CN116284472A - 紫芝多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN116284472A CN202310129546.6A CN202310129546A CN116284472A CN 116284472 A CN116284472 A CN 116284472A CN 202310129546 A CN202310129546 A CN 202310129546A CN 116284472 A CN116284472 A CN 116284472A
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严春艳
余茜
谢溢坤
苏怡帆
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Abstract

本发明公开了一种紫芝多糖及其制备方法和应用。本发明采用水提醇沉法和碱提醇沉法结合对紫芝多糖进行初步分离，得到多种紫芝粗多糖，并且进一步利用离子交换层析和分子筛凝胶柱层析方法纯化紫芝粗多糖，首次制备出一种新的紫芝精多糖，包括GSP4‑2、GSP‑4‑1‑2和GSP‑4‑1‑3的至少一种，并且对其理化性质、分子量、单糖组成等进行系统的分析确认，成功得出该精多糖的特征结构。本发明还发现紫芝粗多糖、紫芝精多糖可以抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移、抑制新生血管生成，可以用于制备预防和/或治疗三阴性乳腺癌或提高患者生存质量的药物、保健品或功能食品。

Description

紫芝多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种紫芝多糖及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是一个重大的公共卫生问题，已经成为中国最常见的死亡原因之一。乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，已成为全球第一大癌症。2020年新增乳腺癌230万例，占新发癌症的11.7％。三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)均为阴性，大约占乳腺癌人群的15-20％，TNBC是乳腺癌患者中预后最差的一种分子亚型，具有侵袭性强、易转移、复发率高、缺乏靶向治疗受体等特点，据欧洲肿瘤研究所估计，20～30％的早期乳腺癌患者将发展为转移性疾病，而5～10％的患者在诊断时已经出现转移。转移性乳腺癌女性的5年生存率介于18～36％，而非转移性乳腺癌患者的5年生存率超过90％。因此，TNBC成为临床亟需解决的焦点问题。化疗是TNBC的主要治疗手段，紫杉醇/蒽环类药物是化疗的首选，铂类药物联合紫杉醇是可手术TNBC患者的有效辅助化疗选择。尽管上述的化疗药物延长了TNBC的生存周期，但毒副作用严重。此外，TNBC容易发生转移，TNBC细胞可以通过促进血管生成获得充分的氧气和营养供给，使得原发灶的肿瘤细胞容易向其他组织迁移，导致肿瘤继发性增生，增加了治疗的难度。上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指黏膜上皮细胞从极化良好的细胞状态向具有嵌入细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)倾向的非极化细胞转化的过程，在机体发育和多种组织器官的分化过程中起着至关重要的作用。EMT程序由一组多向作用的转录因子协调，包括Slug、Snail、Twist、ZEB1和ZEB2，它们通过抑制上皮标记的表达和诱导与间充质状态相关的其他标记的表达来调动细胞进入间充质状态。EMT在肿瘤的侵袭、转移和复发中发挥了重要的作用。肿瘤细胞通过EMT获得形态和功能的变化，使肿瘤细胞获得间充质样细胞的能力，驱动其发生侵袭、转移，最终在宿主体内出现转移性病变。而TNBC的侵袭和转移与EMT密切相关。目前,市面上针对侵袭性肿瘤的药物种类甚少，临床疗效有限并且具有一定的使用限制以及相应的毒副作用。中药是我国的天然瑰宝，资源丰富、品种繁多且中医发展历史悠久，在理论与实践经验上比较完善，有着巨大的开发潜力。在抗肿瘤药物研发方面，来源于中药中活性成分的抗肿瘤药物如紫杉醇、喜树碱、长春碱、鬼臼毒素、香菇多糖以及槐耳多糖等，在治疗肿瘤过程中发挥着重要的作用。因此，从中药中寻找和发现抗肿瘤药物的前景十分广阔。中药多糖作为中药的有效成分之一，具有免疫调节和抗肿瘤等多种作用，从中药中获得高效低毒具有抗肿瘤活性的多糖日益受到人们的关注。
灵芝属于担子菌纲多孔菌科真菌，为我国传统的名贵中药，有着悠久的药用历史。与人参、何首乌、冬虫夏草并称为“四大仙草”。据《中国药典》(2020年版)，赤芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.和紫芝Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang的干燥子实体为中药灵芝的法定来源。灵芝味甘性平，归心、肺、肝、肾经，有补气安神，止咳平喘的功效。现代药理研究表明，灵芝具有广泛的生物活性，能够用于预防和治疗多种疾病。灵芝的化学成分种类丰富，主要包括多糖、三萜、核苷酸、甾体、多肽、脂肪酸和氨基酸等物质。灵芝多糖作为灵芝中重要的生物活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、肝脏保护、降血糖、神经保护、抗氧化以及心血管系统保护作用等生物活性。然而针对灵芝多糖在选择性抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移等方面的研究鲜少报道。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种紫芝精多糖，包括GSP4-2、GSP-4-1-2和GSP-4-1-3的至少一种。
本发明第二方面的目的，在于提供一种紫芝粗多糖的制备方法。
本发明第三方面的目的，在于提供一种紫芝粗多糖。
本发明第四方面的目的，在于提供上述紫芝精多糖的制备方法。
本发明第五方面的目的，在于提供上述紫芝精多糖和紫芝粗多糖的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种产品。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种紫芝精多糖，包括GSP4-2、GSP-4-1-2和GSP-4-1-3的至少一种，所述紫芝多糖GSP4-2的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0004083885610000021
