CN111297937A

CN111297937A - 余甘子乙酸乙酯提取物在防治动脉粥样硬化中的应用

Info

Publication number: CN111297937A
Application number: CN202010243192.4A
Authority: CN
Inventors: 邢澍; 刘健敏; 刘文杰; 约翰·K·别利茨基; 周明扬; 潘学芳; 张永春
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明公开了余甘子乙酸乙酯提取物在防治动脉粥样硬化中的应用，提供余甘子乙酸乙酯提取物在制备如下任意一种或多种产品中的应用：低密度脂蛋白的体内体外氧化抑制剂；氧化型低密度脂蛋白引起的巨噬细胞及血管内皮细胞损伤抑制剂；巨噬细胞泡沫化转变抑制剂；巨噬细胞炎症因子分泌抑制剂；巨噬细胞脂质外排促进剂；ABCA1转运蛋白促进剂；ABCG1转运蛋白促进剂。余甘子资源丰富，而余甘子乙酸乙酯提取物易于制备。将其开发为具有防治动脉粥样硬化症功效的食品添加剂、保健食品和药品等相关产品，具有很高的应用价值。

Description

余甘子乙酸乙酯提取物在防治动脉粥样硬化中的应用

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及余甘子乙酸乙酯提取物在防治动脉粥样硬化中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

近年来心脑血管疾病已经成危害人类身体健康的重大威胁，成为造成死亡率最高的疾病，其主要病理基础动脉粥样硬化已成为我国人口死亡的主要原因。据全国老龄办最新统计，截至2017年年底中国60岁以上老年人口达2.4亿，占总人口比重达17.3％。

动脉粥样硬化导致血管内壁空腔变窄，出现脑组织供血不足，同时会伴有斑块脱落，堵塞血管引起部分组织缺血坏死。氧化应激是指机体内组织或者细胞内氧自由基生成增加和清除能力的减弱，导致氧自由基及其相关代谢产物聚集而引起氧化损伤的过程。在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种自由基，其中羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O·)是体内最活泼的活性氧，可导致多种病理变化，包括脂质过氧化。链式反应可能改变脂质的结构，使其更有可能被困在动脉中。低密度脂蛋白是一种运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒，可被氧化成氧化低密度脂蛋白。当氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)过量时，它携带的胆固醇便积存在动脉壁上，促使动脉硬化斑块形成。清除自由基抑制低密度脂蛋白的体内体外氧化，而抑制动脉粥样硬化(AS)斑块的形成，从而到达预防动脉粥样硬化的效果。

血管内皮功能障碍是发生在动脉粥样斑块形成之前的一种早期病理。氧化应激对血管壁细胞具有直接损伤，造成血管内皮损伤。血管的内皮细胞一旦损伤和过度凋亡，血管的通透性就会增强。低密度脂蛋白渗透并积累到皮下，被脂氧合酶及反应性氧集团氧化成大量的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，继而诱导内皮细胞分泌细胞间粘附因子以及巨噬细胞趋化因子，促进单核细胞穿过血管内膜分化为巨噬细胞。通过清道夫受体和CD36，巨噬细胞吞噬掉大量的ox-LDL，在溶酶体作用下分解为游离的脂质颗粒存在于细胞体内，使巨噬细胞变为重且圆润的泡沫细胞。氧化型低密度蛋白刺激内皮细胞产生炎性标志物，参与泡沫细胞的形成，对内皮细胞具有细胞毒性作用，抑制组织巨噬细胞的运动，并抑制一氧化氮诱导的血管舒张；抑制巨噬细胞炎症因子分泌。氧化低密度脂蛋白能强烈吸引单核细胞进入动脉壁转变成巨噬细胞。不仅如此，氧化低密度脂蛋白还能抑制巨噬细胞的游走，使之在局部停滞。抑制正常低密度脂蛋白转变为氧化型低密度脂蛋白，进而抑制氧化型低密度脂蛋白引起的巨噬细胞及血管内皮细胞损伤，具有预防动脉粥样硬化的效果。

巨噬细胞在动脉粥样硬化的发展中起着核心作用，它通过促进脂质在动脉壁中的滞留以及局部炎症反应的放大而发挥作用，在病变易发区侵入内皮下间隙的脂蛋白经过进一步的修饰，导致氧化低密度脂蛋白ox-LDL的大量积累。继而，循环中的单核细胞被招募并分化为巨噬细胞，吸收沉积在动脉壁中的ox-LDL，最后转化为富含脂质的泡沫细胞。巨噬细胞泡沫细胞中胆固醇酯的大量积累是由于清除剂受体(SRS)的过度表达，包括a类清除剂受体(SR-A)和b类SR(CD36)。相反，反向胆固醇转运介导胆固醇从巨噬细胞泡沫细胞流出到细胞外受体，如高密度脂蛋白(HDL)和载脂蛋白AI。巨噬细胞泡沫细胞中的细胞胆固醇和脂质含量是由SRS和反向胆固醇转运的净效应决定的。ATP结合(ABC)转运蛋白如ABCA1和ABCG1是反向胆固醇转运系统的成主要员，在预防巨噬细胞泡沫细胞形成中起着至关重要的作用。

余甘子果实富含丰富的各类营养物质，食药两用，可生津止渴，润肺化痰，治咳嗽、喉痛，解河豚鱼中毒等。初食味酸涩，良久乃甘，故名“余甘子”。树根和叶供药用，能解热清毒，治皮炎、湿疹、风湿痛等。由此，余甘子具有很大的科研及应用潜力价值。有文献报道，余甘子果汁或乙醇粗提物对家兔动脉粥样硬化具备一定治疗效果，但治疗机制不明确。现有关于余甘子防治动脉粥样硬化的研究关注点在其抗氧化及降血脂功能。由于动脉粥样硬化的产生由多途径致病，发病机制及治疗靶标较为复杂，所以余甘子果汁或乙醇粗提物无法针对各种途径导致的动脉粥样硬化进行全面有效治疗。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供余甘子乙酸乙酯提取物在治疗动脉粥样硬化症方面的应用。余甘子乙酸乙酯提取物通过抑制动脉粥样硬化症关键发病因素，例如巨噬细胞泡沫化转变、巨噬细胞脂质外排紊乱等，从而可以用于预防、治疗动脉粥样硬化症的药物应用中。

