比例而被变动，以便达致最佳的萃取效果。而这些操作条件的选择是熟习此项技艺者能例行性地自行决定的。

依据本发明，该稻作物可以是下列的至少一者：栽培稻(Oryzasativa)、亚洲稻(Oryzaofficinalis)、尼伐拉稻(Oryzanivara)、野生稻(Oryzarufipogon)、东非野生稻(Oryzapunctata)、西非栽培稻(Oryzaglaberrima)、澳洲稻(Oryzaaustraliensis)、巴司稻(Oryzabarthii)、阔叶稻(Oryzalatifolia)、长药稻(Oryzalongistaminata)、南方稻(Oryzameridionalis)、短花稻(Oryzabrachyantha)、艾氏稻(Oryzaeichingeri)、大颖稻(Oryzagrandiglumis)以及微粒稻(Oryzaminuta)。在本发明的一个较佳具体例中，该稻作物为栽培稻。

依据本发明，在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为实质上不具有3,6-连结的半乳糖残基。

如本文中所用的，术语“实质上不具有(substantiallyfreeof)”意指在一组合物中一经鉴别的成分缺少有意义的数量。较佳地，该组合物完全不含有该成分，或者该成分的数量对于该组合物的性质不具有可测量的影响(measurableeffect)。

依据本发明，在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为包含有，以半乳糖残基的总量为基准，呈一不低于84.4％的含量的1,3-连结的半乳糖残基。

依据本发明，在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为包含有，以半乳糖残基的总量为基准，分别以一范围落在1.6至4％以及4至15％的含量而存在的1,6-连结的半乳糖残基以及末端连结的半乳糖残基。

依据本发明，在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为进一步包含有2,4-连结的葡萄糖残基、3,4-连结的葡萄糖残基、1,2-连结的阿拉伯糖残基、4,6-连结的甘露糖残基、末端连结的葡萄糖残基、末端连结的阿拉伯糖残基以及末端连结的甘露糖残基。

依据本发明，在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为包含有呈一范围落在大约3：1至6：1的摩尔比的半乳糖残基与阿拉伯糖残基。在本发明的一个较佳具体例中，在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为包含有呈一为4.48：1的摩尔比的半乳糖残基与阿拉伯糖残基。

依据本发明，在该方法中所使用的第一醇以及第二醇是相同的或不同的，并且是选自于下列所构成的群组：甲醇、乙醇、丙醇，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，在该方法中所使用的第一醇以及第二醇皆是乙醇。

依据本发明的得自于一稻作物的稻壳的精制产物经由活体外细胞实验以及活体内动物实验而被证实能够有效地提升先天性免疫细胞的生物活性，并且具有治疗过敏以及癌症(特别是结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌以及淋巴瘤)的效用。

因此，本发明提供一种用于提升先天性免疫细胞的生物活性的医药品，其包含有一如上所述的得自于一稻作物的稻壳的精制产物。

依据本发明，该先天性免疫细胞是选自于下列所构成的群组：巨噬细胞、嗜中性白血球、自然杀手细胞，以及它们的组合。

本发明也提供一种用于治疗过敏的医药品，其包含有一如上所述的得自于一稻作物的稻壳的精制产物。

如本文中所用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指预防(preventing)、减少(reducing)、减轻(alleviating)、改善(ameliorating)、缓解(relieving)、或控制(controlling)一疾病(disease)或障碍(disorder)的一或多个临床征兆(clinicalsign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆转(reversing)一正在被治疗中的病况(condition)或症状(symptom)的严重性(severity)的进展(progression)。

如本文中所用的，术语“过敏(allergy)”意指免疫系统对于特定的过敏原所引发可致使有害症状的过敏反应(hypersensitivityreaction)。

如本文中所用的，术语“过敏(allergy)”以及“过敏(hypersensitivity)”可被交换地使用。

依据本发明，该过敏的形式包括，但不限于：IgE-媒介的即发性过敏(IgE-mediatedimmediatehypersensitivity)[也就是第I型过敏(typeIhypersensitivity)]、IgG或IgM-媒介的细胞毒性过敏(IgGorIgM-mediatedcytotoxichypersensitivity)[也就是第二型过敏(typeIIhypersensitivity)]、免疫复合体-媒介的过敏(immunecomplex-mediatedhypersensitivity)[也就是第三型过敏(typeIIIhypersensitivity)]以及T细胞-媒介的迟发性过敏(Tcell-mediateddelayedhypersensitivity)[也就是第四型过敏(typeIVhypersensitivity)]。在本发明的一个较佳具体例中，该过敏的形式为IgE-媒介的即发性过敏。

本发明也提供一种用于治疗癌症的医药品，其包含有一如上所述的得自于一稻作物的稻壳的精制产物。

依据本发明，该癌症是选自于下列所构成的群组：结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤，以及它们的组合。

依据本发明，该医药品可利用熟习此领域者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道地(parenterally)或口服地(orally)投药的剂型(dosageform)，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterileaqueoussolution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterilepowder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似物。

依据本发明，该医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。例如，该药学上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、粘结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，该药学上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueoussolutioncontainingalcohol)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该溶剂是磷酸盐缓冲生理盐水。

依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteralroutes)来投药：腹膜内注射(intraperitonealinjection)、皮下注射(subcutaneousinjection)、肌肉内注射(intramuscularinjection)以及静脉内注射(intravenousinjection)。在本发明的一个较佳具体例中，该医药品被制造成适于以腹膜内注射而被投药的剂型。在本发明的另一个较佳具体例中，该医药品被制造成适于以静脉内注射而被投药的剂型。

本发明也提供一种用于提升先天性免疫细胞的生物活性的方法，其包括对一需要提升先天性免疫细胞的生物活性的个体投予(administering)一如上所述的精制产物。

如本文中所用的，术语“投予(administering)”以及“投药”可被交换地使用。

本发明也提供一种用于治疗一具有或被怀疑具有过敏的个体的方法，其包括对该个体投药以一如上所述的精制产物。

本发明也提供一种用于治疗一具有或被怀疑具有癌症的个体的方法，其包括对该个体投药以一如上所述的精制产物。

依据本发明，该得自于一稻作物的稻壳的精制产物的投药剂量与投药次数会视下列因素而变化：要被治疗的疾病的严重性，投药途径，以及要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况与反应。一般而言，依据本发明的医药品可呈单一剂量或是分成数个剂量的形式而被口服地或非经肠道地投药。

<实施例>

本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，这些实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。

一般实验材料：

1.细胞株的来源与培养：

在下面实施例中所使用的小鼠巨噬细胞株(mousemacrophagecellline)RAW264.7(BCRC60001)、小鼠淋巴瘤细胞株(mouselymphomacellline)YAC-1(BCRC60147)、小鼠结肠癌细胞株(mousecoloncarcinomacellline)CT26(BCRC60443)、人类肺癌细胞株(humanlungcarcinomacellline)A549(BCRC60074)、人类乳腺癌细胞株(humanbreastcancercellline)MDA-MB-231(BCRC60425)以及人类自然杀手细胞株(humannaturalkillercellline)NK-92MI(BCRC60438)皆是购自于中国台湾的食品工业发展研究所(FoodIndustryResearchandDevelopmentInstitute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BiosourceCollectionandResearchCenter,BCRC)。