其中，a、b、c、d、e的范围为1～100。
优选地，所述紫芝精多糖GSP4-2的分子量范围为10k～200k Da。
优选地，所述紫芝精多糖GSP4-2包括甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、和岩藻糖。
优选地，所述甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、和岩藻糖的摩尔比为(7～9):(2.5～3.5):(19～21):(3.5～5):1。
优选地，所述甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、和岩藻糖的摩尔比为8.0:3.2:19.7:4.3:1.0。
所述紫芝精多糖GSP4-1-2的结构式如式(II)所示：
Figure BDA0004083885610000022
其中，a、b、c、d、e的范围为1～100。
优选地，所述紫芝精多糖GSP4-1-2的分子量范围为7k～100k Da。
优选地，所述紫芝精多糖GSP4-1-2包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖。
优选地，所述甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖的摩尔为(20～22):(15～17):(48～55):(3～5):(7～9)。
优选地，所述甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖的摩尔为21.1:16.3::51.2:4.1:8.2。
所述紫芝精多糖GSP4-1-3的结构式如式(III)所示：
Figure BDA0004083885610000031
其中，a、b、c、d、e的范围为1～100。
优选地，所述紫芝精多糖GSP4-1-3的分子量范围为10k～200k Da。
优选地，所述紫芝精多糖GSP4-1-3包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖。
优选地，所述甘露糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖的摩尔比为(4.5～6):(3～5):(48～56):(4～7)。
优选地，所述甘露糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖的摩尔比为5.4:4.1:42.8:5.4。
本发明的第二方面，提供一种紫芝粗多糖的制备方法，包含方法(I)和/或方法(II)；
方法(I)包含以下步骤：
S11：将紫芝进行水提，收集得到提取液；
S12：将步骤S11得到的提取液进行分级醇沉，得粗多糖GS1、粗多糖GS2、粗多糖GS3；
S13：对步骤S12中所述的粗多糖GS1、粗多糖GS2、粗多糖GS3中进行除蛋白，得到紫芝粗多糖GS1、紫芝粗多糖GS2、紫芝粗多糖GS3；
方法(II)包含以下步骤：
S21：将紫芝进行水提，收集得到的残渣；
S22：将步骤S21得到的残渣进行碱提，，得到粗多糖GS4；
S23：去除步骤S22中所述的粗多糖GS4中的蛋白，得到紫芝粗多糖GS4。。
优选地，步骤S11、步骤S21中水提前先将紫芝用水浸泡。
优选地，浸泡时所用紫芝为干燥紫芝。
优选地，将干燥紫芝分成2～5cm小块。
优选地，所述浸泡的时间为6～12h。
优选地，步骤S12、步骤S21中所述水提的具体操作包括：将浸泡后的紫芝与水进行混合，60～100℃提取1～10h。
优选地，所述紫芝与水的体积比为1：(5～15)。
优选地，步骤S12中所述分级醇沉的具体操作包括：将步骤S1得到的提取液浓缩，加乙醇至体积浓度为A％，静置得上清液和沉淀，收集沉淀得粗多糖GS1；将上清液浓缩，加乙醇至体积浓度为B％，静置得上清液和沉淀，收集沉淀得粗多糖GS2；再将上清液浓缩，加乙醇至体积浓度为C％，静置收集沉淀，得粗多糖GS3。
优选地，10≤A＜B＜C＜100。
优选地，10≤A＜60，60≤B＜80，80≤C＜100。
优选地，所述静置的时间为10～28h。
优选地，步骤S22的具体操作包括：将步骤S21所述的残渣浸泡于0.1～1M NaOH溶液中进行碱提，收集碱提液，并将碱提液调至pH为6.0-8.0，固液分离后得上清液，将上清液醇沉得粗多糖GS4。
优选地，所述残渣与氢氧化钠溶液的体积比为1：(5～20)。
优选地，所述碱提的条件包括：室温静置1～4h。
优选地，所述固液分离的方式包括离心。
优选地，所述离心的条件为1500～2000×g，8～12min。
优选地，所述醇沉的方法为将上清液与乙醇混合，静置。
优选地，所述沉醇中乙醇的体积浓度为30～100％。
优选地，所述醇沉中静置的时间为10～28h。
优选地，步骤S13、步骤S23中所述去除蛋白的操作包括：利用Sevag法进行除蛋白。
优选地，除蛋白后进一步透析、干燥。
优选地，所述透析的截留分子量为100～1200Da；
优选地，方法(II)还包括：将紫芝粗多糖GS4进一步纯化得到本发明第一方面所述GSP4-2、GSP-4-1-2和GSP-4-1-3。
优选地，所述纯化包括采用离子交换柱层析和分子筛凝胶柱层析纯化；
优选地，所述离子交换柱层析包括离子交换纤维素或离子交换凝胶。
优选地，所述离子交换柱层析采用0～2M的NaCl溶液进行梯度洗脱。
优选地，所述离子交换柱层析采用0、0.05、0.15、0.2M的NaCl溶液进行梯度洗脱。
优选地，所述离子交换层析后根据洗脱曲线收集糖部分，然后浓缩冻干后再加水溶解，离心得上清液。
优选地，将离子交换层析后获得的上清液进行分子筛凝胶层析。
优选地，所述分子筛凝胶柱层析包括Sephadex G或Sephacryl S系列分子筛柱色谱。
优选地，所述分子筛凝胶柱层析采用水洗脱。
优选地，所述分子筛凝胶层析后根据洗脱曲线收集糖部分，然后浓缩冻干获得紫芝精多糖。
优选地，所述浓缩为浓缩至原体积的1/9～1/13。
本发明的第三方面，提供一种紫芝粗多糖，其特征在于，所述紫芝粗多糖由本发明第二方面所述的方法制备而成。
本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的紫芝精多糖或本发明第三方面所述的紫芝粗多糖在制备产品中的应用。
优选地，所述产品包括保健品、食品、日化用品和药品。
优选地，所述药物用于抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移，预防和/或治疗三阴性乳腺癌，提高患者生存质量，抑制新生血管生成。
本发明的第五方面，提供一种产品，所述产品中包含本发明第一方面所述的紫芝精多糖或本发明第三方面所述的粗多糖。
优选地，所述产品包括保健品、食品、日化用品和药品。
优选地，所述药品和/或食品和/或保健品以口服溶液、口服悬浊液、胶囊、片剂、粉末或颗粒的形式存在。
