CN117859917A - 具改善记忆能力的制剂及其制备方法 - Google Patents

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CN117859917A CN202311864712.3A CN202311864712A CN117859917A CN 117859917 A CN117859917 A CN 117859917A CN 202311864712 A CN202311864712 A CN 202311864712A CN 117859917 A CN117859917 A CN 117859917A
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Inventor
李祖明
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Beijing Union University
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Beijing Union University
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Abstract

本发明提供一种具改善记忆能力的制剂及其制备方法，该制剂包括青稞β‑葡聚糖，进一步还包括发酵乳杆菌ZLT 11冻干菌粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 25冻干菌粉。本发明提供的制剂可以通过抑制大脑tau蛋白磷酸化，提高大脑GSH‑PX酶活性，改善神经元退化和突触损伤，调整肠道菌群结构和肠道代谢谱来改善记忆损伤患者的记忆能力。

Description

具改善记忆能力的制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于保健食品领域，涉及具改善记忆能力的制剂及其制备方法。
背景技术
人口老龄化已经成为全球面临的一个严峻的社会问题。研究表明，老年人的工作记忆将在60岁左右开始快速衰退，严重的将会发展成痴呆症。痴呆症是一种中枢神经退行性疾病，在临床上表现为记忆衰退、认知功能障碍、失用、失语，社交障碍、人格和行为改变等，病发早期以学习记忆衰退为主要表现。目前没有十分有效的药物来阻止痴呆的发生或治疗痴呆。
但是研究发现，随着年龄的增长和疾病的发生，老年人的肠道菌群发生了巨大的改变。大量的研究表明补充益生元和益生菌可以调节肠道微生态平衡、增强机体免疫功能、促进营养吸收以及调节精神和神经等方式发挥生理功能作用。已有研究提出基于益生元和益生菌干预作为宿主疾病的辅助疗法。因此，探索延缓/改善记忆能力和预防痴呆的发生的有效方法对于维持老年人的整体认知能力具有现实意义和应用价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种具改善记忆能力的制剂，该制剂可以有效调节肠道菌群结构和促进有益代谢产物产生，从而对记忆损伤起到改善作用，可用于预防和/或辅助改善记忆能力下降。
本发明的另一目的在于提供上述具改善记忆能力的制剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种具改善记忆能力的制剂，包括青稞β-葡聚糖。
本发明提供上述具改善记忆能力的制剂的制备方法，包括如下步骤：
1)原料粉碎：将青稞籽粒去除发霉变质部分，烘干，粉碎青稞，取麸皮粉碎过80目筛，制成青稞麸皮粉；
2)超声波辅助浸提：将烘干的青稞麸皮粉与水按g/ml为1:5的比例混合，将混合液在超声功率为500W，温度45℃下超声辅助提取50min；
3)酶解、离心：取超声波后青稞麸皮粉混合液水浴加热，按照每克青稞麸皮粉加入25U的比例加入耐高温α-淀粉酶，于90℃酶解40min后，升温至100℃灭酶30min；然后按照每克青稞麸皮粉加入2.5U的比例加入胰酶，于pH 8.0、38℃酶解2h，升温至90℃灭酶30min；将酶解液连续离心，条件为14000r/min；
4)95％乙醇沉淀、过滤：取上清加入三倍体积的95％乙醇，4℃沉淀12h；用G2砂芯漏斗对含有絮状沉淀的浑浊液进行过滤，固体用70％乙醇洗涤两次，70℃烘箱烘干，得到粗提青稞β-葡聚糖；
5)复水溶解、冻融、过滤：将粗提青稞β-葡聚糖固体用纯水按照m/v为1:10进行溶解，采用超声波辅助溶解，条件为：500W，60℃，20min，得到青稞β-葡聚糖溶液；室温分装后，放入-18℃冰箱冷冻24h，取出在4℃条件下解冻12h，然后重复冷冻解冻过程两次；再将解冻液通过G2砂芯漏斗过滤，收集絮状凝胶；
6)70％乙醇沉淀、过滤：在絮状凝胶中加入70％乙醇，4℃沉淀12h；用G2砂芯漏斗对含有絮状沉淀的浑浊液进行过滤，滤渣用70％乙醇洗涤两次；
7)干燥制粉：滤渣70℃烘干，用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得到纯化青稞β-葡聚糖。
本发明还提供具改善记忆能力的制剂，进一步包括由发酵乳杆菌ZLT 11冻干菌粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干菌粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干菌粉。
如上所述，发酵乳杆菌ZLT 11的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)ZLT 11；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCCNo.18206；保藏日期为：2019年7月11日；
发酵乳杆菌ZLT 305的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ZLT305；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18207；保藏日期为：2019年7月11日；
植物乳杆菌ZLT 22的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT22；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18208；保藏日期为：2019年7月11日；
植物乳杆菌ZLT 25的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT25；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18209；保藏日期为：2019年7月11日。
本发明还提供上述具改善记忆能力的制剂的制备方法，包括如下步骤：
1)原料粉碎：将青稞籽粒去除发霉变质部分，烘干，粉碎青稞，取麸皮粉碎过80目筛，制成青稞麸皮粉；
2)超声波辅助浸提：将烘干的青稞麸皮粉与水按g/ml为1:5的比例混合，将混合液在超声功率为500W，温度45℃下超声辅助提取50min；
3)酶解、离心：取超声波后青稞麸皮粉混合液水浴加热，按照每克青稞麸皮粉加入25U的比例加入耐高温α-淀粉酶，于90℃酶解40min后，升温至100℃灭酶30min；然后按照每克青稞麸皮粉加入2.5U的比例加入胰酶，于pH 8.0、38℃酶解2h，升温至90℃灭酶30min；将酶解液连续离心，条件为14000r/min；
4)95％乙醇沉淀、过滤：取上清加入三倍体积的95％乙醇，4℃沉淀12h；用G2砂芯漏斗对含有絮状沉淀的浑浊液进行过滤，固体用70％乙醇洗涤两次，70℃烘箱烘干，得到粗提青稞β-葡聚糖；
5)复水溶解、冻融、过滤：将粗提青稞β-葡聚糖固体用纯水按照m/v为1:10进行溶解，采用超声波辅助溶解，条件为：500W，60℃，20min，得到青稞β-葡聚糖溶液；室温分装后，放入-18℃冰箱冷冻24h，取出在4℃条件下解冻12h，然后重复冷冻解冻过程两次；再将解冻液通过G2砂芯漏斗过滤，收集絮状凝胶；