这6种细胞分别依照下面表1所示的培养基被培养于10-cm培养皿(10-cmpetridish)中，并在设定为37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养。之后，大约每隔2天更换新鲜的培养基。当细胞密度达到约80-90％汇聚(confluence)时，移除培养基并以磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,PBS)(pH7.4)(Amresco,USA)来清洗细胞共计2次，接着加入胰蛋白-EDTA(trypsin-EDTA)以使细胞自培养皿的底部脱离。之后，加入新鲜的培养基来中和胰蛋白酶的活性并以吸量管(pipette)反复地吸冲培养基以充分打散细胞，然后将所形成的细胞悬浮液分配到新的培养瓶中，并在培养箱中进行培养。

表1.6种细胞所使用的培养基

2.实验动物：

在下面实施例中所使用的雄性印记控制区域(imprintingcontrolregion,ICR)小鼠(8至10周大，体重约为30g)以及雄性BALB/c小鼠(BALB/cmice)(8至10周大，体重约26g)皆是购自于国家实验动物中心(NationalLaboratoryAnimalCenter)。所有的实验动物是依据中国台湾国家科学委员会(NationalScienceCouncil,Taiwan,China)所认可的准则而被饲养于一个光照与黑暗各为12小时、室温维持在22±2℃以及相对湿度维持在60±10％的独立空调的动物房内，而且水分与饲料被充分地供给。有关实验动物的一切实验程序均符合中国台湾动物保护法(AnimalProtectionActofTaiwan,China)的规定并且依据中国台湾农委会实验动物管理委员会准则(guidelinesofAnimalCareCommitteeoftheCouncilofAgriculture,Taiwan,China)来进行。

一般实验方法：

1.统计学分析(statisticalanalysis)：

在下面的实施例中，各组的实验被重复3次，而实验数据是以平均值±标准偏差(standarddeviation,S.D.)来表示。所有的数据是借由邓奈特测验法(Dunnett’stest)来作分析，以评估各组间的差异性。若所得到的统计分析结果是p＜0.05，这表示有统计学显著性(statisticalsignificance)。

实施例1.制备一得自于栽培稻的稻壳的精制产物(preparationofarefinedproductobtainedfromthericehullofOryzasativa)

首先，称取100kg的台梗九号栽培稻的稻壳(年份为2010年)(国立中兴大学农业试验场，台中)，继而加入1,500L的去离子水并且于100℃下进行加热处理历时3小时，继而进行过滤与减压浓缩而得到一体积为100L的水性萃取产物。接着，对该水性萃取产物添加400L的95％乙醇并于4℃下静置历时16小时，然后收集沉淀物(precipitate)。之后，将每公克沉淀物于95℃下以50μL的α-淀粉酶(α-amylase)(3,000U/mL)(Megazyme,Cat.No.E-BLAAM)、100μL的蛋白酶(protease)(300U/mL)(Megazyme,Cat.No.E-BSPRT)以及200μL的淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase)(3,300U/mL)(Megazyme,Cat.No.E-AMGDF)来将蛋白质以及淀粉进行水解(hydrolysis)历时1.5小时。之后，加入200mL的95％乙醇来进行乙醇沉淀(ethanolprecipitation)历时12小时，继而移除上澄液，然后将所得到的沉淀物溶于去离子水中，接着借由使用一含有阴离子交换树脂(anionexchangeresin)的亲和性管柱(affinitycolumn)(DEAE-650M)来对该沉淀物进行精制处理，而得到一呈黄色液态的洗出物(eluate)。之后，将该洗出物置于一温度被设定为60℃的烘箱中进行烘干，借此而得到一呈干燥粉末(driedpowder)的精制产物。

实施例2.得自于栽培稻的稻壳的精制产物的特性分析

为了了解本发明的得自于栽培稻的稻壳的精制产物的物化性质，将依据上面实施例1所制得的精制产物拿来进行下面的实验。

A、蛋白质含量的测定：

首先，将10mg的依据上面实施例1所得到的精制产物溶于1mL的去离子水中并予以混合均匀而得到一混合溶液，继而取10μL的混合溶液作为测试样品并将它与90μL的CB-蛋白质分析试剂(G-Biosciences，Cat.No.#786-012)进行混合，然后添加至一微量盘(microplate)中并于室温下静置历时10分钟。之后，以一微量盘读取仪(microplatereader)在波长570nm下来测量吸光值(OD₅₇₀)。

另外，使用牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)作为标准品并进行相同的分析，然后利用一根据预先以具有不同已知浓度的BSA相对于它们自身的OD₅₇₀数值所作出的标准曲线来计算所测试的精制产物中的蛋白质含量。实验结果发现，该得自于栽培稻的稻壳的精制产物不含有蛋白质。

B、分子量测定：

本实验是借由使用高效能尺寸-排除层析法(highperformancesize-exclusionchromatography)来进行分子量测定，而各项操作条件被显示于下面的表2中。

表2.高效能尺寸-排除层析法的操作条件

首先，将1mg的依据上面实施例1所得到的精制产物溶于1mL的上面表2中所示的洗提液中，继而以一孔径为0.45μm的滤膜来进行过滤。接着，取20μL的滤液作为测试样品来进行高效能尺寸-排除层析分析，继而记录所得到的层析图谱中的波峰的滞留时间。此外，使用普鲁兰多糖(pullulan)作为标准品并进行相同的分析，继而以它的logMW数值对该波峰的滞留时间作出一标准检量线，并据此来换算该精制产物的数量平均分子量(numberaveragemolecularweight)。

该精制产物经由高效能尺寸-排除层析法而被测定出具有一为77kDa的数量平均分子量。

另外，申请人参照上面实施例1当中所述方法来制备得自于不同年度(2011年以及2012年)的栽培稻稻壳的精制产物，并参照本项当中所述方法来测定它们的分子量。实验结果显示，得自于2011年的栽培稻稻壳的精制产物具有一为56kDa的数量平均分子量，以及得自于2012年的栽培稻稻壳的精制产物具有一为103kDa的数量平均分子量。

C、单糖含量分析：

本实验是借由使用具有一脉冲电流检测器的高效能阴离子交换层析法(highperformanceanionexchangechromatographywithapulsedamperometricdetector)(Wyatt,USA)来进行单糖含量分析，而各项操作条件被显示于下面的表3中。

表3.高效能阴离子交换层析法的操作条件

首先，将10mg的依据上面实施例1所得到的精制产物溶于4mL的2M三氟乙酸溶液(trifluoroaceticacidsolution)中并于100℃下进行水解历时4小时。之后，将所形成的水解物于50℃下进行加热历时40分钟，继而添加上面表3中所示的洗提液至一最终浓度为50μg/mL。接着，取20μL的水解物溶液作为测试样品来进行高效能阴离子交换层析分析，继而计算所得到的层析图谱中各波峰的面积。