优选地，所述日化用品以水剂、乳液、膏剂、霜剂、泡沫剂、洗剂、走珠、凝胶剂或喷雾剂的形式存在。
优选地，所述产品还包括药品、保健品或日化用品中可接受的辅料。
本发明的有益效果是：
本发明采用水提醇沉法和碱提醇沉法结合，乙醇浓度由低到高进行分级醇沉，对紫芝多糖进行初步分离，同时高浓度乙醇能将极性大、水溶性好的多糖与极性小、水溶性差的多糖分离，使所提取的多糖组合物含有更多种类的多糖成分，得到多种紫芝粗多糖，并且操作简单方便，可以大规模生产。
本发明进一步利用离子交换层析和分子筛凝胶层析方法纯化紫芝粗多糖，首次制备出一种新的紫芝精多糖，包括GSP4-2、GSP-4-1-2和GSP-4-1-3的至少一种，并且对其理化性质、分子量、单糖组成等进行系统的分析确认，成功得出该多糖的特征结构。
本发明还发现紫芝粗多糖、紫芝精多糖可以抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移、抑制新生血管生成，可以用于制备预防和/或治疗三阴性乳腺癌或提高患者生存质量的药物、保健品或功能食品。
附图说明
图1：GSP4-2的红外图谱。
图2：GSP4-2的1H NMR图谱。
图3：GSP4-2的13C NMR图谱。
图4：GSP4-2的1H-1H COSY图谱。
图5：GSP4-2的HSQC图谱。
图6：GSP4-2的HMBC图谱。
图7：GSP4-1-2的核磁图谱。图(A)、(B)、(C)、(D)、(E)分别表示GSP4-1-2的1H NMR图谱、13C NMR图谱、HSQC图谱、HMBC图谱、1H-1H COSY图谱。
图8：GSP4-1-3的核磁图谱。图(A)、(B)、(C)、(D)、(E)分别表示GSP4-1-3的1H NMR图谱、13C NMR图谱、HSQC图谱、HMBC图谱、1H-1H COSY图谱。
图9：紫芝多糖对三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)与乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的影响。图(A)、(C)、(E)、(G)分别表示紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3、GS4对MDA-MB-231细胞增殖的影响，图(B)、(D)、(F)、(H)分别表示紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3、GS4对MCF-7细胞增殖的影响；图(I)、(J)分别表示紫芝精多糖GSP4-2对MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞增殖的影响。
图10：紫芝粗多糖GS4对MDA-MB-231细胞的克隆形成实验。图(A)、(B)分别是GS4对MDA-MB-231细胞增殖抑制情况和其定量结果。
图11：紫芝精多糖GSP4-2对MDA-MB-231细胞的克隆形成实验。图(A)、(B)分别是GSP4-2对MDA-MB-231细胞的增殖抑制情况和其定量结果。
图12：紫芝粗多糖GS4对MDA-MB-231细胞的划痕实验。图(A)、(B)分别是GS4对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响和其定量结果。
图13：紫芝精多糖GSP4-2对MDA-MB-231细胞的细胞划痕实验。图(A)、(B)分别是GSP4-2对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响和其定量结果。
图14：紫芝粗多糖GS4对MDA-MB-231细胞的侵袭实验。图(A)、(B)分别是GS4对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响和其定量结果。
图15：紫芝精多糖GSP4-2对MDA-MB-231细胞的侵袭实验。图(A)、(B)分别是GSP4-2对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响和其定量结果。
图16：紫芝粗多糖GS4对MDA-MB-231细胞EMT相关基因Snail,ZEB1,VIM,CDH1,CDH2和MMP9表达的影响。
图17：紫芝精多糖GSP4-2对MDA-MB-231细胞EMT相关基因Snail(A),ZEB1(B),VIM(C),CDH1(D),CDH2(E)和MMP9(F)表达的影响。
图18：紫芝粗多糖GS4对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的(A)细胞活力、(B)血管形成及其(C)定量结果的影响。
图19：紫芝精多糖GSP4-2对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的(A)细胞活力、(B)血管形成及其(C)定量结果的影响。
图20：紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3和GS4对4T1荷瘤BALB/c小鼠(A)移植瘤体积、(B)移植瘤重量、(C)抑瘤率和(D)肿瘤体积的影响。
图21：紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3和GS4对4T1荷瘤BALB/c小鼠的(A)体重和脏器指数((B)和(C))的影响。
上述图7-图19中，与对照组(Control)比较，***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1紫芝多糖的制备
按以下步骤制备紫芝多糖：
1)选材：将45.5kg干燥的紫芝子实体，切成2～5cm小块，用水浸泡10h；
2)水提：将步骤1)浸泡好的紫芝子实体用料液比1:10(w/v)的热水(80℃)提取4h，收集提取液和残渣，残渣晾干；
3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液于50℃减压浓缩至原体积的十分之一，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为55％，室温静置24h后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀一即为粗多糖GS1；将上清液一于50℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为75％，室温静置24h后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀二即为粗多糖GS2；将上清液二于50℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为95％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗多糖GS3；