6)70％乙醇沉淀、过滤：将絮状凝胶中加入70％乙醇，4℃沉淀12h；用G2砂芯漏斗对含有絮状沉淀的浑浊液进行过滤，滤渣用70％乙醇洗涤两次；70℃烘干，得到纯化青稞β-葡聚糖；
7)干燥制粉：滤渣70℃烘干，用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得到纯化青稞β-葡聚糖；
8)益生菌剂制备：将发酵乳杆菌ZLT 11、发酵乳杆菌ZLT 305、植物乳杆菌ZLT 22、植物乳杆菌ZLT 25菌株活化，扩大培养，离心分离收集湿菌体，再分别洗涤后放入冷冻干燥器内冻干收集，得到发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉；
9)活菌混合：在纯化青稞β-葡聚糖中添加发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉，每株菌活菌数的添加量为2.86×109CFU/g青稞β-葡聚糖(纯品)，混合均匀即得青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌剂的功能制剂。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种具改善记忆能力的制剂及其制备方法，该制剂可以通过抑制大脑tau蛋白磷酸化，提高大脑GSH-PX酶活性，改善神经元退化和突触损伤，调整肠道菌群结构和肠道代谢谱来改善记忆损伤患者的记忆能力，可以用于预防和/或辅助改善记忆能力下降，尤其是老年人的记忆衰退。
附图说明
图1为各组小鼠大脑海马组织的切片图。
图2为各组小鼠大脑海马组织的尼氏染色切片图。
图3为各组小鼠的肠道菌群在门水平上的分布图，其中，NC为对照组；M为APP/PS1模型组；Y为酵母β-葡聚糖组；Q为青稞β-葡聚糖组；P为青稞β葡聚糖+益生菌剂组。
图4为各组小鼠的肠道菌群在属水平上的分布图，其中，NC为对照组；M为APP/PS1模型组；Y为酵母β-葡聚糖组；Q为青稞β葡聚糖组；P为青稞β葡聚糖+益生菌剂组。
具体实施方式
下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
β-葡聚糖是由D-葡糖苷单体通过β-糖苷键连接而成的一类非淀粉多糖，其分无支链或有支链两种，属于可溶性膳食纤维，可分为谷物或非谷物两种。β-葡聚糖的共同特征是主干都由β-1,3糖苷键连接，支链通常有β-1,4或β-1,6糖苷键。酵母中β-葡聚糖由β-1,3和β-1,6糖苷键连接组成；青稞中β-葡聚糖是由β-1,3和β-1,4糖苷键连接组成，其DP3/DP4比值在2.4-2.6之间。
青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum)是中国藏区包括西藏自治区和青海、四川、甘肃、云南四省藏区种植面积最大、分布最广的农作物，常年种植面积达410万亩以上，平均亩产则高达250～300kg，部分地区的平均亩产量已达400kg以上，占耕地面积的60％以上和农作物总产量的70％以上，是藏区农牧民不可替代的主粮和重要的动物饲料。青稞籽粒中含有丰富的β-葡聚糖，平均含量为5.25％，最高可达8.62％，是小麦中β-葡聚糖平均含量的50倍，为迄今为止谷类作物中β-葡聚糖含量最高的物种。有研究发现，在青稞籽粒中约75％的β-葡聚糖存在于胚乳中，其余25％存在于糊粉层中。青稞β-葡聚糖具有清肠、降低胆固醇、调节血糖、提高免疫力、抗肿瘤等重要生理作用；同时还可以预防或延缓某些代谢性疾病的发生，且无副作用，其研究开发前景十分广阔。目前，青稞加工主要停留在初级产品加工阶段，而青稞的价值不仅仅体现在食用方面，而且在保健和药用功效方面也有很高的开发价值。青稞在初级产品加工中产生了大量由种皮、糊粉层、胚和胚乳组成的麸皮，约占青稞总量的8％-30％，含有丰富的β-葡聚糖。然而至今麸皮常常用作饲料或农作物残渣、加工废料，造成了巨大的浪费。
由于肠道微生物与肠道及大脑(微生物群-肠-脑轴)相互作用，肠道微生物会产生氨基酸(γ-氨基丁酸(GABA)和色氨酸等)、血清素、组胺和多巴胺等，它们作为神经递质或神经递质前体在大脑中发挥重要作用，这些神经活性产物可以通过血流作用于中枢神经系统，也可影响中枢神经系统中的神经元。
益生菌已被证明可以恢复肠道微生物群的微环境稳定，从而改善记忆损伤。最常用的益生菌有乳酸杆菌和双歧杆菌，由于它们不含脂多糖，因此摄入后不会引起任何形式的炎症。
材料：
1.MRS固体培养基购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，由北京陆桥技术股份有限公司生产，产品编号CM188。
2.MRS液体培养基购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，由北京陆桥技术股份有限公司生产，产品编号CM187。
3.耐高温α-淀粉酶购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，产品编号：A109182-100g。
4.从猪胃黏膜获得的胰蛋白酶购买自上海源叶生物科技有限公司，产品编号：S10034-100g。
5.pancreatin胰酶购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品编号：DH355-4。
6.95％乙醇购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，产品编号：
A112717-25L。
7.氢氧化钠(NaOH)购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,产品编号：S111498-500g。
8.二甲苯购买自上海凌峰化学试剂有限公司。
9.柠檬酸(pH6.0)抗原修复液购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G1201-1L。
10.柠檬酸(PH6.0)抗原修复液购买自BioWhittaker。
11.4％多聚甲醛购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品编号：AR-0211。
12.EDTA脱钙液购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：
G1105-500ML。
13.RNA提取液购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：
G3013-100ML。
14. 2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G3322-15。
15.HyPure TMMolecular Biology Grade Water购买自HyClone。
16.SweScript RT I First Strand cDNA Synthesis Kit购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G3330-100。
17.引物委托武汉赛维尔生物科技有限公司合成。
18.P-tau抗体购买自江苏亲科生物研究中心有限公司，产品编号：AF3141
19.Aβ抗体购买自武汉塞维尔生物科技有限公司，产品编号：GB111197
20.磷酸化蛋白酶抑制剂购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G2007-1ML。
21.BCA蛋白定量检测试剂盒购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G2026-1000T。
22.SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G2003-50T。
23.蛋白Marker购买自美国赛默飞世尔科技公司，产品编号：26617。
