CN107216405A - 一种青稞β‑葡聚糖的制备工艺及其结构序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青稞β‑葡聚糖的制备工艺及其结构序列。青稞β‑葡聚糖制备方法为青稞粉碎、灭酶、除淀粉、除蛋白、制备粗多糖、除色素、除小分子和干燥制备精致β‑葡聚糖等步骤。本发明从青稞中分离出一种新的青稞β‑葡聚糖,采用离子色谱同时结合安培脉冲检测器和在线高分辨质谱(HPAEC‑PAD/QTOF‑MS)为主的多种方法对该种β‑葡聚糖进行结构和序列分析,并通过体内试验,验证了通过该法制备所得具有明确结构和序列的青稞β‑葡聚糖的降血糖降血脂活性,为开发治疗高血脂和糖尿病的新药打下基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种青稞β-葡聚糖的制备工艺及其结构序列。
背景技术
青稞,大麦属,是青藏高原地区人民的主食之一,也是家畜饲料和工业原料作物。据监测,青稞中β-葡聚糖的含量是所有谷物中含量最高的农作物。谷物中的β-葡聚糖是由吡喃型葡萄糖通过β-(1→3) 或者 β-(1→4)糖苷键连接而成的线型多糖。近年来,青稞β-葡聚糖在食品科学领域受到很大关注,β-葡聚糖的许多重要的生理学功能和生理活性逐渐被人认知,据报道,青稞β-葡聚糖可以作为固有免疫和获得性免疫的调节剂,具有良好的降血糖降血脂功能,并在抗氧化、抗肿瘤等方面也显示出良好的应用前景。由于行业中对青稞β-葡聚糖的结构、活性研究较为有限,因而其在行业中的应用也较为低端,多数将青稞打粉后制作面食、面饼等普通食品,未能充分发挥其降糖降血脂等作用。虽然目前已经发现β-葡聚糖具有显著的降血脂和降血糖作用,但由于其序列结构复杂,绝大多数降血脂降血糖活性片段及其作用机理未能明确,阻碍了它们被开发成防治高血脂和糖尿病新药的进程。
目前,也有一些关于谷物中β-葡聚糖的制备方法的专利或者文献的公开,但是大多数方法一般是仅对其中β-葡聚糖进行粗提,得到样品纯度较低,色泽较差或者制备过程需借助色谱,如离子交换(DEAE等)或者分子筛(Sephadex-G200等)对样品进行纯化,过程较为复杂,不适宜大批量制备进而工业化。
发明内容
本发明目的是提供一种青稞β-葡聚糖的制备工艺和青稞β-葡聚糖的结构序列,解决难以提取纯度较高的青稞β-葡聚糖、青稞β-葡聚糖序列复杂、其药用性能不明确等的问题。
本发明的技术方案是:
提供一种青稞β-葡聚糖的制备工艺,该方法包括如下步骤:
(1)青稞粉碎:将青稞磨成粉后,过40-80目筛,制得青稞粉;
(2)灭酶:在所述青稞粉中加入高浓度乙醇,加热回流;
(3)提取并除淀粉:在经步骤(2)加工后所得的青稞粉中加入水,调整pH值至7-11,然后加入高温淀粉酶,混合均匀后于85-90℃条件下搅拌回流1-10h;
(4)除蛋白:调整步骤(3)所得的溶液的pH值至2-4.5,静置后蛋白沉淀析出,离心去除沉淀,制得提取液;
(5)制备粗多糖:对所述提取液浓缩1-5倍后加入硫酸铵,静置后粗多糖沉淀析出,离心后收集沉淀,得青稞β-葡聚糖粗品;
(6)除小分子:将所述青稞β-葡聚糖粗品加水复溶,然后去除小分子杂质,制得青稞β-葡聚糖溶液;
(7)干燥:将所述青稞β-葡聚糖溶液进行干燥,得到精制的青稞β-葡聚糖。
进一步的,步骤(2)中所述料液比为1g:1mL-1g:20mL,所述乙醇的浓度>80%,所述加热回流时间为1-5小时。
进一步的,步骤(3)中所述青稞粉与水的料水比为1g:5mL-1g:50mL,所述pH值采用20%的Na2CO3调整,所述高温淀粉酶与所述青稞粉的比为10U:1g至1000U:1g。
进一步的,步骤(5)中所述硫酸铵与浓缩后的提取液的料液比为1g:2mL-1g:8mL。
进一步的,步骤(6)中所述去除小分子杂质采用超滤膜过滤的方式,所述超滤膜为有机或者无机膜,所述超滤膜截留分子量为1000–5000Da。
进一步的,步骤(7)中所述干燥的方式为喷雾、带式、烘箱或冷冻中的任意一种。
本发明的另一技术方案是:
提供一种上述工艺所制备的青稞β-葡聚糖,所述青稞β-葡聚糖的结构中含有重复单元Glc1→3Glc1→4Glc/Glc1→3Glc1→4Glc1→4Glc。
进一步的,所述青稞β-葡聚糖的结构中具有β-(1→3)和β-(1→4)两种连接方式的直链葡聚糖。
进一步的,所述青稞β-葡聚糖的结构中dp3n、dp3n+1和dp3n+2组成一个周期循环,其中,所述dp3n具有两种序列连接,分别为[Glc1→4Glc1→4Glc]n 和 [Glc1→3Glc1→4Glc]n;所述dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖,其表述为[Glc1→3Glc1→4Glc]n→4Glc;所述dp3n+2是每一个周期中含量较少的寡糖,其为均一的β-(1→4)连接葡萄糖片段。