4)碱提：将步骤2)得到的残渣浸泡于料液比1:10(w/v)的0.4M浓度的NaOH溶液中，室温静置3h得到上清液三，将上清液三用0.6M浓度的HCl中和至pH值为7.0，离心分离(1768×g，10min)后得到上清液四，将上清液四50℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为70％，室温静置24h后离心分离得到沉淀四，收集沉淀即为粗多糖GS4；
5)除蛋白：利用Sevag法分别对各粗多糖进行除蛋白，即粗多糖溶液以5:1的比例加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，剧烈振摇后静置，待其分层明显后除去蛋白层，重复步骤3-5次。除蛋白后粗多糖用透析袋(截留分子量为1000Da)进行透析、冻干，即得除蛋白后的紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3、GS4；
6)离子交换柱层析：由图9可知，在四个紫芝粗多糖中，GS4具有最好的抑制三阴性乳腺癌细胞的活性。取200mg紫芝粗多糖GS4，溶于10mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现4个峰，其中峰一为0M NaCl洗脱部分，峰二为0.05M NaCl洗脱部分，峰三为0.15M NaCl洗脱部分，峰四为0.2M NaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法监测洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液50℃减压浓缩、冷冻干燥后，得到四种多糖(峰一多糖、峰二多糖、峰三多糖、峰四多糖)；
7)分子筛凝胶层析：
将步骤6)得到的峰一多糖样品(多糖含量高)用水溶解，离心分离后取上清液，上Sephacryl S-100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法监测洗脱曲线，收集主峰，50℃减压浓缩，冷冻干燥后得紫芝精多糖GSP4-1-2、GSP4-1-3。
将步骤6)得到的峰二多糖样品(多糖含量高)用水溶解，离心分离后取上清液，上Sephacryl S-100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法监测洗脱曲线，收集主峰，50℃减压浓缩，冷冻干燥后得紫芝精多糖GSP4-2。
纯度检测：将紫芝精多糖GSP4-1-2、GSP4-1-3、GSP4-2配成2％浓度(W/V)的水溶液，HPGPC法测得其洗脱曲线。
经离子交换和凝胶过滤法分离纯化后得到的组分GSP4-1-2、GSP4-1-3、GSP4-2呈单一对称峰，说明GSP4-1-2、GSP4-1-3、GSP4-2为均一紫芝精多糖。
实施例2
按以下步骤制备紫芝多糖：
1)选材：将45.5kg干燥的紫芝子实体，切成2～5cm小块，用水浸泡6h；
2)水提：将步骤1)浸泡好的紫芝子实体用料液比1:5(w/v)的热水(100℃)提取1h，收集提取液和残渣，残渣晾干；
3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液于70℃减压浓缩至原体积的十分之一，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为20％，室温静置10h后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀一即为粗多糖GS1；将上清液一于70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为60％，室温静置10h后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀二即为粗多糖GS2；将上清液二于70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为80％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗多糖GS3；
4)碱提：将步骤2)得到的残渣浸泡于料液比1:5(w/v)的0.1M浓度的NaOH溶液中，室温静置1h得到上清液三，将上清液三用0.1M浓度的HCl中和至pH值为7.0，离心分离(1768×g，10min)后得到上清液四，将上清液四70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为30％，室温静置10h后离心分离得到沉淀四，收集沉淀即为粗多糖GS4；
5)除蛋白：利用Sevag法分别对各粗多糖进行除蛋白，即粗多糖溶液以5:1的比例加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，剧烈振摇后静置，待其分层明显后除去蛋白层，重复步骤3-5次。除蛋白后粗多糖用透析袋(截留分子量为1000Da)进行透析、冻干，即得紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3、GS4；
6)离子交换柱层析：取200mg上述纯化后的紫芝粗多糖GS4，溶于10mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现4个峰，其中峰一为0MNaCl洗脱部分，峰二为0.05M NaCl洗脱部分,峰三为0.15M NaCl洗脱部分，峰四为0.2MNaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液70℃减压浓缩、冷冻干燥后，得到四种多糖(峰一多糖、峰二多糖、峰三多糖、峰四多糖)；
7)分子筛凝胶层析：
将步骤6)得到的峰一多糖样品(多糖含量高)用水溶解，离心分离后取上清液，上Sephacryl S-100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法监测洗脱曲线，收集主峰，50℃减压浓缩，冷冻干燥后得紫芝精多糖GSP4-1-2、GSP4-1-3。
将步骤6)得到的峰二多糖样品(多糖含量高)用水溶解，离心分离后取上清液，上Sephacryl S-100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法监测洗脱曲线，收集主峰，50℃减压浓缩，冷冻干燥后得紫芝精多糖GSP4-2。
实施例3
按以下步骤制备紫芝多糖：
1)选材：将45.5kg干燥的紫芝子实体用水浸泡8h；