此外，为供比对，使用含有阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)以及木糖(xylose)的混合溶液来作为标准品(standard)并进行相同的分析，继而以所得到的层析图谱中各波峰的面积来进行比对，借此而计算出该水解物的单糖含量。

依据高效能阴离子交换层析分析的结果显示：在该精制产物所含有的单糖成分中，各个单糖成分相对于该精制产物的含量比例最高者为半乳糖(galactose)(44.8％)(mol％)，其次依序为葡萄糖(glucose)(29.8％)(mol％)、阿拉伯糖(arabinose)(10％)(mol％)、甘露糖(mannose)(9.3％)(mol％)以及木糖(xylose)(6.1％)(mol％)。

D、键结分析(bondinganalysis)：

本实验是借由使用气相层析-质谱法(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)来进行键结分析，分析仪器如下：GC-MS系统(Agilent)；分析管柱为DB5管柱(OV-1701,Agilent)，它具有一为30m的长度以及一为0.25mm的内径，并且使用一具有一为0.2μm的厚度的薄膜(film)。而GC-MS的各项操作条件被显示于下面的表4中。

表4.气相层析-质谱法的操作条件

有关键结分析大体上是参照CarpitaandShea(1989)Chapter9.AnalysisofCarbohydratesbyGLCandMS.,edsChritopherJ.BiermannandGaryD.McGinnis(CRCPress,USA)当中所述方法来进行，并略作修改。简言之，将上面实施例1所得到的精制产物溶于500μL的DMSO中，接着依据该教科书当中所述的部分甲基化的糖醇乙酸酯(PMAA)衍生化法[partiallymethylatedalditolacetates(PMAA)derivationmethod]来对所形成的精制产物溶液中的多糖分子的羧基(carboxylgroup)与羟基(hydroxylgroup)进行甲基化，然后对经甲基化处理的精制产物溶液进行干燥处理，继而将3mg的经甲基化处理的精制产物粉末溶于250μL的2N三氟乙酸溶液中并于121℃下进行水解历时1小时。之后，以氮气吹干仪(Thermal)来对所形成的水解物进行干燥处理，接着加入2mL的异丙醇(isopropanol)以移除三氟乙酸溶液。接着，加入250μL的氢氧化铵(ammoniumhydroxide)并进行搅拌，然后加入500μL的硼氘化钠(sodiumborodeuteride)溶液并于40℃下进行反应历时90分钟。之后，以500μL的乙酸酐(aceticanhydride)来对所形成的反应物进行乙酰化(acetylation)，继而以4mL的二氯甲烷(dichloromethane)以及2mL的无菌水来清洗所得到的产物。接着，以氮气吹干仪来对经清洗的产物进行干燥处理，然后加入1mL的丙酮(acetone)，继而注射至GC-MS分析仪器中来进行分析。之后，将所得到的分析结果拿来与复合碳水化合物研究中心(ComplexCarbohydrateResearchCenter,TheUniversityofGeorgiaAthens,GA,USA)所提供的资料库当中的已知化合物的质谱作比对，以分析该精制产物中各单糖残基的键结情形。

下面表5显示该精制产物经由气相层析-质谱法所测得的键结分析结果。从表5可见，在该精制产物的组成单糖中，半乳糖残基的主要键结型式为直链的1,3-连结的半乳糖，且该精制产物不含有1,4-连结的半乳糖残基，因而被认定为一第二型阿拉伯半乳聚糖。另外，该精制产物包含有呈分支状的4,6-连结的甘露糖残基、2,4-连结的葡萄糖残基与3,4-连结的葡萄糖残基，以及包含有末端连结的阿拉伯糖残基、末端连结的甘露糖残基、末端连结的葡萄糖残基与末端连结的半乳糖残基。

表5.精制产物的键结分析结果

此外，为了确认本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖是不同于已知得自于其他生物来源的第二型阿拉伯半乳聚糖，申请人将本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖的来源以及上面第C与D项当中所测得的单糖含量分析结果与键结分析结果拿来与WO2011/139168A1(下称D1)的表2、BirgitClassenetal.(2000)(同上述)(下称D2)、EstherMarieGoellneretal.(2011)(同上述)(下称D3)以及YangL.C.etal.(2014)(同上述)(下称D4)当中所揭示者进行比较。所得到的比较结果被显示于下面表6中。

表6.本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖与先前技术当中所揭示者在来源、半乳糖相对于阿拉伯糖的摩尔比以及半乳糖残基的主要键结型式上的比较

从表6可见，本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖在来源、半乳糖相对于阿拉伯糖的摩尔比以及半乳糖残基的主要键结型式上皆不同于这些先前技术当中所揭示者。特别地，D1至D4所揭示的第二型阿拉伯半乳聚糖中，半乳糖残基的主要键结型式皆为呈分支状的3,6-连结的半乳糖。相对地，依据上面表5的结果，本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖不含有3,6-连结的半乳糖残基。综上所述，申请人认为本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖是一新颖的第二型阿拉伯半乳聚糖。

实施例3.本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖在提升先天性免疫细胞(innateimmunecell)的生物活性上的效用评估

为了探讨本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖是否能够有效地提高颗粒球-群落刺激因子(granulocyte-colonystimulatingfactor,G-CSF)以及肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)(它是一种免疫反应初期的指标细胞激素)的浓度，进而提升先天性免疫细胞[诸如巨噬细胞(macrophage)、嗜中性白血球(neutrophil)以及自然杀手细胞(naturalkillercell)]的活性，使用依据上面实施例1所得到的精制产物来进行下面的实验。

A、ICR小鼠血清内的G-CSF以及TNF-α的浓度测量：

首先，将依据上面实施例1所得到的精制产物溶于PBS(pH7.4)中，继而将所形成的精制产物溶液经由尾部静脉内注射(剂量为15mg/kg)至27只雄性ICR小鼠。在注射后的第1、10、30、60、120、180、360、540以及720分钟时，分别从它们的腹腔静脉采集血液，继而在4℃下以4700rpm予以离心历时10分钟而得到血清样品。接着，使用小鼠G-CSF标准ELISA发展套组(murineG-CSFstandardELISAdevelopmentkit)(Preprotech.,Cat.No.900-k103,N.J.,USA)以及小鼠TNF-α套组(eBioscience,Cat.No.88-7324,C.A.,USA)并依照厂商所提供的操作指引来量测血清样品内的G-CSF以及TNF-α的浓度。

图1以及图2分别显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠的血清内G-CSF以及TNF-α的浓度的影响。

