CN108743573A - 石斛中芴酮类化合物在制备防治糖尿病药物中的应用及其制备方法 - Google Patents

石斛中芴酮类化合物在制备防治糖尿病药物中的应用及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种石斛中芴酮类化合物在制备防治糖尿病药物中的用途。具体而言，本发明提供式I所示的芴酮类化合物的用途，可用作降血糖药物、降血糖保健食品或降血糖食品：在式I中，R1，R2分别为‑H或‑OH或‑OCH3。本发明中的芴酮类化合物为石斛中存在的天然化合物，具有较强的α‑葡萄糖苷酶抑制活性，用其作为活性成分与药学上可接受的载体或辅料制备成降血糖药物或药物组合物。

Description

石斛中芴酮类化合物在制备防治糖尿病药物中的应用及其制 备方法
技术领域
本发明涉及石斛中芴酮类化合物在制备防治糖尿病药物中的用途，特别涉及可从兰科石斛属植物(如铁皮石斛、金钗石斛及鼓槌石斛)中分离得到的芴酮类化合物在制备防治抗糖尿病药物中的用途。
背景技术
糖尿病已经成为一种严重影响人类健康的常见病、多发病。根据国际糖尿病联盟(IDF)统计，2015年全球20-79岁的人中有约4.15亿人患糖尿病(患病率8.8％)，另外有3.18亿人糖耐量受损(前期患病率6.7％)。中国是全球糖尿病患者第一大国，2015年病患人数高达1.096亿人，130万人死于糖尿病及其并发症。同时据IDF预测，如果不加干预，2040年全球糖尿病患者将达6.42亿，糖尿病前期人群4.81亿，我国患者数量将上升至1.54亿。一个患了糖尿病的人，极易发生冠心病、缺血性或出血性高血管病、失明、肢端坏疽等严重并发症。现代医学将糖尿病分为四大类，即I型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊类型糖尿病。糖尿病患者中，Ⅱ型糖尿病所占的比例约为95％。在Ⅱ型糖尿病的防治过程中，糖耐量异常(IGT)是一个非常重要的阶段，是人体处于糖代谢紊乱的代偿性阶段。 IGT阶段属于可逆阶段，如果在这一阶段实施有效的干预治疗，可使糖耐量异常者发展为糖尿病机率极大地降低。在对IGT阶段进行干预治疗过程中，α-葡萄糖苷酶抑制剂发挥着重要作用，而目前临床上常用的口服α-葡萄糖苷酶抑制剂，如拜糖平等存在恶心、呕吐和腹泻等胃肠道不良反应等副作用。
α-葡萄糖苷酶(alpha-D-glucoside glucohydrolase,EC 3.2.1)，是糖苷水解酶GH31家族中的膜结合酶，在糖类化合物水解生成单糖时起作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，延缓葡萄糖的生成速度，从而有效降低餐后高血糖。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂已在临床上用于糖尿病的治疗。在自然界获得具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，并作为药物或新药物的先导化合物进行开发，是糖尿病药物研究的热点之一。
兰科石斛属植物包括铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)、金钗石斛(D.nobile Lindl.)及鼓槌石斛(D.chrysotoxum Lindl.)，具有健脾养胃、滋阴补肾、润肺生津等功效，用于治疗慢性萎缩性胃炎、高血压、糖尿病、抗肿瘤、抗衰老等。石斛属植物化学成分多样，含有多糖、多酚、生物碱、糖苷类及氨基酸等，其中多糖、多酚及石斛碱是其主要的生理活性成分。石斛多糖具有的抗氧化、降低血糖、降压、抗炎、抗肿瘤、增强免疫功能等生物活性；石斛多酚包括菲类、茋类、联苄类及木脂素类化合物，具有降血糖、抗肿瘤、抗突变、抗氧化等作用(Zhao, Y.P.,et al.Antioxidant and anti-hyperglycemicactivity of polysaccharide isolated from Dendrobium chrysotoxum Lindl.Journalof Biochemistry and Molecular Biology,2007, 40(5):670-677；Yang,L.C.,etal.Characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides derivedfrom Dendrobium tosaense.Carbohydrate Polymers,2014, 111:856-863；Li,F.,etal.New phenanthrene glycosides from Dendrobium denneanum and their cytotoxicactivity.Phytochemistry Letters,2013,6(4):640-644.)。但尚未见该属植物中多酚类化合物抑制α-葡萄糖苷酶活性的相关报道研究。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供石斛中芴酮类化合物在治疗糖尿病中的用途、用于治疗糖尿病的药物或药物组合物及其制备方法以及用于治疗糖尿病以及糖尿病引起的肾病、视网膜病变、白内障、脑动脉硬化、急性脑血管病、周围神经病变及心脏病。