2)水提：将步骤1)浸泡好的紫芝子实体用料液比1:15(w/v)的热水(80℃)提取10h，收集提取液和残渣，残渣晾干；
3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液于40℃减压浓缩至原体积的十分之一，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为59％，室温静置28h后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀一即为粗多糖GS1；将上清液一于40℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为79％，室温静置28h后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀二即为粗多糖GS2；将上清液二于40℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为99％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗多糖GS3；
4)碱提：将步骤2)得到的残渣浸泡于料液比1:15(w/v)的1M浓度的NaOH溶液中，室温静置4h得到上清液三，将上清液三用1M浓度的HCl中和至pH值为7.0，离心分离(1768×g，10min)后得到上清液四，将上清液四40℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为90％，室温静置28h后离心分离得到沉淀四，收集沉淀即为粗多糖GS4；
5)纯化：利用Sevag法分别对各粗多糖进行除蛋白，即粗多糖溶液以5:1的比例加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，剧烈振摇后静置，待其分层明显后除去蛋白层，重复步骤3-5次。除蛋白后粗多糖用透析袋(截留分子量为1000Da)进行透析、冻干，即得紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3、GS4；
6)离子交换柱层析：取200mg上述纯化后的紫芝粗多糖GS4，溶于10mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现4个峰，其中峰一为0MNaCl洗脱部分，峰二为0.05M NaCl洗脱部分,峰三为0.15M NaCl洗脱部分，峰四为0.2MNaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液70℃减压浓缩、冷冻干燥后，得到四种多糖(峰一多糖、峰二多糖、峰三多糖、峰四多糖)；
7)分子筛凝胶层析：将步骤6)得到的峰一多糖样品(多糖含量高)用水溶解，离心分离后取上清液，上Sephacryl S-100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法监测洗脱曲线，收集主峰，50℃减压浓缩，冷冻干燥后得紫芝精多糖GSP4-1-2、GSP4-1-3。
将步骤6)得到的峰二多糖样品(多糖含量高)用水溶解，离心分离后取上清液，上Sephacryl S-100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法监测洗脱曲线，收集主峰，50℃减压浓缩，冷冻干燥后得紫芝精多糖GSP4-2。
实施例4
下面对实施例1提取分离到的GSP4-2作进一步结构分析：
(1)纯度验证
经HPGPC法测定，GSP4-2呈单一对称峰的均一多糖。
(2)单糖组成分析
由完全酸水解产物采用PMP-柱前衍生化高效液相色谱法测得图谱可知，GSP4-2是由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、和岩藻糖组成的酸性杂多糖，比例为8.0:3.2:19.7:4.3:1.0。
(3)红外光谱检测
GSP4-2的红外光谱(如图1所示)检测结果显示，GSP4-2含有糖的特征吸收峰。
(4)甲基化分析
样品经糖醛酸还原以及甲基化、水解、还原、乙酰化后GC-MS分析，结果表明GSP4-2含有L-Fucp-(1→、D-Galp-(1→、D-GalpA-(1→、→3)-D-Glcp-(1→、→3)-D-GlcpA-(1→、→4)-D-Galp-(1→、→6)-D-Manp-(1→和→3,6)-D-Glcp-(1→糖残基。
(5)多糖的核磁共振分析
将均一精多糖GSP4-2样品置于核磁管中，用D2O溶解后测谱，氘代丙酮作为内标(δC215.9)所得结果如图2～图6所示。
根据上述图2～图6的核磁图谱可知各个1H和13C数据归属，如表1所示。
表1GSP4-2各糖残基的1H和13C数据归属
Figure BDA0004083885610000071
Figure BDA0004083885610000081
经上述完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，结果显示GSP4-2是由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、和岩藻糖组成的酸性杂多糖，摩尔比为8.0:3.2:19.7:4.3:1.0，甲基化分析说明其含有L-Fucp-(1→、D-Galp-(1→、D-GalpA-(1→、→3)-D-Glcp-(1→、→3)-D-GlcpA-(1→、→4)-D-Galp-(1→、→6)-D-Manp-(1→和→3,6)-D-Glcp-(1→糖残基，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出分子量范围在10k～200k Da的GSP4-2的结构为：
Figure BDA0004083885610000082
其中，a、b、c、d、e的范围为1～100；
相同地，实例1提取分离到的GSP4-1-2、GSP4-1-3的解析同上，得到其结构。
紫芝精多糖GSP4-1-2的结构式(核磁图谱见图7)如下所示：
Figure BDA0004083885610000091
其中，a、b、c、d、e的范围为1～100。
紫芝精多糖GSP4-1-2的分子量范围为7k～100k Da；紫芝精多糖GSP4-1-2包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖；摩尔为21.1:16.3:51.2:4.1:8.2。
紫芝精多糖GSP4-1-3的结构式(核磁图谱见图8)如下所示：
Figure BDA0004083885610000092
其中，a、b、c、d、e的范围为1～100。