从图1可见，在静脉内注射以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖后，ICR小鼠的血清内G-CSF的浓度随着时间有增加的情形。特别地，在静脉内注射后的第540分钟时，ICR小鼠的血清内G-CSF的浓度达至高峰。从图2可见，在静脉内注射以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖后的第60分钟时，ICR小鼠的血清内TNF-α的浓度达至高峰。这个实验结果显示：本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖能够持续地提高血清内G-CSF的浓度，并且快速地提高血清内TNF-α的浓度，进而达到提升先天性免疫细胞的生物活性的效用。

基于这个实验结果，申请人将本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖拿来进行下面的实验，以证明该第二型阿拉伯半乳聚糖能够有效地提升先天性免疫细胞的生物活性。

B、巨噬细胞RAW264.7的亚硝酸盐浓度的测定：

为了解本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖是否具有刺激巨噬细胞的活性的效用，以及它的效用是否优于得自于其他生物来源的第二型阿拉伯半乳聚糖所具者，本实验被进行。

首先，申请人大体上参照上面实施例1当中所述方法来制备一得自于栽培稻的米糠(ricebran)的精制产物，不同处在于：以栽培稻的米糠来取代稻壳。另外，申请人使用YangL.C.etal.(2014)(同上述)当中所揭示的第二型阿拉伯半乳聚糖(下称“得自于金线莲的精制产物”)来进行实验。接着，将该得自于金线莲的精制产物、该得自于栽培稻的米糠的精制产物以及依据上面实施例1所得到的精制产物分别溶于PBS(pH7.4)中，而得到3种具有浓度为1000μg/mL的精制产物溶液(下称精制产物溶液1至3)备用。

之后，将依据上面“一般实验材料”的第1项“细胞株的来源与培养”来进行继代培养的RAW264.7细胞分成5组，其中包括1个对照组、1个正对照组以及3个实验组(也就是实验组1至3)。将各组细胞分别以一为3×10⁵细胞/井的数量培养于含有100μL的DMEM(添加有10％FBS、100IU/mL盘尼西林以及100μg/mL链霉素)的96-井培养盘中，并在培养箱(37℃、5％CO₂)中进行培养历时24小时。

接着，将适量的精制产物溶液1至3分别添加至实验组1至3的细胞培养物中，而使得各实验组分别具有一最终浓度为100μg/mL的第二型阿拉伯半乳聚糖。另外，正对照组的细胞培养物被添加以适量的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(SigmaAldrich)，而使得正对照组的细胞培养物具有一最终浓度为1μg/mL的脂多糖，至于对照组的细胞培养物则被添加以100μL的DMEM。各组细胞培养物在培养箱(37℃，5％CO₂)中进行培养历时24小时后，收取培养上澄液(culturesupernatant)，继而以每井100μL的体积将培养上澄液分别加入至一微量培养盘的各井中。接着，对各井加入100μL的革利士试剂(Griessreagent)(SigmaAldrich)并在室温下进行反应历时15分钟。之后，以一微量盘读取仪(DynexTechnologies,USA)来读取各井在波长570nm下的吸光值(OD₅₇₀)。将所得到的OD₅₇₀数值分别根据预先以具有不同已知浓度的亚硝酸钠(NaNO₂)相对于它们自身的OD₅₇₀数值所作出的一标准曲线而被换算成亚硝酸盐浓度(μM)。

图3显示得自于不同生物来源的第二型阿拉伯半乳聚糖对于RAW264.7细胞的亚硝酸盐浓度的影响。从图3可见，与对照组相较下，实验组1至3的亚硝酸盐浓度皆呈现升高的情形。特别地，实验组3的亚硝酸盐浓度几乎相同于正对照组所具者，并且高于实验组1与2所具者。这个实验结果显示：本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖能够有效地提升巨噬细胞RAW264.7的亚硝酸盐浓度，因而具有刺激巨噬细胞的活性的效用，且它的功效是优于得自于栽培稻的米糠以及金线莲的第二型阿拉伯半乳聚糖所具者。

C、巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力分析：

首先，将依据上面“一般实验材料”的第1项“细胞株的来源与培养”来进行继代培养的RAW264.7细胞分成4组，其中包括1个对照组以及3个实验组(也就是实验组1至3)。将各组细胞分别以一为1×10⁵细胞/井的数量培养于含有100μL的DMEM(添加有10％FBS、100IU/mL盘尼西林以及100μg/mL链霉素)的96-井培养盘(96-wellplate)中，并在培养箱(37℃、5％CO₂)中进行培养历时24小时。

接着，将适量的依据本实施例第A项当中所得到的精制产物溶液分别添加至实验组1至3的细胞培养物中，而使得实验组1至3分别具有一最终浓度为10、50以及100μg/mL的第二型阿拉伯半乳聚糖，至于对照组的细胞培养物则不作任何处理。各组细胞培养物在培养箱(37℃，5％CO₂)中进行培养历时24小时后，移除各井中的液体，接着将经异硫氰酸荧光素-标记的大肠杆菌(fluoresceinisothiocyanate-labeledEscherichiacoli)细胞(USA)以一为2.5×10⁶细胞/井的数量加入至各组细胞培养物中，然后在培养箱(37℃，5％CO₂)中进行培养历时2小时，继而以一盘式荧光冷光分析仪(TRIADLT,Dynex)在波长538nm下来测量各井的吸光值(OD₅₃₈)而得到一第一吸光值。接着，对各组细胞培养物添加100μL的锥虫蓝(trypanblue)并予以混合均匀，然后于波长538nm下来测量各井的吸光值(OD₅₃₈)而得到一第二吸光值。

吞噬细胞指数(phagocyticindex)是借由将各组所测得的第一吸光值以及第二吸光值代入下列公式(I)而被计算出：

A＝B/C(I)

其中：A＝吞噬细胞指数

B＝第二吸光值(OD₅₃₈)

C＝第一吸光值(OD₅₃₈)

之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。

图4显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于RAW264.7细胞的吞噬能力的提升效用。从图4可见，与对照组相较下，实验组1至3的吞噬细胞指数有显著的增加，同时会随着第二型阿拉伯半乳聚糖的浓度的增加而更趋于明显。这个实验结果显示：本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖能够有效地提升巨噬细胞的吞噬活性。