具体而言，本发明提供：
(1)式I所示的芴酮类化合物在制备药物中的用途，用于治疗糖尿病以及糖尿病引起的肾病、视网膜病变、白内障、脑动脉硬化、急性脑血管病、周围神经病变及心脏病：
在式I中，R1，R2分别为-H或-OH或-OCH3；
(2)根据(1)所述的用途，其中所述芴酮类化合物为式II-式IV所示化合物中的一种或几种：
式II：
式III：
式IV：
(3)根据(2)所述的用途，其中所述的式II-式IV所示化合物中的一种或几种存在于用溶剂提取石斛属植物而得到的浸膏中并以该浸膏的形式使用；其中所述溶剂为70～95体积％的乙醇/水、70～90体积％的甲醇/水、或50-70 体积％的丙酮/水，其中所述石斛属植物为铁皮石斛或金钗石斛或鼓槌石斛；
(4)根据(1)-(3)中任一项所述的用途，其中所述芴酮类化合物中的一种或几种作为活性成分与药学上可接受的载体或辅料制备成糖尿病药物或药物组合物；
(5)根据权利要求(1)-(4)中任一项所述的用途，其特征在于，所述的糖尿病药物或药物组合物选自片剂、胶囊、丸剂、注射剂；
(6)根据权利要求(1)-(5)中任一项所述的用途，其特征在于，所述的糖尿病药物或药物组合物选自缓释制剂或控释制剂；
(7)根据权利要求(1)-(6)中任一项所述的用途，其中所述的药学上可接受的载体或辅料包括口服制剂辅料、胃肠外途径给药或外用给药的辅料，给药途径可以是口服、注射、外用局部给药等；给药剂型可以是液体剂型、固体剂型，液体剂型形式可以是糖浆剂、注射溶液、非水溶液、悬浮液或乳剂，固体剂型形式可以是片剂、锭剂、胶囊、滴丸、丸剂、粒剂、粉剂、霜剂、溶液剂、栓剂、可分散粉剂如冻干粉针剂、气雾剂等；所用辅料包括：乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸钠、淀粉、环糊精、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素钠、硫酸钙、水、乙醇、丙醇、甘油、丙二醇、异丙醇、糖浆、蜂蜜、葡萄糖、明胶浆、羧甲基纤维素钠、磷酸钾、干燥淀粉、琼脂粉、碳酸钙、碳酸氢钠、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油、季铵盐、滑石粉、三乙胺硬脂酸镁、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡。
(8)式I所示的芴酮类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的用途，
在式I中，R1，R2分别为-H或-OH或-OCH3。
(9)根据(8)所述的用途，其中所述芴酮类化合物为式II-式IV所示化合物中的一种或几种：
式II：
式III：
式IV：
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
有益效果
1、本发明中的式I化合物对α-葡萄糖苷酶展现出较好的抑制作用，提示其具有良好的抗糖尿病活性，可以作为糖尿病活性成分或先导化合物，有着很好的应用前景。
2.本发明中的式I化合物的制备方法中可采用的石斛属植物，特别是铁皮石斛、金钗石斛和鼓槌石斛在国内分布广泛，资源丰富，原料来源简单；而且本发明中的式I化合物在石斛属植物，尤其是铁皮石斛、金钗石斛和鼓槌石斛中含量较高，容易得到。
3.本发明中的式I化合物的制备方法中可采用常规柱层析制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的化合物纯度高，随后的工业化生产很容易实现。
附图说明
图1为本发明中所述的3种降血糖活性芴酮类化合物的活性追踪分离流程图；
图2为1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮对α-葡萄糖苷酶的抑制活性图。图中所示为至少3个重复样平均值和标准方差；
图3为2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮对α-葡萄糖苷酶的抑制活性图。图中所示为至少3个重复样平均值和标准方差；
图4为2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮对α-葡萄糖苷酶的抑制活性图。图中所示为至少3个重复样平均值和标准方差；
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明中的式I化合物是天然存在的化合物，也可以是人工合成的化合物。
本发明中所述的防治糖尿病成分包括由式I化合物中的一种或几种：
在式I中，R1，R2分别为-H或-OH或-OCH3；
本发明所述防治糖尿病成分也可以是用溶剂提取石斛属植物而得到的浸膏；其中溶剂为70～95体积％的乙醇/水、70～90体积％的甲醇/水、或50-70 体积％的丙酮/水。