为了解决以上技术问题，本发明的一个或多个实施例提供如下技术方案：

本发明的第一方面，提供余甘子乙酸乙酯提取物在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

以上的“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗动脉粥样硬化相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

余甘子乙酸乙酯提取物是指余甘子果实进行乙酸乙酯萃取、再将提取液蒸干乙酸乙酯溶剂后获得的物质，所以余甘子乙酸乙酯提取物中不包括乙酸乙酯。

本发明的第二个方面，提供一种防治动脉粥样硬化的药物组合物，所述药物组合物由余甘子乙酸乙酯提取物与至少一种其他药物活性成分和/或至少一种其他非药物活性成分构成。

本发明的第三个方面，提供余甘子乙酸乙酯提取物在制备如下任意一种或多种产品中的应用：

低密度脂蛋白的体内体外氧化抑制剂；

氧化型低密度脂蛋白引起的巨噬细胞及血管内皮细胞损伤抑制剂；

巨噬细胞泡沫化转变抑制剂；

巨噬细胞炎症因子分泌抑制剂；

巨噬细胞脂质外排促进剂；

ABCA1转运蛋白促进剂；

ABCG1转运蛋白促进剂。

与现有技术相比，本发明的以上一个或多个实施例的有益效果为：

提供的余甘子乙酸乙酯提取物，可以作为药物抑制体内胆固醇及其载体低密度脂蛋白氧化变成动脉粥样硬化发病关键因子氧化型低密度脂蛋白ox-LDL，并抑制ox-LDL引起的巨噬细胞和血管内皮细胞损伤。经比较实验证明，余甘子乙酸乙酯提取物上述功能相比乙醇总粗提取物或其他溶剂提取物明显占优。针对脂质代谢机制，余甘子乙酸乙酯提取物可以上调脂质转运关键蛋白ABCA1和ABCG1的表达，促进巨噬细胞脂质外排后经HDL等脂载体转运至肝脏处理分解，从而调控细胞内胆固醇的含量正常化，有效地抑制巨噬细胞的泡沫化转变，从根源上阻断动脉粥样硬化的形成。另外，余甘子乙酸乙酯提取物可以抑制巨噬细胞分泌促炎相关细胞因子IL-6，IL-12p70，MCP-1，IFN等的分泌，调控炎症。通过斑马鱼粥样硬化及炎症调控动物模型实验，验证了余甘子乙酸乙酯提取物能够显著抑制脂质沉积及血管粥样斑块形成，并对炎症具有明显抑制作用。

余甘子资源丰富，而余甘子乙酸乙酯提取物易于制备。将其开发为具有防治动脉粥样硬化症功效的食品添加剂、保健食品和药品等相关产品，具有很高的应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例中余甘子提取物制备方法路线；

图2是余甘子提取物自由基清除对比图，其中(1)为不同极性组分浓度为10μg/ml时自由基清除能力对比图；(2)为较大极性组分不同浓度下自由基清除能力对比图；

图3是本发明实施例余甘子各种不同溶剂提取物抑制低密度脂蛋白体外氧化对比图；

图4中，(1)是余甘子的不同溶剂提取物自身对巨噬细胞活力的影响对比图；(2)余甘子的不同溶剂提取物自身对ox-LDL引起的巨噬细胞损伤(细胞活力变化)影响对比图；(3)是不同浓度余甘子乙酸乙酯提取物自身及对ox-LDL引起的巨噬细胞损伤(细胞活力变化)的影响对比图；

图5中本发明实施例7中的试验结果，其中，(1)是余甘子不同溶剂提取物自身对巨噬细胞活力的影响对比图；(2)是余甘子不同溶剂提取物自身对ox-LDL引起的血管内皮细胞损伤(细胞活力变化)影响的对比图；(3)是不同浓度余甘子乙酸乙酯提取物自身及对ox-LDL引起的血管内皮细胞损伤(细胞活力变化)的影响对比图；

图6是本发明实施例8中余甘子乙酸乙酯提取物对ox-LDL引起的巨噬细胞凋亡的影响图；

图7是本发明实施例9中各组不同处理巨噬细胞油红O染色后显微镜下代表性图片及溶解细胞后上清吸光度；

图8是本发明实施例10中余甘子不同溶剂提取物对巨噬细胞促炎性细胞因子相对分泌水平的影响对比图；

图9是本发明实施例11中余甘子乙酸乙酯提取物对巨噬细胞脂质外排(efflux)的影响对比图；

图10是余甘子乙酸乙酯提取物对巨噬细胞脂质外排相关ABC蛋白表达的影响；

图11中，(1)是荧光显微镜下斑马鱼模型尾静脉血管脂质沉积；(2)斑马鱼模型尾静脉血管脂质沉积荧光强度统计图；

图12中，(1)是荧光显微镜下斑马鱼模型斑马鱼侧线神经丘细胞区域中性粒细胞；(2)斑马鱼侧线神经丘细胞区域中性粒细胞统计图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个具体实施方式中，提供余甘子乙酸乙酯提取物在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

以上的“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗动脉粥样硬化相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

具体可为：将中药材余甘子粉碎后，使用索氏提取器，以乙酸乙酯(ethylacetate，EA)提取，或以乙酸乙酯溶剂直接提取；或将余甘子粉末于70％乙醇-水溶液中回流提取，将提取液依次以乙酸乙酯萃取；或将余甘子鲜果榨汁后用乙酸乙酯萃取；得乙酸乙酯提取液；

然后，过滤或离心乙酸乙酯提取液，以旋转蒸发仪浓缩蒸干溶剂，得到干膏或冷冻干燥得到冻干粉；视不同目的，将干膏或冻干粉以生理盐水、细胞培养基溶解或以DMSO初步溶解后稀释至DMSO终浓度<0.1％使用。

进一步的，所述预防和/或治疗动脉粥样硬化至少表现在具有如下任意一种或多种用途：

清除自由基而抑制低密度脂蛋白的体内体外氧化；

抑制氧化型低密度脂蛋白引起的巨噬细胞及血管内皮细胞损伤；

抑制巨噬细胞泡沫化转变；

抑制巨噬细胞炎症因子分泌；

促进巨噬细胞脂质外排；

上调脂质转运关键蛋白ABCA1和ABCG1的表达。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种防治动脉粥样硬化的药物组合物，所述药物组合物由余甘子乙酸乙酯提取物与至少一种其他药物活性成分和/或至少一种其他非药物活性成分构成。

余甘子乙酸乙酯提取物与至少一种其他药物活性成分配合使用时，可以增强其在防治动脉粥样硬化中的作用，此外，余甘子乙酸乙酯提取物作为其他药物活性成分的替代或补充，还可以与其他非药物活性成分组合使用。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到特定组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

药物组合物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

低密度脂蛋白的体内体外氧化抑制剂；

巨噬细胞泡沫化转变抑制剂；

巨噬细胞炎症因子分泌抑制剂；

巨噬细胞脂质外排促进剂；

ABCA1转运蛋白促进剂；

ABCG1转运蛋白促进剂。

实施例1.余甘子乙酸乙酯提取物的制备

如图1所示，将中药材余甘子粉碎至粒径为20目，按液料比1:10，使用索氏提取器，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水分别提取。即，在索氏提取器提取室中加入余甘子粉末100克，索氏提取器烧瓶中加入1000ml氯仿，油浴锅设置70℃，加热提取180分钟。之后，当虹吸回流发生后，停止加热，冷却至室温。小心将氯仿提取液倒出，4000rpm室温离心5分钟，取上清液保留。之后，在索氏提取器烧瓶中加入1000ml石油醚，85℃加热提取180分钟。虹吸发生后，停止加热，冷却至室温。小心将石油醚提取液倒出，4000rpm室温离心5分钟，取上清液保留。乙酸乙酯、正丁醇、水提液同理，依次操作。其中，乙酸乙酯提取时油浴锅设置温度为85℃，正丁醇提取设置温度为120℃，水提取设置温度为105℃。将上述不同极性溶剂提取液分别旋转蒸发，旋蒸温度设定为90℃，至各提取液无溶剂气味，得到浸膏，直接使用或冷冻干燥，称重。视不同目的，将乙酸乙酯提取物干膏或冻干粉以生理盐水、细胞培养基溶解或以DMSO初步溶解后稀释至DMSO终浓度<0.1％，用于后续实验。

实施例2.余甘子乙酸乙酯提取物的制备

如图1所示，将中药材余甘子粉碎至粒径为20目，按液料比1:10，投入圆底烧瓶，加入1000ml 70％乙醇，沸水浴回流提取4h。之后，冷至室温，倒出提取液，4000rpm室温离心5分钟，取上清。旋转蒸发，得到浸膏，直接使用或冷冻干燥，即得到余甘子乙醇粗提物(EC)。将上述粗提物进行进一步纯化，即，将上清依次以同体积石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。即，向1000ml乙醇提取液中首先加入1000ml石油醚，40℃超声1小时后静置分层，分出石油醚萃取液保留。继而，同样方法，萃取得氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取液及最终剩余的70％乙醇提取液。将上述五种提取液分别旋转蒸发，旋蒸温度设定为90℃，至各提取液无溶剂气味，得到浸膏，直接使用或冷冻干燥，称重。视不同目的，将乙酸乙酯干膏或冻干粉以生理盐水、细胞培养基溶解或以DMSO初步溶解后稀释至DMSO终浓度<0.1％，用于后续实验。

实施例3.余甘子提取物的制备

取余甘子鲜果，带核，以中药粉碎机粉碎榨汁，榨汁过程中控制温度防治局部过热。将榨取的果汁分别以等体积石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇及纯水，依实施例2中萃取方法萃取。旋蒸乙酸乙酯萃取物得浸膏，直接使用或冷冻干燥，称重。视不同目的，将干膏或冻干粉以生理盐水、细胞培养基溶解或以DMSO初步溶解后稀释至DMSO终浓度<0.1％，用于后续实验。

实施例4余甘子提取物自由基清除实验

1.实验方法

DPPH自由基清除：配制200μM DPPH溶液，样品浓度为2μg/ml，10μg/ml,20μg/ml，如表1所示。试剂加入完毕后，室温下反应10min，无水乙醇调零，测517nm处的吸光度，样品吸光度为Ax，样品组吸光度为A0，背景组吸光度为Ax0，清除率＝A0-(Ax-Ax0)/A0*100％。

表1

2.实验结果

(1)余甘子提取物不同极性组分浓度为10μg/ml时自由基清除能力，如表2所示。

表2

注：上述均为三次测定平均值。

图2中，(1)图为余甘子提取物自由基清除实验(不同极性组分浓度为10μg/ml时自由基清除能力)。

(2)余甘子提取物不同极性组分不同浓度时自由基清除能力对比表，如表3所示。

表3

注：上述均为三次测定平均值。

图2中，(2)图为余甘子提取物自由基清除实验(较大极性组分不同浓度下自由基清除能力)。

3.结论

余甘子乙醇粗提物及余甘子提取物不同极性组分中极性较大的组分(包括乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物，水提物)对自由基具有很强的清除作用。同浓度下，余甘子乙酸乙酯提取物(E-EA)的清除率高于乙醇粗提物，且高于阳性对照茶多酚。而且，提取物的自由基清除效果随浓度增加，具有剂量依赖性。

实施例5.余甘子乙酸乙酯提取物抑制低密度脂蛋白氧化实验

1.实验方法

低密度脂蛋白(LDL)在体内氧化为氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)从而获得抗原性是动脉粥样硬化疾病起始的关键因素。体外可以利用TBARS实验(硫代巴比妥酸反应物)测定某种物质对LDL氧化的影响，其原理是利用Cu²⁺作为氧化剂将LDL氧化形成醛类物质，与硫代巴比妥酸TBA反应产生在532nm处有特征光吸收的粉色物质。

反应体系配制如表4所示。

表4

注：余甘子提取物以DMSO溶解。茶多酚及待测余甘子提取物终浓度均为10μg/ml。各组中DMSO终浓度均为0.1％。

抑制率(％)＝(空白对照组OD值-样品组OD值)/空白对照组OD值*100％。

2.实验结果，如表5所示。

表5

图3为余甘子提取物抑制低密度脂蛋白体外氧化对比图。

3.结论

结果显示，余甘子乙酸乙酯提取物可以明显抑制铜离子模拟体内自由基而引起的低密度脂蛋白氧化，其抑制率达50％以上，明显高于乙醇粗总提取物或其他不同极性提取物，与阳性对照茶多酚相当或优于。

实施例6.余甘子乙酸乙酯提取物对ox-LDL引起巨噬细胞损伤的影响

1.实验方法:

MTT法细胞增殖实验：细胞培养，RAW264.7巨噬细胞,培养基RPMI1640+10％FBS。种植细胞密度为10000每孔于96孔板中，将接种好的96孔板放入培养箱中，至细胞单层铺满孔底，加入终浓度100μg/ml的ox-LDL及不同浓度的待测样品或对照，每组设3个复孔。在考察余甘子不同提取物对巨噬细胞活力变化影响时(包括提取物自身，及提取物与ox-LDL同时作用)，不同提取物刺激细胞时的终浓度均为10μg/ml。5％二氧化碳.37℃培养24-48h，显微镜下观察细胞形态变化。每孔加入100ul 0.5％MTTRPMI1640培养基培养4h，弃掉培养基，每孔加入100ulDMSO溶解细胞，避光摇床上10min，酶标仪检测490nm吸光度。

细胞活力＝(样品吸光度-对照组吸光度)/对照组吸光度*100％。

2.实验结果

(1)余甘子不同提取物自身对巨噬细胞活力变化影响，如表6所示。

表6

图4中，(1)图为余甘子不同提取物自身对巨噬细胞活力的影响。

可以看出，除石油醚提取物(E-PE)外，余甘子的不同提取物包括乙醇粗总提取物对巨噬细胞本身对活力没有显著影响，说明在工作浓度(10μg/ml)其细胞毒性较小。而余甘子石油醚提取物在相同浓度下对细胞具有一定对毒性。

(2)余甘子不同提取物对ox-LDL引起的巨噬细胞损伤(细胞活力变化)影响，如表7所示。

表7

图4中，(2)图是余甘子不同提取物自身对ox-LDL引起的巨噬细胞损伤(细胞活力变化)影响。

可以看到，氧化型低密度脂蛋白ox-LDL刺激显著抑制了细胞活力，损伤了细胞。余甘子乙酸乙酯提取物能够显著缓解ox-LDL带来的细胞损伤，使细胞活力回复到接近未刺激的水平，且明显优于乙醇粗总提取物的效果。而其他溶剂的提取物中，正丁醇提取物和水提取物亦略有缓解作用，但统计学不显著。

(3)不同浓度乙酸乙酯提取物自身及对ox-LDL引起的巨噬细胞损伤(细胞活力变化)的影响，如表8所示。

表8

图4中，(3)图为不同浓度余甘子乙酸乙酯提取物自身及对ox-LDL引起的巨噬细胞损伤(细胞活力变化)的影响。

可以看到，余甘子乙酸乙酯提取物在0-20μg/ml的不同浓度下对巨噬细胞活力均无明显影响，说明其在该浓度下对细胞无毒。氧化型低密度脂蛋白ox-LDL刺激显著抑制了细胞活力，损伤了细胞，而不同浓度的余甘子乙酸乙酯提取物可以缓解这种损伤，回复细胞活力，且这种作用呈现剂量依赖性。

3.结论:

综上结果，除石油醚提取物(E-PE)外，余甘子的不同提取物包括乙醇粗总提取物在工作浓度10μg/ml下对巨噬细胞无明显毒性。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)可以明显损伤巨噬细胞，降低其细胞活力。余甘子乙酸乙酯提取物可以显著缓解氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对细胞的损伤效应，相较乙醇总粗提取物及其他溶剂提取物效果明显，且在0-20μg/ml的不同浓度下呈现剂量依赖性。这些结果提示，余甘子乙酸乙酯提取物可以通过抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的巨噬细胞损伤，从而抑制损伤后的巨噬细胞聚集沉积在血管壁，防治动脉粥样硬化。

实施例7.余甘子乙酸乙酯提取物对ox-LDL引起血管内皮细胞损伤的影响

1.实验方法:

MTT法细胞增殖实验：细胞培养，HUVEC(人脐静脉内皮)血管内皮细胞,培养基RPMI1640+10％FBS。种植细胞密度为5000每孔于96孔板中，将接种好的96孔板放入培养箱中，至细胞单层铺满孔底，加入终浓度100μg/ml的ox-LDL及不同浓度的待测样品或对照，每组设3个复孔。在考察余甘子不同提取物对巨噬细胞活力变化影响时(包括提取物自身，及提取物与ox-LDL同时作用)，不同提取物刺激细胞时的终浓度均为10μg/ml。5％二氧化碳37℃培养24-48h，显微镜下观察细胞形态变化。每孔加入100ul0.5％MTTRPMI1640培养基培养4h，弃掉培养基，每孔加入100ul DMSO溶解细胞，避光摇床上10min，酶标仪检测490nm吸光度。

2.实验结果

(1)余甘子不同提取物自身对血管内皮细胞活力变化影响，如表9所示。

表9

图5中，(1)图为余甘子不同提取物自身对巨噬细胞活力的影响。

可以看出，除石油醚提取物(E-PE)外，余甘子的不同提取物包括乙醇粗总提取物对血管内皮细胞本身对活力没有显著影响，说明在工作浓度(10μg/ml)其细胞毒性较小。而余甘子石油醚提取物在相同浓度下对血管内皮细胞具有一定对毒性。

(2)余甘子不同提取物对ox-LDL引起血管内皮细胞损伤(细胞活力变化)的影响，如表10所示。

表10

图5中，(2)图是余甘子不同提取物自身对ox-LDL引起的血管内皮细胞损伤(细胞活力变化)影响。

可以看到，氧化型低密度脂蛋白ox-LDL刺激显著抑制了血管内皮细胞活力，损伤了细胞。余甘子乙酸乙酯提取物能够显著缓解ox-LDL带来的细胞损伤，使细胞活力回复到接近未刺激的水平，且明显优于乙醇粗总提取物的效果。而其他溶剂的提取物中，正丁醇提取物和水提取物亦略有缓解作用，但达不到乙酸乙酯提取物的水平。

(2)不同浓度乙酸乙酯提取物自身及对ox-LDL引起血管内皮细胞损伤(细胞活力变化)的影响，如表11所示。

表11

图5中，(3)图为不同浓度余甘子乙酸乙酯提取物自身及对ox-LDL引起的血管内皮细胞损伤(细胞活力变化)的影响。

可以看到，余甘子乙酸乙酯提取物在0-20μg/ml的不同浓度下对血管内皮细胞活力均无明显影响，说明其在该浓度下对细胞无毒。氧化型低密度脂蛋白ox-LDL刺激显著抑制了血管内皮细胞活力，损伤了细胞，而不同浓度的余甘子乙酸乙酯提取物可以缓解这种损伤，回复细胞活力，且这种作用呈现剂量依赖性。

(3)结论:

综上结果，除石油醚提取物(E-PE)外，余甘子的不同提取物包括乙醇粗总提取物在工作浓度10μg/ml下对血管内皮细胞无明显毒性。可以推测，余甘子石油醚提取物通过某些不同细胞间共通的机制影响了细胞活力，因此不适合用作药物治疗。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)可以明显损伤血管内皮，降低其细胞活力。余甘子乙酸乙酯提取物可以显著缓解氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对血管内皮细胞的损伤效应，相较乙醇总粗提取物及其他溶剂提取物效果明显，且在0-20μg/ml的不同浓度下呈现剂量依赖性。这些结果提示，余甘子乙酸乙酯提取物可以通过抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的血管内皮损伤，从而缓解血管壁的破损及局部炎症，防治动脉粥样硬化。

实施例8.余甘子乙酸乙酯提取物对ox-LDL引起巨噬细胞凋亡的影响

1.实验方法:

FACS荧光双染测定细胞凋亡：细胞培养，巨噬细胞RAW264.7，培养基RPMI1640+10％FBS，种植细胞密度为100000-500000每孔于12孔板置于培养箱中，至细胞完全贴壁，细胞状态较好之后，加入不同余甘子提取物至终浓度10μg/ml，刺激24h，空白对照用相同浓度的DMSO。其中，不同余甘子提取物基于MTT实验结果，选取余甘子乙醇粗总提取物(EC)，两个浓度梯度的余甘子乙酸乙酯提取物(E-EA)，余甘子正丁醇提取物(E-nBu)及余甘子水提取物(E-H₂O)。24h之后每孔加入终浓度为100μg/ml的氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)，刺激24h。将细胞消化重悬，300g离心5min，弃上清。用细胞染色液洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入500ul稀释的1*Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞。在细胞重悬液中加入5ul的Annexin V-FITC和5ul的碘化吡啶(PI)染色液。混匀后避光15-20min。反应完成后样品置于冰上，在1h内用于流式细胞仪检测。

2.实验结果:

流式细胞仪荧光双染测定细胞凋亡，结果如表12所示。

表12

图6是余甘子乙酸乙酯提取物对ox-LDL引起的巨噬细胞凋亡的影响。流式细胞术结果中，划定四分区域Q1-Q4。其中Q1为死细胞区域，Q2为细胞晚期凋亡区域，Q3为细胞早中期凋亡区域，Q4为正常细胞区域。可见，氧化型低密度脂蛋白处理显著提升了巨噬细胞早中期及晚期凋亡比例，而余甘子不同提取物处理可以不同程度抑制ox-LDL引起的凋亡。同样浓度下，余甘子乙酸乙酯提取物的抑制效果明显优于乙醇粗总提取物，正丁醇提取物和水提取物。不同浓度的余甘子乙酸乙酯提取物抑制效应符合剂量依赖趋势。

3.结论

结果表明，氧化型低密度脂蛋白处理明显地诱导巨噬细胞凋亡，提高了被处理细胞群体中早中期、晚期凋亡的比例。而余甘子乙酸乙酯提取物显著地抑制了ox-LDL引起的凋亡，保护了巨噬细胞。这种抑制能力呈一定的剂量依赖性，且明显优于余甘子乙醇粗总提取物和其他溶剂提取物。综上，提示余甘子乙酸乙酯提取物通过抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)引起的巨噬细胞凋亡，从而巨噬细胞血管壁聚集，防治动脉粥样硬化。