D、BALB/c小鼠的腹腔中巨噬细胞与嗜中性白血球的吞噬活性分析：

首先，将雄性BALB/c小鼠随机地分成1个对照组以及2个实验组(也就是实验组1与2)(每组n＝10)，其中实验组1与2的小鼠被腹膜内注射(intraperitoneallyinjected)以本实施例第A项当中所得到的精制产物溶液(剂量分别为3mg/kg以及6mg/kg)，而对照组的小鼠被腹膜内注射以200μL的生理食盐水，每天1次，持续2天。在腹膜内注射开始后的第3天时，各组小鼠被腹膜内注射以100μL经异硫氰酸荧光素-标记的大肠杆菌(配于PBS中，剂量为1×10⁷细胞/100μL)。在注射后的第1小时，各组小鼠借由颈椎脱位术(cervicaldislocation)而被牺牲，继而依序进行下列步骤共计3次：(A)注射5mL的PBS至小鼠的腹腔中；(B)温和地捏揉(knead)小鼠的腹腔以混合腹腔内的流体；以及(C)借由腹部穿刺(abdominalpuncture)并使用一注射器(syringe)[搭配一个大小为20G的注射针(needle)]来收集小鼠的腹腔液(peritonealfluid)。之后，将所收集到的15mL的腹腔液于4℃下以300g进行离心历时10分钟，接而移除上澄液，然后以1mL的PBS来充分散浮所得到的沉淀物，此步骤被重复进行2次，借此而得到一细胞悬浮液。之后，将10μL的细胞悬浮液置于一血球计数盘(Hemocytometer)上，使用一倒立显微镜并在一为100倍的放大倍数下来进行细胞计数。接着，将100μL的细胞悬浮液以一为1×10⁵细胞/100μL的数量添加至96-井培养盘中，然后加入100μL的锥虫蓝，继而以一盘式荧光冷光分析仪在波长535nm下来测量各井的吸光值(OD₅₃₅)。

巨噬细胞与嗜中性白血球的吞噬活性(％)是借由将所测得的吸光值(OD₅₃₅)代入下列公式(II)而被计算出：

D＝(E/F)×100(II)

其中：D＝巨噬细胞与嗜中性白血球的吞噬活性(％)

E＝各组所测得的OD₅₃₅吸光值

F＝对照组所测得的OD₅₃₅吸光值

图5显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠的腹腔中巨噬细胞与嗜中性白血球的吞噬活性的提升效用。从图5可见，与对照组相较下，实验组1与2所测得的巨噬细胞与嗜中性白血球的吞噬活性有显著的增加，同时会随着第二型阿拉伯半乳聚糖的投药剂量的增加而更趋于明显。这个实验结果显示：本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖能够在活体内(invivo)有效地提升巨噬细胞与嗜中性白血球的吞噬活性。

E、自然杀手细胞对于肺癌细胞以及乳腺癌细胞的细胞毒性(cytotoxicity)分析：

首先，将依据上面“一般实验材料”的第1项“细胞株的来源与培养”来进行继代培养的NK-92MI细胞分成5组，其中包括1个对照组以及4个实验组(也就是实验组1至4)。将各组细胞分别以一为1×10⁶细胞的数量培养于含有10mL的α-MEM[添加有2mML-麸酰胺酸、1.5g/L碳酸氢钠、0.2mM肌醇、0.1mM2-巯基乙醇、0.02mM叶酸(folicacid)(BiologicalInc.)、12.5％马血清(horseserum)(Invitrogen)以及12.5％胎牛血清]的75T培养瓶(75Tflask)中，并在培养箱(37℃、5％CO₂)中进行培养历时24小时。

接着，将适量的依据本实施例的第A项当中所得到的精制产物溶液分别添加至实验组1至4的细胞培养物中，而使得实验组1至4分别具有一最终浓度为1、10、100以及200μg/mL的第二型阿拉伯半乳聚糖，至于对照组的细胞培养物则不作任何处理。各组细胞培养物在培养箱(37℃、5％CO₂)中进行培养历时12小时后，以300g进行离心历时10分钟，接着移除上澄液，然后以1mL的培养基来充分散浮所得到的沉淀物，借此而得到一细胞悬浮液。之后，将10μL的细胞悬浮液置于一血球计数盘上，继而使用一倒立显微镜并在一为100倍的放大倍数下来进行细胞计数。

之后，将依据上面“一般实验材料”的第1项“细胞株的来源与培养”来进行继代培养的A549细胞以一为1×10⁵细胞/井的数量加入至96-井培养盘中，接着添加各组细胞悬浮液(1×10⁶细胞/井)，然后在培养箱(37℃、5％CO₂)中进行共培养历时4小时，之后收取所形成的共-培养物(co-culture)并在4℃下以1000rpm进行离心历时10分钟，接着取50μL的培养上澄液并添加至一新的96-井培养盘中。之后，对各井加入50μL的反应试剂(ThermoScientific)并在室温下反应历时30分钟，接着加入50μL的终止试剂(ThermoScientific)，然后以一盘式荧光冷光分析仪在波长490nm下来量测各组的吸光值(OD₄₉₀)。

另外，将NK-92MI细胞以一为1×10⁶细胞/井的数量培养于含有100μL的α-MEM(添加有2mML-麸酰胺酸、1.5g/L碳酸氢钠、0.2mM肌醇、0.1mM2-巯基乙醇、0.02mM叶酸、12.5％马血清以及12.5％胎牛血清)的96-井培养盘中，并在培养箱(37℃、5％CO₂)中进行培养历时4小时。之后，收取细胞培养物并在4℃下以1000rpm进行离心历时10分钟，接着取50μL的培养上澄液并添加至一新的96-井培养盘中。之后，对各井加入50μL的反应试剂并在室温下反应历时30分钟，继而加入50μL的终止试剂，然后在波长490nm下来量测吸光值(OD₄₉₀)，而得到一个第一对照吸光值(OD₄₉₀)。

此外，将A549细胞以一为1×10⁵细胞/井的数量培养于含有90μL的Ham’sF12培养基(添加有2mML-麸酰胺酸、1.5g/L碳酸氢钠以及10％胎牛血清)的96-井培养盘中，并在培养箱(37℃、5％CO₂)中进行培养历时4小时。之后，收取细胞培养物并在4℃下以1000rpm进行离心历时10分钟，接着取50μL的培养上澄液并添加至一新的96-井培养盘中。之后，对各井加入50μL的反应试剂并在室温下反应历时30分钟，继而加入50μL的终止试剂，然后在波长490nm下来量测吸光值(OD₄₉₀)，而得到一个第二对照吸光值(OD₄₉₀)。

另外，将A549细胞以一为1×10⁵细胞/井的数量培养于含有90μL的Ham’sF12培养基(添加有2mML-麸酰胺酸、1.5g/L碳酸氢钠以及10％胎牛血清)的96-井培养盘中，并在培养箱(37℃、5％CO₂)中进行培养历时4小时，接着对所形成的细胞培养物添加以10μL的10％(w/v)TritonX-100并于37℃下进行细胞溶解(celllysis)历时10分钟。之后，收取所形成的溶胞产物(lysate)并在4℃下以1000rpm进行离心历时10分钟，接着取50μL的上澄液并添加至一新的96-井培养盘中。之后，对各井加入50μL的反应试剂并在室温下反应历时30分钟，继而加入50μL的终止试剂，然后在波长490nm下来量测吸光值(OD₄₉₀)，而得到一个第三对照吸光值(OD₄₉₀)。

此外，为了解本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖是否具有提升自然杀手细胞对于乳腺癌细胞的细胞毒性的效用，将NK-92MI细胞分成1个对照组以及4个实验组(也就是实验组1至4)，并参照上面针对肺癌细胞所描述的操作程序来进行实验，不同处在于：以MDA-MB-231细胞来取代A549细胞。

