CN112076248A - 紫苏叶提取物在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以紫苏叶提取物在制备治疗和/或预防哮喘药物中的应用。本发明所述的紫苏叶提取物对哮喘模型小鼠肺部炎症病理损伤有逆转作用；可显著抑制模型小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞因子TNF‑α、IL‑1β等的生成；显著抑制模型小鼠肺泡灌洗液中白细胞总数、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的募集；显著改善模型小鼠哮喘作用。

Description

紫苏叶提取物在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种紫苏叶提取物，其制备方法，及其在制备用于预防和/或治疗哮喘疾病药物或食物中的应用，属于医药或食品技术领域。

背景技术

支气管哮喘是当今世界最常见慢性呼吸系统疾患之一，调查显示，全球约有3亿的哮喘患者，我国就占有3000万左右，发病率高达1-4％，已严重危害国民的身体健康。哮喘的发病机制复杂，气道炎症、变态反应、气道高反应性以及气道重塑等多元机制共同参与其病理进程，而气道炎症是哮喘等呼吸道疾病的病症基础，是哮喘症状反复发生的根本原因，对哮喘的发生、发展与转归起着重要的决定性作用。因此，控制气道炎症是有效治疗哮喘的必要手段，是哮喘临床防治的原则之一。然而，迄今为止，仍没有理想的药物用于气道炎症的治疗。研究发现，皮质激素吸入用于气道炎症治疗存在一定抗药性，而且，皮质激素长期使用存在较多的问题，显著增加感染性肺炎、儿童生长迟滞等不良反应的发生风险。此外，非甾体类抗炎药因其本身存在诱发严重哮喘、增强支气管对组胺、LTD4等刺激的支气管收缩等不良反应而不适用于哮喘的临床治疗。因此，探寻更为安全有效的新药用于哮喘气道炎症治疗已成为国内外抗炎免疫类药物研究的热点。

近年来，中草药抗炎作用研究取得了很大的进展，中药治疗哮喘的研究报道很多，中医认为“痰阻气道、肺失宣降、风盛痰阻、气道挛急”是哮喘的主要发病机制，中药清热解毒、祛风除湿等功效与现代医学的抗炎免疫密切相关。紫苏(Perilla frutescens L.)是唇形科紫苏属一年生草本植物，其叶为临床常用中药，味辛，性温，具有解表散行气和胃等功效，用于风寒感冒，咳嗽呕恶，妊娠呕吐，鱼蟹中毒等治疗。紫苏叶含有的挥发油、黄酮、酚酸等活性成分，具有良好的抗炎、抗氧化、抗过敏、止血、降血脂等药理活性。目前尚未见关于紫苏叶提取物及其治疗哮喘气道炎症的相关研究报道，为有效阐释传统中药治疗哮喘的作用，并为寻找活性更好的抗哮喘中药提供理论依据和实践经验，我们制备了紫苏叶提取物，并对其抗哮喘气道炎症的活性进行了评价。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明解决的技术问题是提供一种紫苏叶提取物在制备抗哮喘疾病药物中的应用。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明技术方案提供了一种紫苏叶提取物在制备抗哮喘疾病药物中的应用，其特征在于，所述紫苏叶提取物制备方法为如下步骤：

1)以紫苏叶药材为原料，水或C₁～C₅低级醇水溶液为溶剂进行提取，回收含水低级醇溶剂，回收后的溶液浓缩，制得浸膏；

2)将浸膏加水分散，加入低极性有机溶剂萃取，剩余水溶液浓缩得到得浸膏；

3)所得浸膏以C₁～C₅低级醇水溶液醇沉，过滤，滤液回收含水低级醇溶剂，干燥、粉碎得到紫苏叶提取物。

在上述制备方法的步骤1)中，

提取溶剂为水或C₁～C₅低级醇水溶液，优选C₁～C₃低级醇水溶液，进一步优选为乙醇水溶液；

C₁～C₅低级醇水溶液的低级醇浓度为0-95％(体积/体积)，优选为50-80％(体积/体积)，进一步优选为65％-75％(体积/体积)；

提取方法为浸渍、渗漉、煎煮或加热回流，优选煎煮或加热回流；

提取次数为1-5次，优选2-3次；

浓缩为常压浓缩或减压浓缩，优选减压浓缩。

在上述制备方法的步骤2)中，

萃取所用低极性有机溶剂为环己烷、石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异戊醇或它们的混合溶剂，优选乙酸乙酯或正丁醇溶剂，进一步优选为正丁醇溶剂；

