CN115381887B - 锦灯笼在缓解鸡急性热应激损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种锦灯笼在制备治疗或缓解鸡热应激损伤药物中的应用，所述药物含有锦灯笼蓿萼的乙醇提取物。本发明提供了锦灯笼在缓解鸡热应激损伤中的应用，可抑制热应激鸡只体温的升高、保护热应激后十二指肠细胞的活性，降低细胞损伤。本发明提供的锦灯笼提取物可以提取自锦灯笼蓿萼，原料易得、成本低。本发明为开发锦灯笼宿萼对家禽的药理作用，降低家禽热应激损伤提供了新的途径。

Description

锦灯笼在缓解鸡急性热应激损伤中的应用
技术领域
本发明属于兽医药领域，涉及一种锦灯笼提取物在缓解鸡急性热应激损伤中的应用。
背景技术
短暂的过高温刺激或长时间持续热应激，可引起机体体温调节及生理机能紊乱，严重时会出现器官衰竭，甚至猝死。家禽具有羽毛丰厚、皮肤无汗腺、代谢旺盛、体温高等特点，其机体状态和生产性能极易受到高温环境的影响。目前，通常采取通风降温结合湿帘等措施降低鸡舍温度。然而，在夏季高温时间段，降温系统达到的效果温度仍会处于32-34℃，对于未投入环控设备的散养户来说，舍内温度甚至超过35℃，导致鸡群处于热应激的亚健康状态。研究发现：鸡舍温度大于30℃，蛋鸡自身体温调节能力下降，食欲减退，造成周产蛋率、蛋重的显著下降；当鸡舍温度达到33-34℃时，蛋鸡的产蛋率会下降8.6%，周平均蛋重最高下降7.21%；当鸡舍平均温度达34℃时，鸡群周死淘率高达0.66%。
在热应激条件下，由于大量血液流向体表以增加散使经肠道的血量减少，黏膜上皮细胞受损且再生能力下降不及时更新最终导致黏膜受损。肠道黏膜是维持肠道内环境平衡和阻碍致病菌及毒素的先天性屏障，热应激可破坏肠道屏障的完整性，引起脂多糖（LPS）或菌群泄露，进而引起全身炎症。十二指肠是肠道的起始段，是重要的消化吸收器官和免疫器官。因此，寻找缓解鸡十二指肠热应激损伤的有效制剂意义重大。
锦灯笼为茄科植物酸浆（Physalis alkekengi L. var. franchetii (Mast.)Makino.）的干燥宿萼或带果实的宿萼。现代药理学分析发现锦灯笼的化学成分主要包括酸浆苦素类、木犀草素、黄酮类、甾醇类、生物碱类、挥发油类、丰富的无机元素和多糖类等，其在抗氧化、抗炎、抗肿瘤和降低血糖、血脂等方面具有显著疗效。然而，目前锦灯笼在缓解家禽热应激方面的应用尚无报道。
发明内容
针对为了减轻鸡急性热应激损伤，尤其十二指肠细胞热损伤，而提供的一种锦灯笼在缓解鸡热应激损伤中的应用。
本发明的另一目的是提供一种减轻鸡急性热应激损伤的锦灯笼宿萼提取物。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种锦灯笼（Physalis alkekengi L. var. franchetii (Mast.) Makino.）在制备治疗或缓解鸡热应激损伤药物中的应用。
所述鸡包括肉鸡和蛋鸡。
所述药物含有锦灯笼蓿萼的乙醇提取物。
一种减轻鸡热应激损伤的锦灯笼提取物，所述锦灯笼提取物为锦灯笼宿萼的乙醇提取物。
上述锦灯笼提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将锦灯笼宿萼粉碎，过筛获得锦灯笼粉末；
（2）称取锦灯笼粉末按照质量体积比（1:8）g/mL加入90%v/v乙醇，超声提取、固液分离，获得提取液；
（3）提取液浓缩或干燥后获得锦灯笼提取物。
优选地，超声提取的功率为250 W，时间为20 min。
为了提高收率，步骤（2）中，超声提取、固液分离可以重复1次到多次。
一种包含上述锦灯笼提取物的兽药或饲料添加剂。
本发明具有以下优点：
本发明提供了锦灯笼在缓解鸡热应激损伤中的应用，可抑制热应激鸡只体温的升高、保护热应激后十二指肠细胞的活性，降低细胞损伤。本发明提供的锦灯笼提取物可以提取自锦灯笼蓿萼，原料易得、成本低。本发明为开发锦灯笼宿萼对家禽的药理作用，降低家禽热应激损伤提供了新的途径。
附图说明
图1是不同处理受试鸡体温柱状图，其中，*和**表示与对照组0 h相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；#和##表示在同等热应激条件下，1 g/kg组和3 g/kg组与对照组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；