紫芝精多糖GSP4-1-3的分子量范围为10k～200k Da；紫芝精多糖GSP4-1--3包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖；摩尔比为5.4:4.1:42.8:5.4。
以上均一精多糖可能是紫芝在选择性抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移等方面的活性成分，因而，均一精多糖的结构鉴定将为后续探究紫芝选择性抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移的机制提供有力依据。
实施例5：紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的研究
1、MTT比色法：取对数期MDA-MB-231细胞，调整细胞密度为5×104个/mL；每孔100μL细胞悬液，接种至96孔板中培养箱中孵育24h；除去96孔板中旧培养基，加入不同浓度的含药培养基，100μL/孔，培养48h(每个浓度至少设置3个复孔)，其中给药组包括：100、200、400、800、1600μg/mL的实施例1中的GS1、GS2、GS3和GS4；25、50、100、200、400μM的GSP4-2；DDP(10μM)；Control组细胞则加入相同体积的含10％FBS以及1％青霉素-链霉素的DMEM培养基；给药组和Control组分别加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，空白组不加MTT溶液，置于培养箱中继续培养4h；小心去除染色液，避免吸走甲瓒，每孔加入100μL DMSO，震荡使甲瓒溶解完全，酶标仪检测(490nm)；记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线。
计算公式：
Figure BDA0004083885610000093
结果如图9(A)-图9(H)所示，紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3和GS4分别作用在MDA-MB-231细胞48h后与Control组比较均能够有效抑制MDA-MB-231细胞增殖，并且表现出相应的浓度依赖性(400-1600μg/mL,P<0.001)，而GS1、GS2、GS3和GS4作用在MCF-7细胞48h后与Control组比较没有显著的抑制活性。其中，GS4对MDA-MB-231细胞在100μg/mL时开始出现抑制作用(P<0.05)，且呈浓度依赖性。因此，对紫芝粗多糖GS4进行了分离纯化，得到紫芝精多糖GSP4-2。
紫芝精多糖GSP4-2对MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞的增殖影响如图9(I)-图9(J)所示，GSP4-2仅对MDA-MB-231细胞中表现出浓度依赖性的增殖抑制作用(50-400μM)，对MCF-7细胞无抑制活性。因此，紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3和GS4以及精多糖GSP4-2在体外细胞实验中对MDA-MB-231细胞增殖具有选择性抑制活性。其中，粗多糖GS4对MDA-MB-231的增殖抑制作用最优，因此选择紫芝粗多糖GS4及其分离纯化得到的精多糖GSP4-2进行抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、侵袭和转移等相关实验。
2、细胞克隆形成实验：取对数生长期的MDA-MB-231细胞，调整细胞密度为2.0×102/mL，接种于24孔板内，置于培养箱内孵育24h后给药；设置Control组、GS4低浓度组(50μg/mL)、GS4中浓度组(100μg/mL)、GS4高浓度组(200μg/mL)、GSP4-2低浓度组(50μM)，GSP4-2中浓度组(100μM)，GSP4-2高浓度组(200μM)。每组设置三个复孔，给药48h后，弃去含药培养基，加入含10％ FBS的DMEM培养基，继续培养10天，每天观察。在第10～12天取出24孔板，4％多聚甲醛固定10min后用0.1％结晶紫染色20min(室温下)。用PBS轻轻洗去染液，拍照观察，用prism软件进行数据统计。
粗多糖GS4的实验结果如图10(A)-图10(B)所示，Control组细胞集落密集，而经GS4处理后与Control组相比，形成的细胞集落数量更少、更小(P<0.05)，且表现出一定的浓度依赖性。精多糖GSP4-2实验结果如图11(A)和图11(B)所示，经GSP4-2处理的细胞集落与Control组相比，形成的细胞集落更少、更小，其表现出一定的浓度依赖性。其中，在200μM下GSBP-2抑制MDA-MB-231细胞集落的形成最显著(P<0.001)。提示紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2均能够抑制MDA-MB-231细胞的增殖。
本发明所提取的紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3和GS4能够选择性抑制MDA-MB-231细胞的增殖。其中由GS4分离纯化得到的精多糖GSP4-2可能是发挥上述活性的有效成分，具有显著选择性抑制人源性三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)增殖的活性，其抗MDA-MB-231细胞的作用机制在后续实验中进一步研究。
实施例6：紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2抑制MDA-MB-231细胞迁移、侵袭的活性研究
1、划痕实验：(1)培养板划线。使用marker笔在6孔板背后，借助直尺均匀地画横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条细线；(2)在孔中加入2mL 2×105个/mL的MDA-MB-231细胞悬液；(3)第二天用200μL枪头，垂直于细胞平面，沿着画好的线在细胞层进行划痕(不同孔之间最好使用同一只枪头)；(4)划痕完成后，使用无菌PBS洗细胞3次，洗去死掉的不贴壁的细胞，使划线后留下的间隙清晰可见。然后更换新鲜无血清培养基和不同浓度的样品溶液；(5)将细胞放入CO2培养箱中培养。在第0、12和24h取出细胞，显微镜下观察并测量划痕的宽度，拍照记录(6)使用Image J软件打开图片后，随机选取至少5个点，计算细胞间距离。