自然杀手细胞对于癌细胞的细胞毒性百分比(％)是借由将各组所测得的吸光值、该第一对照吸光值、该第二对照吸光值以及该第三对照吸光值代入下列公式(III)而被计算出：

G＝(H-I-J)/(K-J)×100(III)

其中：G＝自然杀手细胞对于癌细胞的细胞毒性百分比(％)

H＝各组所测得的吸光值(OD₄₉₀)

I＝第一对照吸光值(OD₄₉₀)

J＝第二对照吸光值(OD₄₉₀)

K＝第三对照吸光值(OD₄₉₀)

图6与图7分别显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖在提升自然杀手细胞对于肺癌细胞以及乳腺癌细胞的细胞毒性上的效用。从图6与图7可见，与对照组相较下，实验组1至4的细胞毒性百分比皆有显著的升高，同时会随着第二型阿拉伯半乳聚糖的浓度的增加而更趋于明显。这个实验结果显示：本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖能够在活体外(invitro)有效地提升自然杀手细胞对于肺癌细胞以及乳腺癌细胞的细胞毒性。

F、BALB/c小鼠的脾脏中自然杀手细胞对于淋巴瘤细胞的细胞毒性分析：

首先，将雄性BALB/c小鼠随机地分成1个对照组以及3个实验组(也就是实验组1至3)(每组n＝12)，其中实验组1至3的小鼠被口服投药(administeredorally)以本实施例第A项当中所得到的精制产物溶液(剂量分别为5mg/kg、15mg/kg以及30mg/kg)，每天1次，并且持续历时6周，至于对照组的小鼠没有接受任何处理。在投药开始至第6周结束时，借由CO₂来牺牲各组小鼠，接着取出脾脏并使用一孔径为40μm的细胞滤网(cellstrainer)(BDBiosciences)以分离出各组小鼠的自然杀手细胞。

另外，将依据上面“一般实验材料”的第1项“细胞株的来源与培养”来进行继代培养的YAC-1细胞培养于含有RPMI培养基的10-cm培养皿中，并在培养箱(37℃、5％CO₂)中进行培养历时24小时。之后，吸取1mL的YAC-1细胞的细胞培养物(2×10⁶细胞/mL)并加入15μL的BCECF-AM荧光染剂(配于DMSO中)(MolecularProbe,Cat.No.B1170)，然后于37℃下进行反应历时30分钟。接着，以RPMI培养基来进行清洗，以移除未进入细胞的荧光染剂，而得到经荧光标记的YAC-1细胞。

之后，该经荧光标记的YAC-1细胞分别被添加以25μL的各组小鼠的自然杀手细胞(2×10⁴细胞/mL)并于37℃下进行共培养历时4小时，然后收取所形成的共-培养物并在4℃下以800rpm进行离心历时5分钟，接着取100μL的培养上澄液并添加至96-井培养盘中，然后以一盘式荧光冷光分析仪(TRIADLT,Dynex)在波长538nm下来量测各组的吸光值(OD₅₃₈)。另外，该经荧光标记的YAC-1细胞被添加以10μL的1％(w/v)TritonX-100并于37℃下进行细胞溶解历时30分钟，继而收取所形成的溶胞产物并添加至96-井培养盘中，然后在波长538nm下来量测吸光值，而得到一对照吸光值(OD₅₃₈)。

此外，将适量的PBS添加至96-井培养盘中并在波长538nm下来量测吸光值，而得到一背景吸光值(OD₅₃₈)。

自然杀手细胞对于淋巴瘤细胞的细胞毒性百分比(％)是借由将各组所测得的吸光值、该对照吸光值以及该背景吸光值代入下列公式(IV)而被计算出：

L＝(M-O)/(N-O)×100(IV)

其中：L＝自然杀手细胞对于淋巴瘤细胞的细胞毒性百分比(％)

M＝各组所测得的吸光值(OD₅₃₈)

N＝对照吸光值(OD₅₃₈)

O＝背景吸光值(OD₅₃₈)

下面表7显示本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖在提升小鼠的脾脏中自然杀手细胞对于淋巴瘤细胞的细胞毒性上的效用。从表7可见，与对照组相较下，实验组1至3的细胞毒性百分比有增加的情形，同时会随着第二型阿拉伯半乳聚糖的投药剂量的增加而更趋于明显。这个实验结果显示：本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖能够在活体内有效地提升自然杀手细胞对于淋巴瘤细胞的细胞毒性。

表7.各组小鼠的脾脏中自然杀手细胞对于淋巴瘤细胞的细胞毒性百分比

^**：当与对照组作比较，p＜0.01。

^***：当与对照组作比较，p＜0.001。

综合以上第A至F项的实验结果，申请人认为：依据本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖可以有效地提升先天性免疫细胞的生物活性，进而达到抗肺癌、乳腺癌以及淋巴瘤的效用。

实施例4.本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖在抗结肠癌细胞上的效用评估

为了探讨本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖是否具有抗结肠癌细胞的效用，使用依据上面实施例1所得到的精制产物来进行下面的实验。

A、本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠结肠癌细胞的增生(proliferation)的影响：

首先，将雄性BALB/c小鼠随机分成1个正常对照组、1个病理对照组以及2个实验组(也就是，实验组1与2)(每组n＝8)，其中病理对照组以及实验组的小鼠的腿部被皮下注射(subcutaneouslyinjected)以1×10⁶个小鼠结肠癌细胞CT26，而正常对照组的小鼠没有接受任何处理。

在小鼠结肠癌细胞CT26注射后，实验组1与2的小鼠立即被腹膜内注射以上面实施例3的第A项当中所得到的精制产物溶液(剂量分别为5mg/kg以及15mg/kg)，而病理对照组的小鼠被腹膜内注射以生理食盐水(剂量为10mL/kg)。实验组与病理对照组的小鼠每天被投药1次，并且持续进行至小鼠结肠癌细胞CT26注射后的第3周结束为止。至于正常对照组的小鼠没有接受任何处理。

在小鼠结肠癌细胞CT26注射后的第3周结束时，各组小鼠借由CO₂而被麻醉，然后予以牺牲。接着，取出肿瘤并测量其重量。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。所得到的结果被显示图8中。

从图8可见，与病理对照组相较下，实验组1与2的小鼠的肿瘤重量皆有下降的趋势。特别地，实验组2的小鼠的肿瘤重量与病理对照组所具者相较呈现出统计显著性。这个实验结果显示，依据本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖能够在小鼠体内有效地抑制结肠癌细胞的增生。

B、本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于小鼠结肠癌细胞的转移(metastasis)的影响：

首先，将雄性BALB/c小鼠随机分成1个假手术组、1个病理对照组以及2个实验组(也就是，实验组1与2)(每组n＝8)，其中病理对照组以及实验组的小鼠借由乙醚而被麻醉，然后对小鼠的左上腹部(leftupperabdomen)以75％酒精予以消毒(disinfected)。之后，使用手术刀(surgicalknife)将皮肤层(skin)切开而使得在皮肤层下方的腹膜(peritoneum)被显露出来，接着以该手术刀将腹膜切开以形成一长度约为1公分的切口(incision)，继而将1×10⁶个小鼠结肠癌细胞CT26注射至脾脏中，然后缝合伤口。