本发明人发现石斛属植物(如铁皮石斛、金钗石斛或鼓槌石斛)的溶剂(如 95体积％的乙醇/水)提取物具有较好的镇痛活性，并在生物活性测试指导下对提取物进行化学成分研究，从中获得了抗糖尿病活性较好的一种芴酮类活性成分。
所述的芴酮类化合物主要来自石斛属植物，包括(但不限于)：1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮(1,4,7-trihydroxy-5-methoxy-9-fluorenone)、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮(dengibsin)、2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮(2,4,7-trihydroxy-5-methoxy-9-fluorenone)。
1,4,7-三羟基-5-甲基芴酮(1,4,7-trihydroxy-5-methoxy-9-fluorenone)的结构式为：
2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮(dengibsin)的结构式为：
2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮(2,4,7-trihydroxy-5-methoxy-9-fluorenone)的结构式为：
本发明所述的式I化合物对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用。优选的是，所述的式I化合物中的1,4,7-三羟基-5-甲基芴酮对α-葡萄糖苷酶有最强的抑制作用。所述的式I化合物在制备糖尿病药物或药物组合物中的应用，其特征在于，所述糖尿病药物或药物组合物为治疗糖尿病以及糖尿病引起的肾病、视网膜病变、白内障、脑动脉硬化、急性脑血管病、周围神经病变及心脏病。
本发明人采用目前国内外公认的α-葡萄糖苷酶抑制模型，对本发明所述的式I 化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测试，并计算了式I化合物对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度。计算结果表明1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)测定结果分别为13.3μg/ml，51.3μg/ml及23.9μg/ml。上述结果表明3种化合物均显示出较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮的抑制作用最强。
本发明还提供上述式I化合物的制备方法，该方法包括从石斛属植物(如铁皮石斛、金钗石斛或鼓槌石斛)中制备所述化合物。优选的是，从石斛属植物铁皮石斛、金钗石斛或鼓槌石斛的根、茎、叶、果实中制备1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮。优选的是，所述方法具有下述步骤：
(1)将新鲜的铁皮石斛鲜条清洗干净，晾干；
(2)将(1)中的铁皮石斛鲜条置于干燥箱中，在95-100℃下干燥3.0-3.5 小时，使其水分含量为20-25％，切成3.0-4.0厘米的短条；
(3)将(2)中的铁皮石斛短条用微波膨化破壁即得；所述微波膨化破壁的工艺条件为功率800-900瓦，膨化破壁时间为35-45秒，得膨化破壁制品；
(4)将膨化破壁制品粉碎后用溶剂提取，合并提取液；
(5)减压浓缩(4)中的提取液得浸膏；
(6)将(5)中的浸膏混悬于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物；
(7)将(6)中的乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析分离，用氯仿–甲醇(体积比30:1～0:1)梯度洗脱得到9个组分(Fr.1～9)。
(8)将(7)中的Fr.2经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)纯化，然后通过硅胶柱色谱，以石油醚–乙酸乙酯(体积比20:1～0:1)洗脱，得到组分 Fr.2-1～6。Fr2-2经硅胶柱色谱，以石油醚–乙酸乙酯(体积比15:1)洗脱，得到1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮；Fr.2-4经硅胶柱色谱，以石油醚–乙酸乙酯(体积比10:1)洗脱，得到2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮；将(7)中的Fr.3经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)纯化，再经硅胶柱色谱，用石油醚–乙酸乙酯(体积比 15:1～0:1)梯度洗脱得到Fr.3-1-4共4个组分。Fr.3-3通过硅胶柱色谱，以石油醚–乙酸乙酯(体积比4:1)洗脱，得到2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮。
