CN110041441A - 一种红花多糖、其制备方法及在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多糖技术领域，具体而言，涉及一种红花多糖HH1‑1、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的用途。所述制备方法包括：首先从红花中沸水提取、浓缩、透析、醇沉得粗多糖后，进一步过离子交换柱层析得到红花多糖HH1‑1。该红花多糖HH1‑1可以显著抑制癌细胞增殖及癌细胞克隆，并且体内实验表明该红花多糖HH1‑1可显著抑制裸鼠移植瘤生长。这表明该红花多糖HH1‑1具有良好的抑制肿瘤作用，有望成为治疗肿瘤潜在多糖药物。

Description

一种红花多糖、其制备方法及在抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于多糖技术领域，具体涉及一种红花多糖HH1-1、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
多糖是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。多糖在生物界广泛存在，是构成生命的四大基本物质之一；作为动物、细菌、高等植物、真菌和藻类的生理活性物质存在。随着糖化学与糖生物学的深入发展，植物多糖作为一类重要的生物活性物质，经大量研究已表明其具有免疫调节、抗病毒、抗氧化及抗感染等多种生物活性，且对机体的毒副作用小。因此，具有生物活性的多糖已日益受到重视。自1969年，Nature杂志文章首次报道香菇多糖具有抗肿瘤功效以来(ChiharaG,MaedaY,Hamuro J,Sasaki T,Fukuoka F.Inhibition of mouse sarcoma 180by polysaccharides fromLentinus edodes(Berk.)sing.Nature.1969May 17；222(5194):687-8.)，多糖的抗肿瘤活性受到越来越多关注。目前，在我国已投放市场的多糖药物主要有：香菇多糖注射液、猪苓多糖注射液、云芝多糖胶囊、黄芪多糖、云芝肝泰、灰树花胶囊等。国外对多糖的研究也十分重视，目前有多种植物多糖已经在临床治疗上用于肿瘤的辅助治疗和减轻化疗的副作用(Schepetkin IA,Quinn MT.Botanical polysaccharides:Macrophage immunomodulationand therapeuticpotential[J].IntImmunopharmacol,2006,6(3):317-333.)。多糖可以通过多种途径发挥抗肿瘤作用，例如，提高机体免疫功能，抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化，诱导肿瘤细胞凋亡，清除自由基等。
肿瘤是危害人类健康的恶性疾病之一，很多抗癌药在杀灭癌细胞的同时对人体正常细胞也有一定的损害，尤其是损害人体的免疫系统，造成多种并发症，另一方面，在治疗的同时，肿瘤对抗癌药逐渐产生多药耐药性，也是肿瘤治疗效果不佳的重要原因，多糖的研究结果表明，很多多糖有免疫增强作用，与放化疗药合用可增强抗癌效果，改善身体状况，是很好的抗癌辅助治疗药物。
红花(Carthamus tinctoriusL.)，又称草红花、刺红花、杜红花、金红花。主产地为新疆，次产地为河南、浙江、四川、云南、青藏、西藏等地。红花是我国传统中药，具有活血通经，去瘀止痛的功效。目前对于红花的化学成分研究，主要集中在红花黄色素(Saffloryellow)及红花甙(Carthamin)等小分子化合物。而对于红花多糖的提取分离结构及药理活性的研究报道很少。目前尚无以红花为原料提取多糖，并用于治疗肿瘤药物的研究。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种红花多糖。
本发明的另一目的是提供一种从红花中提取所述的红花多糖的方法。
本发明的另一目的是提供一种包含所述的红花多糖的药物组合物。
本发明的另一目的在于提供红花多糖或含有所述红花多糖的组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明的另一目的是提供所述红花多糖或含有所述红花多糖的组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤转移的药物中的用途。
本发明的一个方面，提供了一种红花多糖HH1-1，所述红花多糖的重均分子量为10～500kDa，优选为20～200kDa；更优选为20～100kDa，其由阿拉伯糖和半乳糖组成，阿拉伯糖和半乳糖的重量比约为1:(1.3～1.5)。
在本发明的一个实施例中，所述的红花多糖HH1-1的相对分子质量为70.9kDa。
所述的红花多糖HH1-1主要含有半乳糖(59.2wt％)，阿拉伯糖(40.8wt％)。
本发明的另一个方面，提供了一种红花多糖HH1-1的制备方法，包括以下步骤：以红花为原料，经水提取、浓缩、透析、加乙醇沉淀，得红花粗多糖后，进一步经柱层析，得到红花多糖HH1-1。