图2是不同处理受试鸡血清皮质醇水平柱状图，其中，*和**表示与对照组0 h相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；#和##表示在同等热应激条件下，1 g/kg组和3 g/kg组与对照组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；
图3是不同处理受试鸡十二指肠绒隐比水平柱状图，其中，*和**表示与对照组0 h相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；#和##表示在同等热应激条件下，1 g/kg组和3g/kg组与对照组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；
图4是不同处理鸡胚十二指肠细胞活性，其中，*和**表示与对照组0 µg/mL相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；
图5是不同处理鸡胚十二指肠细胞中LDH（a）和MDA（b）含量柱状图，其中，*和**表示与对照组0 h相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异；#和##表示在同等热应激条件下，用药组与对照组相比，在0.05和0.01水平上的显著性差异。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 锦灯笼提取物的制备
（1）将锦灯笼宿萼剪碎，置粉碎机内粉碎30 s过20目筛，获得锦灯笼粉末；
（2）称取锦灯笼粉末，按照质量体积比（1:8）g/mL加入90%v/v乙醇，搅拌均匀后超声提取20 min（功率250 W，频率40 kHz），过滤分离沉淀；
向沉淀内再次加入首次加入等量的90%v/v乙醇，超声提取20 min（功率250 W，频率40 kHz），过滤分离沉淀，合并两次上清，即提取液；
（3）提取液以旋转蒸发仪浓缩至1 g/mL，获得锦灯笼浓缩液；存放于-20°C环境中，使用时在在室温下回温至全部溶解即可使用。
实施例2 锦灯笼提取物对鸡热应激的影响
1. 受试鸡热应激模型的构建
取90只SPF鸡随机分为3组，分别为对照组、锦灯笼1 g/kg组、锦灯笼3 g/kg组。鸡只在温度为22°C-24°C，湿度在50%的环境中适应饲养一周。随后，进入为期3 d的给药期：对照组鸡只饲喂正常饮用水，锦灯笼组鸡只饲喂含相应剂量锦灯笼提取物的饮用水。给药结束后，进入热应激处理期，热应激温度为40±1°C，湿度保持在50%，热应激期间按照给药期的饮水饲喂，分别进行0 h、6 h和12 h的热应激处理。
2. 受试鸡只体温的测定
对热应激完毕的鸡立即使用电子体温计测量鸡直肠温度，结果如图1所示。结果表明，热应激会引起鸡只体温的升高，在6 h和12 h时体温平均上涨1°C-1.2°C，呈现极显著上升（P < 0.01），说明热应激模型建模成功。在正常条件下，饮水中添加1 g/kg和3 g/kg锦灯笼提取物对鸡体温没有影响，平均体温在41.4°C。在遭受热应激时，比较相同热应激时间点，发现在6 h时，3g/kg锦灯笼组体温低于对照组0.26°C（P < 0.05）；在12 h时，1 g/kg和3g/kg锦灯笼组较对照组分别下降了0.37°C和0.63°C，均呈极显著性差异（P < 0.01）。这说明，添加锦灯笼提取物能够抑制热应激后SPF鸡体温的升高，且有剂量正相关性。
3. 受试鸡只血清内皮质醇水平的检测
待热应激处理结束后，处死鸡只，收集血液。血液置于4℃环境中过夜，待析出血清后，按照3000 rpm的转速进行离心，收集血清进行检测。血清皮质醇测定采用ELISA检测试剂按照说明书进行，试剂盒购自武汉基因美科技有限公司。结果如图2所示。在饮水添加1g/kg和3 g/kg的锦灯笼提取物，在鸡只热应激0 h、6 h和12 h时均可极显著上调血清内皮质醇含量（P < 0.01），上升程度大致在12%-22%。这说明，添加锦灯笼提取物能够增强受试鸡只在正常条件和热应激条件下抵御应激的能力。
4. 受试鸡十二指肠组织损伤的检测
待热应激处理结束后，处死鸡只，迅速采集受试鸡十二指肠组织，固定于4%的多聚甲醛中。将固定好的十二指肠组织制作石蜡切片，观察小肠绒毛状态。使用光学显微镜测定小肠绒毛长度及隐窝深度，用小肠绒毛长度与隐窝深度的比值评价十二指肠消化能力。