在步骤(4)中，所述的溶剂可用体积百分比为70％～95％的乙醇/水、或 70％～90％的甲醇/水、或50％～90％的丙酮/水，溶剂用量为石斛6-10倍重量，回流提取时间为每次0.5小时，回流提取重复3次，合并滤液即得到石斛属药材提取物溶液。
本发明还提供所述的式I化合物在制备糖尿病药物中的应用：所述的式 I化合物作为活性成分与药学上可接受的载体或辅料制备成糖尿病药物或药物组合物。
本发明所述的糖尿病药物或药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可以为肠道、或非肠道，如口服、肌肉、鼻腔、口腔黏膜、皮肤、透皮、皮下、皮内、腹膜、直肠、静脉内、肌内等；
本发明所述的糖尿病药物或药物组合物的给药途径可以为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、穴位注射、鞘内注射和腹膜注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型的溶液性质可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。液体剂型形式可以是糖浆剂、注射溶液、非水溶液、悬浮液或乳剂；固体剂型例如片剂、锭剂、胶囊、滴丸、丸剂、粒剂、粉剂、霜剂、溶液剂、栓剂、可分散粉剂如冻干粉针剂、气雾剂等。
本发明所述的糖尿病药物或药物组合物可以制成普通制剂，也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
本发明所述的药学上可接受的载体或辅料包括口服制剂辅料、胃肠外途径给药或外用给药的辅料。所用辅料包括，赋形剂如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸钠；稀释剂与吸收剂如淀粉、环糊精、乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素钠、硫酸钙等；湿润剂与粘合剂如水、乙醇、丙醇、甘油、丙二醇、异丙醇、糖浆、蜂蜜、葡萄糖、明胶浆、羧甲基纤维素钠、磷酸钾等；崩解剂如干燥淀粉、琼脂粉、碳酸钙、碳酸氢钠、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素等；崩解抑制剂如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂如滑石粉、三乙胺硬脂酸镁、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡等。还可以将片剂进一步制备成包衣片，如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片，以延迟其在胃肠道中的崩解和吸收，并由此提供在较长时间内的持续作用。
为了更好的理解本发明，以下通过具体实施例进一步解释或说明本发明内容，但这些例子不应被理解为对本发明保护范围的限制。
具体实施例
通过以下给出的具体实施例和典型应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但这并非是对本发明保护范围的限制。
实施例1
铁皮石斛提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
材料来源：所属石斛属植物铁皮石斛、金钗石斛及鼓槌石斛，采于云南弥勒，经云南民族大学民族医药学院杨青松副教授依次鉴定为Dendrobium officinale Kimura etMigo、D.nobile Lindl.及D.chrysotoxum Lindl.。标本保存于云南民族大学民族医药学院标本馆。
铁皮石斛提取物的制备：将新鲜的铁皮石斛鲜条清洗干净，晾干；将铁皮石斛鲜条置于干燥箱中，在95℃下干燥3.0小时，使其水分含量为20-25％，切成 3.5厘米的短条；将铁皮石斛短条在功率850瓦和膨化破壁时间40秒条件下，用微波膨化破壁即得膨化破壁制品；将膨化破壁制品粉碎，得铁皮石斛碎块；然后将铁皮石斛的碎块用95体积％乙醇/水回流提取3次，每次0.5小时得提取液；将铁皮石斛提取液分别过滤并用旋转蒸发仪减压浓缩成浸膏备用。
采用α-葡萄糖苷酶抑制实验模型(可参见科技文献：Fu S.L.,Zhi L.Z.,Fu L,etal.Polyflavanostilbene A,a new flavanol fused stilbene glycoside fromPolygonum cuspidatum.2013,Vol.15,No.3,674–677)测试了铁皮石斛提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。以96微孔板为反应载体，最终反应体积160μL，其中包括0.25U/mlα-葡萄糖苷酶溶液20μL，1mg/ml还原型谷胱甘肽10μL， 1.25mmol/L底物PNPG(4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)溶液20μL，待测样品 10μL，磷酸钾缓冲液(PBS，pH 6.8)50μL，反应终止液碳酸钠50μL(0.4mmol/L)。同时设定对照：样品管(酶+样品+底物)，样品空白管(样品+PBS),酶空白管(酶 +PBS)，酶活性对照(PBS+酶+底物)，加缓冲液补足总体积。以阿卡波糖为阳性对照。混合均匀，37℃恒温反应5min后，各管加入底物20ul，接着在37℃下继续恒温反应15min，再加入0.4mmol/L碳酸钠溶液50μL终止反应，于波长为405nm 处测定吸光度(A)。
样品对酶活性的抑制率(％)按下式计算：
抑制率(％)＝1-(A样品-A样品空白)/(A酶-A空白)×100％
根据不同浓度样品对应不同的抑制率，计算各样品对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)。
结果表明上述浓度下，铁皮石斛提取物对α-葡萄糖苷酶有显著的抑制作用。结果见表1。
表1.铁皮石斛提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用(IC50)。
n＝3
实施例2
用铁皮石斛进一步试验
分别用体积百分比为95％的甲醇/水、70％的乙醇/水和70％的丙酮/水作提取溶剂，重复实施例1。结果见表3。实验结果表明用95％的甲醇/水、70％的乙醇/水和70％的丙酮/水作提取溶剂分别所获得的铁皮石斛95％甲醇提取物、铁皮石斛70％乙醇提取物以及70％丙酮/水的提取物同样对α-葡萄糖苷酶有显著的抑制作用，因此用不同浓度的乙醇/水、甲醇/水或丙酮/水作提取溶剂同样可以获得铁皮石斛中的对α-葡萄糖苷酶有抑制作用的成分。结果见表 2。
表2.铁皮石斛不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用(IC50)。
n＝3
实施例3
从铁皮石斛茎中分离鉴定抗糖尿病活性化合物
(1)将新鲜的铁皮石斛鲜条清洗干净，晾干；
(2)将步骤(1)中的铁皮石斛鲜条置于干燥箱中，在95℃下干燥3.0小时，使其水分含量为20-25％，切成3.5厘米的短条；
(3)将步骤(2)中的铁皮石斛短条在功率850瓦和膨化破壁时间40秒条件下，用微波膨化破壁即得膨化破壁制品；
(4)将步骤(3)中的5Kg铁皮石斛膨化破壁制品粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得铁皮石斛粉，将铁皮石斛粉在70～74℃的温度下每次用30Kg 95％浓度的乙醇回流提取3次，每次0.5小时，合并乙醇提取液，备用；
(5)将步骤(4)制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏563g，备用；
(6)将(5)中的563g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚萃取物(114g)、乙酸乙酯萃取物(127 g)以及正丁醇萃取物(234g)；
(7)将(6)中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比 30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.9 共9个组分，Fr.1为8.8g，Fr.2为9.5g，Fr.3为14.2g，Fr.4为13.6g，Fr.5为 15.1g，Fr.6为17.7g，Fr.7为8.7g，Fr.8为5.4g，Fr.9为20.2g。取Fr.2(9.5g) 经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)纯化后，再经200-300目硅胶柱色谱，用体积比20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、0:1的石油醚–乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.2-1-6 共6个组分，Fr.2-1为2.2g，Fr.2-2为2.3g，Fr.2-3为2.0g，Fr.2-4为0.7g， Fr.2-5为0.6g，Fr.2-6为1.1g。Fr.2-2(2.3g)经200-300目硅胶柱色谱，以石油醚–乙酸乙酯(体积比15:1)洗脱，得到1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮 (16mg)。Fr.2-4经硅胶柱色谱，以石油醚–乙酸乙酯(体积比10:1)洗脱，得到2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮(13mg)；将Fr.3(14.2g)经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇)纯化，再经硅胶柱色谱，用体积比15:1、10:1、5:1、0:1的石油醚–乙酸乙酯梯度洗脱得到Fr.3-1-4共4个组分，Fr.3-1为2.7g，Fr.3-2为1.8g，Fr.3-3为3.3g，Fr.3-4为2.9g。Fr.3-3通过200-300目硅胶柱色谱，以石油醚–乙酸乙酯(体积比4:1)洗脱，得到2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮(17mg)。铁皮石斛茎中α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的分离鉴定流程见图1。
本发明的化合物的化学结构用核磁共振谱(1H NMR,13C NMR,DEPT)及 ESI-MS(阳离子模式)等波谱图鉴定。根据分析化合物1～3的波谱数据，并参考相关文献(杨薇薇,辛浩.金钗石斛化学成分研究.分析测试技术与仪器,2006,12(2):98-100；Fan CQ,Wang W,Wang YP,Qin GW,Zhao WM. Chemical constituent from Dendrobiumdensiflorum.Phytochemistry, 2001,57(8):1255-1258；Ye QH,Zhao WM,Qin GW.Newfluorenone and phenanthrene derivatives from dendrobium chrysanthum.Nat ProdRes,2003,17(3): 201-205.)，分别鉴定为1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮(1,4,7-trihydroxy-5-methoxy-9 -fluorenone)、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮(dengibsin)、2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮 (2,4,7-trihydroxy-5-methoxy-9-fluorenone)。
化合物1的理化数据：化合物(1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮)为红色无定型粉末(甲醇)，ESI-MS m/z:259[M+H]+，分子式C14H10O5。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δH:6.83(1H,d,J＝8.8Hz,H-3),6.68(1H,d,J＝2.0Hz,H-6),6.64 (1H,d,J＝2.0Hz,H-8),6.58(1H d,J＝8.8Hz,H-2),4.02(3H,s,5-OMe)；13C NMR data(100MHz,DMSO-d6):190.4(C-9),159.6(C-7),152.2(C-5),150.7 (C-1),142.7(C-4),136.3(C-8a),127.3(C-3),124.6(C-4a),119.4(C-4b),119.2 (C-2),116.7(C-9a),104.5(C-6),104.1(C-8),56.8(5-OMe).
化合物2的理化数据：化合物(2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮)为红色无定型粉末(甲醇)，ESI-MS m/z:243[M+H]+，分子式C14H10O4。1H NMR(400MHz, CD3COCD3)δH:9.10(1H,2-OH),8.89(1H,5-OH),7.09(2H,m,7,8-H),6.93 (1H,dd,J＝1.6,7.6Hz,H-6),6.80(1H,d,J＝2.0Hz,H-1),6.77(1H,d,J＝2.0Hz, H-3),4.10(3H,s,4-OMe).
化合物3的理化数据：化合物(2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮)为红色无定型粉末(甲醇)，ESI-MS m/z:259[M+H]+，分子式C14H10O5。1H NMR(400MHz, CD3COCD3)δH:6.62(1H,d,J＝2.0Hz,H-1),6.36(1H,d,J＝2.0Hz,H-3),6.69 (1H,d,J＝2.0Hz,H-6),6.73(1H,d,J＝2.0Hz,H-8),4.16(3H,s,5-OMe).13C NMR data(100MHz,CD3COCD3):104.6(C-1),158.2(C-2),109.0(C-3),151.4 (C-4),118.8(C-4a),122.4(C-4b),151.8(C-5),105.4(C-6),159.0(C-7),105.3 (C-8),136.0(C-8a),206.3(C-9),136.1(C-9a),56.6(5-OMe).
实施例4
所述式I化合物的降血糖活性检测
采用α-葡萄糖苷酶抑制实验模型(可参见科技文献：Fu S.L.,Zhi L.Z.,Fu L,etal.Polyflavanostilbene A,a new flavanol fused stilbene glycoside fromPolygonum cuspidatum.2013,Vol.15,No.3,674–677)测试了1,4,7-三羟基-5- 甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。以96微孔板为反应载体，最终反应体积160μL，其中包括0.25U/ml α-葡萄糖苷酶溶液20μL，1mg/ml还原型谷胱甘肽10μL，1.25mmol/L底物PNPG (4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)溶液20μL，待测样品10μL，磷酸钾缓冲液(PBS， pH 6.8)50μL，反应终止液碳酸钠50μL(0.4mmol/L)。同时设定对照：样品管(酶 +样品+底物)，样品空白管(样品+PBS),酶空白管(酶+PBS)，酶活性对照(PBS+ 酶+底物)，加缓冲液补足总体积。以阿卡波糖为阳性对照。混合均匀，37℃恒温反应5min后，各管加入底物20ul，接着在37℃下继续恒温反应15min，再加入 0.4mmol/L碳酸钠溶液50μL终止反应，于波长为405nm处测定吸光度(A)。
样品对酶活性的抑制率(％)按下式计算：
抑制率(％)＝1-(A样品-A样品空白)/(A酶-A空白)×100％
计算半数抑制浓度(IC50)，阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)测定结果为113.9μg/ml，1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)测定结果分别为13.3μg/ml，51.3μg/ml及23.9μg/ml，表明本发明的化合物对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用。
实施例5
按实施例3所述方法，制备获得的1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮，分别加入片剂常用辅料，按常规制备工艺制备成片剂。
也可将按实施例3所述方法制备获得的1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮按任意比例混合加入片剂常用辅料，按常规制备工艺制备成片剂。
实施例6
按实施例3所述方法，制备获得的1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮，分别加入注射剂常用辅料，按常规制备工艺制备成注射剂。
也可将按实施例3所述方法制备获得的1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮按任意比例混合加入注射剂常用辅料，按常规制备工艺制备成注射剂。
实施例7
按实施例3所述方法，制备获得的1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮，分别加入胶囊剂常用辅料，按常规制备工艺制备成胶囊剂。
也可将按实施例3所述方法制备获得的1,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮、2,5-二羟基-4-甲氧基芴酮及2,4,7-三羟基-5-甲氧基芴酮按任意比例混合加入胶囊剂常用辅料，按常规制备工艺制备成胶囊剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.式I所示的芴酮类化合物在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗糖尿病以及糖尿病引起的肾病、视网膜病变、白内障、脑动脉硬化、急性脑血管病、周围神经病变及心脏病：
在式I中，R1，R2分别为-H或-OH或-OCH3。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述芴酮类化合物为式II-式IV所示化合物中的一种或几种：
式II：
式III：
式IV：
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的式II-式IV所示化合物中的一种或几种存在于用溶剂提取石斛属植物而得到的浸膏中并以该浸膏的形式使用；其中所述溶剂为70～95体积％的乙醇/水、70～90体积％的甲醇/水、或50-70体积％的丙酮/水，其中所述石斛属植物为铁皮石斛或金钗石斛或鼓槌石斛。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述芴酮类化合物中的一种或几种作为活性成分与药学上可接受的载体或辅料制备成糖尿病药物或药物组合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其特征在于，所述的糖尿病药物或药物组合物选自片剂、胶囊、丸剂、注射剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其特征在于，所述的糖尿病药物或药物组合物选自缓释制剂或控释制剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述的药学上可接受的载体或辅料包括口服制剂辅料、胃肠外途径给药或外用给药的辅料，给药途径可以是口服、注射、外用局部给药等；给药剂型可以是液体剂型、固体剂型，液体剂型形式可以是糖浆剂、注射溶液、非水溶液、悬浮液或乳剂，固体剂型形式可以是片剂、锭剂、胶囊、滴丸、丸剂、粒剂、粉剂、霜剂、溶液剂、栓剂、可分散粉剂如冻干粉针剂、气雾剂等；所用辅料包括：乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸钠、淀粉、环糊精、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素钠、硫酸钙、水、乙醇、丙醇、甘油、丙二醇、异丙醇、糖浆、蜂蜜、葡萄糖、明胶浆、羧甲基纤维素钠、磷酸钾、干燥淀粉、琼脂粉、碳酸钙、碳酸氢钠、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油、季铵盐、滑石粉、三乙胺硬脂酸镁、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡。
8.式I所示的芴酮类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的用途，其特征在于，
在式I中，R1，R2分别为-H或-OH或-OCH3。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述芴酮类化合物为式II-式IV所示化合物中的一种或几种：
式II：
式III：
式IV：
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