进一步的,所述青稞β-葡聚糖中β-(1→3) 与β-(1→4)糖苷键的比值为1:2 至 1:5。
本发明所述青稞β-葡聚糖的具体优点如下:
(1)该青稞β-葡聚糖的制备工艺简单,适合大规模生产;
(2)利用本发明所述的工艺制备的青稞β-葡聚糖纯度高;
(3)该青稞β-葡聚糖结构明确;
(4)该青稞β-葡聚糖具有良好的降血糖降血脂功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中,
图1为本发明中所述的一种青稞β-葡聚糖的制备工艺所制备的青稞β-葡聚糖的核磁共振谱图;
图2为本发明中β-葡聚糖单糖组成以及各标准品对比图;
图3为本发明中β-葡聚糖部分酶解产物中寡糖的分离分析图;
图4是本发明中6h、12h以及24h酶解产物中寡糖PAD色谱图及其对应的提取离子流色谱图(EIC);
图5是本发明中dp2-dp4的二级质谱图;
图6是本发明中dp5-dp7的二级质谱图;
表1是本发明中青稞β-葡聚糖的13C NMR峰位归属;
表2是本发明中青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠血浆中血脂的影响(n=10);
表3是本发明中青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠肝脂以及肝重系数的影响(n=10);
表4是本发明中青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠肝组织MDA含量,SOD和GSH-px活性的影响(n=10);
表5是本发明中青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠空腹血糖的影响(n=10);
表6是本发明中青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠口服葡萄糖耐量的影响(n=10);
表7是本发明中青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠糖原的影响(n=10)。
具体实施方式
本发明提供一种青稞β-葡聚糖的制备工艺,包括以下步骤:
(1)青稞粉碎:将青稞磨成粉后,过40-80目筛,制得青稞粉;
(2)灭酶:在所述青稞粉中加入高浓度乙醇,加热回流;
(3)提取并除淀粉:在经步骤(2)加工后所得的青稞粉中加入水,调整pH值至7-11,然后加入高温淀粉酶,混合均匀后于85-90℃条件下搅拌回流1-10h;
(4)除蛋白:调整步骤(3)所得的溶液的pH值至2-4.5,静置后蛋白沉淀析出,离心去除沉淀,制得提取液;
(5)制备粗多糖:对所述提取液浓缩1-5倍后加入硫酸铵,静置后粗多糖沉淀析出,离心后收集沉淀,得青稞β-葡聚糖粗品;
(6)除小分子:将所述青稞β-葡聚糖粗品加水复溶,然后去除小分子杂质,制得青稞β-葡聚糖溶液;
(7)干燥:将所述青稞β-葡聚糖溶液进行干燥,得到精制的青稞β-葡聚糖。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
一种青稞β-葡聚糖的制备工艺,包括:
步骤一:将青稞磨成粉后,过40-80目筛,制得青稞粉;
步骤二:在所述青稞粉中加入高浓度乙醇,加热回流;
在一个实施例中,该步骤可以具体如下执行:将青稞粉中加入高浓度乙醇,加热回流。料液比为1:1-1:20(g:mL);乙醇浓度>80%;回流时间1-5小时。该过程的目的在于除去脂溶性物质、色素,并且抑制内源性β-葡聚糖酶或生物酶在提取过程中降解目标产物。
步骤三:在青稞粉中加入水,调整pH值至7-11,然后加入高温淀粉酶,混合均匀后于85-90℃条件下搅拌回流1-10h;
在一个实施例中,该步骤可以具体如下执行:按照1:5到1:50的料水比在处理后的青稞粉中加水,采用20%Na2CO3调整pH到7-11,并按照活力单位(U)与乙醇处理后青稞粉质量(g)比为10:1至1000:1加入高温淀粉酶,混合均匀后于85-90℃条件下搅拌回流1-10h。
步骤四:调整所得的溶液的pH值至2-4.5,静置后蛋白沉淀析出,离心去除沉淀,制得提取液;
在一个实施例中,该步骤可以具体如下执行:调整溶液pH至2-4.5,静置后蛋白(淀粉酶以及青稞中固有蛋白)沉淀析出,离心去除沉淀。
步骤五:对所述提取液浓缩1-5倍后加入硫酸铵,静置后粗多糖沉淀析出,离心后收集沉淀,得青稞β-葡聚糖粗品;
在一个实施例中,该步骤可以具体如下执行:对提取液浓缩1-5倍后加入硫酸铵,硫酸铵质量(g)与浓缩后的提取液(mL)料液比为1:2-1:8,静置后粗多糖沉淀析出,离心后收集沉淀。该步骤是根据不同多糖在不同盐溶液中溶解度不同,使β-葡聚糖在硫酸铵溶液中沉淀,而提取液中的阿拉伯木聚糖会在加入硫酸铵条件下不会析出,达到纯化β-葡聚糖的目的。
步骤六:将所述青稞β-葡聚糖粗品加水复溶,然后去除小分子杂质,制得青稞β-葡聚糖溶液;
