CN108823277A - 运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法 - Google Patents
运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108823277A CN108823277A CN201810347565.5A CN201810347565A CN108823277A CN 108823277 A CN108823277 A CN 108823277A CN 201810347565 A CN201810347565 A CN 201810347565A CN 108823277 A CN108823277 A CN 108823277A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sturgeon
- genome size
- flow cytometry
- measured
- buffer solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 title claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 24
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 14
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims abstract description 13
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 20
- 241000252230 Ctenopharyngodon idella Species 0.000 claims description 19
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 241000883306 Huso huso Species 0.000 description 13
- 241000252344 Acipenser gueldenstaedtii Species 0.000 description 9
- 241000162143 Acipenser schrenckii Species 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000252335 Acipenser Species 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 241000209439 Cabomba caroliniana Species 0.000 description 2
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical group [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000876433 Acipenser dabryanus Species 0.000 description 1
- 241000252355 Acipenser ruthenus Species 0.000 description 1
- 241000252338 Acipenseridae Species 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 241001672694 Citrus reticulata Species 0.000 description 1
- 241000251464 Coelacanthiformes Species 0.000 description 1
- 241000276446 Gadiformes Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000252143 Polyodon spathula Species 0.000 description 1
- 241000252130 Polyodontidae Species 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000037805 labour Diseases 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 238000002324 minimally invasive surgery Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000005424 photoluminescence Methods 0.000 description 1
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1434—Optical arrangements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1486—Counting the particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1493—Particle size