本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的红花多糖HH1-1具体通过以下方法制备：以红花为原料，沸水提取，每次提取时沸水的用量约为红花总质量的5～20倍，每次提取时间约为1.5～5h，浓缩、透析、加乙醇沉淀，得红花粗多糖；取红花粗多糖，用水溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，依次以蒸馏水和NaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并NaCl溶液洗脱液，浓缩，透析，干燥得所述红花多糖HH1-1。
优选地，所述NaCl溶液的浓度约为0.1M。
所述的提取可以进行一次或多次，例如1、2、3次或3次以上。
所述透析的透析袋的截留分子量为3500Da。
所述的干燥的方法包括旋转蒸发、喷雾干燥和真空冷冻干燥中的一种或多种，优选为真空冷冻干燥。
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述的红花多糖HH1-1作为活性成分，该组合物可以进一步包括药剂学上可接受的药物辅料，例如载体、赋形剂、佐剂和/或稀释剂等。
本发明的又一方面，提供了上述的红花多糖HH1-1或含有其的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中用途。所述的肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。本发明筛选了9种常见肿瘤包括乳腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、肝癌、大肠癌、宫颈癌、黑色素瘤、肺癌，发现红花多糖HH1-1可特异性抑制胰腺癌细胞增殖。
发明所述的红花多糖HH1-1可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药，特别是与其他用于预防或治疗肿瘤或癌症药物组合。所述的治疗剂包括但不限于：氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、塞替派、卡莫司汀、司莫司汀、白消安、顺铂、卡铂、草酸铂、丝裂霉素。
本发明的又一方面，还提供了上述的红花多糖HH1-1或含有其的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤转移的药物中的用途。
本发明的又一方面，还提供了一种治疗和/或预防肿瘤的方法，所述方法包括向需要该治疗的对象给药治疗有效量的上述红花多糖HH1-1或含有其的药物组合物。
经实验验证，本发明的红花多糖可以通过体外抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞克隆能力、体内抑制裸鼠移植瘤生长，从而起到抑制肿瘤的功效。
附图说明
图1为实施例1制备的红花多糖HH1-1的13C NMR谱图；
图2为实施例1制备的红花多糖HH1-1对多种癌细胞以及人正常细胞生长抑制作用随浓度变化的示意图；
图3为实施例1制备的红花多糖HH1-1对人胰腺癌细胞BxPC-3平板克隆形成抑制作用的示意图；
图4为实施例1制备的红花多糖HH1-1对裸鼠移植瘤的抑制作用的示意图；
图5为实施例1制备的红花多糖HH1-1对胰腺癌患者的裸鼠移植瘤的抑制作用的示意图。
具体实施方式
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的内容。
高效凝胶渗透色谱采用UltrahydrogelTM 2000(25cm×0.75cm，美国Waters公司)；和UltrahydrogelTM 500(25cm×0.75cm，美国Waters公司)串联柱，以用不同分子量的T-系列标准葡聚糖(Dextran)制作标准曲线；
高效液相色谱(HPLC)采用Agilent 1260Seri高效液相系统测定(美国Agilent公司)；
红外分析采用Perkin-Elmer 599B型红外分光光度计测定(美国Perkin-Elmer公司)；
核磁共振分析采用BruckerAM-500型核磁共振仪测定(德国Brucker公司)；
细胞增殖分析采用(SPECTRAmax190)可调波长式微孔酶标仪(美国MolecularDevice公司)。
实施例1：红花多糖HH1-1的制备
a.多糖提取：
干燥的红花，用95％的乙醇脱脂1周，然后室温自然干燥。干燥后的红花5kg用沸水(去离子水)50L提取5次，第1-3次每次提取3h，第4-6次，每次提取6h。将每次的提取液合并，过滤，提取液常压下加热浓缩至约5L，对流动水透析3天。透析袋内液浓缩至约5L，浓缩液离心，取上清液在搅拌下加入4倍体积95％乙醇，静置，离心收集沉淀，沉淀经无水乙醇和丙酮依次各洗涤2次后，置真空干燥器中50℃下干燥，得到红花粗多糖HH(得率5.73％)。
b.多糖纯化：
取上述制备的红花粗多糖HH10g，100mL水溶解，离心除去不溶物，上清液通过Cl-型DEAE-纤维素阴离子柱进行初步分离。依次以蒸馏水和0.1M NaCl洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并0.1M NaCl洗脱液，浓缩，透析，真空冷冻干燥得红花多糖HH1-10.5g。
c.多糖结构鉴定：