紫芝粗多糖GS4定性和定量实验结果如图12(A)-图12(B)所示，在Control组中，损伤的MDA-MB-231细胞层在24h内随着时间的增加而出现愈合的趋势，表明正常状态下MDA-MB-231细胞具有较强的运动能力。GS4组对创面愈合表现出较强的抑制作用(P<0.05)，且呈浓度依赖性。其中，200μg/mL GS4组在12h后与Control组比较，创面愈合有显著性差异。紫芝精多糖GSP4-2定性和定量实验结果如图13(A)-图13(B)所示，与Control组相比，GSP4-2组对创面愈合表现出一定的抑制，且呈浓度依赖性。其中，200μM GSP4-2处理24h对创面愈合的抑制作用最强(P<0.01)。以上结果表明紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2均具有抑制MDA-MB-231细胞迁移的能力。
2、Transwell侵袭实验：(1)将分装的Matrigel基质胶从-20℃转移至4℃冰箱过夜，Matrigel胶即从固体状态融化为液体状态；(2)按Matrigel基质胶：培养基为1：2或1：3稀释，包被transwell小室底部膜的上室面，置于培养箱中等待其凝固；(3)PBS洗1～2遍去除血清的影响，用胰酶消化，用无血清培养基重悬MDA-MB-231细胞，调整细胞密度为2×104个/mL；(4)取100μL细胞悬液加入Transwell上室，加入100μL不同浓度的多糖样品溶液，24孔培养板下室内加入600μL含10％ FBS培养基。(5)培养板置于CO2培养箱中培养12～48h；(6)取出小室，用PBS洗2遍，用棉签擦去小室微孔膜上层内的细胞，在24孔板内用4％多聚甲醛固定20min，PBS洗3遍，结晶紫溶液染色15min；(7)使用PBS清洗后，倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数10个视野，取平均值，统计分析。
紫芝粗多糖GS4定性和定量实验结果如图14(A)-图14(B)所示，Control组通过基质包膜的MDA-MB-231细胞数量相对较多，说明MDA-MB-231细胞的侵袭确实存在。GS4处理24h后的MDA-MB-231细胞，侵袭数量明显减少(P<0.001)，随着样品浓度的增加，GS4对细胞的侵袭能力抑制作用显著。紫芝精多糖GSP4-2定性和定量实验结果如图15(A)-图15(B)所示，与Control组相比，GSP4-2处理24h后的MDA-MB-231细胞，侵袭数量明显减少，在100μM和200μM浓度下，通过基质胶的细胞数显著减少(P<0.001)。以上结果表明紫芝粗多糖GS4和紫芝精多糖GSP4-2均具有抑制MDA-MB-231细胞侵袭的能力。
3、qPCR实验：通过qPCR分析紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2对MDA-MB-231细胞EMT相关基因转录水平的影响。
引物设计如下表所示：
表2qRT-PCR引物序列
Figure BDA0004083885610000111
结果如图16-图17所示。与EMT呈正相关的Snail1、ZEB1、VIM、CDH2和MMP9基因经紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2处理后均表现出浓度依赖性抑制表达，而与EMT呈负相关的CDH1基因则表现出浓度依赖性促进表达。经100μM GSP4-2处理后，正相关基因的表达显著降低(P<0.001)，而负相关基因CDH1在200μM GSP4-2处理后表达显著性增加(P<0.001)，具有浓度依赖性。提示紫芝粗多糖GS4和紫芝精多糖GSP4-2特异性抑制MDA-MB-231细胞EMT相关基因的转录水平，从而显著抑制EMT介导的侵袭和转移。
实施例7：紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2对血管生成的影响
首先利用MTT比色法检测紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2对HUVECs细胞的毒性，结果如图18(A)和图19(A)所示，GS4和GSP4-2在所选取的浓度范围内对HUVECs不具有细胞毒活性。
血管形成实验：(1)Matrigel基质胶和96孔板置于冰上，使用预冷枪头取50μLMatrigel基质胶于96孔板中，铺平；(2)将96孔板置于37℃培养箱中30min，等待成胶；(3)收集HUVEC细胞，调整密度为6×105/100μL。从培养箱中取出96孔板，实验组给予50μL不同浓度的多糖溶液及50μL的细胞悬液，而Control组给予50μL 1640培养基及50μL的细胞悬液，每个浓度设置三个复孔；(4)96孔板放于培养箱中培养12h，等待成管；(5)取出96孔板，吸去上层培养基，加入4％多聚甲醛固定20min，用PBS洗净，显微镜下拍照，用ImageJ进行数据处理。
紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2的血管形成实验结果如图18(B)、18(C)和19(B)、19(C)所示，与Control组相比，GS4以浓度依赖(50～200μg/mL)的方式显著地抑制HUVECs血管的形成(P<0.001)。GSP4-2以浓度依赖的方式显著抑制HUVECs血管的形成(P<0.001)。因此，紫芝粗多糖GS4和精多糖GSP4-2均能够抑制血管生成。
实施例8：紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3和GS4体内抗乳腺癌实验
1、构建BALB/c小鼠荷4T1乳腺肿瘤模型，将42只成瘤小鼠随机分为模型(Control)组(等体积的生理盐水)、阳性对照组(顺铂，腹腔注射3mg/kg，每三天给一次药，持续14天)和紫芝粗多糖组(GS1、GS2、GS3和GS4，除GS4设置200mg/kg和400mg/kg两个浓度外，其余浓度均为400mg/kg，灌胃0.1mL/10g，每天一次)，每组6只动物。实验期间每隔一天记录动物反应情况和体重，并测量肿瘤体积＝(长×宽2)/2；多糖组给药14天后，小鼠麻醉处死，解剖剥取移植瘤和各脏器，拍照并记录重量。脏器指数＝脏器重量/小鼠体重。
结果显示，紫芝粗多糖(GS1、GS2、GS3和GS4)和顺铂(Cisplatin)对瘤体积和重量的影响如图20(A)、20(B)所示，模型(Control)组移植瘤体积大，说明4T1移植瘤成功接种。Cisplatin组给药14天后移植瘤体积显著变小，说明其有效抑制4T1瘤的生长。多糖给药组中，GS2和GS4(400mg/kg)组瘤体积明显缩小，表现出接近Cisplatin组的抑瘤效果；在移植瘤重量方面，与Control组相比，Cisplatin组、GS2和GS4(400mg/kg)组瘤重显著性减小(P＜0.001)，GS3组瘤重显著性减小(P＜0.05)。抑瘤率结果如图20(C)所示，Cisplatin组抑瘤率为69.03％，GS1、GS2、GS3和GS4(200mg/kg和400mg/kg)组抑瘤率分别为21.04％、37.51％、16.05％、14.63％和29.38％；荷瘤BALB/c小鼠14天内瘤体积变化如图20(D)所示，与Control组相比，Cisplatin组刚开始给药时对移植瘤的作用不明显，随着给药时间的延长，Cisplatin组对移植瘤体积的抑制作用逐渐突出(P＜0.001)。随着给药时间的延长，紫芝粗多糖组中GS2和GS4(400mg/kg)对移植瘤体积表现出一定的抑制作用(P＜0.001，P＜0.01)。综上，紫芝粗多糖GS2、GS3和GS4有一定的体内抗乳腺癌作用，其中GS2和GS4(400mg/kg)的作用显著。