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，包括如下步骤：一、选取基因组已知大小的鱼类作为标准对照；将所述标准对照及待测鲟鱼分别进行如下操作：尾静脉取血，将血液进行离心、PBS缓冲液洗涤、加入2％多聚甲醛溶液、加入透化剂、染色等处理，用流式细胞仪进行检测，分别得标准对照的荧光强度峰值P2及待测鲟鱼的荧光强度峰值P1；二、按照N1＝N2×P1/P2，获得待测鲟鱼的基因组大小；式中N1表示待测鲟鱼基因组大小，N2表示标准对照的基因组大小。采用本发明的方法，能在大规模基因组测序之前，对我国几种主要的鲟鱼养殖品种进行基因组大小的初步测定。
Description
技术领域
本发明属于鱼类基因组学领域，具体指的是运用流式细胞技术对我国几种主要的鲟鱼品种基因组大小测定的方法。
背景技术
鲟鱼(Acipenser sturio Linnaeus)隶属硬骨鱼纲辐鳍亚纲软骨硬鳞总目鲟形目，包括鲟科和匙吻鲟科两科，其下共有6属26个种。鲟鱼是世界上现有鱼类最古老的种类之一，迄今已有2亿多年的历史，素有“水中活化石”之称。鲟鱼主要分布在北半球的北美洲大陆和欧亚大陆，我国现存8种，3种分布于新疆(西伯利亚鲟、裸腹鲟、小体鲟)，2种在黑龙江(达氏鳇、施氏鲟)，2种在长江(白鲟、达氏鲟)，1种在长江至珠江各河流及沿海(中华鲟)。鲟鱼肉质味道鲜美，营养丰富，鲟鱼卵富含大量蛋白质和不饱和脂肪酸，有其加工而成的鱼子酱更是被称为“黑色黄金”，在国际市场价格昂贵，销售走俏。但是，由于过度捕捞，污染及栖息地环境退化等原因致使世界范围内野生鲟鱼的数量急剧下降，大多数已被列为濒危物种。
为了满足人们对鲟鱼肉制品及鱼子酱日益增长的需求，自20世纪80年代中期开始，鲟鱼养殖业在全世界逐渐形成和扩大，我国也加入其中成为了世界鲟鱼养殖的重要生产国。目前，我国主要养殖品种有：施氏鲟、达氏鳇、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟，以及达氏鳇和施氏鲟的杂交鲟。从鱼子酱的色泽和大小上看，达氏鳇或者杂交鲟的卵径较大，达3.0毫米以上，颜色为珍珠灰或灰黑色，为目前市场上高端的一种鱼子酱，但缺点是它们卵成熟都较晚，一般需要8-10年。从2009-2013年世界鱼子酱产量来看，西伯利亚鲟为产量最大的品种，占总产量的36.24％。鲟鱼子酱是欧美等发达国家的奢侈消费品，近年来由于捕捞产量稀少，养殖产量正在逐步增长的过程中，市场供应量还远未恢复到历史上鱼子酱消费的峰值，产量的不足导致国际市场价格昂贵。根据FAO贸易统计数据显示，近十余年来鲟鱼子酱价格整体呈上升趋势，在高位区间窄幅波动。
鲟鱼无论是野外生长还是人工养殖，其雄性和雌性的比例都接近于1:1，并且鲟鱼没有第二性征，外部特征不足以进行性别鉴定。但是，鲟鱼又是一个典型的单性养殖品种，两种性别的养殖价值具有极大的差距。雄鱼主要用于肉食，生产价值不高。雌鱼主要用于鱼仔酱生产，具有很高的附加值。目前国内市场上对鲟鱼性别鉴定主要采用微创手术法，技术人员对在割开鱼腹一道5cm宽的小口后，直接对性腺进行观察。采用该方法，有很多局限性：
①、极大增加了饲养成本。必须要等到鲟鱼饲养到一定大小(性腺肉眼可见)时才能观察，这对于希望尽可能早期地鉴别出雌性鲟鱼、用于鱼子酱生产的养殖户来说，大大增加了饲养成本和场地占用成本。据浙江地区一位饲养鲟鱼长达二十多年的养殖户介绍，养殖鲟鱼一般要到3龄以后才能进行性别鉴定，达氏鳇要到4龄(此时约有10kg左右，非常难抓捕) 鉴定。
②、增加了性别鉴定的成本。掌握此性别鉴定技术的人员缺少，鉴定所需要费用的市场价格垄断，成本高。一般鉴定费用是15元/条。一家中型养殖企业每年用于性别鉴定的费用高达20-30万元。
③、鉴定所开的切口有感染风险。由于该方法是有创观察，鲟鱼在手术后会影响进食3-4 个月。同时，为了避免感染，只能在每年12月份以后到次年4月前，气温偏低的时期内进行鉴定。这对不同时间饲养的鲟鱼又造成了一定饲养成本的浪费。
所以，鲟鱼的早期性别鉴定对鲟鱼养殖具有决定性的意义。鱼类的性染色体分化处于进化的早期阶段，两种性染色体(X与Y，Z与W)之间的差异很小，用传统的方法(如SSR)几乎无法找到他们的差别。只有借助现代基因组测序技术，才有可能在鱼类性别早期鉴定的领域取得突破。可是，对于一般从来鱼类研究的工作者来说，几乎没有太多的基因组研究的背景知识和方法，这也是为什么，到目前为止，鲟鱼性别的鉴定还处于如上所述的、主要靠经验和大量人力劳动的阶段。
鉴于目前鲟鱼养殖和研究的现状，如果能开发出早期鉴定鲟鱼性别的分子标记显得尤为重要。通过分子生物学的手段，在鲟鱼苗期(小于6月龄)来实现对鲟鱼性别的鉴定。但要获得雌雄鉴定的分子标记，雌雄鲟鱼的基因组序列是关键。在正式对鲟鱼基因组进行测定前，需要对鲟鱼基因组的大小进行初步评判，从而制定可靠的测序策略。流式细胞术(FCM)是 20世纪70年代发展起来的一种利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性(细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等)进行定量、快速、客观、多参数相关检测分析的新技术。在动物界，除配子及细胞分裂中某一短时间外，一个有机体中所有的正常细胞都含有相同数量的DNA，所以，利用仪器测量细胞中的含量，可以用来鉴别有机体的倍性。流式细胞术广泛应用于检测鱼类、贝类和虾类等水产经济动物的倍性。
现有的已公开的鲟鱼基因组大小的初步测定法为：