在一个实施例中,该步骤可以具体如下执行:将β-葡聚糖粗品加水复溶后,采用超滤膜过滤的方式取去除小分子杂质。这个过程中选用截留分子量为1000–5000Da的有机或者无机膜。
步骤七:将所述青稞β-葡聚糖溶液进行干燥,得到精制的青稞β-葡聚糖。
在一个实施例中,该步骤可以具体如下执行:将经过膜处理的溶液,以喷雾或带式或烘箱或冷冻等方式进行干燥,得到精制β-葡聚糖产品。
上述工艺所制得的具有降血糖降血脂功能的青稞β-葡聚糖的结构特征为含有重复单元Glc1→3Glc1→4Glc/Glc1→3Glc1→4Glc1→4Glc,且他们之间存在多个结构序列均一但不同长度的β-(1→4)连接的葡萄糖片段。根据核磁共振结果,在上述条件下提取制备的样品为具有β-(1→3)和β-(1→4)两种连接方式的直链葡聚糖。根据HPAEC-PAD-MS/MS分析结果,组成该β-葡聚糖的片段存在一定重复规律,即不同聚合度的寡糖之间存在一定规律,dp3n,dp3n+1,dp3n+2,可组成一个周期循环,其中,dp3n具有两种序列连接,它们是分别为[Glc1→4Glc1→4Glc]n 和 [Glc1→3Glc1→4Glc]n;dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖,它可以表述为[Glc1→3Glc1→4Glc]n→4Glc;dp3n+2含量较少,它为均一的β-(1→4)连接的葡萄糖片段。此外,制备所得葡聚糖中β-(1→3) 与 β-(1→4)糖苷键的比值确定为1:2 至 1:5。该青稞β-葡聚糖有较好的防治高血脂和糖尿病活性,并有潜在成药性。
取上述工艺所得β-葡聚糖进行体内降血脂和降血糖试验,具体实验条件以及实验结果如下:
1)降血脂实验:通过预防给药的方式,进行判定,采取上午灌胃给药(根据体重200mg/kg),下午灌食高脂乳剂(乳剂由15%猪油和1.5%胆固醇等辅料制备而成),在连续灌胃21天以后,发现该β-葡聚糖相对与模型组可以显著降低实验组小鼠的总胆固醇(TC)(*P<0.05),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(*P<0.05),以及改善小鼠体内游离脂肪酸(FFA)(*P<0.05)的含量,具体机理可能是β-葡聚糖可以抑制肝肠循环过程中胆汁酸的重新收,从而促进肝脏中LDL-C转化为胆酸,从而达到降血脂的目的。
2)降血糖实验:向建模组小鼠根据体重110mg/kg注射链脲佐菌素,特异性损伤小鼠胰腺,建立I型糖尿病模型,对实验组小鼠体重采取灌胃给药(200mg/kg)的方式给予β-葡聚糖。在连续灌胃给药10天之后,β-葡聚糖与模型组对比可以显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖(*P<0.05),改善小鼠口服葡萄糖耐量(*P<0.05),促进肝糖原的合成(*P<0.05)以及肌糖原的合成(*P<0.05),具体机理可能是β-葡聚糖通过保护小鼠胰岛细胞,增加胰岛素的分泌,促进肌糖原和肝糖原的合成,达到降低血糖的目的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例,还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
首先,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
其次,本发明利用结构示意图等进行详细描述,在详述本发明实施例时,为便于说明,示意图会不依一般比例作局部放大,而且所述示意图只是实例,其在此不应限制本发明保护的范围。此外,在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。
实施例一
本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺:
将青稞连带麸皮磨粉,过60目筛;将青稞粉收集后,称取30g青稞粉,加入150mL 80%乙醇溶液,置于75℃回流2h。离心,除去乙醇溶液和色素,将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌,按照料水比为1:15,向30g青稞粉中加入450mL水溶液,使用20%Na2CO3调整pH至10,并加入4.5mL(约135U)耐高温淀粉酶,在90℃(85-95℃均可)条件下搅拌回流2h,4500r/min,15min,收集上清液;冷却至室温,4500r/min,15min,分离后收集上清液,再加入适量耐高温淀粉酶,85℃保持1-2h,选用0.1mol/L碘液作为指示剂,直至碘液不再变色,确认淀粉降解为单糖或寡糖;冷却至室温后,用HCl调整溶液pH至2-4.5,搅拌,静置,沉淀蛋白;4500r/min,15min,离心得上清液,调整pH至7.0,旋转蒸发,将体积浓缩至1/3,并于每50ml浓缩液中加入14.5g (NH4)2SO4固体,边加边搅拌,使硫酸铵溶液充分溶解后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入100mL纯水,充分加热溶解;冷却至室温,缓慢加入3倍体积的无水乙醇,充分搅拌后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入100mL纯水,边加热边搅拌,直至沉淀完全溶解;采用孔径为3500Da的卷式有机膜进行脱盐处理,每隔1h换水,透析24h,用0.5M BaCl2进行监测,直至样品溶液与BaCl2溶液混合时不再产生白色沉淀;12000r/min,15min,去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒,收集上清液,将溶液浓缩为原来体积的1/5,冷冻干燥,得到1 g β-葡聚糖产品。
1、青稞β-葡聚糖的结构表征
对实施例1中所得的产品分别进行核磁共振分析、单糖组成分析和序列分析。
(1)核磁共振分析
13C-NMR分析结果所得谱图如图1所示,根据已有知识,异头碳的化学位移大于103ppm的,则糖苷键类型为β型,可初步确定该糖链为β型。除此之外,根据文献中已有的凝胶多糖(Curdlan,由单一的β-(1→3)糖苷键连接而成的葡聚糖)的常规13C-NMR峰位归属以及纤维素(Cellulose,由单一的β-(1→4)糖苷键连接而成的葡聚糖)的固态13C-NMR峰位归属特征,可对青稞β-葡聚糖的谱图进行有效地归属。其中,104.03ppm与103.20ppm处的共振峰分别归属为β-(1→3)-D-Glc的异头碳C-1以及β-(1→4)-D-Glc的异头碳C-1,β-(1→3)-D-Glc的C-3共振峰出现在87.71ppm处,将73.38, 71.04, 76.70 以及61.24 ppm的共振峰分别归属为β-(1→3)-D-Glc的C-2,C-4, C-5 and C-6,68.72,将72.63, 80.74, 75.37 以及60.69ppm处的共振峰分别归属为C-2,C-3, C-4, C-5 以及C-6,具体见下表1。
表1 青稞β-葡聚糖的13C-NMR峰位归属
(2)单糖组成分析
通过HPAEC-PAD的方式对实施例1中制备所得青稞β-葡聚糖进行单糖组成分析。在分析之前,采用2M三氟乙酸(TFA)对实施例1中制备所得样品进行降解,降解12h后,通过旋转蒸发的方式,将具有强腐蚀作用的TFA去除。分别配制阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以木糖标准品溶液及其混合液,采用HPEAC-PAD对降解样品以及标准品溶液进行分离分析, 分析柱为CarboPac PA-1 column (4 × 250 mm, Dionex, Sunnyvale, CA),并选取15 mM NaOH溶液为流动相,以1mL/min进行等度洗脱。根据降解后的样品和标准单糖的PAD色谱图对比,样品降解后只有葡萄糖被检测到,葡萄糖色谱峰的纯度超过95%。因此可确定制备所得β-葡聚糖纯度较高(>95%)。如图2所示。
(3)序列结构分析
为了研究青稞β-葡聚糖的序列结构特征,将β-葡聚糖溶于10mM PBS缓冲溶液中,样品浓度3mg/mL,加入1U β-葡聚糖酶,置于37℃恒温水浴培养箱;分别于6h,12h,24h采集样品;采集后溶液煮沸,使酶失活,并离心(15000r/min,10min)去除变性蛋白。采用离子色谱同时串联PAD和Q-TOF质谱仪的方式,对不同时间酶解产物进行分离分析。分析柱为CarboPacPA-200 column (3 × 250 mm, Dionex, Sunnyvale, CA),流动相A为100 mM NaOH,流动相B为1 M NaOAc 以及100 mM NaOH 溶液,以0.8mL/min流速进行梯度洗脱,其中,B相在0-35min内由0%洗脱至35%。
β-葡聚糖部分酶解产物中寡糖的分离分析流程具体见图3,由于流动相中存在高浓度的非挥发性盐,不可直接进入质谱,因此需经具有在线脱盐功能的阳离子交换柱处理;图4,分别为6h、12h以及24h酶解产物的PAD色谱图与其对应的提取离子流色谱图(EIC),如图所示,EIC与PAD谱图结果可互相对应,在脱盐过程中,可导致样品的扩散,因而,EIC中峰型比PAD谱图中峰型宽。其次,对图中各峰进行归属,根据图中6h酶解产物的分析结果可发现,不同聚合度的寡糖分布存在一定规律,dp3n,dp3n+1,dp3n+2,可组成一个周期循环,其中,dp3n具有两种序列连接,dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖, dp3n+2含量较少。
对聚合度为dp2-7的寡糖分别进行二级质谱分析,结果如图5(A、B、C、D)及图6(A、B、C、D)。图5A为二糖二级质谱结果,B1 (m/z 161)/C1 (m/z 179)是典型的糖苷键断裂,据报道,2,4A2 (m/z 221) /2,5A2 (m/z 263)是1,4糖苷键连接二糖的特殊离子峰,因此该二糖的连接方式可以确认为Glc1→4Glc。图5B和5C分别为dp3(a)以及dp3(b)的二级质谱结果。在dp3(a)的二级质谱图中,除了典型的B和C糖苷键断裂以外,还有 2,5A2 (m/z 263)和2,5A3(m/z 425)断裂方式的存在,因此,可以确定dp3(a)的两个糖苷键连接方式均为1,4连接。根据dp3(b) 二级质谱图可知,在二级质谱轰击过程中,第二个糖环上未发生任何跨环断裂,而这一特征可证明1→3糖苷键的存在,第三个糖环上出现了2,4A3 (m/z 383) /2,5A3 (m/z425)/ 0,2A3 (m/z 443)的断裂方式,证明了1→4糖苷键的存在。因此,dp3(a)和dp3(b)的序列结构可分别确认为Glc1→4Glc1→4Glc以及Glc1→3Glc1→4Glc。图5D为dp4二级质谱结果,由于2,5A3 (m/z 425)和2,5A4 (m/z 587)的存在,可确认,从非还原端处开始的第二个和第三个糖苷键均为1,4糖苷键;由于该谱图中未找到第二个糖环上的任何跨环断裂的碎片离子峰,因而该四糖中第一个糖苷键可确定为1,3糖苷键。dp4的序列结构确认为Glc1→3Glc1→4Glc1→4Glc。同理可得,图6(A、B、C、D)中dp5, dp6(a), dp6(b), dp7的序列结构可分别确定为:
Glc1→4Glc1→4Glc1→4Glc1→4Glc,
Glc1→4Glc1→4Glc1→4Glc1→4Glc1→4Glc,
Glc1→3Glc1→4Glc1→4Glc1→3Glc1→4Glc,
Glc1→3Glc1→4Glc1→4Glc1→3Glc1→4Glc1→4Glc。
综上所述,实施例1中制备所得的青稞β-葡聚糖具有如下结构特征:存在重复单元Glc1→3Glc1→4Glc/Glc1→3Glc1→4Glc1→4Glc,且存在多个β-(1→4)连接的片段。根据核磁共振结果,在上述条件下提取制备的样品为具有β-(1→3)和β-(1→4)两种连接方式的直链葡聚糖。根据HPAEC-PAD-MS/MS分析结果,组成该β-葡聚糖的片段存在一定重复规律,即,dp3n,dp3n+1,dp3n+2,可组成一个周期循环,其中,dp3n存在两种序列连接,它们是分别为[Glc1→4Glc1→4Glc]n 和 [Glc1→3Glc1→4Glc]n;dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖,它可以表述为[Glc1→3Glc1→4Glc]n→4Glc;dp3n+2含量较少,它为均一的β-(1→4)连接的葡萄糖片段。此外,制备所得葡聚糖中β-(1→3) 与 β-(1→4)糖苷键的比值确定为1:3。
2、青稞β-葡聚糖的降血脂功能评价
对实施例1中制备所得青稞β-葡聚糖进行降血脂体内活性评价。
选取40只雄性昆明小鼠,体重18-22g,通过预防给药的方式,进行判定,采取上午灌胃给药(根据体重200mg/kg),下午灌食高脂乳剂(乳剂由15%猪油和1.5%胆固醇等辅料制备而成)的方式,连续灌胃21天,最后,眼球取血后处死。提取小鼠肝脏组织,称重,按照不同试剂盒要求测定这40只小鼠体内总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、小鼠肝脏中总胆固醇、甘油三酯和肝重系数指标以及游离脂肪酸(FFA)的结果以及肝脏内多种酶活性进行评价。试验中分为空白组、模型组、实验组和阳性药对照组,其中阳性药为辛伐他汀( 20mg/kg)。具体结果见表2、表3、表4。
表2 青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠血脂的影响(n=10)
注:与正常组比较,##P˂0.01,#P˂0.05;与模型组比较**P˂0.01,*P˂0.05。
表3 青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠肝脂以及肝重系数的影响(n=10)
注:与正常组比较,##P˂0.01,#P˂0.05;与模型组比较**P˂0.01,*P˂0.05。
表4 青稞β-葡聚糖对高脂血症小鼠肝组织MDA含量,SOD和GSH-px活性的影响(n=10)
注:与正常组比较,##P˂0.01,#P˂0.05;与模型组比较**P˂0.01,*P˂0.05。
表2、表3、表4中,与正常组小鼠对比,模型组小鼠体内多项参数存在显著差异,具有统计学意义(##P˂0.01或#P˂0.05),说明模型建立成功。表2中,实验组小鼠与模型组对比,血清中TC、LDL-C以及HDL-C等指标均有显著改善,且存在显著差异,存在统计学意义(**P˂0.01或*P˂0.05),表3和表4中,实验组小鼠与模型组相比,实验组小鼠肝脏系数具有显著改善 (**P˂0.01),且肝脏内SOD以及GSH-px活性增加,机体抗氧化能力增强。
高血脂小鼠体内实验结果表明,青稞β-葡聚糖可以有效降低血清中TC、LDL-C和FFA的浓度,并且可以适当增加小鼠血清中HDL-C,此外,青稞β-葡聚糖可以有效地增加实验组小鼠体内抗氧化酶活性,因而可确定,采用该工艺生产的青稞β-葡聚糖具有良好的降血脂作用以及抗氧化作用。
3、青稞β-葡聚糖的降血糖活性评价
对实施例1中制备所得青稞β-葡聚糖进行降血糖体内活性评价试验。
选用雄性昆明小鼠,体重18-22g,适应性培养后随机分为两组,空白组和建模组,向建模组小鼠根据体重110mg/kg注射链脲佐菌素,特异性损伤小鼠胰腺,建立I型糖尿病模型,并将建模成功的小鼠随机分为三组:模型组、阳性对照组以及实验组。对实验组小鼠体重采取灌胃给药(200mg/kg)的方式给予β-葡聚糖,分别于0day、10day、20day、30day取血,测量空腹血糖浓度,并于培养第30天后,禁食,分别取0h、0.5h、2h测定口服葡萄糖耐受量,并于眼球取血后处死,提取小鼠肝脏组织和肌肉组织,称重,按照不同试剂盒要求测定这40只小鼠空腹血糖浓度、肝糖原、肌糖原、口服葡萄糖耐受量(OGTT)进行测量。试验中共设置4组,分别为空白组、模型组、实验组和阳性药对照组,其中,阳性药为二甲双胍(20mg/kg)。具体结果见表5、表6、表7。
表5 青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠空腹血糖的影响(n=10)
注:与正常组比较,##P˂0.01,#P˂0.05;与模型组比较**P˂0.01,*P˂0.05。
表6 青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠口服葡萄糖耐量的影响(n=10)
注:与正常组比较,##P˂0.01,#P˂0.05;与模型组比较**P˂0.01,*P˂0.05。
表7 青稞β-葡聚糖对高血糖小鼠糖原的影响(n=10)
注:与正常组比较,##P˂0.01,#P˂0.05;与模型组比较**P˂0.01,*P˂0.05.
表5、表6、表7中,与正常组小鼠对比,模型组小鼠体内多项参数存在显著差异,具有统计学意义(##P˂0.01或#P˂0.05),说明模型建立成功。表5中,与模型组小鼠相比,实验组小鼠空腹血糖浓度得到有效控制(**P˂0.01),血糖耐受量得到有效改善(**P˂0.01);表6中,实验组小鼠体内的肌糖原和肝糖原含量显著增多(**P˂0.01).
动物实验结果表明,青稞β-葡聚糖可以有效地降低高血糖小鼠的空腹血糖,改善口服血糖耐受量,促进肝糖原以及肌糖原的合成,从而可以进一步确认,采用该工艺制备的β-葡聚糖具有良好的降血糖的作用。
根据上述数据,可以判断采取该工艺制备的青稞β-葡聚糖具有较好的降血脂以及降血糖活性。
实施例二
本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺:
将青稞连带麸皮磨粉,过40目筛;将青稞粉收集后,称取80g青稞粉,加入400mL 80%乙醇溶液,置于75℃回流2h。离心,除去乙醇溶液和色素,将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌,按照料水比为1:20,向80g青稞粉中加入1600mL水溶液,使用20%Na2CO3调整pH至10,并加入12mL(约359U)耐高温淀粉酶,在85℃条件下搅拌回流2h,4500r/min,15min,收集上清液;冷却至室温,4500r/min,15min,分离后收集上清液,再加入适量耐高温淀粉酶,85℃保持1-2h,选用0.1mol/L碘液作为指示剂,直至碘液不再变色,确认淀粉降解为单糖或寡糖;冷却至室温后,用HCl调整溶液pH至3,搅拌,静置,沉淀蛋白;4500r/min,15min,离心得上清液,调整pH至7.0,旋转蒸发,将体积浓缩至1/3,并于每50ml浓缩液中加入16.5g (NH4)2SO4固体,边加边搅拌,使硫酸铵溶液充分溶解后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入250mL纯水,充分加热溶解;冷却至室温,缓慢加入3倍体积的无水乙醇,充分搅拌后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入250mL纯水,边加热边搅拌,直至沉淀完全溶解;采用孔径为3500Da的卷式有机膜进行脱盐处理,每隔1h换水,透析24h,用0.5M BaCl2进行监测,直至样品溶液与BaCl2溶液混合时不再产生白色沉淀;12000r/min,15min,去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒,收集上清液,将溶液浓缩为原来体积的1/5,冷冻干燥,得到3.5g β-葡聚糖产品。
实施例三
本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺:
将青稞连带麸皮磨粉,过40目筛;将青稞粉收集后,称取120g青稞粉,加入600mL 80%乙醇溶液,置于75℃回流2h。离心,除去乙醇溶液和色素,将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌,按照料水比为1:15,向120g青稞粉中加入1800mL水溶液,使用20%Na2CO3调整pH至10,并加入14mL(约408U)耐高温淀粉酶,在90℃条件下搅拌回流2h,4500r/min,15min,收集上清液;冷却至室温,4500r/min,15min,分离后收集上清液,再加入适量耐高温淀粉酶,85℃保持1-2h,选用0.1mol/L碘液作为指示剂,直至碘液不再变色,确认淀粉降解为单糖或寡糖;冷却至室温后,用HCl调整溶液pH至2.5,搅拌,静置,沉淀蛋白;4500r/min,15min,离心得上清液,调整pH至7.0,旋转蒸发,将体积浓缩至1/3,并于每50ml浓缩液中加入12.5g (NH4)2SO4固体,边加边搅拌,使硫酸铵溶液充分溶解后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入400mL纯水,充分加热溶解;冷却至室温,缓慢加入3倍体积的无水乙醇,充分搅拌后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入400mL纯水,边加热边搅拌,直至沉淀完全溶解;采用孔径为3500Da的卷式有机膜进行脱盐处理,每隔1h换水,透析24h,用0.5M BaCl2进行监测,直至样品溶液与BaCl2溶液混合时不再产生白色沉淀;12000r/min,15min,去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒,收集上清液,将溶液浓缩为原来体积的1/5,冷冻干燥,得到4.8g β-葡聚糖产品。
实施例四
本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺:
将青稞连带麸皮磨粉,过60目筛;将青稞粉收集后,称取140g青稞粉,加入840mL 80%乙醇溶液,置于75℃回流2h。离心,除去乙醇溶液和色素,将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌,按照料水比为1:10,向140g青稞粉中加入1400mL水溶液,使用20%Na2CO3调整pH至10,并加入19mL(约600U)耐高温淀粉酶,在85℃条件下搅拌回流2h,4500r/min,15min,收集上清液;冷却至室温,4500r/min,15min,分离后收集上清液,再加入适量耐高温淀粉酶,85℃保持1-2h,选用0.1mol/L碘液作为指示剂,直至碘液不再变色,确认淀粉降解为单糖或寡糖;冷却至室温后,用HCl调整溶液pH至3,搅拌,静置,沉淀蛋白;4500r/min,15min,离心得上清液,调整pH至7.0,旋转蒸发,将体积浓缩至1/3,并于每50ml浓缩液中加入16.5g (NH4)2SO4固体,边加边搅拌,使硫酸铵溶液充分溶解后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入500mL纯水,充分加热溶解;冷却至室温,缓慢加入3倍体积的无水乙醇,充分搅拌后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入500mL纯水,边加热边搅拌,直至沉淀完全溶解;采用孔径为3500Da的卷式有机膜进行脱盐处理,每隔1h换水,透析24h,用0.5M BaCl2进行监测,直至样品溶液与BaCl2溶液混合时不再产生白色沉淀;12000r/min,15min,去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒,收集上清液,将溶液浓缩为原来体积的1/5,冷冻干燥,得到5.2g β-葡聚糖产品。
实施例五
本实施案例按如下步骤展示一种青稞β-葡聚糖的制备工艺:
将青稞连带麸皮磨粉,过60目筛;将青稞粉收集后,称取200g青稞粉,加入1000mL 80%乙醇溶液,置于75℃回流2h。离心,除去乙醇溶液和色素,将沉淀置于干燥箱烘干。加水搅拌,按照料水比为1:15,向200g青稞粉中加入3000mL水溶液,使用20%Na2CO3调整pH至10,并加入24mL(约750U)耐高温淀粉酶,在85℃条件下搅拌回流2h,4500r/min,15min,收集上清液;冷却至室温,4500r/min,15min,分离后收集上清液,再加入适量耐高温淀粉酶,85℃保持1-2h,选用0.1mol/L碘液作为指示剂,直至碘液不再变色,确认淀粉降解为单糖或寡糖;冷却至室温后,用HCl调整溶液pH至3,搅拌,静置,沉淀蛋白;4500r/min,15min,离心得上清液,调整pH至7.0,旋转蒸发,将体积浓缩至1/3,并于每50ml浓缩液中加入16.5g (NH4)2SO4固体,边加边搅拌,使硫酸铵溶液充分溶解后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入600mL纯水,充分加热溶解;冷却至室温,缓慢加入3倍体积的无水乙醇,充分搅拌后,置于4℃,静置,过夜;4500r/min,15min,收集沉淀,加入600mL纯水,边加热边搅拌,直至沉淀完全溶解;采用孔径为3500Da的卷式有机膜进行脱盐处理,每隔1h换水,透析24h,用0.5M BaCl2进行监测,直至样品溶液与BaCl2溶液混合时不再产生白色沉淀;12000r/min,15min,去除溶液中可能存在的不溶性小颗粒,收集上清液,将溶液浓缩为原来体积的1/5,冷冻干燥,得到12.3gβ-葡聚糖产品。
综上所述,本发明公开了一种青稞β-葡聚糖的制备工艺,通过高效溶出、硫酸铵沉淀、超滤膜过滤等关键工艺的改进,使得β-葡聚糖有较高的纯度,纯度达到95%以上,且色泽较好;得率较高,每100g干燥青稞粉中可提取3-10gβ-葡聚糖;结构序列明确;以及具有良好的降血脂以及降血糖活性,可以用于高血脂以及糖尿病的治疗,为开发治疗高血脂以及糖尿病的新药打下基础,积极推动高血脂以及糖尿病天然药物活性成分的研究开发。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种青稞β-葡聚糖的制备工艺,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)青稞粉碎:将青稞磨成粉后,过40-80目筛,制得青稞粉;
(2)灭酶:在所述青稞粉中加入高浓度乙醇,加热回流;
(3)提取并除淀粉:在经步骤(2)加工后所得的青稞粉中加入水,调整pH值至7-11,然后加入高温淀粉酶,混合均匀后于85-90℃条件下搅拌回流1-10h;
(4)除蛋白:调整步骤(3)所得的溶液的pH值至2-4.5,静置后蛋白沉淀析出,离心去除沉淀,制得提取液;
(5)制备粗多糖:对所述提取液浓缩1-5倍后加入硫酸铵,静置后粗多糖沉淀析出,离心后收集沉淀,得青稞β-葡聚糖粗品;
(6)除小分子:将所述青稞β-葡聚糖粗品加水复溶,然后去除小分子杂质,制得青稞β-葡聚糖溶液;
(7)干燥:将所述青稞β-葡聚糖溶液进行干燥,得到精制的青稞β-葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的青稞β-葡聚糖的制备工艺,其特征在于:步骤(2)中所述料液比为1g:1mL-1g:20mL,所述乙醇的浓度>80%,所述加热回流时间为1-5小时。
3.根据权利要求1所述的青稞β-葡聚糖的制备工艺,其特征在于:步骤(3)中所述青稞粉与水的料水比为1g:5mL-1g:50mL,所述pH值采用20%的Na2CO3调整,所述高温淀粉酶与所述青稞粉的比为10U:1g至1000U:1g。
4.根据权利要求1所述的青稞β-葡聚糖的制备工艺,其特征在于:步骤(5)中所述硫酸铵与浓缩后的提取液的料液比为1g:2mL-1g:8mL。
5.根据权利要求1所述的青稞β-葡聚糖的制备工艺,其特征在于:步骤(6)中所述去除小分子杂质采用超滤膜过滤的方式,所述超滤膜为有机或者无机膜,所述超滤膜截留分子量为1000–5000Da。
6.根据权利要求1所述的青稞β-葡聚糖的制备工艺,其特征在于:步骤(7)中所述干燥的方式为喷雾、带式、烘箱或冷冻中的任意一种。
7.根据权利要求1-6任意一项所制备的青稞β-葡聚糖,其特征在于:所述青稞β-葡聚糖的结构中含有重复单元Glc1→3Glc1→4Glc/Glc1→3Glc1→4Glc1→4Glc。
8.根据权利要求7所述的青稞β-葡聚糖,其特征在于:所述青稞β-葡聚糖的结构中具有β-(1→3)和β-(1→4)两种连接方式的直链葡聚糖。
9.根据权利要求8所述的青稞β-葡聚糖,其特征在于:所述青稞β-葡聚糖的结构中dp3n、dp3n+1和dp3n+2组成一个周期循环,其中,所述dp3n具有两种序列连接,分别为[Glc1→4Glc1→4Glc]n和 [Glc1→3Glc1→4Glc]n;所述dp3n+1是每一个周期中丰度最高的寡糖,其表述为[Glc1→3Glc1→4Glc]n→4Glc;所述dp3n+2是每一个周期中含量较少的寡糖,其为均一的β-(1→4)连接葡萄糖片段。
10.根据权利要求8所述的青稞β-葡聚糖,其特征在于:所述青稞β-葡聚糖中β-(1→3)与β-(1→4)糖苷键的比值为1:2至1:5。
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