另外，假手术组的小鼠被拿来进行相同的实验，不同处在于：这些小鼠的脾脏没有被注射以小鼠结肠癌细胞CT26。

在小鼠结肠癌细胞CT26注射后的隔天(也就是第2天)，实验组1与2的小鼠被静脉内注射(intravenouslyinjected)以上面实施例3的第A项当中所得到的精制产物溶液(剂量分别为50mg/kg以及100mg/kg)，而病理对照组与假手术组的小鼠被静脉内注射以生理食盐水(剂量皆为10mL/kg)。各组小鼠每天被投药1次，并且持续进行至小鼠结肠癌细胞CT26注射后的第10天。

在小鼠结肠癌细胞CT26注射后的第11天，各组小鼠借由CO₂而被麻醉，然后予以牺牲。接着，取出脾脏与肝脏并测量其重量。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。脾脏的相对增重(relativeincreasedweightofspleen)是以各组所测得的脾脏重量与假手术组所测得者的差值来表示，而肝脏的相对增重(relativeincreasedweightofliver)是以各组所测得的肝脏重量与假手术组所测得者的差值来表示。所得到的结果分别被显示图9与10中。

从图9与10可见，与病理对照组相较下，实验组的小鼠所测得的脾脏与肝脏的相对增重皆有显著地下降。这个实验结果显示：依据本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖不只能够在小鼠体内抑制脾脏中的结肠癌细胞增生，还能够有效地抑制结肠癌细胞转移至肝脏。

C、本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于氧偶氮甲烷(azoxymethane)-诱发的肠道异常腺窝(aberrantcrypt)以及异常腺窝病灶(aberrantcryptfoci)的影响：

首先，将雄性BALB/c小鼠随机分成1个病理对照组、1个正对照组以及2个实验组(也就是，实验组1与2)(每组n＝8)，各组小鼠被腹膜内注射以氧偶氮甲烷(剂量皆为10mg/kg)，每天1次，并且持续进行2周。

在氧偶氮甲烷注射开始后的第1天，实验组1与2的小鼠被口服投药以上面实施例3的第A项当中所得到的精制产物溶液(剂量分别为5mg/kg以及15mg/kg)，正对照组的小鼠被口服投药以阿斯匹林(aspirin)(剂量为10mg/kg)，而病理对照组的小鼠被口服投药以去离子水(剂量为10mL/kg)。实验组、正对照组以及病理对照组的小鼠每天被投药1次，并且持续进行至氧偶氮甲烷注射开始后的第6周结束为止。

在氧偶氮甲烷注射开始后的第6周结束时，各组小鼠借由CO₂而被麻醉，然后予以牺牲。接着取出结肠，继而以冰冷的生理食盐水予以清洗并移除肠内容物(intestinalcontent)，然后使用手术刀进行纵剖，接着以固定溶液[配于PBS中的4％三聚甲醛(paraformaldehyde)]进行固定处理(fixation)历时24小时。之后，依据熟习此项技艺者所详知且惯用的技术来进行亚甲蓝染色(methylenebluestain)。经染色的结肠组织是借由使用光学显微镜并在一为40X的放大倍数下来进行异常腺窝以及异常腺窝病灶的计数。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。所得到的结果被显示图11与12中。

从图11与12可见，与病理对照组相较下，实验组1与2的小鼠的异常腺窝数目以及异常腺窝病灶数目皆有显著地下降。特别地，实验组2的小鼠的异常腺窝数目以及异常腺窝病灶数目近似于正对照组所具者。这个实验结果显示：依据本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖能够有效地改善氧偶氮甲烷-诱发的肠道异常腺窝以及异常腺窝病灶。

综合以上的实验结果，申请人据此而推论：依据本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖可借由提升先天性免疫细胞的生物活性来达到在活体内抑制结肠癌细胞的生长与转移并且预防结肠癌细胞的形成。

实施例5.本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖与5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)在抗结肠癌细胞上的协同作用的评估

首先，将雄性BALB/c小鼠随机分成1个正常对照组、1个病理对照组、1个5-FU组以及1个协同组(每组n＝8)，其中病理对照组、5-FU组以及协同组的小鼠的腿部被皮下注射以1×10⁶个小鼠结肠癌细胞CT26，而正常对照组的小鼠没有接受任何处理。

在小鼠结肠癌细胞CT26注射后，依据下面表8所示的处理物及其投药剂量、投药途径以及投药频率来投药5-FU组、协同组以及病理对照组的小鼠，直到小鼠结肠癌细胞CT26注射后的第3周结束为止。至于正常对照组的小鼠没有接受任何处理。

表8.5-FU组、协同组以及病理对照组的小鼠所投药的处理物及其投药剂量、投药途径以及投药频率

	5-FU组	协同组	病理对照组
				处理物1	5-FU	5-FU	生理食盐水
投药剂量	10mg/kg	10mg/kg	10mL/kg
				投药途径	腹膜内注射	腹膜内注射	腹膜内注射
投药频率	3天1次	3天1次	3天1次
				处理物2	去离子水	精制产物溶液^a	去离子水
投药剂量	30mL/kg	30mg/kg	30mL/kg
				投药途径	口服投药	口服投药	口服投药
投药频率	每天1次	每天1次	每天1次

^a：精制产物溶液是在上面实施例3的第A项当中所得到的。

在小鼠结肠癌细胞CT26注射后的第3周结束时，各组小鼠借由CO₂而被麻醉，然后分别从它们的腹腔静脉采集血液。所采集到的血液借由自动血液学分析仪(automatedhematologyanalyzer)(Sysmex,KX-21N)来测定总白血球数。另外，取出肿瘤并测量其重量。所得到的结果被显示下面表9中。

从表9中可见，与病理对照组相较下，5-FU组的小鼠的肿瘤重量以及总白血球数皆有显著地下降，这表示虽然5-FU可发挥抗癌效用，但同时会产生减少白血球数目的副作用。另外，与5-FU组相较下，协同组的小鼠的肿瘤重量有显著地下降，而总白血球数有显著地上升。这个实验结果显示：依据本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖不只能够提升5-FU的抗癌效用并且也能减少5-FU的副作用。

表9.本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖与5-FU的合并使用对于总白血球数与肿瘤重量的影响

组别	总白血球数^a	肿瘤重量^a
			正常对照组	8.05±0.39	0±0
病理对照组	6.59±1.46	4.10±0.92
			5-FU组	4.46±0.77	3.19±1.47
协同组	5.33±0.60	2.34±0.85

^a：总白血球数与肿瘤重量皆是以平均值±标准偏差来表示。

实施例6.本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖对于带有卵白蛋白(ovalbumin)-诱发的过敏的小鼠的治疗效用的评估