1、张四明等人采用显微分光光度计测定史氏鲟DNA含量，史氏鲟DNA含量的变动幅度为5.56-6.22pg，平均值为6.07pg,[张四明,晏勇,邓怀,等.几种鲟鱼基因组大小、倍体的特性及鲟形目细胞进化的探讨[J].动物学报(Current Zoology),1999,45(2):200-206.]。
2、尹洪滨等人运用流式细胞仪测定达氏鳇的体细胞DNA含量为4.77pg[尹洪滨,孙中武,孙大江.五种养殖鲟、鳇鱼DNA含量的比较[J].上海海洋大学学报,2004,13(2):111-114.]。
尹洪滨等人运用流式细胞仪测定俄罗斯鲟的DNA含量平均值分别为12.24pg/N[尹洪滨, 孙中武,孙大江.五种养殖鲟、鳇鱼DNA含量的比较[J].上海海洋大学学报,2004, 13(2):111-114.]。
但是上述方法均存在缺陷。显微分光光度计法测量时准确度较低，特别是采用显微分光光度计法时的人为操作易使结果产生差异。在鱼类DNA含量测定时，通常都是用采血的方法进行检测。尹洪滨等人采用鱼的尾鳍作为被检样品，样品处理工艺较为复杂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供如何在大规模基因组测序之前，对我国几种主要的鲟鱼养殖品种进行基因组大小的初步测定。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，包括如下步骤：
一、选取基因组已知大小的鱼类(鲤科鱼类)作为标准对照；将所述标准对照及待测鲟鱼分别进行如下操作：
1)、尾静脉取血(可采用EDTA抗凝管保存)；
2)、将步骤1)所得血液离心，用PBS缓冲液洗涤，最后加入PBS缓冲液至原血液原体积(目的是重悬红细胞)，得红细胞悬液Ⅰ；
3)、将50μl的红细胞悬液Ⅰ加入至1±0.01ml的2％(质量％)多聚甲醛溶液中，混匀，4 ±1℃放置10～14小时(即，冰箱过夜固定，自然形成分层)；
4)、去除步骤3)所得物的上清，将沉淀用PBS缓冲液洗涤，最后加0.5±0.01ml的PBS 缓冲液(目的是重悬红细胞)，得红细胞悬液Ⅱ；
5)、在红细胞悬液Ⅱ加入透化剂，所述透化剂由10μl Triton X-100和20μg RnaseA组成，于室温下透化处理30±5min；
6)、将步骤5)所得的透化处理所得物用PBS缓冲液洗涤，最后加0.5±0.01ml的PBS缓冲液(目的是重悬红细胞)，得红细胞悬液Ⅲ；
7)、将红细胞悬液Ⅲ进行PI染色；
8)、用流式细胞仪进行检测，分别得标准对照的荧光强度峰值P2及待测鲟鱼的荧光强度峰值P1；
二、按照N1＝N2×P1/P2，获得待测鲟鱼的基因组大小；
式中N1表示待测鲟鱼基因组大小，N2表示标准对照的基因组大小。
作为本发明的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法的改进，所述步骤7) 为：取步骤6)所得的红细胞悬液Ⅲ150ul加入30μl PI(250μg/ml)，避光染色30±5min。
作为本发明的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法的进一步改进：所述步骤8)中流式细胞仪需具备488nm波长。
作为本发明的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法的进一步改进：所述步骤2)中的离心为1500±300rpm转速离心5±1min。
作为本发明的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法的进一步改进：所述2％ (质量％)多聚甲醛以0.2mol/L,PH7.4的PBS缓冲液为溶剂。
作为本发明的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法的进一步改进：所述 PBS缓冲液为0.2mol/L，PH7.4的PBS缓冲液。
作为本发明的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法的进一步改进：以草鱼作为标准对照。
本发明提出了一种运用流式细胞技术对我国几种常见鲟鱼基因组大小进行快速测定的方法，即用流式细胞术检测不同鲟鱼样品的荧光累积情况，并与基因组已知大小的鲤科鱼类——草鱼的荧光峰值进行比较，可简便、快速的在大规模基因组测序之前测定鲟鱼基因组大小。
本发明利用流式细胞技术，能对我国几种主要的鲟鱼品种进行基因组大小的快速测定。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为1号雌性达氏鳇样品(右)与草鱼样本(左)经流式细胞仪检测获得的直方图；横坐标为荧光强度的相对值，单位是道数；纵坐标为检测到的细胞数目。
图2为2号雄性达氏鳇样品(右)与草鱼样本(左)经流式细胞仪检测获得的直方图；横坐标为荧光强度的相对值，单位是道数；纵坐标为检测到的细胞数目。
图3为3号雌性施氏鲟样品(右)与草鱼样本(左)经流式细胞仪检测获得的直方图；横坐标为荧光强度的相对值，单位是道数；纵坐标为检测到的细胞数目。
图4为4号雄性施氏鲟样品(右)与草鱼样本(左)经流式细胞仪检测获得的直方图；横坐标为荧光强度的相对值，单位是道数；纵坐标为检测到的细胞数目。
图5为5号雌性俄罗斯鲟样品(右)与草鱼样本(左)经流式细胞仪检测获得的直方图；横坐标为荧光强度的相对值，单位是道数；纵坐标为检测到的细胞数目。
图6为6号雄性俄罗斯鲟样品(右)与草鱼样本(左)经流式细胞仪检测获得的直方图；横坐标为荧光强度的相对值，单位是道数；纵坐标为检测到的细胞数目。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下案例中：