十二指肠组织绒毛长度与隐窝深度的比值如图3所示。热应激会导致十二指肠绒隐比的下降，在热应激至6 h时最为严重，约下降了25%，具有显著性差异（P < 0.05），说明热应激对受试鸡十二指肠组织造成了损伤。在添加锦灯笼提取物后，绒隐比均呈现不同程度地上涨，相比各时间点对照组，上涨幅度在30%-70%不等。这说明，添加锦灯笼提取物能够抑制热应激对受试鸡十二指肠组织的损伤。
实施例3 锦灯笼提取物对热应激鸡胚十二指肠细胞的影响
1. 鸡胚十二指肠细胞的分离与培养
16日龄SPF鸡胚，酒精棉球擦拭蛋壳消毒后，用镊子敲碎蛋壳并沿气室去掉蛋壳，取出胚体。用眼科剪剖开腹腔，完整取出十二指肠，置于D-Hank’s溶液。小心分离去除十二指肠中间的胰腺组织，用D-Hank’s溶液清洗获得的十二指肠组织。采用弯头镊小心捋出十二指肠内的肠粘膜，经800 rpm转速离心15 min，收集肠粘膜组织。向粘膜组织中加入终浓度为1 mg/mL的胶原酶I，置于细胞培养箱中消化30 min，中间每隔10 min用微量移液器吹打重新悬起组织沉淀。待组织消化至单个细胞后，加入等量的含20%血清的DMEM/F12培养基终止消化。经800 rpm转速离心15 min，收集细胞，加入含20%血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，过200目的细胞筛后按照1×106/mL的密度进行布板，置于细胞培养箱中培养，24 h后，换液备用。
2. 锦灯笼提取物最佳作用浓度的筛选
将分离的鸡胚十二指肠细胞接种于96孔板内，待细胞融合度达70%-80%时，弃掉细胞培养液，换含有不同浓度梯度的锦灯笼提取物的细胞培养基，每个浓度设置3个平行。待药物作用16 h后，更换含有相同浓度锦灯笼提取物的培养基，置于42°C细胞培养箱中热应激0 h、5 h和10 h，弃掉上清，PBS清洗2次，加入含10% CCK-8的培养基，置于37°C培养箱内孵育 2 h，在450 nm波长下检测吸光值，确定细胞活性。
结果如图4所示，锦灯笼提取物的浓度在300 µg/mL以内，对细胞活性没有影响（P> 0.05），为作用于细胞的安全浓度。锦灯笼提取物浓度在100 µg/mL时可极显著性提高热应激10 h和5 h时的细胞活性（P < 0.01），因此后续细胞试验选择锦灯笼提取物浓度为100µg/mL作为缓解热应激的用药浓度。
3. 锦灯笼提取物缓解鸡胚十二指肠细胞热应激损伤的作用
分离的鸡胚十二指肠细胞，然后随机分为2组，分别为对照组和锦灯笼组。待细胞融合度达70%-80%时，弃掉细胞培养液，对照组更换为正常的培养基，锦灯笼组更换为含100μg/mL锦灯笼提取物的培养基。待药物作用16 h后，重新按照组别更换相应的培养基，并置于42°C细胞培养箱中分别热应激0 h、5 h和10 h。热应激结束后收集细胞上清液和细胞样品，用于损伤相关指标乳酸脱氢酶（LDH）和丙二醛（MDA）的检测，检测均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行，检测操作步骤按照试剂盒说明书进行。
结果如图5所示：细胞在遭受热应激时，LDH活性随着热应激时间的延长而上升，说明热应激对鸡胚十二指肠细胞造成了损伤。添加锦灯笼提取物可抑制同等热应激条件下LDH的释放，在0 h和5 h呈现极显著性差异（P < 0.01），下降幅度分别为13%和25%。这说明添加锦灯笼提取物可以有效抑制热应激对鸡胚十二指肠的损伤。添加锦灯笼提取物可显著降低正常细胞中的MDA的含量（P < 0.05），还可降低热应激5 h时导致的MDA上升（P <0.01），但在热应激10 h时降低效果有限。这说明添加锦灯笼提取物可以有效抑制热应激引起的鸡胚十二指肠脂质过氧化的水平。

Claims (3)

1.一种锦灯笼宿萼的乙醇提取物在制备治疗或缓解热应激致鸡十二指肠损伤药物或饲料添加剂中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，鸡包括肉鸡和蛋鸡。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，锦灯笼宿萼的乙醇提取物的制备方法包括以下步骤：
（1）将锦灯笼宿萼粉碎，过筛获得锦灯笼粉末；
（2）称取锦灯笼粉末按照质量体积比1:8 g/mL加入90%v/v乙醇，超声提取、固液分离，获得提取液；
（3）提取液浓缩或干燥后获得锦灯笼提取物；
超声提取的功率为250 W，时间为20 min。
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