为了探讨本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖在抗过敏上的效用，使用依据上面实施例1所得到的精制产物来进行下面的实验。

实验方法：

A、以本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖来投药带有卵白蛋白-诱发的过敏的小鼠：

首先，将雄性BALB/c小鼠随机分成1个正常对照组、1个病理对照组以及3个实验组(也就是，实验组1、2以及3)(每组n＝10)，其中实验组1至3的小鼠被口服投药以上面实施例3的第A项当中所得到的精制产物溶液(剂量分别为5mg/kg、15mg/kg以及30mg/kg)，而病理对照组的小鼠被口服投药以去离子水(剂量为10mL/kg)。实验组与病理对照组的小鼠每天被投药1次，并且持续进行8周。至于正常对照组的小鼠没有接受任何处理。

在投药开始后的第6周结束时，实验组与病理对照组的小鼠皆被腹膜内注射以100μL的卵白蛋白(ovalbumin)(配于PBS中，剂量为50μg/只)以及2μL的弗氏完全佐剂(Freund’scompleteadjuvant)，而在投药开始后的第8周结束时，实验组与病理对照组的小鼠皆被腹膜内注射以6μL的弗氏不完全佐剂(Freund’sincompleteadjuvant)，以诱发小鼠产生过敏。至于正常对照组的小鼠没有接受任何处理。

在弗氏不完全佐剂注射后的第24小时，借由穿刺(puncture)而从各组小鼠的面静脉(facialvein)采集血液。接着，将所采集到的血液在4℃下以4700rpm离心历时10分钟，所得到的血清被拿来进行下面第B项的分析。

B、酵素结合免疫吸附分析(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)：

首先，将100μL的10μg/mL卵白蛋白(配于PBS中)加入至一个96井培养盘中，于4℃下进行涂覆过夜。之后，移除各井中的液体并以洗涤缓冲液(WashingBuffer)(含有0.1％Tween20的PBS)予以洗涤3次，接着在每井中分别加入200μL的1％牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)(配于PBS中)，于室温下进行培养历时2小时。之后，移除各井中的液体并以洗涤缓冲液予以洗涤3次，接着在每井中分别加入200μL的在本实施例的第A项中所得到的血清(经PBS予以稀释20倍)，于室温下反应历时2小时。之后，移除各井中的液体并以洗涤缓冲液予以洗涤3次。接着，在每井中加入200μL的经生物素化的抗-小鼠IgE抗体(biotibylatedanti-mouseIgEantibody)(eBioscience,Catno.13-5992)并予以混合均匀后，于室温下反应历时2小时。之后，移除各井中的液体并以300μL的洗涤缓冲液予以洗涤3次。然后，在每井中加入100μL的抗生物素蛋白-过氧化酶缀合物(avidin-peroxidaseconjugate)(Millipore,Cat.No.189728)并予以混合均匀后，于室温下反应历时2小时。接着，在每井中加入100μL的TMB过氧化酶受质(TMBperoxidasesubstrate)(eBioscience,Cat.No.00-4201-56)，于室温下进行呈色反应历时30分钟，继而将50μL的2NH₂SO₄加入至各井中以终止反应。最后，以一ELISA读取机(ELISAreader)(TRIADLT,Dynex)在波长450nm下来测量各井的吸光值(OD₄₅₀)。若所测得的吸光值越高，代表IgE抗体的含量越高。之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。

结果：

下面表10显示各组小鼠的血清借由酵素结合免疫吸附分析所测得的吸光值。从表10可见，与正常对照组相较下，病理对照组的小鼠的血清的吸光值有显著地上升，这表示卵白蛋白成功地诱发小鼠产生过敏。而与病理对照组相较下，实验组1至3的小鼠的血清的吸光值皆有显著地下降。这个实验结果显示：依据本发明的第二型阿拉伯半乳聚糖能够在小鼠体内有效地改善卵白蛋白-诱发的过敏。

表10.各组小鼠的血清借由酵素结合免疫吸附分析所测得的吸光值

组别	吸光值^a
		正常对照组	0.08±0.01
病理对照组	0.12±0.01^##
		实验组1	0.11±0.00^**
实验组2	0.10±0.00^**
		实验组3	0.10±0.00^**

^a：吸光值是以平均值±标准偏差来表示。

^##：当与正常对照组作比较，p＜0.01。

^**：当与病理对照组作比较，p＜0.01。

在本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考资料。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。

虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文所附的权利要求书所示者的限制。

Claims

1.一种得自于一稻作物的稻壳的精制产物，其特征在于：该精制产物是借由一包含下列步骤的方法而被制得：

令该水性萃取产物与一第一醇混合，以得到一第一沉淀物；

2.如权利要求1所述的精制产物，其特征在于：在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为实质上不具有3,6-连结的半乳糖残基。

3.如权利要求1所述的精制产物，其特征在于：在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为包含有，以半乳糖残基的总量为基准，呈一不低于84.4％的含量的1,3-连结的半乳糖残基。

4.如权利要求1所述的精制产物，其特征在于：在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为包含有，以半乳糖残基的总量为基准，分别以一范围落在1.6至4％以及4至15％的含量而存在的1,6-连结的半乳糖残基以及末端连结的半乳糖残基。

5.如权利要求2或3所述的精制产物，其特征在于：在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为进一步包含有2,4-连结的葡萄糖残基、3,4-连结的葡萄糖残基、1,2-连结的阿拉伯糖残基、4,6-连结的甘露糖残基、末端连结的葡萄糖残基、末端连结的阿拉伯糖残基以及末端连结的甘露糖残基。

6.如权利要求1所述的精制产物，其特征在于：在该精制产物中所含有的第二型阿拉伯半乳聚糖被测定为包含有呈一范围落在大约3：1至6：1的摩尔比的半乳糖残基与阿拉伯糖残基。

7.如权利要求1所述的精制产物，其特征在于：在该方法中所使用的第一醇以及第二醇是相同的或不同的，并且是选自于下列所构成的群组：甲醇、乙醇、丙醇，以及它们的组合。

8.一种如权利要求1所述的精制产物用于制备一用来提升先天性免疫细胞的生物活性的医药品的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于：该先天性免疫细胞是选自于下列所构成的群组：巨噬细胞、嗜中性白血球、自然杀手细胞，以及它们的组合。

10.一种如权利要求1所述的精制产物用于制备一用来治疗过敏的医药品的用途。

11.一种如权利要求1所述的精制产物用于制备一用来治疗一癌症的医药品的用途。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于：该癌症是选自于下列所构成的群组：结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤，以及它们的组合。

13.一种用于制备一得自于一稻作物的稻壳的精制产物的方法，其特征在于：该方法包含：

令该水性萃取产物与一第一醇混合，以得到一第一沉淀物；

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于：该第一醇以及该第二醇是相同的或不同的，并且是选自于下列所构成的群组：甲醇、乙醇、丙醇，以及它们的组合。