如图21所示，紫芝粗多糖各组小鼠体重未见显著减少，各脏器指数无明显变化，与Control组无显著性差异，说明对小鼠无明显毒性。而顺铂(Cisplatin)组体重明显减小(P＜0.001)，肝指数、脾指数、肾指数和肺指数与Control组相比，有显著性的下降(P＜0.001，P＜0.01)，说明顺铂对于小鼠有毒副作用。综上，紫芝粗多糖GS1、GS2、GS3和GS4对4T1荷瘤BALB/c小鼠的体重和脏器指数无明显影响，即无毒副作用。
以上结果说明，紫芝粗多糖GS2、GS3和GS4，在体内有一定的抗乳腺癌作用，其中GS2和GS4在体内能够显著性抑制乳腺癌生长。Cisplatin作为传统化疗药物，对机体有毒副作用。而紫芝粗多糖能够在抗乳腺癌的同时，未产生明显的毒副作用，不对机体产生显著性损伤，即可能存在保护作用。因此，为紫芝多糖在成为特异性抑制三阴性乳腺癌的候选药物或提高患者生存质量的辅助治疗药物中的应用提供依据。
传统手术治疗对于乳腺癌，特别是对具有强侵袭转移倾向的三阴性乳腺癌的效果并不显著，仍有术后复发的可能性。绝大多数与乳腺癌相关的死亡与其转移性复发有关，转移性乳腺癌会迅速导致多器官衰竭，增加治疗的难度。乳腺癌发生迁移、侵袭过程与EMT息息相关。因此，通过抑制乳腺癌细胞自身EMT相关基因的表达以及抑制其对血管生成的促进作用，是在手术治疗后延长乳腺癌患者生存期的研究热点和重要策略。通过上述方法提取的紫芝多糖表现出对三阴性乳腺癌细胞的选择性抑制作用、对EMT调控的侵袭和转移的抑制作用以及血管生成的抑制作用。因此，紫芝多糖在制备能够选择性抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移等方面活性研究为紫芝多糖在医药域的应用提供了依据。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种紫芝精多糖，包括GSP4-2、GSP-4-1-2和GSP-4-1-3的至少一种，其特征在于，所述紫芝精多糖GSP4-2的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0004083885600000011
其中，a、b、c、d、e的范围为1～100；
式(I)；
所述紫芝精多糖GSP4-1-2的结构式如式(II)所示：
Figure FDA0004083885600000012
其中，a、b、c、d、e的范围为1～100；
式(II)
所述紫芝精多糖GSP4-1-3的结构式如式(III)所示：
Figure FDA0004083885600000021
其中，a、b、c、d、e的范围为1～100；
式(III)。
2.根据权利要求1所述的紫芝精多糖，其特征在于，所述紫芝精多糖GSP4-2的分子量范围为10k～200k Da；优选地，所述紫芝精多糖GSP4-1-2的分子量范围为7k～100k Da；所述紫芝精多糖GSP4-1-3的分子量范围为10k～200k Da。
3.一种紫芝粗多糖的制备方法，包含方法(I)和/或方法(II)：
方法(I)包含以下步骤：
S11：将紫芝进行水提，收集得到提取液；
S12：将步骤S11得到的提取液进行分级醇沉，得粗多糖GS1、粗多糖GS2、粗多糖GS3；
S13：去除步骤S12中所述的粗多糖GS1、粗多糖GS2、粗多糖GS3中的蛋白，得到紫芝粗多糖GS1、紫芝粗多糖GS2、紫芝粗多糖GS3；
方法(II)包含以下步骤：
S21：将紫芝进行水提，收集得到的残渣；
S22：将步骤S21得到的残渣进行碱提，得到粗多糖GS4；
S23：去除步骤S22中所述的粗多糖GS4中的蛋白，得到紫芝粗多糖GS4。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S11、步骤S21中所述水提的具体操作包括：将紫芝与水进行混合，60～100℃提取1～10h；优选地，所述紫芝与水的体积比为1：(5～15)。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S12中所述醇沉为分级醇沉，优选地，所述分级醇沉的具体操作包括：将步骤S11得到的提取液浓缩，加乙醇至体积浓度为A％，静置出沉淀，得粗多糖GS1，加乙醇至体积浓度为B％，静置出沉淀，得粗多糖GS2，加乙醇至体积浓度为C％，静置出沉淀，得粗多糖GS3；
优选地，10≤A＜B＜C＜100。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S22的具体操作包括：将步骤S21所述的残渣浸泡于0.1～1M NaOH溶液中进行碱提，收集碱提液，并将碱提液调至pH为6-8，固液分离后得上清液，将上清液醇沉得粗多糖GS4；
优选地，所述残渣与氢氧化钠溶液的体积比为1：(5～20)；
优选地，所述碱提的条件包括：室温静置1～4h；
优选地，所述固液分离的方式包括离心；
优选地，所述沉醇中乙醇的体积浓度为30～90％。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，通过将权利要求3～6任一项所述的紫芝粗多糖GS4进一步纯化得到权利要求1所述GSP4-2、GSP-4-1-2和GSP-4-1-3；
优选地，所述纯化包括采用离子交换层析、分子筛凝胶层析；
优选地，所述离子交换层析包括离子交换纤维素或离子交换凝胶；
优选地，所述离子交换层析采用0～2M的NaCl溶液进行梯度洗脱；
优选地，所述分子筛凝胶层析包括Sephadex G、Sephacryl S系列分子筛色谱柱；
优选地，所述分子筛凝胶层析采用水洗脱。
8.一种紫芝粗多糖，其特征在于，所述粗多糖由权利要求3～6任一项所述的方法制备而成。
9.权利要求1～2任一项所述的紫芝多糖或权利要求8所述的紫芝粗多糖在制备产品中的应用；优选地，所述产品包括药物，所述药物用于抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移，预防和/或治疗三阴性乳腺癌，提高患者生存质量，抑制新生血管生成。
10.一种产品，其特征在于，所述产品中包含权利要求1～2任一项所述的紫芝多糖或权利要求8所述的紫芝粗多糖。
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