PBS缓冲液均为0.2mol/L，PH7.4的PBS缓冲液。
2％(质量％)多聚甲醛溶液为将2g多聚甲醛用PBS缓冲液(0.2mol/L,PH7.4 PBS配制，现配现用)定容至100g，均匀混合后所得。
实施例1、运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，依次进行如下步骤：
一、选取基因组大小已知的鲤科鱼类——草鱼作为标准对照，草鱼的基因组大小约为1.07 Gb。将草鱼以及待测的鲟鱼(雌性达氏鳇、雄性达氏鳇、雌性施氏鲟、雄性施氏鲟、雌性俄罗斯鲟及雄性俄罗斯鲟)进行以下操作的步骤1)～步骤7)：
1)、采取尾静脉取血的方法，取血量0.5ml，EDTA抗凝管保存。
2)、取新鲜血或抗凝血离心1500rpm，5min。用PBS缓冲液洗涤两次(每次洗涤后均去除洗涤液，以下同)，加0.5ml PBS缓冲液重悬红细胞；得红细胞悬液Ⅰ。
3)、取步骤2)所得的红细胞悬液Ⅰ50μl，加入至1ml 2％多聚甲醛溶液中，混匀，4℃冰箱过夜(约12小时)固定；自然形成分层。
4)、去除步骤3)所得物的上清，将沉淀用PBS缓冲液洗涤两次，加0.5ml PBS缓冲液重悬红细胞，得红细胞悬液Ⅱ；
5)、在步骤4)所得的红细胞悬液Ⅱ中加透化剂(10μl Triton X-100+20μg RnaseA)，室温透化处理30min。
6)、透化处理后，用PBS缓冲液洗涤一遍，再重悬于0.5ml PBS缓冲液中；得红细胞悬液Ⅲ；
7)、取步骤6)所得的红细胞悬液Ⅲ150ul加入30μl PI(250μg/ml)，避光染色30±5min；得染色液；
将草鱼所得的染色液以及待测鲟鱼所得的染色液混合后(一般为1:1的体积比混合)，进行下述步骤8)。
8)、用流式细胞仪(具备488nm波长)进行检测。
9)、荧光染料PI(碘化丙啶)染液在着色过程中的嵌入量与DNA含量呈正比，因此用流式细胞术测定的样品荧光强度，即可代表样品DNA的相对含量。对照标准的DNA含量已知，根据待测样品与对照标准DNA相对含量之间的倍数关系，最终可以计算出待测样品的 DNA含量，即待测样品基因组大小。计算公式为：N1＝N2×P1/P2。
式中N1表示待测鲟鱼基因组大小，N2表示标准对照草鱼基因组大小；P1、P2是流式细胞术测定结果，P1为待测鲟鱼荧光强度峰值，P2为草鱼荧光强度峰值。
由流式细胞仪检测结果可知(图1-6)，峰值明显，两峰值有一定间距，表明实验条件下可以良好的区分混合样品，可用流式细胞术所得数据进行基因组大小的分析。
由图1可知，经处理的样本DNA用流式细胞术测定，直方图显示草鱼样本峰值为927810，雌性达氏鳇样本峰值为4495194。
由图2可知，经处理的样本DNA用流式细胞术测定，直方图显示草鱼样本峰值为879037，雄性达氏鳇样本峰值为4495194。
由图3可知，经处理的样本DNA用流式细胞术测定，直方图显示草鱼样本峰值为849470，雌性施氏鲟样本峰值为4570630。
由图4可知，经处理的样本DNA用流式细胞术测定，直方图显示草鱼样本峰值为852482，雄性施氏鲟样本峰值为4045136。
由图5可知，经处理的样本DNA用流式细胞术测定，直方图显示草鱼样本峰值为849751，雌性俄罗斯鲟样本峰值为4255096。
由图6可知，经处理的样本DNA用流式细胞术测定，直方图显示草鱼样本峰值为868117，雄性俄罗斯鲟样本峰值为4380095。
经公式计算，结果见表1。
表1
目前有文献显示，估测鲟鱼DNA含量的方法有采用显微分光光度计测定以及流式细胞仪测定两种方法，所得施氏鲟史氏鲟DNA含量的变动幅度为5.56-6.22pg，达氏鳇的体细胞DNA含量为4.77pg，俄罗斯鲟的DNA含量平均值分别为12.24pg/N，这与本发明所得结果较为接近。
对比例1-1、将实施例1中“2％多聚甲醛溶液”改成“75％乙醇溶液”，其余等同于实施例1。最终所得结果为：经甲醛固定的血液样品，细胞分散良好。乙醇固定是保存DNA标本的常用方法，但乙醇的加入，导致细胞聚集或破裂，无法进行流式细胞术测定。
对比例2-1、将实施例1中“多聚甲醛溶液”的浓度由2％改成1％，其余等同于实施例1。最终所得结果为：使用2％多聚甲醛溶液进行细胞固定，细胞群较1％多聚甲醛溶液固定更为集中且更为均一，细胞形态变化更小，因此使用2％多聚甲醛溶液进行细胞固定效果更好。
对比例3-1、将实施例1中固定时间由冰箱过夜(约12小时)改成3小时，其余等同于实施例1。最终所得结果为：固定12小时的细胞形态，大小及均一性均好于固定3小时。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，其特征是包括如下步骤：
一、选取基因组已知大小的鱼类作为标准对照；将所述标准对照及待测鲟鱼分别进行如下操作：
1)、尾静脉取血；
2)、将步骤1)所得血液离心，用PBS缓冲液洗涤，最后加入PBS缓冲液至原血液原体积，得红细胞悬液Ⅰ；
3)、将50μl的红细胞悬液Ⅰ加入至1±0.01ml的2％多聚甲醛溶液中，混匀，4±1℃放置10～14小时；
4)、去除步骤3)所得物的上清，将沉淀用PBS缓冲液洗涤，最后加0.5±0.01ml的PBS缓冲液，得红细胞悬液Ⅱ；
5)、在红细胞悬液Ⅱ加入透化剂，所述透化剂由10μl Triton X-100和20μg Rnase A组成，于室温下透化处理30±5min；
6)、将步骤5)所得的透化处理所得物用PBS缓冲液洗涤，最后加0.5±0.01ml的PBS缓冲液，得红细胞悬液Ⅲ；
7)、将红细胞悬液Ⅲ进行PI染色；
8)、用流式细胞仪进行检测，分别得标准对照的荧光强度峰值P2及待测鲟鱼的荧光强度峰值P1；