经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定红花多糖HH1-1相对分子质量为70.9kDa。将其进行单糖组成分析，即将红花多糖HH1-1完全水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后送入气相色谱GC分析。
单糖组成分析结果显示，红花多糖HH1-1主要含有半乳糖(59.2wt％)，阿拉伯糖(40.8wt％)。
13C NMR谱中(图1)，位于δ110-δ108的端基碳信号，分别为末端阿拉伯糖、1,3-阿拉伯糖及1,3,5-阿拉伯糖的C1信号；位于δ106-δ104的端基碳信号，分别为末端半乳糖、1,3-半乳糖、1,6-半乳糖及1,3,6-半乳糖的C1信号。此外，在δ17.7处为鼠李糖甲基碳的信号峰，在δ176.7处为半乳糖醛酸羧基碳的信号峰。从上述结果可以发现红花多糖HH1-1为一阿拉伯半乳聚糖。
实施例2：红花多糖HH1-1抑制胰腺癌肿瘤活性
a.MTT(四氮唑盐法)实验
实验采用人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人神经胶质瘤细胞株U87，人髓系白血病K652，人肝癌细胞BEL-7402，人大肠癌细胞SW116，人宫颈癌细胞Hela，人恶性黑色素瘤细胞A375，人非小细胞肺癌A549，人胰腺癌细胞株BxPC-3、Panc-1和AsPC-1以及人正常肝细胞株LO2和人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM或1640培养基(HyClone公司)中。细胞在37℃含5％CO2培养箱中培养。
接种细胞取对数生长期细胞，胰酶消化，用培养基制成单细胞悬液后计数，以3000-4000个细胞/孔接种于96孔培养板，另外设空白对照孔，只加完全培养基。在37℃、含5％CO2、饱和湿度的培养箱内常规培养过夜待细胞贴壁后，再使用不同浓度红花多糖HH1-1处理，使终浓度从1mg/mL至0.015625mg/mL，每孔终体积为l00μL，每组设3个复孔。药物处理72小时后，加入MTT液(5mg/mL购自Sigma-Aldrich)20μL每孔，继续培养4小时。小心吸尽板中的培养液，各孔加l50μLDMSO溶液，将平板置于微孔板振荡器上振荡10min，使结晶物甲躜充分溶解。用酶标仪570nm处测定各孔的光密度OD值，各孔均需减去空白对照孔的OD值，记录结果。
MTT实验结果显示(图2)，红花多糖HH1-1可特异性抑制胰腺癌细胞增殖，该抑制作用呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性，而对其他肿瘤细胞没有明显的抑制作用。并且当红花多糖HH1-1浓度高达1mg/mL时，对正常胰腺细胞和肝细胞仍然几乎没有毒性。
b.平板克隆形成实验
取对数生长期的细胞，胰酶消化并吹打成单个细胞，用培养基制成单细胞悬液后计数。将细胞悬液以每皿100个细胞接种于35mm细胞培养皿，轻轻转动，使细胞分散均匀，加入红花多糖HH1-1处理，使其终浓度为0mg/mL，0.5mg/mL和1mg/mL。置于37℃5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)小心浸洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞15分钟，去固定液，加适量GIMSA(购自Sigma-Aldrich)应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
平板克隆形成实验结果显示(图3)，红花多糖HH1-1能够抑制胰腺癌细胞克隆形成能力Panc-1和BxPC-3细胞与不同浓度红花多糖HH1-1共孵育两周，平板克隆实验结果显示红花多糖HH1-1能明显抑制胰腺癌细胞克隆数量以及克隆大小。
实施例3：红花多糖HH1-1抑制裸鼠移植瘤活性
a.BxPC-3裸鼠移植瘤模型
实验用雌性BALB/c nu/nu小鼠(6-8周龄，体重18-20g)，购自上海试验动物资源中心(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)在上海药物所实验动物中心，恒温(24-26℃)，Specific Pathogen Free(SPF)条件下饲养，笼具、垫料、饮水及饲料均做高压和紫外线消毒处理，无菌操作，实验遵照中国科学院上海药物研究所实验动物使用与管理委员会规定进行。收获对数生长期的BxPC-3细胞计数后将细胞悬于PBS，调整细胞悬液浓度，以5×106个细胞量接种在裸鼠右侧腋下皮下。在肿瘤体积达到20-100mm3时，将动物进行随机分组，分为空白对照组(control)，低剂量组(0.5mg/kg)，中剂量组(5mg/kg)，高剂量组(50mg/kg)和吉西他滨组(GEM，40mg/kg)。其中低中高红花处理组均每日口服灌胃红花多糖HH1-1，空白组每日口服灌胃等量PBS，吉西他滨组每周两次给以使用腹腔注射。实验期间每周测定动物体重和肿瘤大小。给药结束时，拍照记录肿瘤大小。取肿瘤组织，称重，固定于4％多聚甲醛或取蛋白或冻存于液氮中。肿瘤体积(TumorVolume,TV)的计算公式为:TV＝(L×W2)/2。其中，L、W分别代表肿瘤测量长和宽。
BxPC-3裸鼠移植瘤模型结果显示(图4)，红花多糖HH1-1处理的各个组的肿瘤大小以及瘤重与空白对照组相比显著减少，并且其抑制肿瘤效果与阳性药吉西他滨处理组相当。经计算，红花多糖HH1-1的低、中、高剂量组和吉西他滨组的相对抑制率分别为55.95％、46.46％、46.80％和51.95％。实验过程中，红花多糖HH1-1对小鼠的体重及状态没有明显影响，以上结果表明红花多糖HH1-1体内也具有抑制胰腺癌细胞生长的作用。
b.胰腺癌患者来源的裸鼠移植瘤实验
实验用雌性SCID nu/nu小鼠(6-8周龄，体重18-20g)，以及雌性BALB/c nu/nu小鼠(6-8周龄，体重18-20g)均购自上海试验动物资源中心(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)在上海药物所实验动物中心，恒温(24-26℃)，无特定病原(Specific Pathogen Free，SPF)条件下饲养，笼具、垫料、饮水及饲料均做高压和紫外线消毒处理，无菌操作，实验遵照中国科学院上海药物研究所实验动物使用与管理委员会规定进行。手术切除的胰腺癌病人样本取自第二军医大学附属长海医院，操作遵照第二军医大学长海医院道德伦理委员会规定进行，病人签署知情同意书。手术切除的人胰腺癌肿瘤标本，病理报告显示为中分化导管腺癌，切下的肿瘤组织切取3cm×3cm置于含有青霉素和链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，冰上转移至动物房屏障区内进行移植，将肿瘤组织转移到无菌培养皿上，生理盐水冲洗3次，把肿瘤组织剪切成体积约10-30mm3的小块，插块移植到重症联合免疫缺陷SCID裸鼠皮下，该样本原代裸鼠移植瘤为P0代，将成功建立的移植瘤再次移植于BALB/c裸鼠为P1代，此后依次类推。在P3代肿瘤体积达到20-100mm3时，将动物进行随机分组，分为空白对照组(control)，低剂量组(0.5mg/kg)，中剂量组(5mg/kg)和高剂量组(50mg/kg)，并开始口服灌胃给药。实验期间每周测定动物体重和肿瘤大小。每日观察记录临床症状。给药结束时，拍照记录肿瘤大小。取肿瘤组织，称重，固定于4％多聚甲醛或取蛋白或冻存于液氮中。肿瘤体积(Tumor Volume,TV)的计算公式为:TV＝(L×W2)/2。
实验结果发现(图5)，红花多糖HH1-1能够抑制胰腺癌患者来源的裸鼠移植瘤生长，且其抑制作用呈剂量依赖性。结果显示红花多糖HH1-1处理组，瘤重明显减少，低剂量组(0.5mg/kg)相对抑制率为40.45％，中剂量组(5mg/kg)相对抑制率为45.27％，高剂量组(50mg/kg)相对抑制率为58.78％。实验过程中，红花多糖HH1-1对裸鼠体重以及体征并没有明显影响。以上实验表明，红花多糖HH1-1能够明显抑制肿瘤的生长。

Claims (10)

1.一种红花多糖HH1-1，其特征在于，所述的红花多糖HH1-1的重均分子量为10～500kDa，其由阿拉伯糖和半乳糖组成，所述的阿拉伯糖和半乳糖的重量比约为1:1.3～1.5。
2.根据权利要求1所述的红花多糖HH1-1，其特征在于，所述的红花多糖HH1-1的相对分子质量为70.9kDa；所述的红花多糖HH1-1主要含有59.2wt％半乳糖和40.8wt％阿拉伯糖。
3.一种制备红花多糖HH1-1的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
以红花为原料，经水提取、浓缩、透析、加乙醇沉淀，得红花粗多糖后，进一步经柱层析，得到红花多糖HH1-1。
4.根据权利要求3所述的制备红花多糖HH1-1的方法，其特征在于，所述的经水提取为沸水提取，每次提取时沸水的用量约为红花总质量的5～20倍，每次提取时间约为1.5～5小时。
5.根据权利要求3所述的制备红花多糖HH1-1的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
以红花为原料，沸水提取时，每次提取时沸水的用量约为红花总质量的5～20倍，每次提取时间约为1.5～5小时，浓缩、透析、加乙醇沉淀，得红花粗多糖；取红花粗多糖，用水溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，依次以蒸馏水和NaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并NaCl溶液洗脱液，浓缩，透析，干燥得所述红花多糖HH1-1。
6.根据权利要求5所述的制备红花多糖HH1-1的方法，其特征在于，
所述NaCl溶液的浓度约为0.1M；和/或
所述透析的透析袋的截留分子量为3500Da。
7.一种药物组合物，其包含权利要求1或2中所述的红花多糖HH1-1作为活性成分。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其进一步包括药剂学上可接受的药物辅料。
9.权利要求1或2所述的红花多糖HH1-1或权利要求7或8所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤、肿瘤转移的药物中的用途。
10.据权利要求9所述的用途，其中，所述肿瘤为胰腺癌。
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