24.PVDF膜(0.45um)和PVDF膜(0.22um)均购自millipore。
25.脱脂奶粉购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：GC310001-100g。
26.显影定影试剂盒购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G2019-250ML。
27.β-actin购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：GB12001。
28.TBS缓冲液购买自武汉赛维尔生物科技有限公司，产品编号：G0001-2L。
29.Beta葡聚糖(混键)检测试剂盒购买自Megazyme，产品编号：K-BGLU。
30.青稞购买自扶风斯诺特生物科技有限公司。
31.酵母葡聚糖购买自唐山拓普生物科技有限公司。
32.APP/PS1雄性小鼠，12周龄，购买自江苏华创信诺医药科技有限公司。
33.B6C3雄性小鼠，12周龄，购买自江苏华创信诺医药科技有限公司。
设备：
1.酶标检测仪(Rayto)购买自雷杜生命科学股份有限公司。
2.电子天平购买自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
3.电热恒温水浴锅购买自上海一恒科学仪器有限公司。
4.超声波清洗仪购买自克斯特超声波(上海)有限公司。
5.GQLY-150N摇摆型管式分离机购买自辽阳阳光制药机械有限公司。
6.冷冻离心机(heal force)购买自美国赛默飞世尔科技公司。
7.顶开式冷冻箱购买自青岛澳柯玛股份有限公司。
8.医用冷藏柜购买自青岛海尔特种电器有限公司。
9.电热恒温鼓风干燥机烘箱购买自上海一恒科学仪器有限公司。
10.LRH-250生化培养箱购买自上海一恒科学仪器有限公司。
11.高速万能粉碎机购买天津市泰斯特仪器有限公司。
12.掌上离心机购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
13.涡旋混合器购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
14.磁力搅拌器购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
15.脱色摇床购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
16.电泳仪购买自北京六一仪器厂。
17.扫描仪(EPSON)购买自爱普生(中国)有限公司。
18.灰度分析软件购买自美国Alpha Innotech。
19.图像分析软件购买自Adobe。
20.台式高速冷冻型微量离心机购买自DragonLa。
21.匀浆仪购买自武汉赛维尔生物科技有限公司。
22.超微量分光光度计购买自美国赛默飞世尔科技公司。
23.脱水机购买自DIAPATH。
24.包埋机购买自武汉俊杰电子有限公司。
25.病理切片机购买自上海徕卡仪器有限公司。
实施例1：青稞β-葡聚糖的制备
1.青稞β-葡聚糖的提取
1)原料粉碎
将青稞籽粒进行挑选去除发霉变质部分，送进烘箱进行70℃烘干，粉碎青稞，取麸皮粉碎过80目筛，制成青稞麸皮粉；
2)超声波辅助浸提
将青稞麸皮粉与蒸馏水按1:5(g/ml)的比例混合，将混合液超声波处理，条件为：功率为500W，温度45℃，25min。
3)酶解、离心
将超声波处理后青稞麸皮粉混合液水浴加热到90℃时，加入耐高温α-淀粉酶(25U/g青稞麸皮粉)酶解40min后，100℃灭酶30min；然后将酶解液温度降至38℃，并用1％NaOH水溶液调节酶解液pH至8.0，添加胰酶(2.5U/g青稞麸皮粉)进行酶解反应2h，再90℃灭酶30min；将冷却至室温的酶解液用连续式离心机进行离心处理，转速为14000r/min。
4)95％乙醇沉淀、过滤：取离心后上清液加入三倍体积的95％乙醇，放置4℃冰柜中静置沉淀12h；用G2砂芯漏斗对含有絮状的浑浊液进行过滤，固体用70％乙醇洗涤两次，再在70℃的烘箱中烘干，粉碎过60目筛得到粗提青稞β-葡聚糖。
2.青稞β-葡聚糖的纯化
1)复水溶解、冻融、过滤：将粗提青稞β-葡聚糖用纯水溶解(1:10，g/mL)，采用超声波处理，条件为：功率为500W，温度60℃，时间30min，得到青稞β-葡聚糖溶液；冷却至室温后，放入-18℃冰箱冷冻24h，取出在4℃条件下解冻12h，然后重复冷冻解冻过程两次；再将解冻液通过G2砂芯漏斗过滤，收集絮状凝胶物质。
2)70％乙醇沉淀、过滤：在过滤后的絮状凝胶中加入2倍体积的70％乙醇，4℃条件沉淀12h；然后用G2砂芯漏斗对含有絮状沉淀的浑浊液进行过滤，滤渣用70％乙醇洗涤两次。
3)干燥制粉：过滤收集的固体先放置在铺有锡纸的托盘中，然后放置到通风处晾置30min，再放入70℃烘箱烘干，然后用粉碎机进行粉碎过80目筛，得到纯化青稞β-葡聚糖。青稞β-葡聚糖的纯度用试剂盒测试。计算方式如下所示：
青稞β-葡聚糖得率(％)＝m/M×100
式中m：提取青稞β-葡聚糖的质量，g；M：原料质量，g。
青稞β-葡聚糖提取率(％)＝(m×P1)/(M×P2)×100
式中m：提取青稞β-葡聚糖的质量，g；P1：提取青稞β-葡聚糖的纯度；M：原料质量，g；P2：原料中青稞β-葡聚糖的含量。
结果如表1所示。
表1纯化青稞β-葡聚糖相关指标
从表1可以看出，使用本方法提取纯化得到的青稞β-葡聚糖纯度为83.57％，远高于市售产品(20％左右)的纯度。
实施例2青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂的制备
本发明所使用乳酸杆菌为发酵乳杆菌ZLT11冻干菌粉、发酵乳杆菌ZLT305冻干菌粉、植物乳杆菌ZLT22冻干菌粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干菌粉，上述乳酸杆菌均由健康成人体内分离所得并进行保藏。
发酵乳杆菌ZLT 11的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ZLT11；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18206；保藏日期为：2019年7月11日。
发酵乳杆菌ZLT 305的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ZLT305；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18207；保藏日期为：2019年7月11日。
植物乳杆菌ZLT 22的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT22；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18208；保藏日期为：2019年7月11日。
植物乳杆菌ZLT 25的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT25；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18209；保藏日期为：2019年7月11日。
上述乳酸杆菌单一菌株的逐级培养方法为：
菌种活化：挑取保存于甘油冻存管的发酵乳杆菌ZLT 11、发酵乳杆菌ZLT 305、植物乳杆菌ZLT 22、植物乳杆菌ZLT 25，分别倒入15mL MRS肉汤培养基混匀后于37℃培养48-72h得到活化好的发酵乳杆菌ZLT 11纯菌液、发酵乳杆菌ZLT 305纯菌液、植物乳杆菌ZLT22纯菌液、植物乳杆菌ZLT 25纯菌液。
种子液制备：将活化好的发酵乳杆菌ZLT 11纯菌液、发酵乳杆菌ZLT 305纯菌液、植物乳杆菌ZLT 22纯菌液、植物乳杆菌ZLT 25纯菌液分别摇匀后取1mL接种于15mL MRS肉汤培养基中，于37℃静置培养20h，得到发酵乳杆菌ZLT 11种子液、发酵乳杆菌ZLT 305种子液、植物乳杆菌ZLT 22种子液、植物乳杆菌ZLT 25种子液。
发酵液制备：将上述四种种子液分别按照1％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，分别得到发酵乳杆菌ZLT 11菌液、发酵乳杆菌ZLT 305菌液、植物乳杆菌ZLT 22菌液、植物乳杆菌ZLT 25菌液。
冻干粉制备：将上述四种菌液分别在4℃，3000r/min的条件下离心分离收集湿菌体，再分别用无菌水洗涤2次后放入冷冻干燥器内冻干收集，分别得到发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉。
活菌混合：在纯化青稞β-葡聚糖中添加发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉、发酵乳杆菌ZLT305冻干粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉，每株菌活菌数的添加量为2.86×109CFU/g青稞β-葡聚糖(纯品)，混合均匀即得青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌剂的功能制剂。
实施例3：青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂对体重、进食量和脏器系数的影响
1.动物分组及干预
所有小鼠适应性饲养一周后，12只野生型小鼠作为空白对照组(NC)，72只APP/PS1小鼠分为模型组(M)、酵母β-聚葡萄糖组(Y)、青稞β-葡聚糖组(Q)、青稞β-葡聚糖+乳酸杆菌(P)，每组12只。其中乳酸杆菌由发酵乳杆菌ZLT11、发酵乳杆菌ZLT305和植物乳杆菌ZLT22、植物乳杆菌ZLT 25按照1：1：1：1的质量比例混合而成。实验进行12周。5组分组详情如下：
空白对照组(NC)：饲喂普通小鼠维持饲料；
模型组(M)：饲喂普通小鼠维持饲料；
酵母β-葡聚糖组(Y)：饲喂添加7％酵母β-葡聚糖(纯品)的饲料(酵母β-聚葡萄糖(纯品)含量为0.07g/g饲料)；
青稞β-葡聚糖组(Q)：饲喂添加7％青稞β-葡聚糖(纯品)的饲料(青稞β-聚葡萄糖(纯品)含量为0.07g/g饲料)；
青稞β-葡聚糖+乳酸杆菌组(P)：饲喂添加7％青稞β-葡聚萄糖+4株乳酸杆菌(每株菌活菌含量均为2×108CFU/g饲料，青稞β-聚葡萄糖(纯品)含量为0.07g/g饲料)的饲料。
2.体重变化
每周记录一次小鼠体重，结果如表2所示。
表2各组体重变化
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表2可以看出，在实验开始前各组APP/PS1小鼠体重无显著性差异，NC组小鼠的体重平均略高于M、Y、Q、P组小鼠体重；在第2-9周期间，M组小鼠体重与NC组有显著性差异，但是在第10-12周期间恢复正常；在整个实验个过程中，与NC、M组小鼠相比，Y、Q和P各组小鼠体重无显著性差异，表明Y、Q和P组对小鼠体重没有影响，各组小鼠正常稳定生长。
3.进食量变化
每周第一天称量给小鼠添加的饲料重量并记录，最后一天称量剩余饲料并记录，计算一周的进食量。如表3所示为各组进食量情况。
表3各组进食量变化
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表3可以看出，在整个实验过程中，M组与NC组小鼠的进食量没有显著性差异；在第2-10周期间，与M组相比，Y组与Q组小鼠的进食量显著增加；在第4-9周期间，P组与Y、Q组小鼠的进食量有显著降低，这些结果表明青稞β-葡聚糖促进小鼠肠道蠕动，增加饮食，结合表1分析，饮食量变化并未对各组小鼠体重产生较大的影响。
4.脏器系数变化
小鼠宰杀后解剖取心脏、肝脏、肾脏、脾脏和胸腺，将取下来的器官应生理盐水冲洗去血污，然后用滤纸吸干水分，再进行称重记录。表4所示为各组脏器系数情况。脏器系数计算公式如下：
脏器系数＝脏器质量(g)/总体重(g)
表4各组脏器系数变化
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表4可以看出，各组小鼠的脏器系数(心脏、肝脏、肾脏、脾脏和胸腺)没有显著差异，表明青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂对小鼠器官没有影响。
实施例4：青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂对记忆能力的改善作用
1.空间识别
在实验前30min被带进试验室，让它们熟悉环境。第1d让小鼠在没有物体的情况下自由探索盒子5min。第2d，小鼠进行训练实验。期间，两个相同的物体被放置在箱子内同一侧、距箱壁相同距离的位置，距离最近的角落相同。这些老鼠被允许在盒子中探索两相同物体5min，然后返回它们的笼子。20min进行测试，小鼠被放到箱子里。此时两个熟悉的物体中的一个被移动相对的位置，开始5min的测试阶段。在测试阶段中使用的两个物体在大小、形状和颜色完全相同。它们被固定在箱子的地板上，以避免移动。为了排除嗅觉线索的存在，每次试验后，整个箱子和物体都用水和酒精彻底清洗。物体探测时间被定义为动物用鼻子在2cm范围内对物体进行探测，或用鼻子或爪子对物体进行探测的时间长度。在训练阶段，使用以下公式计算训练阶段的位置偏好和测试阶段的空间辨别指数(DiscriminationIndex,DI)。
DI＝(T2-T1)÷(T1+T2)
式中：
T1：小鼠探测熟悉位置物体的时间(S)
T2：小鼠探测对角位置物体的时间(S)
各组小鼠在空间识别实验中的识别指数见表5。
表5各组空间辨别指数
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表5可以看出，M组与NC组相比，空间辨别指数极显著降低。Q、P和Y组分别与MC组相比空间辨别指数均极显著上升，其中P组的空间辨别指数上升最明显，比Y组的辨别指数增加了16.7％，与Q组相比增加了7.7％。可见，青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂均能有效改善记忆损伤模型小鼠的记忆能力；另外，青稞β-葡聚糖的改善效果优于酵母β-葡聚糖；而青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂的改善效果不仅优于酵母β-葡聚糖，而且优于青稞β-葡聚糖。
2.新物体识别
在空间识别实验结束后第2d(即实验第3d)。小鼠先进行训练实验，期间，两个相同的物体被放置在箱子内同一侧、距箱壁相同距离的位置，距离最近的角落相同。这些老鼠被允许在相同的物体上探索5min，然后返回它们的笼子。20min进行测试，小鼠被放到箱子里。此时两个熟悉的物体中的一个被换成一个新的，开始5min的测试阶段。在测试阶段中使用的两个物体在形状和颜色上都不同，但大小相同。它们被固定在箱子的地板上，以避免移动。为了排除嗅觉线索的存在，每次试验后，整个箱子和物体都用水和酒精彻底清洗。物体探测时间被定义为动物用鼻子在2cm范围内对物体进行探测，或用鼻子或爪子对物体进行探测的时间长度。在训练阶段，使用以下公式计算训练阶段的位置偏好和测试阶段的识别指数(recognition index,RI)。
RI＝(T4-T3)÷(T3+T4)
式中：
T3：小鼠探测熟悉物体的时间(S)
T4：小鼠探测新物体的时间(S)
各组小鼠在新物体识别实验中的新物体识别指数见表6。
表6各组新物体识别指数
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表6可以看出，M组与NC组相比，新物体辨别指数极显著降低。Q、P和Y组分别与MC组相比新物体辨别指数均极显著上升，其中Q组的新物体辨别指数上升最明显，比Y组的辨别指数增加了6.25％。可见，青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂均能有效改善记忆损伤模型小鼠的记忆能力，且青稞β-葡聚糖的改善效果优于酵母β-葡聚糖。
实施例5：青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂对大脑生化指标的作用
1.HE染色(苏木精—伊红染色法)(本节中出现的Ⅰ、II、Ⅲ等表示第一份试剂、第二份试剂和第三份试剂，每份试剂相同)
取小鼠组织用4％多聚甲醛进行固定24h备用。
将组织放入包埋盒中置于梯度酒精中进行脱水。75％酒精2h，85％酒精2h，90％酒精1.5h，95％酒精2h，无水乙醇I 2h，无水乙醇II 2h。
脱水后进行透明处理。二甲苯I 40min，二甲苯II 40min。
浸蜡：65℃浸入石蜡I中0.5h，65℃浸入石蜡II中1h，65℃浸入石蜡II I2h。
包埋：先将融化的蜡放入包埋框中，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出于-20℃冷却，蜡凝固后取出并修整蜡块。
切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚5μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片捞起，放入60℃烘箱内烤片。将水烤干后取出常温保存备用。
脱蜡染色：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min，二甲苯II20min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇II5min-75％酒精5min，自来水洗。对切片进行苏木素染液染3-5min，水洗，分化液分化，水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，放入伊红染液中染色5min。切片依次放入无水乙醇I 5min无水乙醇II 5min，无水乙醇Ⅲ5min，二甲Ⅰ5min，二甲苯II5min，中性树胶封片。
大脑海马HE染色结果如图1所示，NC组小鼠神经细胞形态完整，排列紧密，没有明显的病理损伤；M组小鼠有神经元细胞形态固缩，染色加深；与MC组相比，Q、P和Y组神经元排列较为整齐，固缩深染细胞减少。
2.尼氏染色(本节中出现的Ⅰ、II、Ⅲ等表示第一份试剂、第二份试剂和第三份试剂，每份试剂相同)
取出小鼠大脑组织，将其放在4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片。
脱蜡：将石蜡切片在65℃烘箱中烘烤40-60min，后用二甲苯(I)、(I)浸泡，各15min；
水化：无水酒精(100％乙醇)2min，下行至90％、80％、70％酒精各2min,
蒸馏水(I)、(II)各2min；
染色：石蜡画圈，用滴管滴加焦油紫在脑片上，放湿盒15s；
流水浸洗：把玻片装入玻片铁架子里，在1L烧杯里用自来水对玻片进行流水浸洗；
脱水：先在通风橱外的70％酒精浸没，时长2-3s，以颜色适宜为准，再放入通风橱中脱水，70％、80％、90％2-3s，100％酒精I、II各1min，二甲苯I、II各2min；
封片：上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去。显微镜观察形态变化。
各组大脑海马神经元细胞情况如图2所示。NC组大脑海马尼氏小体较大且数量较多，表明神经细胞内蛋白质合成活性较强，M组大脑海马尼氏小体数量减少，染色浅，染色不清晰，Q、P和Y组小鼠大脑这种情况得到明显改善。
3.Western blot检测大脑中P-tau蛋白表达
细胞总蛋白提取：取肝脏组织用磷酸缓冲液(PBS)将血污冲洗后，剪成小块置于匀浆管中。加入1～2个2mm的匀浆珠，加入10倍组织体积裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)置于均质匀浆机中匀浆。完成匀浆后，将匀浆管置于冰上30min。为了确保组织完全的裂解，期间每隔5min震荡一次，然后12000r/min离心10min收集上清。
蛋白浓度测定：用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
蛋白变性：将蛋白溶液按照4:1的比例加入5x(表示浓度)蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，于-20℃冰箱保存备用。
SDS-PAGE电泳：清洗晾干玻璃板，安装后检查是否漏胶。配制10％分离胶和5％浓缩胶。
10％分离胶配制方法：H2O 4mL、30％丙烯酰胺(29：1)3.3mL、1.5M TRIS-HCl(TRIS：三羟甲基氨基甲烷，HCl：盐酸)(pH 8.8)2.5mL、10％SDS(十二烷基硫酸钠)0.1mL、AP(过硫酸铵)0.1mL和，TEMED(四甲基乙二胺)5uL总体积10mL。
5％浓缩胶配制方法：H2O 4mL、30％丙烯酰胺(29：1)1mL、1M TRIS-HCl(pH 6.8)1mL、10％SDS 80μL、AP 60μL和TEMED 8uL，总体积6mL。
加入分离胶至适当高度，加纯水静置30min至分离胶凝固，倒掉上层水并吸干。将浓缩胶填满空余空间，拔掉梳子，静置30min。
将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。直至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。
转模：准备7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。小心剥下分离胶放在滤纸上，将PVDF膜盖于胶上，不要有气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，300mA恒流转膜半小时。转膜过程中将转膜的槽子放在冰水中降温。
免疫反应：转好膜后室温下用5％的脱脂牛奶在脱色摇床上封闭1h。稀释一抗(TBST溶解的5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5％ BS)，4℃孵育过夜。用TBST(缓冲液：Tris-HCl缓冲盐溶液和TWEEN 20(吐温20)配制而成)在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
曝光、凝胶图像分析：在暗室中将ECL(显影液)和ECL(显影液)两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层手套或者其他透明薄膜，将PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1-2min后，去尽残液，盖上上面的一层薄膜开始曝光。曝光后的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。大脑中P-tau蛋白的表达量如表7所示。
表7海马中磷酸化tau蛋白水平
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表7可以看出，Q、P、Y组与M组相比P-tau表达量均显著下降，且Q组与Y组相比P-tau表达水平分别降低了36％；P组与Y组相比P-tau表达水平降低了14.7％。结果表明，青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂均对小鼠大脑tau蛋白磷酸化具有显著的抑制作用，其抑制效果均优于β-酵母葡聚糖。
4.脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达水平
取匀浆管加入1mL RNA提取液冰上预冷后加入100mg组织，在匀浆机上研磨至无可见块状组织。离心(12000rpm，10min)取上清。
上清中加入250μL三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min，离心(12000rpm，10min，4℃)。
弃掉液体，对管底白色RNA沉淀用1.5mL75％乙醇进行洗涤，离心(12000rpm，5min，4℃)。
吸干液体，离心管置于超净台上吹3min后加入15μL无RNA酶的水溶解RN，55℃孵育5min。
检测RNA浓度及纯度，使其最终浓度为100-500ng/μL，备用。
将含有2μg RNA的溶液加入PCR管中，加入0.5μL Oligo(dT)18Primer和0.5μLRandom Hexamer primer，去离子水补至15μL于PCR仪上65℃保温5min后迅速置于冰上冷却。
依次加入4μL 5×Reaction Buffer，1μLRT Enzyme Mix，混匀。于PCR仪上42℃保温60min，结束后70℃保温5min灭活反转录酶。
取0.2mL PCR管配置反应体系2×qPCR Mix 7.5μL，2.5μM基因引物1.5μL，反转录产物2.0μL，ddH2O 4.0μL。
PCR扩增条件为预变性(95℃，10min)，变性(95℃，15s)，退火/延伸(60℃，60s)，溶解曲线(60℃-95℃，每15s温度提升0.3℃)。
结果处理使用△△CT法(Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。)
表达倍数＝2-K
＝CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)
＝CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)
K＝A-B
其结果如表8所示。
表8各组大脑中BDNF mRNA表达水平
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
脑源性神经营养因子(BDNF)是中枢神经系统中含量最丰富的神经营养因子之一，可以促进神经元的生成和生长,改善突触的可塑性，与学习和记忆相关，在痴呆的病因学中发挥着重要作用。在海马、皮层和基底前脑等受AD型病理影响的脑区，BDNF的水平下降，其中顶叶皮质BDNF蛋白的减少已被证明与认知能力下降相关，提示这种下降可能与痴呆等的发病机制有关。从表8可以看出，P、Q、Y组与M组相比BDNF mRNA的相对表达水平均显著上升。与Y组相比，Q、P组BDNF的mRNA相对表达水分别上升13.3％和9.6％。结果表明，青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂均能有效增加小鼠大脑脑源性神经营养因子(BDNF)水平，进而改善记忆能力；其改善效果均优于酵母β-葡聚糖。
5.大脑中氧化因子的变化
准确称取小鼠大脑组织，按重量(mg)：体积(μL)＝1:9的比例加入9倍体积的0.9％的生理盐水，冰水浴条件下，机械匀浆，制备成10％的匀浆液。3000r/min，离心10min，取上清液分别按照GSH-PX试剂盒进行测定。
GSH-PX活力计算：
规定为每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。
结果如表9所示。
表9各组大脑中GSH-PX酶活力的变化
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
从表9可知，与M组相比，Q、P和Y组小鼠大脑中GSH-PX酶活力均显著上升，且P组GSH-PX酶活力上升最多，与NC组接近。与Y组相比，P组的GSH-PX酶活力上升9.0％；与Q组相比，P组的GSH-PX酶活力上升13.3％。结果表明，青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂均能有效降低小鼠大脑的氧化水平，从而有效改善记忆损伤模型小鼠的记忆能力；且青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂的改善效果不仅优于酵母β-葡聚糖，而且优于青稞β-葡聚糖。
实施例6：青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂对肠道菌群结构的作用
无菌取小鼠宰杀前的粪便，将粪便样品送至上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina NovaSeq测序平台进行粪便微生物基因组DNA的提取和质量鉴定、16S rDNA测序及后续生物信息学分析，基本流程如下：
1)上机流程
从样本到数据获得的过程中，会经过DNA提取与检测、PCR扩增、PCR产物的纯化、文库制备及库检。
2)测序数据质量控制
对原始数据(Raw Data)进行拼接、过滤干扰数据(Dirty Data)，最终得到有效数据(Clean Data)。
3)OTU聚类和物种注释
为研究各样本的物种组成，对所有样本的Effective Tags，以97％的一致性(Identity)进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，之后进行物种注释。
如图3和表10所示为肠道菌群在门水平上的分布情况。
表10各组肠道微生物门水平的相对丰度
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01；与P组相比，∨P<0.05，∨∨P<0.01。
从图3和表10可知，各组小鼠肠道中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、弯曲菌门(Campilobacterota)、放线菌门(Actinobacteria)、脱硫菌门(Desulfobacterota)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)、髌骨菌门(Patescibacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacterota)和蓝菌门(Cyanobacteria)共占肠道菌群总量95％以上。与M组相比，Y、P和Q组中Firmicutes的相对丰度降低，其中Q组相对丰度显著下降；Y、Q、P组中Campilobacterota和Deferribacterota相对丰度显著上升；Q组Actinobacteriota相对丰度显著上升；Y、P和Q组Desulfobacterota相对丰度上升，其中P组相对丰度极显著上升。与Y组相比，Q组Campilobacterota、Actinobacteriota和Deferribacterota相对丰度显著上升；P组Desulfobacterota和Deferribacterota相对丰度显著上升。与Q组相比，P组Campilobacterota和Actinobacteriota相对丰度显著降低，同时Desulfobacterota和Deferribacterota相对丰度显著上升。
如图4和表11所示为肠道菌群在属水平上分布情况。
从图4和表11可以看出，与M组相比，Y、Q、P组中Desulfovibrio的相对丰度显著上升，Lactobacillus和Lactococcus的相对丰度显著下降；Y组中norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、Rikenella和
Eubacterium_nodatum_group的相对丰度显著降低；Q、P组中
norank_f__Erysipelotrichaceae、norank_f__Ruminococcaceae、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、Eubacterium_nodatum_group的相对丰度上升。与Y组相比，Q、P组中norank_f__Erysipelotrichaceae、Lactococcus、Eubacterium_nodatum_group和Anaerofustis的相对丰度显著上升。与Q组相比，P组中Lactobacillus、Desulfovibrio、
norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group的相对丰度均上升，Desulfovibrio、norank_f__Erysipelotrichaceae和Anaerofustis相对丰度均下降。
表11各组肠道微生物属水平的相对丰度
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01。
大量研究表明，肠道微生物群可能影响海马体依赖性学习、记忆和行为；益生菌通过作用于肠道微生物群来调节学习和记忆。Desulfovibrio可产生硫化氢(H2S)，激活AKT途径，改善胰岛素抵抗。与NC组相比，M组脱硫弧菌的相对丰度显著下降，但经P、Q、Y干预后恢复，其中P组恢复效果最好，表明青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂和青稞β-葡聚糖治疗可以恢复了脱硫弧菌的相对丰度而不会引起过度生长。norank_f__Ruminococcaceae、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、Rikenella、Eubacterium_nodatum_group、Anaerofustis和Lachnospiraceae_UCG-006可以增加肠道短链脂肪酸(SCFA)的产生。SCFA是主要由肠道菌群利用未消化的纤维和蛋白质产生的代谢物，可以调节肠上皮屏障(IEB)通透性和保持肠道屏障完整性，维持宿主免疫系统的稳态和葡萄糖稳态；另一方面，微生物群及其代谢可以驱动免疫功能，其特征是细胞因子信号释放，从而改变神经元和神经胶质细胞的激活状态和生理机能，并最终提高记忆能力。SCFA已被证明会影响神经递质和神经营养因子水平；也是肠道血清素合成和稳态的重要调节剂。Lactococcus可以代谢肠道多糖产生神经递质，对大脑活动产生影响，但是它们在体循环中浓度过高会导致不良的代谢和神经生物学影响。
上述结果显示，青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂和青稞β-葡聚糖均能够调节肠道菌群结构，有利于肠道健康，促进SCFA的产生，调节神经递质的产生，从而起到抗炎、调节脑部细胞发育和改善记忆的作用。
实施例6：青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合益生菌制剂对肠道代谢的作用
1)代谢物提取
分别取100mg液氮研磨各组小鼠盲肠内容物样本，置于EP管中，加入500μL含0.1％甲酸的80％甲醇水溶液，涡旋震荡，冰浴静置5min，15000rpm、4℃离心10min，取一定量的上清液加质谱级水稀释至甲醇含量为53％，并置于带有0.22μm滤膜的离心管中15000g、4℃离心10min，收集滤液，进样LC-MS进行分析。
2)液相色谱条件
色谱柱：Hyperil Gold column(C18)，柱温：40℃；流速：0.2mL/min，正模式：流动相A：0.1％甲酸，流动相B：甲醇，负模式：流动相A：5mM醋酸铵，pH＝9.0，流动相B：甲醇；色谱梯度洗脱程序如表12所示。
表12液相色谱梯度洗脱条件
3)质谱条件
扫瞄范围选择m/z 70-1050；ESI源设置如下：Spray V oltage:3.2kV；Sheath gasflow rate:35arb；Aux Gas flow rate:10arb；Capillary Temp:320℃.Polarity:positive；negative；MS/MS二级扫瞄为data-dependent scans。
4)数据分析
首先使用Compound Discoverer 3.1软件对原始数据进行谱图处理及数据库搜索，得到代谢物的定性定量结果，然后对数据进行质控保证数据结果的准确度、可靠性。接下来对代谢物进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)等，以分析两组代谢物的差异。最后，通过对代谢物所涉及代谢通路的分析来探究代谢物代表的生物学意义。
小鼠在不同饲料饲喂方式之下，肠道菌群代谢物产生了不同的变化。分析并对比各组显著变化的代谢物，发现了一些生物活性物质，如L-组氨酸、异亮氨酸、血清素、色氨酸、γ-氨基丁酸、褪黑素、香草酸、谷氨酰胺、3H多巴胺、丁酸等，如表13所示。与M组相比，L-组氨酸的含量在Y组小鼠肠道中显著增加；异亮氨酸的含量在Q组小鼠肠道中显著增加；血清素、色氨酸的含量在Q、P组小鼠肠道中增加，在Y组小鼠肠道中显著下降；γ-氨基丁酸的含量在P组小鼠肠道中显著增加；褪黑素的含量在Y、Q、P组小鼠肠道中增加，其中Q、P组显著增加；香草酸和3H多巴胺的含量在Y、Q、P组小鼠肠道中显著下降，与NC组趋近；谷氨酰胺的含量在各组小鼠肠道中增加，Q组增加最为显著；丁酸的含量在Y组小鼠肠道中增加，在Q、P组中显著下降，与NC组趋近。与Y组相比，Q、P组小鼠肠道中的异亮氨酸、血清素、色氨酸、GABA、褪黑素的含量都显著增加；与Q组相比，P组中γ-氨基丁酸和褪黑素含量都明显增加。
L-组氨酸是一种半必须氨基酸，其脱羧形成的组胺，这种反应发生在胃的肠嗜铬样细胞、免疫细胞和各种组织中的肥大细胞；组胺能充当大脑的特定区域中的神经递质，控制多种功能，例如睡眠周期、食欲、记忆和压力反应。异亮氨酸是人体必需氨基酸之一，可以改善免疫系统，包括免疫器官、细胞和免疫物质。最近研究表明，异亮氨酸可能诱导宿主的表达防御肽(即β-防御素)，可以调节宿主先天性和适应性免疫。肠道微生物群通过肠内分泌细胞(系统)参与神经递质的产生和释放，从而调节中枢神经系统功能。血清素是一种在中枢神经系统和肠道中均活跃的神经递质，它是由细菌犬尿氨酸生产途径控制的，与情绪波动、认知和昼夜节律周期等大脑功能障碍有关。色氨酸是5-HT合成和其他胺能神经递质血清素的中心氨基酸前体，它不能由人体合成，但肠道细菌能够通过莽草酸途径产生色氨酸；色氨酸的代谢通过微生物群-肠-脑轴调节大脑神经递质信号传导，其在中枢神经系统中的积累与各种神经精神疾病相关。γ-氨基丁酸(GABA)、褪黑素、谷氨酰胺和3H多巴胺是神经递质，在大脑神经系统中起到重要的作用，并与各种精神疾病和记忆相关。其中GABA是一种对信号转导具有抑制特性的主要神经递质，其代谢紊乱已在抑郁等认知障碍中得到证实。丁酸及丁酸盐是一种具有神经保护特性的分子，可以降低促炎介质的水平和增加活化小胶质细胞中抗炎介质的水平来减少小胶质细胞的活化，从而提供神经保护作用；它还是一种重要的能量底物，可增加线粒体ATP的产量；还可以恢复血脑屏障的完整性。香草酸(VA)是苯甲酸的衍生物，具有多种生理功能，例如抗氧化、抗炎、免疫刺激、神经保护、肝脏保护、心脏保护和抗细胞凋亡。据报道，香草酸具有减轻Aβ1-42引起的认知障碍和氧化应激的潜力，因此有助于改善记忆损伤。
由上所述可知，青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂均能够调整肠道的代谢谱，促进肠道中异亮氨酸、血清素、色氨酸、γ-氨基丁酸、褪黑素、谷氨酰胺等有益代谢产物的富集，进而通过肠脑神经、迷走神经、外周血液等作用于大脑中枢神经系统，调节神经递质代谢，起到改善记忆的作用。
对肠道差异代谢通路分析，结果如表14所示。与M组相比，Y组小鼠中色氨酸代谢、α-亚麻酸代谢和甘油磷脂代谢通路显著富集；Q组小鼠体内的色氨酸代谢和甘油磷脂代谢通路极显著富集；P组小鼠体内的色氨酸代谢、丁酸代谢、甘油磷脂代谢和酪氨酸代谢。与Y组相比，Q组亚油酸代谢、色氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢和酪氨酸代谢通路显著富集；P组亚油酸代谢、色氨酸代谢、丁酸代谢、α-亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢和酪氨酸代谢通路显著富集。
与Q组相比，P组组氨酸代谢、色氨酸代谢和甘油磷脂代谢通路显著富集。
表14各组肠道差异代谢物通路富集表
注：与MC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Y组相比，#P<0.05，##P<0.01；与Q组相比，&P<0.05，&&P<0.01；与P组相比，∨P<0.05，∨∨P<0.01。
从上述实施中发现，本发明中提供的青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合益生菌的制剂能够通过抑制大脑中tau蛋白磷酸化，提高大脑GSH-PX酶活性，改善神经元退化和突触损伤，调整肠道菌群结构和肠道代谢谱来改善记忆损伤模型小鼠的记忆能力。与酵母β-葡聚糖相比，青稞β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂改善记忆能力的效果均有所增强。另外，青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌制剂对记忆能力的改善效果总体上优于青稞β-葡聚糖。
本发明方法采用青稞麸皮作为β-葡聚糖生产的原料，一方面解决了青稞麸皮作为废弃物带来的环境污染问题，减少了浪费，同时实现了资源的再利用，另一方面由于青稞麸皮作为废弃物，其原料成本几乎可以不计，而生产的青稞β-葡聚糖又具有很好的应用前景和经济效益。根据计算我国藏区每年消耗青稞所产青稞麸皮可达37.8万吨，利用废弃的青稞麸皮生产青稞β-葡聚糖所创造的经济价值高达到3亿元以上，从而可增加藏区农牧民收入，延长产业链，增加附加值，带动当地经济发展。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种具改善记忆能力的制剂，其特征在于，包括青稞β-葡聚糖。
2.如权利要求1所述的具改善记忆能力的制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)原料粉碎：将青稞籽粒去除发霉变质部分，烘干，粉碎青稞，取麸皮粉碎过80目筛，制成青稞麸皮粉；
2)超声波辅助浸提：将烘干的青稞麸皮粉与水按g/ml为1:5的比例混合，将混合液在超声功率为500W，温度45℃下超声辅助提取50min；
3)酶解、离心：取超声波处理后青稞麸皮粉混合液水浴加热，按照每克青稞麸皮粉加入25U的比例加入耐高温α-淀粉酶，于90℃酶解40min后，升温至100℃灭酶30min；然后按照每克青稞麸皮粉加入2.5U的比例加入胰酶，于pH 8.0、38℃酶解2h，升温至90℃灭酶30min；将酶解液连续离心，条件为14000r/min；
4)95％乙醇沉淀、过滤：取上清加入三倍体积的95％乙醇，4℃沉淀12h；用G2砂芯漏斗对含有絮状沉淀的浑浊液进行过滤，固体用70％乙醇洗涤两次，70℃烘箱烘干，得到粗提青稞β-葡聚糖；
5)复水溶解、冻融、过滤：将粗提青稞β-葡聚糖固体用纯水按照m/v为1:10进行溶解，采用超声波辅助溶解，条件为：500W，60℃，20min，得到青稞β-葡聚糖溶液；室温分装后，放入-18℃冰箱冷冻24h，取出在4℃条件下解冻12h，然后重复冷冻解冻过程两次；再将解冻液通过G2砂芯漏斗过滤，收集絮状凝胶；
6)70％乙醇沉淀、过滤：将絮状凝胶中加入70％乙醇，4℃沉淀12h；用G2砂芯漏斗对含有絮状沉淀的浑浊液进行过滤，滤渣用70％乙醇洗涤两次；
7)干燥制粉：滤渣70℃烘干，用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得到纯化青稞β-葡聚糖。
3.如权利要求1所述的具改善记忆能力的制剂，其特征在于，进一步包括由发酵乳杆菌ZLT 11冻干菌粉、发酵乳杆菌ZLT 305冻干菌粉和植物乳杆菌ZLT 22冻干菌粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干菌粉。
4.如权利要求3所述的具改善记忆能力的制剂，其特征在于，发酵乳杆菌ZLT 11的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ZLT 11；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18206；保藏日期为：2019年7月11日；
发酵乳杆菌ZLT 305的分类命名为：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ZLT 305；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18207；保藏日期为：2019年7月11日；
植物乳杆菌ZLT 22的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT 22；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18208；保藏日期为：2019年7月11日；
植物乳杆菌ZLT 25的分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZLT 25；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC No.18209；保藏日期为：2019年7月11日。
5.如权利要求3或4所述的具改善记忆能力的制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)原料粉碎：将青稞籽粒去除发霉变质部分，烘干，粉碎青稞，取麸皮粉碎过80目筛，制成青稞麸皮粉；
2)超声波辅助浸提：将烘干的青稞麸皮粉与水按g/ml为1:5的比例混合，将混合液在超声功率为500W，温度45℃下超声辅助提取50min；
3)酶解、离心：取超声波处理后青稞麸皮粉混合液水浴加热，按照每克青稞麸皮粉加入25U的比例加入耐高温α-淀粉酶，于90℃酶解40min后，升温至100℃灭酶30min；然后按照每克青稞麸皮粉加入2.5U的比例加入胰酶，于pH 8.0、38℃酶解2h，升温至90℃灭酶30min；将酶解液连续离心，条件为14000r/min；
4)95％乙醇沉淀、过滤：取上清加入三倍体积的95％乙醇，4℃沉淀12h；用G2砂芯漏斗对含有絮状沉淀的浑浊液进行过滤，固体用70％乙醇洗涤两次，70℃烘箱烘干，得到粗提青稞β-葡聚糖；
5)复水溶解、冻融、过滤：将粗提青稞β-葡聚糖固体用纯水按照m/v为1:10进行溶解，采用超声波辅助溶解，条件为：500W，60℃，20min，得到青稞β-葡聚糖溶液；室温分装后，放入-18℃冰箱冷冻24h，取出在4℃条件下解冻12h，然后重复冷冻解冻过程两次；再将解冻液通过G2砂芯漏斗过滤，收集絮状凝胶；
6)70％乙醇沉淀、过滤：将絮状凝胶中加入70％乙醇，4℃沉淀12h；用G2砂芯漏斗对含有絮状沉淀的浑浊液进行过滤，滤渣用70％乙醇洗涤两次；
7)干燥制粉：滤渣70℃烘干，用粉碎机进行粉碎，过80目筛，得到纯化青稞β-葡聚糖；
8)益生菌剂制备：将发酵乳杆菌ZLT 11，发酵乳杆菌ZLT 305、植物乳杆菌ZLT 22和植物乳杆菌ZLT 25菌株活化，扩大培养，离心分离收集湿菌体，再分别洗涤后放入冷冻干燥设备内冻干收集，得到发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉，发酵乳杆菌ZLT 305冻干粉、植物乳杆菌ZLT22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉；
9)活菌混合：在纯化青稞β-葡聚糖中添加发酵乳杆菌ZLT 11冻干粉、发酵乳杆菌ZLT305冻干粉、植物乳杆菌ZLT 22冻干粉和植物乳杆菌ZLT 25冻干粉，每株菌活菌数的添加量为2.86×109CFU/g纯品青稞β-葡聚糖，混合均匀即得青稞β-葡聚糖联合乳酸杆菌剂的功能制剂。
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