二、按照N1＝N2×P1/P2，获得待测鲟鱼的基因组大小；
式中N1表示待测鲟鱼基因组大小，N2表示标准对照的基因组大小。
2.根据权利要求1所述的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，其特征在于所述步骤7)为：取步骤6)所得的红细胞悬液Ⅲ150ul加入30μl PI，避光染色30±5min。
3.根据权利要求1或2所述的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，其特征在于：所述步骤8)中流式细胞仪需具备488nm波长。
4.根据权利要求1或2所述的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，其特征在于：所述步骤2)中的离心为1500±300rpm转速离心5±1min。
5.根据权利要求1或2所述的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，其特征在于：所述2％多聚甲醛以0.2mol/L,PH7.4的PBS缓冲液为溶剂。
6.根据权利要求1或2所述的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，其特征在于：所述PBS缓冲液为0.2mol/L，PH7.4的PBS缓冲液。
7.根据权利要求1或2所述的运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，其特征在于：以草鱼作为标准对照。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810347565.5A CN108823277A (zh) | 2018-04-18 | 2018-04-18 | 运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810347565.5A CN108823277A (zh) | 2018-04-18 | 2018-04-18 | 运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108823277A true CN108823277A (zh) | 2018-11-16 |
Family
ID=64155088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810347565.5A Pending CN108823277A (zh) | 2018-04-18 | 2018-04-18 | 运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108823277A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110274865A (zh) * | 2019-06-21 | 2019-09-24 | 中南民族大学 | 一种推算金腰属植物基因组大小的方法 |
| CN115326686A (zh) * | 2022-08-15 | 2022-11-11 | 江苏省林业科学研究院 | 一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101302561A (zh) * | 2008-06-19 | 2008-11-12 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 半滑舌鳎遗传性别及ww超雌鱼鉴定方法 |
| CN104585083A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-05-06 | 湖南师范大学 | 鲤鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 |
| CN106967796A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-07-21 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种快速批量化测定水生动物基因组倍性的方法 |
-
2018
- 2018-04-18 CN CN201810347565.5A patent/CN108823277A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101302561A (zh) * | 2008-06-19 | 2008-11-12 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 半滑舌鳎遗传性别及ww超雌鱼鉴定方法 |
| CN104585083A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-05-06 | 湖南师范大学 | 鲤鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 |
| CN106967796A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-07-21 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种快速批量化测定水生动物基因组倍性的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 宋苏详等: "施氏鲟的核型及DNA含量研究", 《遗传》 * |
