CN113899709A - 一种定量检测鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种定量检测鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法以及应用。本发明基于脂溶性染料油红O可特异性着色脂肪组织的特性，开发出一种精确、便捷定量鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法。采用染色‑萃取技术方案，避免传统解剖刀刮取脂肪组织直接称量方法的量化粗糙、误差大、操作不便利等问题，通过内脏团样品采集处理、样品标记、固定、脱水、定染、漂洗、萃取和定量等操作步骤，获得个体肠系膜脂肪的沉积量，是以样品吸附并萃取出的油红O质量来表示，可用于精准比较鱼个体间肠系膜脂肪沉积的差异。

Description

一种定量检测鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法以及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种定量检测鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法以及应用。

背景技术

近年来，随着高产高效集约化模式的推广应用，养殖鱼类长速加快，上市周期缩短，但也常出现体脂过度沉积现象，导致鱼体自身健康状况及食用品质下降等问题。其中腹腔内的肠系膜脂肪组织，作为多数鱼类贮存能量，蓄积脂肪的主要功能部位，过度沉积不仅造成饲料资源的浪费，也直接加剧肥胖体型，影响鲜活产品的销售。

针对上述产业问题，科研人员尝试从营养与饲料、遗传育种等多方面开展调控机理与应用技术研究。在研发过程中，通常涉及鱼体肠系膜脂肪沉积量的测定与比较，用以量化评价调控方案的实施效果及优化技术参数。然而，多数鱼类腹腔内的脂肪组织紧随肠管附着延伸，而鱼肠道细长，盘旋回折多，导致该性状无法直接计量。传统解决方法是利用解剖刀等工具将粘连在肠壁周围的脂肪组织进行人工刮取剖离，再集中称量分析。该方法虽然简单直接，但在实际刮取时，易发生肠管破裂，使得肠道内容物混杂其中而造成数据出现较大误差。尤其当处理样品数量较多或实验鱼规格较小时，该方法存在耗时费力，操作失误率高，不易统一规范操作等问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明拟利用油红O作为脂溶性染料，可特异性着色脂肪的特性，开发出了一种可精确定量鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法，操作简单，无需刮取鱼体腹腔内的脂肪组织。

本发明采用以下技术方案实现本发明的目的：

第一个方面，本发明提供一种定量检测鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法，包括以下步骤：

S1、取出鱼体的内脏团，摘除胆囊器官；

S2、将内脏团样品用无水乙醇进行快速脱水处理，沥干样品；

S3、将脱水后的样品用油红O染液进行染色处理，沥干样品；

S4、用无水乙醇漂洗去除样品表面残留的染液，沥干样品；

S5、将S4的样品放入盛有无水乙醇溶液的密封容器中，进行静置萃取；对获得的萃取液进行离心，收集上清液；

S6、在波长510nm处测定S5上清液的吸光度OD值；

S7、将S6的吸光度OD值与油红O标准曲线的吸光度OD值进行比对，获得萃取液的油红O质量分数，再根据计算公式获得个体肠系膜脂肪沉积量。

本发明整个构思以油红O特异性染色脂肪组织的特性，与有机溶剂萃取的机制，将染色与萃取相结合，通过有机溶剂萃取吸附有油红O染料的样品组织，并以萃取出的油红O质量来表示鱼体肠系膜脂肪的沉积量，用于精准定量鱼体肠系膜脂肪沉积量。本发明之所以选择无水乙醇作为脱水、染色、萃取过程的溶剂，主要是因为乙醇与油红O具有良好的相溶性，其次是乙醇相比其他醇类易于获得，价格低廉、低毒性、刺鼻气味轻微。在本发明中需要摘除鱼的胆囊器官，是因为胆囊内储存的有色胆汁，一旦发生破裂可能干扰样品染色、吸光度检测的精准度。

本发明的内脏团具体指：剖开鱼腹，以腹腔内消化道为采集对象，剪断消化道前端(前肠顶部)和后端(后肠肛门处)，用镊子取出整个消化道以及与其紧密粘连的肝胰脏、胆囊、脾脏器官和肠系膜脂肪组织，不含鱼鳔和性腺。摘除胆囊后，从而获得初始内脏团样品。

本发明检测方法中的脱水处理的时间、染色处理的时间、静置萃取的时间以及萃取液的用量实际上是可以根据内脏团样品的大小而调整的。快速脱水处理的时间以样品脱水率为衡量指标，当脱水率为50％～95％之间即可；染色是否成功的判定依据为肉眼可见的脂肪组织被充分染为红色，但肠道、肝胰脏等其他脏器未被染色或影响较为轻微；萃取的时间以样品中肉眼观测染样脂肪组织内的红色染料完全褪去，恢复组织原本颜色为准。

本发明其中一个实施例，样品内脏团样品质量为5.2g，因此根据实际操作，其快速脱水处理时间为15min，样品脱水率为63.5％。油红O染色时肉眼可见的脂肪组织被充分染为红色，但肠道、肝胰脏等其他脏器未受明显影响，其具体染色时间为6min。乙醇萃取时肉眼观测到脂肪组织内的红色染料完全褪去，直至恢复组织原本颜色，其具体萃取时间为24h。

由此，需要说明的是，本发明定量检测鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法中，染色时间、萃取时间不是固定的参数，可根据鱼体内脏团的实际大小来决定，只要染色结果达到油红O染色时肉眼可见的脂肪组织被充分染为红色，但肠道、肝胰脏等其他脏器未受明显影响的效果，以及乙醇萃取结果达到肉眼观测到脂肪组织内的红色染料完全褪去，直至恢复组织原本颜色的效果，均可实现本发明的目的。

第二个方面，本发明还提供了所述方法在比较鱼个体间肠系膜脂肪沉积差异中的应用。

第三个方面，本发明提供了一种比较鱼类肠系膜脂肪沉积量差异的定量分析方法，包括以下步骤：

S1、取出各鱼体的内脏团，摘除胆囊器官；

S2、将PIT电子芯片标记分别塞入各内脏团样品的肠道内；

S3、将S2的内脏团样品放入浓度为4％的多聚甲醛溶液中浸泡，获得内脏团固定样品；

S4、将内脏团固定样品用无水乙醇进行快速脱水处理，沥干样品；

S5、将脱水后的样品用油红O染液进行集中染色处理，沥干样品；

S6、用无水乙醇漂洗去除样品表面残留的染液，沥干样品；

S7、将S6的各个样品分别放入盛有相同质量的无水乙醇溶液的密封容器中，进行静置萃取；对获得的萃取液进行离心，收集上清液；

S8、在波长510nm处测定S7上清液的吸光度OD值；

S9、将S8的吸光度OD值与油红O标准曲线的吸光度OD值进行比对，获得萃取液的油红O质量分数，再根据计算公式获得各内脏团样品的肠系膜脂肪沉积量；

S10、将各内脏团样品的肠系膜脂肪沉积量进行比较，获得各鱼体肠系膜脂肪沉积量差异结果。

本发明比较鱼类肠系膜脂肪沉积量差异的定量分析方法，是为了批量测定鱼类肠系膜脂肪沉积量以及分析个体之间脂肪沉积量的差异。因此，与上述方法相比，该方法还需要增加以下步骤：1)对内脏团样品进行PIT芯片个体标记，这是由于批量处理的样品需要混合在一起集中进行固定、脱水、染色操作，以达到所有样品处理条件、处理效果的一致性；2)对内脏团进行固定，即将所有内脏团样品浸泡于4％的多聚甲醛溶液，这是由于当大批量样品需要进行定量检测时，采集批量样品则会出现时间差，在这个过程中内脏团样品会发生组织自溶，导致脂肪细胞内的脂质流失，因此，开始时采集的样品与结束时的样品会产生差别，造成样品之间的批间差；为了保持批量采集的样品之间的一致性，防止脂肪细胞内的脂质流失，减少批量样品之间的批间差；3)每个内脏团萃取所用无水乙醇的质量是相同的，这是由于萃取液需在试验开始前备好，而统一质量的萃取液不仅有利于批量准备，也可以无差别的随机使用。

进一步地，所述内脏团不包含鱼鳔、性腺器官。

需要说明的是，本发明检测方法中的脱水处理的时间、染色处理的时间、静置萃取的时间以及萃取液的用量实际上是可以根据内脏团样品的大小而调整的。快速脱水处理的时间以样品脱水率为衡量指标，当脱水率为50％～95％之间即可；染色是否成功的判定依据为肉眼可见的脂肪组织被充分染为红色，但肠道、肝胰脏等其他脏器未被染色或影响较为轻微；萃取的时间以样品中肉眼观测染样脂肪组织内的红色染料完全褪去，恢复组织原本颜色为准。

为了使本发明的方法操作更便捷，本发明对样品固定时间、快速脱水处理的时间、染色时间、萃取时间均进行了优化。

进一步地，所述S4快速脱水处理的时间为10～25min；优选地，所述S4快速脱水处理的时间为15min。由于样品染色、萃取处理全部处于无水乙醇环境，样品会出现自行脱水现象。而这可能干扰染色，也有可能影响萃取液定量的精确度。因此，在染色操作前，增加样品快速脱水步骤，以有效避免染色或萃取处理期间样品大幅脱水可能带来的不利影响。经试验验证快速脱水处理的时间为10～25min时，脱水率为55.36％～90.59％，均能有效缓解对染色过程的影响。优选地，脱水处理的时间为15min时，样品能够显著大幅脱水，达到所需样品的要求。

进一步地，所述S5染色处理的时间为6～12min；优选地，所述S5染色处理的时间为9min。在染色过程中，既要保证鱼体肠系膜脂肪组织获得充分染色，又要防止染色时间过长导致非脂肪组织被动着色问题，据此发明人经试验发现当染色时间小于6min时，脂肪组织未达到充分染色，当染色时间大于12min时，其他脏器组织会出现明显被动着色现象。更为优选地，当染色时间为9min时，脂肪组织染色充分，而肠道、肝胰脏等脏器未被染色或影响较为轻微。

进一步地，所述S6漂洗时间为30s。进一步地，所述S7静置萃取的时间为28～36h；优选地，所述S7静置萃取的时间为28h。判断样品萃取是否完成是以肉眼观测染样脂肪组织内的红色染料完全褪去，恢复组织原色为准。据此发明人经试验发现，当萃取的时间小于20h，肠系膜脂肪组织仍有红色染料残留；当萃取的时间大于28h，脂肪组织内未再见有染料存在；本发明发现样品在经历36h静置萃取后，与28h萃取效果相同，所有样品脂肪组织所吸附的油红O染料被完全抽提出来。优选地，当萃取时间达28h时，肠系膜脂肪组织内就未再见有染料，已恢复原色，达到萃取要求，因此，为了缩减操作时间，萃取时间为28h，作为本发明的优选萃取时间。

进一步地，所述S9的计算公式具体如下：

计算公式为：w_o＝ω×w_e，式中w_o为样品萃取出的油红O质量，ω为利用标准曲线计算出的样品萃取液油红O的质量分数，w_e为萃取所用无水乙醇的质量；鱼体肠系膜脂肪沉积量＝w_o。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种定量检测鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法，首次将油红O特异性染色脂肪组织的特性与无水乙醇萃取相结合，通过无水乙醇萃取出的油红O质量与鱼类肠系膜脂肪沉积量进行关联，来精确定量鱼类肠系膜脂肪沉积量，实现精准量化个体间脂肪沉积的差异，这在本领域是首创。本发明的检测方法无需刮取肠壁周围粘连的脂肪组织，也无需顾忌肠管破裂及肠道内容物混杂的影响，具有取样完整，操作便捷，量化精准的特点。本发明还提供了一种比较鱼类肠系膜脂肪沉积量差异的定量分析方法，尤其适用于大批量、小规格实验鱼取样需求，避免了人工剖离肠系膜脂肪组织直接称量方法耗时费力，量化粗糙等问题。

附图说明

图1为本发明鱼类肠系膜脂肪沉积量测定方法的流程图

图2草鱼肠系膜脂肪组织的油红O染色与萃取效果示意图(A:草鱼解剖；B:内脏团初始样品；C:样品固定；D:样品脱水；E:样品油红O染色；F:萃取后样品；a:肠系膜脂肪组织；b:肠道；c:肝胰脏.)

图3油红O标准曲线图

图4为不同染色时间下样品着色效果的对比图(a:肠系膜脂肪组织；b:肠道；c:肝胰脏)

图5为不同萃取时间下油红O染样的变化图

图6同一样品固定不同时间的效果对比图

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

本发明实施例中使用的试剂或溶液的配制，以及使用到的仪器耗材具体信息如下：

油红O干粉购自Sigma-Aldrich公司；无水乙醇(分析纯)购自天津市百世化工有限公司；4％多聚甲醛溶液(中性)购自武汉塞维尔生物科技有限公司；多功能酶标仪(型号：Cytation-5)购自美国伯腾仪器有限公司；电子天平采用梅特勒-托利多公司产品(精度：1mg、0.1mg)。PIT电子芯片标记购自安徽瑞佰创物联科技有限公司。油红O染液的配置是按比例将1.0g油红O干粉充分溶解于5.0kg无水乙醇溶剂中，经300目滤网过滤后，密封备用。

本发明标准曲线的制定具体如下：

称量25.0mg(精确到0.1mg，下同)油红O固体粉末，充分溶解于约100.0g的无水乙醇试剂中，配成油红O质量分数为250μg/g的标准母液。然后，定量吸取标准母液稀释于无水乙醇溶剂中，配成质量分数0μg/g、0.5μg/g、1.0μg/g、1.5μg/g、2.0μg/g、2.5μg/g、3.0μg/g、3.5μg/g、4.0μg/g、4.5μg/g、5.0μg/g、5.5μg/g(以油红O质量计)的工作液，此标准溶液相当于上述80.0g萃取液中含有油红O质量分别为0μg、40μg、80μg、120μg、160μg、200μg、240μg、280μg、320μg、360μg、400μg、440μg。取200μl各梯度工作液置于酶标板，在波长510nm处测定吸光度，以油红O质量分数为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。重复3次。制得的标准曲线如图3所示。油红O浓度(质量分数)与吸光度值之间呈现近乎直线的线性关系，求得拟合回归方程:y＝0.0276x+0.0403,

R²＝0.9997。当油红O质量分数在0μg/g～5.5μg/g范围内时，可以依据此方程进行样品定量分析。

实施例1提供一种定量鱼类肠系膜脂肪沉积量的检测方法，具体包括以下步骤：

S1、取出鱼体的内脏团，摘除胆囊器官；

S2、将内脏团样品用无水乙醇进行快速脱水处理，沥干样品；

S3、将脱水后的样品用油红O染液进行染色处理，沥干样品；

S4、用无水乙醇漂洗去除样品表面残留的染液，沥干样品；

S5、将S4的样品放入盛有无水乙醇溶液的密封容器中，进行静置萃取；对获得的萃取液进行离心，收集上清液；

S6、在波长510nm处测定S5上清液的吸光度OD值；

S7、将S6的吸光度OD值与油红O标准曲线的吸光度OD值进行比对，获得样品萃取液的油红O质量分数，再根据计算公式获得个体肠系膜脂肪沉积量。

本实施例中，内脏团样品为5.2g，快速脱水处理时间为15min，样品脱水率为63.5％，染色处理的时间为肉眼可见的脂肪组织被充分染为红色，但肠道、肝胰脏等其他脏器未受明显影响，萃取的时间以样品中肉眼观测脂肪组织内的红色染料完全褪去，直至恢复组织原本颜色。

计算公式为：w_o＝ω×w_e，式中w_o为样品萃取出的油红O质量，ω为利用标准曲线计算出的样品萃取液油红O的质量分数，w_e为萃取所用无水乙醇的质量；鱼体肠系膜脂肪沉积量＝w_o；其中，所述萃取所用无水乙醇的质量为脂肪组织内的红色染料完全褪去，直至恢复组织原有颜色所需的无水乙醇的质量。

重复检测萃取液吸光度值3次，平均OD值为0.12，再依据上述绘制的标准曲线y＝0.0276x+0.0403，比对获得样品萃取液油红O的质量分数w_o＝2.888μg/g；在已知萃取所用无水乙醇的质量w_e＝80.0g，根据计算公式w_o＝ω×w_e，得出油红O质量w_o＝231.01μg，即表示本实施例中5.2g内脏团样品中肠系膜脂肪沉积量为231.01μg。

实施例2本发明方法中对脱水时间、染色时间和萃取时间的优化

1、快速脱水时间的优化

由于样品染色、萃取处理全部处于无水乙醇环境，样品会出现自行脱水现象。这可能干扰染色，也有可能影响萃取液定量的精确度。因此，有必要在染色操作前，增加样品快速脱水步骤，以有效避免染色或萃取处理期间样品大幅脱水可能带来的不利影响。

为了摸索快速脱水处理时间参数，将内脏团固定样品放入无水乙醇中进行连续检测。测试结果如表1所示，无水乙醇浸泡5min后，样品平均脱水率为35.03％；浸泡延长至10min后，样品平均脱水率为55.36％；浸泡处理15min后，样品平均脱水率达到67.85％；浸泡20min后，样品平均脱水率为78.79％；浸泡25min后，样品平均脱水率达到90.59％。结果表明，将快速脱水步骤处理时间设置为15min，可达到样品显著大幅脱水的目的，有效缓解对染色过程的影响，而且样品再经染色阶段的无水乙醇环境(对应15～25min测试区间)，脱水率达到约90％，同时也保证了后续萃取液定量分析的精准度。

表1固定后样品在无水乙醇环境下的脱水效果测试

注：样品脱水率＝(固定样品质量－阶段性脱水样品质量)/(固定样品质量－脱水28h样品质量)×％

2、染色时间的优化

需要确定适宜的样品染色时间，既要保证鱼体肠系膜脂肪组织获得充分染色，又要防止染色时间过长导致非脂肪组织被动着色问题。为此，在明确油红O染色液配置参数的前提下(按比例1.0g油红O干粉充分溶解于5.0kg无水乙醇溶剂)，开展相关对比测试研究。结果如图4所示，当内脏团样品染色时间为3min时，肠系膜脂肪组织(a)特异性着色，但未达到充分染色；当染色时间延长至6min时，脂肪组织基本达到染色要求；当染色时间延长至9min时，脂肪组织已得到充分染色，肠道(b)、肝胰脏(c)等脏器未被染色或影响较为轻微。当染色时间延长至12min时，脂肪组织着色略微加深，其他脏器组织出现轻微着色现象；当继续延长染色时间至15min或以上时，脂肪组织着色进一步加深，其他脏器组织出现较大程度被动着色问题。综上所述，适宜的油红O染色时间设置为9min。

3、萃取时间的优化

判定样品萃取完成是以肉眼观测染样脂肪组织内的红色染料褪去，恢复组织原色为准。经测试发现，染样经过12h无水乙醇萃取液浸泡，红色染料褪去大部分；延长至20h时，只有少量红色染料残留；当萃取时间为28h时，肠系膜脂肪组织内未再见有染料存在，恢复原色，达到萃取要求；当继续延长萃取至36h时，样品与28h效果保持一致，由此可认定样品萃取完成。如图5所示。

4、在多聚甲醛溶液中浸泡时间的优化

为了防止内脏团样品发生组织自溶，样品取出后需要立即进行固定操作，以保证样品不发生质变，避免细胞内脂质流失。当大量样品需要采集时，则存在采集开始时样品与结束时样品固定时间不一致问题。针对此问题，测试发现，内脏团样品经3～6h多聚甲醛溶液(4％)浸泡后，整个样品包括裸露在外的脂肪组织即已实现固定效果，而且即使再经过24h甚至更长时间的浸泡，固定样品状态依然保持不变。由此可见，当全部样品采集结束时，样品固定时间再统一固定3～6h，不仅保证所有样品均达到统一的固定状态，而且可以长期保持不变，这也为大批量采样提供了宽松的时间。如图6所示。

实施例3提供一种比较鱼类肠系膜脂肪沉积量差异的定量分析方法，具体步骤如下，如图2所示：

1材料与方法

1.1实验鱼

试验所用草鱼是从池塘养殖群体中随机挑选的健康个体，体质量范围约为75.0～95.0g，数量100尾。所有实验鱼出自同一批水花苗种，并在同一个池塘进行培育，以保证饲养环境条件的一致性。

1.2性状采集与样品处理

麻醉称量草鱼质量，游标卡尺测量鱼体体长等体尺性状，然后解剖取出整个内脏团(不含鱼鳔、性腺)，摘除胆囊；将PIT电子芯片塞入鱼肠道内，记录样品编码等信息后，再把已处理标记好的内脏团样品放入多聚甲醛溶液中统一固定6h，获得固定样品。将固定样取出集中，加入适量无水乙醇试剂进行脱水操作，试剂需浸没全部样品，时长15min；倒掉脱水废液，样品沥干2min后，加入提前配置好的油红O染液进行染色处理，染液需浸没全部样品，时长9min；倒掉染色废液，终止染色，样品沥干2min后，加入适量无水乙醇进行快速漂洗，时长30s；倒掉漂洗废液，样品沥干5min后，将染色样品分别放入提前备好的加盖密封萃取瓶，进行28h静置萃取；当萃取完毕，吸取1.6ml萃取液至离心管，10000×rpm，离心1min；再从中吸取200μl上清液至酶标板，在波长510nm处测定吸光度OD值，每个样品检测3次，取平均值。

1.3计算结果

草鱼个体肠系膜脂肪沉积量是以样品吸附并萃取出的油红O质量来表示，计算公式为：w_o＝ω×w_e，式中：ω为利用标准曲线计算出的样品萃取液油红O的质量分数(μg/g)；w_e为萃取所用无水乙醇的质量(g)，w_o为样品萃取出的油红O质量(μg)。最终上述100尾草鱼的肠系膜脂肪沉积量如表2所示：

表2 100尾草鱼的肠系膜脂肪沉积量数据

编号	沉积量/μg	编号	沉积量/μg	编号	沉积量/μg	编号	沉积量/μg
								1	105.12	26	127.44	51	274.59	76	181.93
2	267.63	27	156.33	52	111.11	77	204.93
								3	188.99	28	231.01	53	188.7	78	164.64
4	210.05	29	194.4	54	146.47	79	240.39
								5	200.19	30	201.26	55	113.43	80	183.57
6	166.47	31	162.13	56	111.3	81	165.02
								7	160.68	32	154.69	57	208.6	82	178.45
8	256.23	33	121.74	58	236.81	83	174.98
								9	174.11	34	127.63	59	128.6	84	206.67
10	134.3	35	132.56	60	196.62	85	201.93
								11	215.75	36	117.97	61	177.78	86	162.42
12	122.51	37	126.28	62	123.67	87	261.16
								13	163.38	38	229.76	63	143.48	88	234.88
14	132.27	39	166.47	64	110.72	89	168.02
								15	131.69	40	198.16	65	221.64	90	146.76
16	191.69	41	165.7	66	201.06	91	166.09
								17	158.74	42	154.59	67	167.54	92	191.4
18	132.56	43	166.86	68	139.61	93	158.07
								19	178.16	44	108.79	69	134.98	94	136.04
20	174.2	45	247.63	70	191.3	95	140.77
								21	151.11	46	212.56	71	173.62	96	222.42
22	124.83	47	185.6	72	168.02	97	139.52
								23	195.46	48	108.99	73	141.45	98	108.41
24	145.89	49	318.07	74	186.18	99	199.13
								25	253.53	50	166.76	75	226.18	100	182.9

由表2可知，本发明一种比较鱼类肠系膜脂肪沉积量差异的定量分析方法，能够精确的定量鱼类肠系膜脂肪沉积量，通过该沉积量可分析不同个体之间肠系膜脂肪沉积量的差异。

结论：

油红O是一种脂溶性偶氮染料，可高度溶解于脂类物质，并能够使其特异性着色，因此常被用于细胞内脂滴的定位与指示变化，涉及冰冻组织切片、细胞鉴定、大体染色等技术，用以揭示脂质代谢与机体生理、病理过程的联系。本发明利用油红O有色溶液可量化的另一特性，基于朗伯-比尔定律，通过萃取液吸光度检测，首次将其应用于鱼类肠系膜脂肪沉积量的定量分析。

与传统刮取称量方法相比，本发明开发的鱼类肠系膜脂肪沉积量的定量检测方法，具有取样完整，操作便捷，量化精准的特点，尤其适用于批量、小规格实验鱼采样需求。方法实施步骤的目的是：(1)内脏团中胆囊的摘除，是防止有色胆汁可能对染色过程、萃取液吸光度检测造成干扰。(2)批量操作时实施芯片标记操作，不仅用于识别区分个体，也为后续共同染色提供必要条件，以达到样品处理时间、处理环境的一致性。(3)实施组织固定操作，主要是防止取样时间较长引发的组织自溶，避免细胞内脂质流失，为大批量采样提供宽松的时间。(4)染色前实施脱水操作，是先让样品快速大幅脱水，显著缓解后续无水乙醇操作环境中样品自行脱水可能引起的干扰。(5)选择无水乙醇作为染色、萃取过程的溶剂，主要是乙醇与油红O具有良好的相溶性，而且乙醇相比其他醇类易于获得，价格低廉、低毒性、刺鼻气味轻微。(6)实施漂洗步骤，是去除沥干样品表面残留的工作液，防止残液影响定量分析。(7)通过绘制的标准曲线，可将测定的萃取液吸光度值转换为相应的油红O浓度(质量分数)，而拟合的标准工作曲线决定系数R²达到0.9997，充分表明样品检测过程可靠，量化数据精准。(8)鱼体肠系膜脂肪沉积量，最终是以样品吸附并萃取出的油红O质量来表示。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种定量检测鱼类肠系膜脂肪沉积量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取出鱼体的内脏团，摘除胆囊器官；

S2、将内脏团样品用无水乙醇进行快速脱水处理，沥干样品；

S3、将脱水后的样品用油红O染液进行染色处理，沥干样品；

S4、用无水乙醇漂洗去除样品表面残留的染液，沥干样品；

S5、将S4的样品放入盛有无水乙醇溶液的密封容器中，进行静置萃取；对获得的萃取液进行离心，收集上清液；

S6、在波长510nm处测定S5上清液的吸光度OD值；

S7、将S6的吸光度OD值与油红O标准曲线的吸光度OD值进行比对，获得萃取液的油红O质量分数，再根据计算公式获得个体肠系膜脂肪沉积量。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内脏团不包含鱼鳔、性腺器官。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述S7的计算公式具体如下：

计算公式为：w_o＝ω×w_e，式中w_o为样品萃取出的油红O质量，ω为利用标准曲线计算出的样品萃取液油红O的质量分数，w_e为萃取所用无水乙醇的质量；鱼体肠系膜脂肪沉积量＝w_o。

4.如权利要求3所述的方法在比较鱼个体间肠系膜脂肪沉积差异中的应用。

5.一种比较鱼类肠系膜脂肪沉积量差异的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取出各鱼体的内脏团，摘除胆囊器官；

S2、将PIT电子芯片标记分别塞入各内脏团样品的肠道内；

S3、将S2的内脏团样品放入浓度为4％的多聚甲醛溶液中浸泡，获得内脏团固定样品；

S4、将内脏团固定样品用无水乙醇进行快速脱水处理，沥干样品；

S5、将脱水后的样品用油红O染液进行集中染色处理，沥干样品；

S6、用无水乙醇漂洗去除样品表面残留的染液，沥干样品；

S7、将S6的各个样品分别放入盛有相同质量的无水乙醇溶液的密封容器中，进行静置萃取；对获得的萃取液进行离心，收集上清液；

S8、在波长510nm处测定S7上清液的吸光度OD值；

S9、将S8的吸光度OD值与油红O标准曲线的吸光度OD值进行比对，获得萃取液的油红O质量分数，再根据计算公式获得各内脏团样品的肠系膜脂肪沉积量；

S10、将各内脏团样品的肠系膜脂肪沉积量进行比较，获得各鱼体肠系膜脂肪沉积量差异结果。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述S4快速脱水处理的时间以样品的脱水率为衡量指标，脱水率为50％～95％；优选地，所述S4快速脱水处理的时间为10～25min；优选地，所述S4快速脱水处理的时间为15min。

7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述S5染色处理的时间为肉眼可见的脂肪组织被充分染为红色，肠道、肝胰脏、脾脏其他脏器未被染色或影响轻微；优选地，所述S3染色处理的时间为6～12min；优选地，所述S5染色处理的时间为9min。

8.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述S6漂洗时间为30s。

9.如权利要求5所述的定量分析方法，其特征在于，所述S7静置萃取的时间是以样品中肉眼观测染样脂肪组织内的红色染料完全褪去，组织恢复原色；优选地，所述S7静置萃取的时间为28～36h；优选地，所述S7静置萃取的时间为28h。

10.如权利要求5所述的定量分析方法，其特征在于，所述S9的计算公式具体如下：

计算公式为：w_o＝ω×w_e，式中w_o为样品萃取出的油红O质量，ω为利用标准曲线计算出的样品萃取液油红O的质量分数，w_e为萃取所用无水乙醇的质量；鱼体肠系膜脂肪沉积量＝w_o。

Images