CN115290615A - 一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，本发明涉及环境污染物检测领域，具体涉及一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法。本发明要解决现有方法不能快速、高效且准确检测海洋生物中微塑料含量的问题。方法：一、实验动物驯化；二、微塑料暴露实验；三、组织采集；四、组织消解；五、建立标准曲线；六、微塑料含量测定。本发明能够快速、高效且准确检测海洋生物中微塑料含量。本发明用于检测海洋生物中微塑料含量。
Description
技术领域
本发明涉及环境污染物检测领域，具体涉及一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法。
背景技术
近年来，海洋微塑料污染问题已引起各国政府、科学界、公众等的广泛关注，并成为当前海洋生态与环境研究的热点问题之一。
水环境中的微塑料粒径小、分布广泛、难以降解、易吸附环境污染物，其被海洋生物摄入后，可对海洋生物产生一系列毒性效应，并可能通过食物链传递威胁海洋生态系统的健康，导致极大的生态环境风险。因此，研究海洋生物摄入微塑料的途径及其被摄入后在海洋生物体内的蓄积情况非常必要。
高效准确的微塑料分析检测技术是开展微塑料生态环境效应相关研究的基础。然而现有的微塑料分析方法的效果参差不齐、可比性较差，存在着分析过程冗长、分离效率低及准确率不足等缺点。申请授权号CN 105651748B的发明专利，公开了一种定量分析微塑料在水生生物体内富集分布的方法；该方法不足之处主要在于：(1)采用浓硝酸进行组织高温消解处理：强酸消解法已被证明可损害微塑料的物理结构，并显著降低微塑料表面荧光强度，导致加标回收率不高，即检测结果可能被极大低估；(2)采用荧光光谱仪进行测量：该技术一次仅能测量一个样品，每次测量均需人为操作，流程包括加入待测样品至石英比色皿、擦拭比色皿液滴、放入检测池、测量荧光强度、取出比色皿清洗；再重复以上步骤，进行下一样品测量。使用该方法检测数百个样品往往需要数天时间，实验操作繁琐、过程冗长。因此，亟需建立一种快速、高效且能准确检测海洋生物摄入微塑料含量的高通量测定方法。
发明内容
本发明要解决现有方法不能快速、高效且准确检测海洋生物中微塑料含量的问题，而提供一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法。
一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，具体按以下步骤进行：
步骤一：实验动物驯化
配制海水溶液，以海洋双壳贝类为受试动物，在海水溶液中进行暂养驯化；
步骤二：微塑料暴露实验
将步骤一驯化后的受试动物随机分组，分为空白对照组和暴露组，空白对照组采用步骤一配制的海水溶液进行饲养；暴露组采用含荧光标记微塑料颗粒的海水溶液饲养，进行微塑料暴露实验；
步骤三：组织采集
将步骤二实验后的受试动物进行目标组织器官采集，然后称重，冷冻保存；
步骤四：组织消解
采用复合消解试剂对步骤三采集的目标组织器官进行恒温振荡消解，然后定容，获得待测样品溶液；
步骤五：建立标准曲线
配制一系列不同浓度梯度的荧光微塑料溶液，依次加入到96孔酶标板中，采用多功能酶标仪设置激发波长和发射波长，重复测定样品荧光强度三次，建立微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线；
步骤六：微塑料含量测定
将步骤四中的待测样品溶液依次加入96孔酶标板中，采用步骤五中多功能酶标仪设置同样的激发和发射波长，重复测定待测样品溶液荧光强度三次，并根据步骤五建立的标准曲线计算待测样品溶液中微塑料浓度；
根据步骤三中目标组织重量和步骤四中定容体积，计算单位质量组织中微塑料的含量；然后扣除空白对照组的背景值，得到海洋生物体内微塑料含量，完成。
步骤一中，采用水族专用海盐商品配制海水溶液，其营养元素根据水族动物需求调配，且杂质含量少，配制海水溶液盐度为29～31‰，根据受试动物的最佳生存条件选择适宜盐度；优选地，配制后使用0.45μm微孔滤膜对海水进行过滤以进一步去除杂质。
步骤一中，暂养驯化周期为2～3周，使受试动物充分适应实验室养殖条件。
进一步，在步骤二中，每日需更换所需海水实验用溶液，动物培育条件应与暂养驯化期间一致，暴露期间应避免喂食以免影响实验结果。控制微塑料暴露实验的周期为63h或更长。
进一步，步骤三采集的组织器官是双壳贝类的鳃、消化腺、肠、外套膜和足部中任一个或其中几个的任意组合。
进一步，步骤四采用氢氧化钾溶液和过氧化氢溶液作为复合消解试剂，一方面消解试剂对微塑料影响较小，荧光强度损耗微弱；另一方面，针对贝类组织韧性较强的特性，采用恒温振荡、加大消解试剂用量及增加消解时间的方式使组织样本得以充分消解，提高后续检测结果的准确性。