萃取次数为1-5次，优选2-3次。

浓缩为常压浓缩或减压浓缩，优选减压浓缩。

在上述制备方法的步骤3)中，

醇沉所用C₁～C₅低级醇水溶液优选C₂～C₃低级醇水溶液，进一步优选为乙醇水溶液；

C₁～C₅低级醇浓度为50-90％(体积/体积)，优选为60-85％(体积/体积)，进一步优选为 75％-85％(体积/体积)；

醇沉时间为8-72h,优选为12-24h；

干燥方法为常压干燥、真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥，优选真空干燥、冷冻干燥。

对OVA诱导小鼠过敏性哮喘，紫苏叶提取物在剂量50、100mg/kg下灌胃给药，对小鼠 BALF中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的生成有抑制作用；对BALF中白细胞总数、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的募集有抑制作用；对小鼠肺部炎症病理变化有逆转作用。

本发明技术方案的第二方面是提供了一种药物组合物在制备抗哮喘疾病药物中的应用，所述的药物组合物含有第一方面所述紫苏叶提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂。其中紫苏叶提取物的制备方法如本发明第一方面所述。

用于此目的时，如果需要，可将活性成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当施用形式或剂量形式。

本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明的组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化纳、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘泊、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素纳、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢纳与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸纳等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酶、明胶、半合成甘油酶等。

为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明的组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3 一丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酶等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明药用组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数等，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明药用组合物中最后的制剂中所含有的实际有效药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的治疗哮喘疾病的目的。通常对体重约75公斤患者，所给提取物的日剂量为0.001mg/kg体重～500mg/kg体重，优选3mg/kg体重～30mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及给药方案。

本发明的优点在于：(1)本发明属于中药制剂，成分纯天然，毒副作用低；(2)本发明能有效防治哮喘；(3)本品制备工艺简单，易于规范化生产。

附图说明

图1紫苏叶提取物对哮喘小鼠肺组织病理学改变的影响；

具体实施方式

以下实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：紫苏叶提取物的制备

取干燥的紫苏叶1.5kg，加入70％乙醇5升，加热回流1.5小时，趁热过滤。滤渣以同样的方法再处理一次；合并两次所得滤液，减压回收乙醇，得浸膏65g。该浸膏加入300mL水搅拌制成混悬液，分别以150mL乙酸乙酯萃取2次。剩余水部分加入1580mL95％乙醇溶解，室温沉淀24h，减压抽滤，滤液减压回收乙醇，冷冻干燥、粉碎得紫苏叶提取物。

实施例2：剂型制备

胶囊：紫苏叶提取物100g，加入糊精147.5g，硬脂酸镁2.5g，充分拌均匀后，按胶囊制备法制成1000粒，填装于250mg胶囊，每粒含紫苏叶提取物100mg，其总量不低于50％。

片剂：取紫苏叶提取物100g，加入淀粉100g，糊精80g，蔗糖15g，充分搅拌混匀，制成颗粒，在60℃以下干燥，加入适量硬脂酸镁、滑石粉，混匀，压制成1000片，包糖衣或薄膜衣，即得。

颗粒剂：取紫苏叶提取物100g，加入适量蔗糖和糊精，按颗粒剂制法制成颗粒，干燥，制成1000g。

口服液：取紫苏叶药材，70％乙醇加热回流1.5小时提取2次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇；浸膏加入等量水搅拌制成混悬液，乙酸乙酯萃取2次；水部分加入95％乙醇适量溶解，室温沉淀24h，减压抽滤，滤液以40％氢氧化钠调节PH值至7.0，搅匀，4-8℃冷藏48小时，滤过，滤液加入蔗糖300g，搅匀使溶解，再加入适量香精并调节PH值至7.0，加水制成1000ml，搅匀，静置12小时，滤过，灌装，灭菌，即得。

药理实验

实验例1：紫苏叶提取物对OVA诱导小鼠过敏性哮喘的抑制作用

方法：SPF级雄性BALB/c小鼠，18-20g，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组 (地塞米松，0.5mg/kg，灌胃给药)、药物处理组(紫苏叶提取物50，100mg/kg，灌胃给药)，每组20只。各组动物于实验第1天腹腔注射OVA溶液100μL(20μg)与氢氧化铝凝胶100μL的混合液，空白对照组给予等体积的生理盐水；并分别于首次致敏后第7、14天，腹腔注射致敏相同剂量的OVA及氢氧化铝凝胶进行免疫加强。动物于第14天加强后，灌胃给药，每天1次，连续14天。除空白对照组给予等体积溶媒外，各组动物于首次致敏后第26天，小鼠麻醉，气管滴注1.60mg/ml的OVA溶液50μL(80μg)进行攻击，每天1次，连续3天。末次攻击24h后，小鼠以苯巴比妥钠麻醉，用0.7mL预冷的生理盐水灌流，冲洗3次，吸出支气管肺泡灌洗液(BALF)，离心，上清用于分析TNF-α及IL-1β的含量；PBS缓冲液重悬细胞，进行白细胞分类计数；取肺组织进行组织病理学检查。

结果：

(1)紫苏叶提取物改善OVA诱导过敏性哮喘小鼠肺组织炎性病理的损伤

病理染色结果见图1，病理评分见表1。与空白对照组比较，模型组小鼠在支气管周围和血管周围可见明显的炎症细胞浸润(主要为嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞)，支气管上皮细胞脱落，呈绒毛状增生、杯状细胞化生、粘性分泌物增加，局部肺泡间隔中度增宽、肺泡腔缩小、肺泡腔内可见纤维蛋白渗出。

结果：紫苏叶提取物在剂量50,100mg/kg下灌胃给药，可显著减轻支气管和血管周围炎性细胞浸润、上皮细胞增生，对OVA诱导过敏性哮喘小鼠有显著的治疗作用。

表1紫苏叶提取物对哮喘小鼠肺组织病理炎性损伤评分结果(Mean±Std,n＝4)

备注：与空白对照组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

(2)紫苏叶提取物对哮喘小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞募集的抑制作用

①紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中白细胞总数的影响

哮喘患者的气道有中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等浸润。在哮喘中，白细胞在气道聚集，合成、分泌多种细胞因子，细胞因子主导了炎症反应，在哮喘进程中发挥重要作用。本实验目的在于考察紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中总炎性细胞募集的影响，结果见表2。

结果：紫苏叶提取物在剂量50，100mg/kg下对哮喘模型小鼠灌胃给药，可减少模型小鼠 BALF中白细胞的募集。

表2紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中白细胞总数的影响(Mean±Std n＝10)

备注：与空白对照组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

②紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中淋巴细胞分类计数的影响

过敏性疾病本质上是由淋巴细胞的两个亚群(Th1和Th2)平衡异常，Th2细胞优势分化和 Th2细胞因子过度表达而引起。CD4+T淋巴细胞亚群——调节性T细胞(Treg)在维护机体免疫平衡中也发挥了重要作用，它通过分泌IL-10和TGF-β等细胞因子，抑制巨噬细胞和炎症细胞因子的产生，介导机体对过敏原产生耐受，抑制Th2型免疫反应，减轻哮喘气道炎症，最终起到抑制哮喘发展的作用。Th17淋巴细胞及其分泌的炎症介质可促进中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及炎性介质在哮喘小鼠气道内的聚集，加重气道炎症，与哮喘气道重塑密切相关。本实验目的在于考察紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中淋巴细胞募集的影响，结果见表3。

结果：紫苏叶提取物在剂量50，100mg/kg下对过敏性哮喘模型小鼠灌胃给药，可降低小鼠BALF中淋巴细胞募集。

表3紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中淋巴细胞分类计数的影响(Mean±Std,n＝10)

备注：与空白对照组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

③紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞分类计数的影响

嗜酸性粒细胞的聚集和激活在哮喘的呼吸道炎症中起关键性的作用，其胞浆中含有多种特殊的蛋白质颗粒，主要有嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)、主碱蛋白(MBP)、嗜酸细胞过氧化物酶(EPO)，所有这些蛋白质均有强大的细胞毒性，哮喘的许多病理生理改变是由于嗜酸性粒细胞释放的这些蛋白质所致。嗜酸性粒细胞脱颗粒和释放活性炎症介质，引起支气管痉挛、血管充血和渗透性增强、组织炎症，导致哮喘反应。本实验目的在于考察紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞募集的影响，结果见表4。

结果：紫苏叶提取物在剂量50，100mg/kg下对过敏性哮喘模型小鼠灌胃给药，可降低小鼠BALF中嗜酸性粒细胞募集。

表4紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞分类计数的影响(Mean±Std,n＝10)

备注：与空白对照组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

(3)紫苏叶提取物对哮喘小鼠肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子生成的抑制作用

①紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中TNF-α生成的影响

TNF-α在哮喘发生发展过程中具有广泛的病理生理作用。TNF-α升高可活化血管内皮细胞，增加血管通透性，诱导内皮细胞间粘附分子的表达，使炎症细胞粘附于血管内皮细胞，由血循环渗入气道粘膜组织，导致炎症反应。活化的炎症细胞释放炎性介质，进一步趋化嗜酸细胞释放炎性介质，引起气道上皮细胞脱落，促进气道上皮损伤和气道高反应形成，进而出现气道痉挛、血管通透性增加、气道粘膜水肿等，诱发或加重哮喘。本实验目的在于考察紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中TNF-α生成的影响，结果见表5。

结果：紫苏叶提取物在剂量50，100mg/kg下对过敏性哮喘模型小鼠灌胃给药，可降低小鼠BALF中TNF-α的生成。

表5紫苏提取物对哮喘小鼠BALF中TNF-α生成的影响(Mean±Std n＝10)

备注：与空白对照组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01

②紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中IL-1β生成的影响

IL-1β为内皮细胞活化因子，具有明显的促炎作用。IL-1β能诱导气道嗜酸性细胞浸润、气道高反应性和杯状细胞增生，刺激气道内皮细胞释放成纤维细胞生长因子，导致成纤维细胞增殖与胶原的合成，从而参与气道重塑。IL-1β促使肺泡间的弹力纤维断裂，增加胸膜厚度以及粘液的产生，并能导致气道壁纤维化，从而在哮喘病理生理过程中的气道重塑中发挥作用。本实验目的在于考察紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中IL-1β生成的影响，结果见表6。

结果：紫苏叶提取物在剂量50，100mg/kg下对过敏性哮喘模型小鼠灌胃给药，可降低小鼠BALF中IL-1β的生成。

表6紫苏叶提取物对哮喘小鼠BALF中IL-1β生成的影响(Mean±Std,n＝10)

备注：与空白对照组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01。

Claims (5)

1.一种紫苏叶提取物制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用，其特征在于，所述紫苏叶提取物制备方法为如下步骤：

1)以紫苏叶为原料，水或C₁～C₅低级醇水溶液为溶剂进行提取，回收含水低级醇溶剂，回收后的溶液浓缩，制得浸膏；

2)将步骤1)得到的浸膏加水分散，加入低极性有机溶剂萃取，剩余水溶液浓缩得到浸膏；

3)将步骤2)得到的浸膏以C₁～C₅低级醇水溶液醇沉，过滤，回收含水低级醇溶剂，回收后的溶液浓缩，干燥、粉碎得到紫苏叶提取物。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述步骤1)中提取方法为浸渍、渗漉、煎煮或加热回流。

3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述步骤1)中C₁～C₅低级醇水溶液的低级醇浓度为0-95％。

4.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述步骤2)中，萃取所用低极性有机溶剂为环己烷、石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异戊醇或它们的混合溶剂；萃取次数为1-5次。

5.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述步骤3)中C₁～C₅低级醇水溶液的低级醇浓度为50-90％。

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