实施例9.余甘子乙酸乙酯提取物抑制巨噬细胞泡沫化转变

1.实验方法:油红O染色(Oil Red Staining)

油红O为脂质染料。巨噬细胞吞噬ox-LDL，细胞内脂质储积，发生泡沫化转变，是动脉粥样硬化的关键起始步骤。加入油红O后，脂质被其染色显现红色，显色面积及色度深浅体现泡沫化转变程度。细胞培养RAW264.7，RPMI1640+10％FBS，种植细胞密度为500000于6孔板中，培养至细胞稳定生长。换无血清RPMI1640培养，空白对照组(Naive)只加入DMSO至终浓度0.1％，剩余各组加入OX-LDL至终浓度为30μg/ml，同时加入DMSO溶解的余甘子不同提取物至终浓度为10μg/ml.根据之前实验结果，选取余甘子乙醇粗总提取物(EC)，两个浓度梯度的余甘子乙酸乙酯提取物(E-EA)，余甘子正丁醇提取物(E-nBu)及余甘子水提取物(E-H₂O)进行测试。刺激24h。弃掉培养基，PBS清洗3遍，10％中性甲醛固定10min，PBS清洗3遍，加入孵育液10min，油红O染色15min，脱色液A清洗2遍，脱色液B清洗2遍。显微镜下观察。观察拍照完成后，每孔加入1ml异丙醇溶解细胞。取上清，在紫外可见分光光度计中扫描最大吸收波长，为518nm。在518nm处测各组上清液吸光度，即体现各组细胞中的脂质含量。

2.实验结果

油红O染色反映巨噬细胞泡沫化转变程度(溶解上清518nm吸光度)，如表13所示。

表13

注^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001,与ox-LDL+DMSO组相比有显著差异。

图7是各组不同处理巨噬细胞油红O染色后显微镜下代表性图片及溶解细胞后上清吸光度，通过显微镜下观察及溶解细胞后测定细胞中被染色油滴的油红o特定吸光度，可以发现，ox-LDL处理后，巨噬细胞内油滴显著增多，呈现泡沫化转变。而余甘子乙酸乙酯提取物处理使细胞内的油滴显著减少，染色程度显著降低，比其他提取物，尤其是乙醇总粗提物效果明显更好，且有一定的剂量依赖性。

3.结论

通过油红O染色的情况可以看出，在OX-LDL刺激作用下，细胞着色明显，脂滴较大较多，巨噬细胞泡沫化较为严重。而加入余甘子乙酸乙酯提取物后，细胞着色情况减弱，说明余甘子提取物有效地抑制了巨噬细胞的泡沫化发展。异丙醇溶解之后，在518nm处油红O有最大吸收波长，可以量化各组细胞内脂质含量。结果与显微镜下视图一致，乙酸乙酯提取物处理组油红o特异性的吸光度显著低于其他提取物处理组。特别的，我们可以看到，乙醇总粗提物的效果在本实验中相对不好。在前述MTT等实验中，乙醇总粗提物的效果介于乙酸乙酯提取物及其他提取物中间，但本实验中乙醇总粗提物的效果在测定的提取物中最差。推测乙醇总粗提物中的其他物质干扰了有效成分的作用。

实施例10.余甘子乙酸乙酯提取物抑制巨噬细胞促炎性细胞因子分泌

1.实验方法:基于流式细胞术的细胞因子微球检测(CBA)

细胞因子微球检测技术(Cytometric Bead Array，CBA)是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。其原理是通过利用一系列带有荧光标记的微小、分散的微球连接特定的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物，通过对应各种不同检测物的特异微球上所带有荧光强度不同从而同时测定分析样本中多种可溶性成分的数量。本实验中，利用购自BD公司的小鼠炎症因子试剂盒，对脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞培养液上清进行测定，测定其中IL-6，IL-10，IL-12p70，MCP-1，TNF-α及IFN浓度。实验流程如下。细胞培养RAW264.7小鼠巨噬细胞，RPMI1640+10％FBS培养基种植细胞于24孔板中，细胞铺满于24孔板底面。加入LPS至终浓度5μg/ml，并同时加入不同余甘子提取物(10μg/ml)。根据之前实验结果，选取余甘子乙醇粗总提取物(EC)，三个浓度梯度的余甘子乙酸乙酯提取物(E-EA)，余甘子正丁醇提取物(E-nBu)及余甘子水提取物(E-H₂O)进行测试。刺激24h。取细胞培养上清，4000rpm离心。根据试剂盒说明书步骤，取50μL离心上清作为样品，加入微球等，流式细胞术测定其中上述炎症因子浓度。

2.实验结果

余甘子不同提取物对巨噬细胞促炎性细胞因子相对分泌水平的影响，如表14所示。

表14

图8中，余甘子不同提取物对巨噬细胞促炎性细胞因子相对分泌水平的影响。以LPS刺激而不加余甘子提取物(加入与余甘子提取物中等量的DMSO溶剂作为空白对照)组培养上清中细胞因子含量作为基准100％，可以发现，余甘子不同提取物包括乙醇总粗提取物均可以降低炎性因子IL-6，IL-12p70，MCP-1，IFN的表达分泌水平，而对TNF-α和IL-10水平影响不显著。其中，余甘子乙酸乙酯提取物抑制巨噬细胞促炎性因子表达分泌的能力尤为突出，显著优于乙醇总粗提取物及其他提取物，且呈剂量依赖性。

3.结论

通过以上结果可以看出，余甘子乙酸乙酯提取物对LPS刺激所引发的巨噬细胞促炎性细胞因子表达分泌具有抑制作用，并相较于乙醇总粗提取物和其他溶剂提取物具有更好的效果。LPS刺激培养的巨噬细胞，作为较为公认的炎症细胞模型，虽然不能完全模拟动脉粥样硬化时体内炎症机制，但亦被业内学者接受用以分析动脉粥样硬化相关的炎症因子分泌情况。以上结果提示，余甘子乙酸乙酯提取物可以通过调控巨噬细胞引发炎症的相关机制，调控体内炎症水平，从而防治动脉粥样硬化。

实施例11.余甘子乙酸乙酯提取物促进巨噬细胞脂质外排

1.实验方法

脂质外排，即巨噬细胞吞噬脂质后通过细胞膜脂质转运蛋白外排至血液中HDL等脂质载体，运输至肝脏进行分解或贮存处理，是回复巨噬细胞活力，缓解细胞泡沫化转变，抑制动脉粥样硬化的关键机制。根据之前实验结果综合考虑，选取余甘子乙醇粗总提取物(EC)，及两个浓度梯度的余甘子乙酸乙酯提取物(E-EA)进行测试。以10μM 22-hydroxycholesterol及cis retinoic acid刺激作为阳性对照(PC)。其过程为，小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞培养，RPMI1640+10％FBS培养基，种植细胞于24孔板中，细胞铺满于24孔板底面，加入Bodipy-cholesterol每孔1ml作用1.5h，加入待测提取物或阴/阳性对照，作用18h(换培养基为无血清基础培养基RPMI1640+0.2％牛血清蛋白BSA)。弃掉培养基，每孔加入50ug/ml的高密度脂蛋白(HDL)，作用18h，同时time＝0的24孔板弃掉培养基，每孔加入500ul的胆酸钠溶液，充分溶解细胞4h，酶标仪测激发波长482nm，吸收波长515nm处，荧光强度。样品板作用18h之后，收集细胞上清，细胞胆酸钠溶解4h，测荧光强度。

Efflux＝细胞上清荧光强度/(细胞上清荧光强度+time＝0细胞溶解强度)*100％。

2.实验结果

巨噬细胞脂质外排到HDL的比率，如表15所示。

表15

注^*p<0.05，^***p<0.001,与Naive组相比有显著差异。

图9是余甘子乙酸乙酯提取物对巨噬细胞脂质外排(efflux)的影响。

结果表明，余甘子乙酸乙酯提取物刺激可以增加经BODIPY-Cholesterol处理后RAW264.7巨噬细胞的荧光染色脂质外排到血清脂质载体HDL的比例，而且随剂量的增加具有依赖性趋势。而余甘子乙醇总粗提物亦有一定上调，但程度相对较低。

3.结论

通过结果可以看出，余甘子乙酸乙酯提取物刺激可以通过促进巨噬细胞的脂质外排保护巨噬细胞，缓解动脉粥样硬化。而乙醇总粗提物的促进作用有限，这一对机制的解析结果与上述抑制巨噬细胞泡沫化转变的实验现象相吻合。

实施例12.巨噬细胞脂质代谢相关蛋白的变化

1.实验方法

脂质外排的关键相关蛋白中最重要的是ABC转运蛋白家族的ABCA1和ABCG1。通过蛋白印迹western blot实验分析其表达量，进一步揭示余甘子乙酸乙酯提取物促进脂质外排，抑制巨噬细胞泡沫化的机制。小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞培养，RPMI1640+10％FBS培养基，种植细胞于6孔板中，培养至细胞铺满6孔板底面，加入待测物刺激36h。以10μM 22-hydroxycholesterol及cis retinoic acid刺激作为阳性对照。RIPA+1％PMSF裂解细胞15min，置于冰上30min，10000rpm 5℃，10min提取蛋白。

6％凝胶，80V浓缩胶，120V分离胶。

转膜60V,120min，抗体ABCA1,ABCG1,内参为α-Tubulin。

2.实验结果

Western blot免疫印迹实验检测蛋白表达量变化，如表16所示。

表16

图10是余甘子乙酸乙酯提取物对巨噬细胞脂质外排相关ABC蛋白表达的影响，结果显示，余甘子乙酸乙酯提取物处理对巨噬细胞脂质外排相关的ABCA1和ABCG1蛋白均有上调作用。

3.结论

通过western blot免疫印迹实验，不同刺激后提取细胞总蛋白，分别以ABCA1和ABCG1抗体杂交后(以α-Tubulin抗体作为内参表征上样量)，荧光显色分析发光强度。结果显示，若以未刺激组相应蛋白表达量作为基准(100％)，阳性对照显著促进了巨噬细胞的ABCA1蛋白及ABCG1蛋白表达量。而余甘子乙酸乙酯提取物同样显著上调ABCA1和ABCG1这两个脂质转运相关蛋白的表达，可能通过其相关机制促进巨噬细胞脂质转运，抑制动脉粥样硬化。

实施例13.斑马鱼血管脂质沉积斑块模型

1.实验方法

由于斑马鱼幼鱼身体透明，斑马鱼血管粥样硬化模型便于直观观察，造模周期短，样本量大，是衡量降血脂或治疗动脉粥样硬化药物的又一公认模型。通过高脂饲料建模，并在其中掺入红色荧光标记的胆固醇(Cholesteryl BODIPY@542/563C11)，可以直观的观察到血管壁粥样斑块沉积的情况。使用血管特异标记绿色荧光转基因型斑马鱼TG品系(flk1:EGFP)，5dpf(day post fertilization)鱼龄进行实验。

斑马鱼随机把分到6孔板，每孔4ml水，10-15条鱼为一组。

分别设置空白对照组(C组)荧光标记普通饲料；模型组(M组)、阳性对照组(依泽替米倍，Ezetimibe，市售药物，胆固醇吸收抑制剂，PC组)、样品组(余甘子乙酸乙酯提取物E-EA组，正丁醇提取物E-nBu组)，每日喂食掺入荧光标记的高脂饲料(3％胆固醇饲料)，连续喂食7天。

喂食7天完成后共聚焦显微镜拍照，利用Image Pro Plus软件计算各组斑马鱼尾静脉血管(从泄殖腔到末端)的红色荧光强度。

造模及给药处理方式，如表17所示：

表17

2.实验结果

尾静脉荧光标记的脂质沉积物荧光强度统计，如表18所示。

表18

注#P﹤0.05，与空白对照组相比；**P﹤0.005***P﹤0.001，与Model组(模型未治疗)

相比，n＝6。

图11中，(1)图为荧光显微镜下斑马鱼模型尾静脉血管脂质沉积，(2)图为斑马鱼模型尾静脉血管脂质沉积荧光强度统计图。荧光强度代表脂质沉积水平，而脂质沉积体现粥样硬化斑块严重程度。可以看出，以掺杂荧光示踪染料-胆固醇的高脂饲料喂养斑马鱼幼鱼可以成功造模，而加入余甘子乙酸乙酯提取物治疗，可以显著降低尾静脉处观察到的红色荧光强度，其程度优于用作阳性对照的市售药物依泽替米倍Ezetimibe。余甘子正丁醇提取物亦有治疗效果，但逊于乙酸乙酯提取物。

3.结论

通过结果可以看出，余甘子乙酸乙酯提取物E-EA及正丁醇提取物E-nBu能够有效的减少脂质在flk1斑马鱼尾静脉血管中的积累，缓解粥样板块形成，提示其能够在动物模型水平通过多种机制整体防治动脉粥样硬化。

实施例14.斑马鱼炎症调控模型

1.实验方法

使用髓系细胞myeloid(中性粒细胞/巨噬细胞)绿色荧光转基因斑马鱼TG品系(lyz:EGFP),鱼龄3dpf(days post fertilization)时，在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔10枚，每次每组两个重复孔。

分组：空白对照组(Naive组)、炎症模型组(Model组)、阳性对照组(布诺芬组、Ibuprofen)、样品E-EA(1:5K)、E-nBu(1:5K)。

给药表格如下:

表19

各组分别加培养水至1.0mL。然后将24孔板置于光照培养箱(28℃)。孵育2h后，除空白组外，用10μM的CuSO4分别处理模型组、阳性药物组和样品组斑马鱼，继续在28℃条件培养。1h后荧光显微镜下观察拍照。利用Image Pro Plus软件统计样品对炎症反应的影响。

2.实验结果

炎症程度由斑马鱼侧线神经丘细胞区域中性粒细胞迁移数目表征，如表20所示。

表20

注###P﹤0.0001，与空白对照组相比；*P﹤0.05,**P﹤0.01,***P﹤0.001，与Model组(模型未治疗)相比，n＝8。放大倍数100倍。

图12中，(1)是荧光显微镜下斑马鱼模型斑马鱼侧线神经丘细胞区域中性粒细胞；(2)斑马鱼侧线神经丘细胞区域中性粒细胞统计图。斑马鱼侧线神经丘细胞区域中性粒细胞迁移数目提示炎症严重程度。可以看出，硫酸铜CuSO₄诱导斑马鱼幼鱼可以成功造模，而加入余甘子乙酸乙酯提取物治疗，可以显著降低斑马鱼侧线神经丘细胞区域中性粒细胞迁移，其程度接近用作阳性对照的市售药物布诺芬Ibuprofen。余甘子正丁醇提取物亦有治疗效果，但逊于乙酸乙酯提取物。

3.结论

通过结果可以看出，余甘子乙酸乙酯提取物E-EA能够有效的减少斑马鱼侧线神经丘细胞区域中性粒细胞迁移，减缓炎症的发生，提示其能够在动物模型水平通包括免疫调控在内的多种机制整体防治动脉粥样硬化。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.余甘子乙酸乙酯提取物在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述预防和/或治疗动脉粥样硬化至少表现在具有如下任意一种或多种用途：

清除自由基而抑制低密度脂蛋白的体内体外氧化；

抑制巨噬细胞泡沫化转变；

抑制巨噬细胞炎症因子分泌；

促进巨噬细胞脂质外排；

上调脂质转运关键蛋白ABCA1和ABCG1的表达。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：余甘子乙酸乙酯提取物为余甘子果实粉碎后进行乙酸乙酯萃取，再将提取液蒸干乙酸乙酯溶剂后获得的物质。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：余甘子乙酸乙酯提取物的制备方法为：

将中药材余甘子粉碎后，使用索氏提取器，以乙酸乙酯提取；

或以乙酸乙酯溶剂直接提取；

或将余甘子粉末于70％乙醇-水溶液中回流提取，将提取液依次以乙酸乙酯萃取；

或将余甘子鲜果榨汁后用乙酸乙酯萃取；

过滤或离心乙酸乙酯提取液，蒸干溶剂，得到干膏或冷冻干燥得到冻干粉。

5.一种防治动脉粥样硬化的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物由余甘子乙酸乙酯提取物与至少一种其他药物活性成分和/或至少一种其他非药物活性成分构成。

6.根据权利要求5所述的防治动脉粥样硬化的药物组合物，其特征在于：所述药物非活性成分为药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂。

7.根据权利要求6所述的防治动脉粥样硬化的药物组合物，其特征在于：所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。

8.余甘子乙酸乙酯提取物在制备如下任意一种或多种产品中的应用：

低密度脂蛋白的体内体外氧化抑制剂；

巨噬细胞泡沫化转变抑制剂；

巨噬细胞炎症因子分泌抑制剂；

巨噬细胞脂质外排促进剂；

ABCA1转运蛋白促进剂；

ABCG1转运蛋白促进剂。