步骤四所述消解工艺为每个样品中加入8mL质量浓度为10％的氢氧化钾溶液，放入恒温摇床中，控制温度为65℃、转速为80rpm，消解12h，再向每个样品中加入2mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，控制温度为65℃、转速为80rpm，继续消解12h。
进一步，步骤五中多功能酶标仪的激发波长为488nm，发射波长为518nm。
在本发明方法中，步骤六中采用多功能酶标仪一次性测定96个样品溶液中的微塑料浓度仅需数分钟。
本发明的有益效果是：
本发明不仅建立了一种针对微塑料提取的生物组织消解优化方法，还提供了一种基于多功能酶标仪高效便捷、准确测定样品溶液中微塑料含量的方法。该方案主要具有以下优点：采用温和复合消解试剂，避免强酸消解试剂对微塑料的物理结构破坏和荧光强度损耗而引起的结果偏差；采用恒温振荡及优化消解参数的方式使组织样本得以充分消解，提高后续检测结果的准确性；通过多功能酶标仪可快速检测样品溶液中微塑料含量，本方法可以在一小时内完成数百个样品测定，极大地提高了检测效率，而基于荧光光谱仪的方法则需要数天完成数百个样品的测定。该方法可为研究海洋生物摄入微塑料的途径及其在海洋生物体内的蓄积特征提供有效的检测方法，并为探究微塑料对海洋生物的生态毒理效应提供数据参考。
本发明用于检测海洋生物体内微塑料含量。
附图说明
图1为具体实施方式一所述方法流程图；
图2为实施例一步骤五建立PS微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线图；
图3为实施例一海洋生物体内各器官中PS微塑料含量图；
图4为实施例二步骤五建立PS-NH2微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线图；
图5为实施例二海洋生物体内各器官中PS-NH2微塑料含量图；
图6为实施例三步骤五建立PS-COOH微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于该方法具体按以下步骤进行：
步骤一：实验动物驯化
配制海水溶液，以海洋双壳贝类为受试动物，在海水溶液中进行暂养驯化；
步骤二：微塑料暴露实验
将步骤一驯化后的受试动物随机分组，分为空白对照组和暴露组，空白对照组采用步骤一配制的海水溶液进行饲养；暴露组采用含荧光标记微塑料颗粒的海水溶液饲养，进行微塑料暴露实验；
步骤三：组织采集
将步骤二实验后的受试动物进行目标组织器官采集，然后称重，冷冻保存；
步骤四：组织消解
采用复合消解试剂对步骤三采集的目标组织器官进行恒温振荡消解，然后定容，获得待测样品溶液；
步骤五：建立标准曲线
配制一系列不同浓度梯度的荧光微塑料溶液，依次加入到96孔酶标板中，采用多功能酶标仪设置激发波长和发射波长，重复测定样品荧光强度三次，建立微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线；
步骤六：微塑料含量测定
将步骤四中的待测样品溶液依次加入96孔酶标板中，采用步骤五中多功能酶标仪设置同样的激发和发射波长，重复测定待测样品溶液荧光强度三次，并根据步骤五建立的标准曲线计算待测样品溶液中微塑料浓度；
根据步骤三中目标组织重量和步骤四中定容体积，计算单位质量组织中微塑料的含量；然后扣除空白对照组的背景值，得到海洋生物体内微塑料含量，完成。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述暂养驯化时间为2～3周。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一在暂养驯化期间采用0.45μm微孔滤膜对海水溶液进行过滤。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中饲养过程需每日更换海水实验溶液，其他培育条件与暂养驯化期间一致；微塑料暴露实验的周期为63h或更长。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三采集的组织器官是双壳贝类的鳃、消化腺、肠、外套膜和足部中任一个或其中几个的任意组合。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三冷冻保存温度为-10～-20℃。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四所述复合消解试剂为氢氧化钾溶液和过氧化氢溶液。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四所述消解工艺为每个样品中加入8mL质量浓度为10％的氢氧化钾溶液，放入恒温摇床中，控制温度为65℃、转速为80rpm，消解12h，再向每个样品中加入2mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，控制温度为65℃、转速为80rpm，继续消解12h。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤五中多功能酶标仪的激发波长为488nm，发射波长为518nm。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤六将每个待测样品溶液各取200μL依次加入96孔酶标板中。其它与具体实施方式一至九之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：
本实施例一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，具体按以下步骤进行：
步骤一：实验动物驯化
以海洋双壳贝类波纹巴非蛤为受试动物，放入大型水族箱中暂养驯化两周，控制温度25±1℃，盐度30±1‰，连续充气，每日投喂海水小球藻一次，驯化所用海水溶液为水族专用海盐配制的盐度为30±1‰海水，并使用0.45μm微孔滤膜进行过滤；
步骤二：微塑料暴露实验
将步骤一驯化后个体大小相似且健康的波纹巴非蛤随机分组，分为空白对照组和暴露组，空白对照组采用步骤一配制的海水溶液进行饲养；暴露组采用平均粒径为80nm绿色荧光标记的聚苯乙烯微塑料颗粒(PS)进行微塑料暴露实验，PS微塑料颗粒浓度为500μg/L；每个实验组含3个平行水缸，每个水缸饲养15只波纹巴非蛤；采用与驯化期间相同的实验条件进行暴露实验，每日更换所需实验用水；暴露期间为避免进食影响实验结果，未对贝类进行喂食；
步骤三：组织采集
将步骤二暴露63h的受试动物进行目标组织器官采集，分别采集鳃、消化腺、肠、外套膜、足部，用超纯水冲洗三遍，吸干水分，称量样本重量，冷冻保存，获得组织样品；
步骤四：组织消解
将步骤三获取的每个组织样品中加入8mL质量浓度为10％的氢氧化钾溶液，放入恒温摇床中，控制温度为65℃、转速为80rpm，消解12h，再向每个样品中加入2mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，控制温度为65℃、转速为80rpm，继续消解12h，取得的消解液用超纯水统一定容至10mL，即为待测样品溶液；
步骤五：建立标准曲线
采用1mg/mL的荧光PS标准储备液稀释配制浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1mg/L的荧光PS微塑料溶液，取不同浓度的荧光PS微塑料溶液各200μL，依次加入到96孔酶标板中，采用多功能酶标仪(Molecular Decvices)设置激发波长为488nm、发射波长为518nm，测定三次各样品的荧光强度，取平均值，建立PS微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线。
步骤六：微塑料含量测定
将步骤四中每个待测样品溶液各取200μL依次加入96孔酶标板中，采用步骤五中多功能酶标仪设置激发波长为488nm、发射波长为518nm，各待测样品溶液测定三次荧光强度；根据步骤五建立的标准曲线计算待测样品溶液中对应PS微塑料浓度；
进一步根据步骤三中各组织重量和步骤四中定容体积数据，换算为单位质量组织中PS微塑料的含量，然后扣除空白对照组的背景值，得到海洋生物体内微塑料含量，完成。
实施例二：
本实施例与实施例一不同的是：步骤一中以文蛤为受试动物；步骤二中暴露组采用平均粒径为80nm绿色荧光标记的氨基改性的聚苯乙烯微塑料颗粒(PS-NH2)进行微塑料暴露实验。其它与实施例一相同。
实施例三：
本实施例与实施例一不同的是：步骤二中暴露组采用平均粒径为3μm绿色荧光标记的羧基改性的聚苯乙烯微塑料颗粒(PS-COOH)进行微塑料暴露实验，PS-COOH微塑料颗粒浓度为100μg/L，暴露时间为7天。其它与实施例一相同。
其中图2为实施例一步骤五建立PS微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线图；由图可知，其相关系数达到0.997，表明标准曲线的荧光强度与PS微塑料浓度之间相关性强，回归拟合效果好。
图3为实施例一海洋生物体内各器官中PS微塑料含量图；
图4为实施例二步骤五建立PS-NH2微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线图；由图可知，其相关系数达到0.996，表明标准曲线的荧光强度与PS-NH2微塑料浓度之间相关性强，回归拟合效果好。
图5为实施例二海洋生物体内各器官中PS-NH2微塑料含量图；
图6为实施例三步骤五建立PS-COOH微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线图；由图可知，其相关系数达到0.993，表明标准曲线的荧光强度与PS-COOH微塑料浓度之间相关性强，回归拟合效果好。
由以上实验结果可证实，本发明不仅建立了一种针对微塑料提取的生物组织消解优化方法，还提供了一种基于多功能酶标仪高效便捷、准确测定样品溶液中微塑料含量的方法。该方案主要具有以下优点：采用温和复合消解试剂，避免强酸消解试剂对微塑料的物理结构破坏和荧光强度损耗而引起的结果偏差；采用恒温振荡及优化消解参数的方式使组织样本得以充分消解，提高后续检测结果的准确性；通过多功能酶标仪可快速检测样品溶液中微塑料含量，本方法可以在一小时内完成数百个样品测定，极大地提高了检测效率，而基于荧光光谱仪的方法则需要数天完成数百个样品的测定。该方法可为研究海洋生物摄入微塑料的途径及其在海洋生物体内的蓄积特征提供有效的检测方法，并为探究微塑料对海洋生物的生态毒理效应提供数据参考。
Claims (10)
1.一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于该方法具体按以下步骤进行：
步骤一：实验动物驯化
配制海水溶液，以海洋双壳贝类为受试动物，在海水溶液中进行暂养驯化；
步骤二：微塑料暴露实验
将步骤一驯化后的受试动物随机分组，分为空白对照组和暴露组，空白对照组采用步骤一配制的海水溶液进行饲养；暴露组采用含荧光标记微塑料颗粒的海水溶液饲养，进行微塑料暴露实验；
步骤三：组织采集
将步骤二实验后的受试动物进行目标组织器官采集，然后称重，冷冻保存；
步骤四：组织消解
采用复合消解试剂对步骤三采集的目标组织器官进行恒温振荡消解，然后定容，获得待测样品溶液；
步骤五：建立标准曲线
配制一系列不同浓度梯度的荧光微塑料溶液，依次加入到96孔酶标板中，采用多功能酶标仪设置激发波长和发射波长，重复测定样品荧光强度三次，建立微塑料浓度和对应荧光强度的标准曲线；
步骤六：微塑料含量测定
将步骤四中的待测样品溶液依次加入96孔酶标板中，采用步骤五中多功能酶标仪设置同样的激发和发射波长，重复测定待测样品溶液荧光强度三次，并根据步骤五建立的标准曲线计算待测样品溶液中微塑料浓度；
根据步骤三中目标组织器官重量和步骤四中定容体积，计算单位质量组织中微塑料的含量；然后扣除空白对照组的背景值，得到海洋生物体内微塑料含量，完成。
2.根据权利要求1所述的一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于步骤一所述暂养驯化时间为2～3周。
3.根据权利要求1所述的一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于步骤一在暂养驯化期间采用0.45μm微孔滤膜对海水溶液进行过滤。
4.根据权利要求1所述的一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于步骤二中饲养过程需每日更换海水实验溶液，其他培育条件与暂养驯化期间一致；微塑料暴露实验的周期为63h或更长。
5.根据权利要求1所述的一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于步骤三采集的组织器官是双壳贝类的鳃、消化腺、肠、外套膜和足部中任一个或其中几个的任意组合。
6.根据权利要求1所述的一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于步骤三冷冻保存温度为-10～-20℃。
7.根据权利要求1所述的一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于步骤四所述复合消解试剂为氢氧化钾溶液和过氧化氢溶液。
8.根据权利要求1所述的一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于步骤四所述消解工艺为每个样品中加入8mL质量浓度为10％的氢氧化钾溶液，放入恒温摇床中，控制温度为65℃、转速为80rpm，消解12h，再向每个样品中加入2mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液，控制温度为65℃、转速为80rpm，继续消解12h。
9.根据权利要求1所述的一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于步骤五中多功能酶标仪的激发波长为488nm，发射波长为518nm。
10.根据权利要求1所述的一种检测海洋生物体内微塑料含量的高通量方法，其特征在于步骤六将每个待测样品溶液各取200μL依次加入96孔酶标板中。
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