| 尹洪滨等: "五种养殖鲟、鳇鱼DNA含量的比较", 《上海水产大学学报》 * |
| 尹洪滨等: "小体鲟染色体核型及倍性的细胞遗传学研究", 《水产学杂志》 * |
| 范兆廷等: "十三种淡水养殖鱼类的DNA含量", 《水产学报》 * |
| 薛淑群等: "匙吻鲟的细胞遗传学分析", 《水生生物学报》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110274865A (zh) * | 2019-06-21 | 2019-09-24 | 中南民族大学 | 一种推算金腰属植物基因组大小的方法 |
| CN115326686A (zh) * | 2022-08-15 | 2022-11-11 | 江苏省林业科学研究院 | 一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法 |
| CN115326686B (zh) * | 2022-08-15 | 2024-01-19 | 江苏省林业科学研究院 | 一种基于基因组大小差异的枸骨性别快速鉴定方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106719114B (zh) | 暗纹东方鲀和红鳍东方鲀之间的杂交种及生产方法 | |
| CN105969845B (zh) | 眼肌面积性状相关基因svep1的分子标记及其应用 | |
| CN105176997B (zh) | 一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN104585083B (zh) | 鲤鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 | |
| CN106011300A (zh) | 乌苏里拟鲿遗传性别鉴定用pcr引物对及快速鉴定方法 | |
| CN105961251B (zh) | 一种耐低氧团头鲂的构建方法 | |
| CN109971885A (zh) | 新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重荧光定量pcr检测引物、试剂盒及应用 | |
| CN108823277A (zh) | 运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法 | |
| CN105548321A (zh) | 一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法 | |
| CN104152451B (zh) | 一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法 | |
| CN115290615A (zh) | 一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法 | |
| CN109136229B (zh) | 特异性识别卵形鲳鲹源神经坏死病毒的核酸适配体及其应用 | |
| CN106811514B (zh) | 鳖亚科生物成分特异性实时荧光检测方法及其试剂盒 | |
| CN113151430A (zh) | 一种中国对虾雌性特异性引物及其应用 | |
| CN104396812B (zh) | 一种通过抑制受精卵极体释放获得异源多倍体泥鳅的方法 | |
| CN115679004B (zh) | 鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和杂交种的引物、方法和试剂盒 | |
| CN109207480B (zh) | 特异性针对卵形鲳鲹神经坏死病毒的核酸适配体及其应用 | |
| CN106376501A (zh) | 一种生产泥鳅四倍体的方法 | |
| CN103642911B (zh) | 鱼翅食品中鲨鱼成分快速检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN102477461A (zh) | 脂联素基因表达水平在肉牛肌肉大理石纹等级鉴定中的应用 | |
| Crozier et al. | Experimental production of triploid brown trout, Salmo trutta L., using heat shock | |
| TWI719665B (zh) | 用以鑑別鴿子性別之引子組、在場快速鑑別鴿子性別之方法及套組 | |
| CN109161548B (zh) | 核酸适配体及其在检测卵形鲳鲹源神经坏死病毒中的应用 | |
| CN105603097A (zh) | 用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用 | |
| Krasznai et al. | Can flow cytometric DNA content analysis become a routine procedure in aquaculture? |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181116 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |